本發(fā)明涉及一種藥物的制藥用途，具體涉及五味子甲素的制藥用途。
背景技術(shù)：
五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.或華中五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的干燥成熟果實(shí)。前者習(xí)稱“北五味子”，后者習(xí)稱“南五味子”。秋季果實(shí)成熟時(shí)采摘，曬干或蒸后曬干，除去果梗及雜質(zhì)。唐等《新修本草》載“五味皮肉甘酸，核中辛苦，都有咸味”，故有五味子之名。五味子分為南、北二種。古醫(yī)書稱它荎蕏、玄及、會(huì)及，最早列于神農(nóng)本草經(jīng)上品中藥，能滋補(bǔ)強(qiáng)壯之力，藥用價(jià)值極高，有強(qiáng)身健體之效，與瓊珍靈芝合用治療失眠。由五味子果仁中可以提取出的一類木脂素類，其中包含了五味子甲素。
在不孕不育的治療中，一半以上患者的病因是男性精子活力不足，精子活力(sperm motility)是指精液中呈前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子所占的百分率。由于只有具有前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子才可能具有正常的生存能力和受精能力，所以活力與雌性受胎率密切相關(guān)，從而它是目前評(píng)定精液品質(zhì)優(yōu)劣的常規(guī)檢查的主要指標(biāo)之一。
目前針對(duì)生精能力的研究持續(xù)展開，但還未發(fā)現(xiàn)一種低毒且高活性的藥物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了五味子甲素在制備生精的組合物中的用途。
本發(fā)明提供了五味子甲素在制備促進(jìn)生精的組合物中的用途。
本發(fā)明提供了五味子甲素在制備促進(jìn)精子生長(zhǎng)的組合物中的用途。
本發(fā)明提供了五味子甲素在制備抑制精子數(shù)量減少的組合物中的用途。
本發(fā)明提供了五味子甲素在制備抑制精子活力減少的組合物中的用途。
本發(fā)明提供了五味子甲素在制備提高精子活力的組合物中的用途。
本發(fā)明提供了五味子甲素在制備提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的組合物中的用途。
本發(fā)明提供了五味子甲素在制備治療少精癥的組合物中的用途。
本發(fā)明提供了五味子甲素在制備治療弱精癥的組合物中的用途。
本發(fā)明提供了五味子甲素在制備提高精子運(yùn)動(dòng)性的組合物中的用途。
本發(fā)明提供了五味子甲素組合物，用于制備食品、保健品、藥品；其用途包括而不限于：提高精子活力、提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖、治療少精癥、治療弱精癥、提高精子運(yùn)動(dòng)性、生精。
本發(fā)明提供了五味子甲素組合物，用于制備食品、保健品、藥品；其劑型包括而不限于：片劑，膠囊，緩釋片，緩釋膠囊，緩釋顆粒、凍干粉、溶液等劑型。
本發(fā)明提供了至少一種高分子聚合物為緩釋骨架材料，優(yōu)選羥丙甲纖維素、羥丙基纖維素、聚氧乙烯、羥乙基纖維素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸共聚物等。
本發(fā)明提供了至少一種藥用輔料作填充劑，優(yōu)選乳糖，甘露醇，微晶纖維素或磷酸氫鈣。
本發(fā)明提供了潤(rùn)滑劑，優(yōu)選硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸。
本發(fā)明提供微粉硅膠作助流劑，
具體實(shí)施方式
本發(fā)明采用的材料和儀器
實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：睪丸間質(zhì)細(xì)胞系(TM3)，購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心。
主要器材：CO2培養(yǎng)箱(NAPCO)；倒置顯微鏡(Olympus)；酶標(biāo)儀(BioRad)。
主要試劑：DMEM/F12高糖培養(yǎng)基(Hyclone)；優(yōu)級(jí)馬血清(TBD21HY，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心提供)；澳洲胎牛血清(GIBICO)；胰酶(Hyclone)；PBS(Hyclone)WST-8(鈕因華信)；DMSO(Sigma)。
實(shí)施例1
睪丸間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和處理
1睪丸間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法
(1)將凍存的TM3細(xì)胞從液氮罐中取出，立即投入到37℃的恒溫箱中水浴，孵育凍存管2-3分鐘，直到完全融化。
(2)在超凈工作臺(tái)內(nèi)打開螺蓋，將TM3細(xì)胞吸入高壓蒸汽滅菌的離心管中，加入2ml DMEM/F12高糖培養(yǎng)基于凍存管，沖洗細(xì)胞并轉(zhuǎn)入離心管中，然后再加入2ml DMEM/F12高糖培養(yǎng)基于離心管中，800rpm離心5分鐘，棄上清，加入3ml培養(yǎng)基，用吸管反復(fù)吹打使細(xì)胞懸浮。
(3)再次在超凈工作臺(tái)內(nèi)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一次性的塑料培養(yǎng)瓶中，然后再加入2ml左右的培養(yǎng)基，輕輕搖晃使細(xì)胞均勻地平鋪培養(yǎng)瓶底部，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃，5％的CO2的條件下培養(yǎng)。次日再換液一次，繼續(xù)培養(yǎng)。
(4)每2-3天換培養(yǎng)基一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合時(shí)，棄除培養(yǎng)液，加入2-3ml的高壓蒸汽滅菌的PBS溶液漂洗細(xì)胞，去除殘留血清及衰老脫落細(xì)胞。
(5)加入0.25％的胰蛋白酶溶液1ml入培養(yǎng)瓶，37℃消化2-5分鐘，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞成片收縮變圓，細(xì)胞間隙變大，大部分細(xì)胞懸浮時(shí)，加入含血清的DMEM/F12高糖培養(yǎng)基2ml終止消化。收集細(xì)胞懸液，然后800rpm離心5分鐘，棄上清。
(6)以4ml的DMEM/F12高糖培養(yǎng)基將離心管內(nèi)的細(xì)胞反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液，然后按1∶2的傳代比例接種到兩個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，再分別補(bǔ)充3ml的DMEM/F12高糖培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。以后每4-5天左右根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況傳代一次。
2、細(xì)胞的凍存
(1)配制凍存液(70％無血清培養(yǎng)基+20％血清+10％DMSO)。
(2)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，倒掉舊培養(yǎng)液，用無菌PBS清洗后加入0.25％胰蛋白酶消化至細(xì)胞從培養(yǎng)皿上脫落。加入含血清培養(yǎng)基終止消化。
(3)800rpm離心5分鐘后，棄去培養(yǎng)基，加入凍存液，制成細(xì)胞懸液(計(jì)數(shù)達(dá)5×106/ml密度)，分裝入凍存管。
(4)4℃，30分鐘，轉(zhuǎn)入-20℃，1-2h，凍存管放入-70℃冰箱(可過夜)。
(5)取出凍存管放入-160℃液氮罐中，操作完畢。
3細(xì)胞培養(yǎng)
(1)睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液：取DMEM/F12培養(yǎng)基47ml，加入馬血清2.5ml，胎牛血清1.25ml后，混勻使用。
(2)細(xì)胞
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化之后按0.8x104重懸細(xì)胞并將細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h，待細(xì)胞鐵壁后。收集未貼壁細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例2
五味子甲素對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力的影響
實(shí)驗(yàn)分為正常組、DMSO組、五味子甲素各劑量組。五味子甲素劑量設(shè)置如下：10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、60μmol/L、80μmol/L。其中五味子甲素以DMSO溶解。
藥物作用24h后，棄上清液，PBS洗細(xì)胞3次，96孔板每孔加入10μl WST-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h后，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。
統(tǒng)計(jì)方法
使用SPSS 20.0軟件對(duì)正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行ONE-WAY ANOVA檢驗(yàn)，均值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
與正常組比較，5‰DMSO可抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖活性(p＜0.05)。與5‰DMSO組相比，五味子甲素10～40μmol/L范圍均可明顯提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞的活力(p＜0.05)。10μmol/L劑量時(shí)，與5‰DMSO組比較有顯著差異(p＜0.001)，且與正常組比較亦有顯著差異(p＜0.001)。五味子甲素劑量在50μmol/L以上可顯著降低睪丸間質(zhì)細(xì)胞的活性(p＜0.01)。
實(shí)施例3
少弱精子癥模型大鼠的建立
將造模大鼠用環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CP)35mg/kg進(jìn)行腹腔注射，每天一次，連續(xù)5天，造成少弱精子癥大鼠模型。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥：SD大鼠70只，隨機(jī)分為7組，即正常組1組、模型組1組、五味子甲素高中低劑量3組，五子衍宗丸對(duì)照組1組和左卡尼汀對(duì)照組1組，每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天。
正常組(NS)：用生理鹽水代替CP等量腹腔注射5天，從第6天起給予生理鹽水進(jìn)行灌胃。連續(xù)灌胃2周。
模型組(CP)：用CP 35mg/kg給予腹腔注射5天，自第6天起采用生理鹽水進(jìn)行灌胃。連續(xù)灌胃2周。
五味子甲素組(WWZJS)：分為高中低三個(gè)劑量組。用CP35mg/kg給予腹腔注射5天，自第6天起分別予五味子甲素(1％羧甲基纖維素鈉溶解)1.24g/kg·d、0.62g/kg·d、0.31g/kg·d進(jìn)行灌胃。連續(xù)灌胃2周。
左卡尼汀組(Levocarnitine)：用CP 35mg/kg給予腹腔注射5天，自第6天起予左卡尼汀2.1ml/kg·d進(jìn)行灌胃。連續(xù)灌胃2周。
灌胃期間，每5天為大鼠稱重一次，根據(jù)最新體重調(diào)整灌胃劑量，每天觀察并記錄各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的精神狀態(tài)，活動(dòng)程度，毛色及皮膚變化，排泄情況等。
實(shí)施例4
實(shí)驗(yàn)大鼠取材
所有大鼠最后一次給藥24h后，先用摘兩側(cè)眼球的方法，取靜脈血，取血后麻醉處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，迅速摘取睪丸、附睪，以備實(shí)驗(yàn)之用。2.3.1血清制備及檢測(cè)
將取得的靜脈血，靜置一小時(shí)后離心，吸取析出的血清，凍存于-80℃冰箱備用。實(shí)施例5睪丸、附睪及精子的獲取
實(shí)驗(yàn)大鼠取血后用10％水合氯醛，0.3ml/100g予腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈抽血處死大鼠，迅速摘取睪丸及附睪。
根據(jù)參考文獻(xiàn)方法稍加改進(jìn)，應(yīng)用擴(kuò)散法收集附睪尾精子。給藥結(jié)束后處死動(dòng)物，取附睪尾部放入3m137℃生理鹽水(需要提前預(yù)熱)中，剪碎，放置1分鐘，取50μl精子混懸液，加入ImlM199中，37℃恒溫水浴5分鐘，取13μl加到預(yù)溫的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板用于精子質(zhì)量分析。
實(shí)施例5
精液質(zhì)量分析
采用WL-9000型精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)(CASA)，測(cè)試溫度37℃，將經(jīng)處理的精子混懸液涂于計(jì)數(shù)板上，選取5個(gè)視野，于2min內(nèi)完成測(cè)試。主要測(cè)試指標(biāo)：精子密度(×106/ml)、精子活力(％)、精子活率(％)、A級(jí)精子、B級(jí)精子。
統(tǒng)計(jì)方法
使用SPSS20.0軟件對(duì)正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行ONE-WAY ANOVA檢驗(yàn)，均值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.大鼠的基本情況
造模完成至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，CP組至第10天，體重增加不明顯，精神狀況不佳，第10天以后，體重略有增加，體毛光澤度增加，活動(dòng)狀況改善，但較其他組整體狀況差。其余各組，從第8天開始，大鼠體重增加，體毛出現(xiàn)光澤，活動(dòng)逐漸增加，出現(xiàn)打斗的現(xiàn)象。
2.大鼠睪丸及附睪指數(shù)
經(jīng)藥物干預(yù)后，睪丸、附睪指數(shù)差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與干預(yù)時(shí)間短，大鼠自愈能力有關(guān)。(見表1)
表1睪丸、附睪指數(shù)
注：與NS組比較：＊P＜0.05；與CP組比較：#P＜0.05。
3.a級(jí)、b級(jí)精子及精子密度
造模后CP組大鼠a、b級(jí)精子以及精子密度均明顯減少，其中b級(jí)精子、精子密度與NS組相比有明顯差異(P＜0.05)，說明造模成功。給藥干預(yù)后，精子活力及密度均有不同程度的改善。其中WWZJS高劑量組a、b級(jí)精子以及精子密度與CP組比較無顯著差異(P＞0.05)，但從其均值來看，仍有改善的趨勢(shì)；WWZJS中劑量組、WWZJS低劑量組的a級(jí)、b級(jí)精子與CP組比較有明顯差異(P＜0.05)，精子密度與CP組比較無顯著差異(P＞0.05)，但有改善趨勢(shì)。Levocarnitine組b級(jí)精子與CP組比較有顯著性差異(P＜0.05)。(如表2)
表2各組a級(jí)精子、b級(jí)精子、精子密度檢測(cè)值
注：與NS組比較：＊P＜0.05；與CP組比較：#P＜0.05。
4.精力活力與活率
從表中可以看出，造模后CP組大鼠精子活力和活率均明顯下降，與正常組比較有明顯差異(P＜0.05)，說明造模成功；給藥干預(yù)后，各組精子活力和活率均有不同程度改善，與CP組比較，WWZJS中劑量組、WWZJS低劑量組精子活力和活率明顯高于CP組(P＜0.05)；WWZJS高劑量組、Levocarnitine組與CP組比較無明顯差異(P＞0.05)，但有改善的趨向。(如表3)
表3各組精子活力、精子活率結(jié)果
注：與NS組比較：＊P＜0.05；與CP組比較：#P＜0.05。
5結(jié)論
CP造模后，CP組大鼠精子密度、活力和活率均較NS組大鼠顯著下降，說明制備大鼠少弱精子癥模型成功。經(jīng)五味子甲素治療后，中劑量組和低劑量組大鼠精子活力和活率均有不同程度的改善，與CP組比較有明顯差異，高劑量組雖然無明顯差異，但仍有改善趨勢(shì)，說明五味子甲素能明顯改善并恢復(fù)少弱精癥模型大鼠的精子質(zhì)量。
實(shí)施例6
本發(fā)明涉及一種五味子甲素組合物，由如下組分組成：五味子甲素與生理鹽水；五味子甲素的含量是0.1μM，1μM，10μM，20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、80μM。
實(shí)施例7
本發(fā)明涉及一種五味子甲素組合物，由如下組分組成：五味子甲素與DMSO；五味子甲素的含量是0.1μM，1μM，10μM，20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、80μM。
實(shí)施例8
本發(fā)明涉及一種五味子甲素組合物，由如下組分制備而成：五味子甲素(1mg)、羧甲基纖維素鈉(100mg)：
其制備方法包括如下步驟中任一：
五味子甲素、羧甲基纖維素鈉，加入適量注射用水溶解。
五味子甲素、羧甲基纖維素鈉，加入適量注射用水溶解，在冷凍干燥機(jī)中凍干。
實(shí)施例9
本發(fā)明涉及一種五味子甲素組合物，由如下組分組成：五味子甲素(1mg)、羧甲基纖維素鈉(100mg)、乳糖(250mg)、海藻糖(210mg)。
其制備方法包括如下步驟：
五味子甲素、羧甲基纖維素鈉，加入適量注射用水溶解，接著加入乳糖、海藻糖，所得混合物再次混合直至溶解，在冷凍干燥機(jī)中凍干。
實(shí)施例10
本發(fā)明涉及一種五味子甲素組合物，由如下組分組成：五味子甲素(1mg)、羧甲基纖維素鈉(100mg)、乳糖(250mg)、海藻糖(210mg)、半胱氨酸(4mg)。
其制備方法包括如下步驟：
五味子甲素、羧甲基纖維素鈉，加入適量注射用水溶解，接著加入乳糖、海藻糖、半胱氨酸，所得混合物再次混合直至溶解，在冷凍干燥機(jī)中凍干。
實(shí)施例11
本發(fā)明涉及一種五味子甲素組合物，由如下組分組成：五味子甲素(1mg)、聚維酮(150mg)、乙基纖維素(30mg)、微晶纖維素微丸(100mg)、歐巴代(20mg)
其制備方法包括如下步驟：
1)五味子甲素和聚維酮采用50％乙醇溶劑進(jìn)行溶解，包裹于微晶纖維素微丸丸芯表面，
2)采用乙基纖維素水分散體進(jìn)行微丸包衣，
3)將歐巴代加水配置成8％濃度的水溶液，作為隔離層包裹于微丸表面，
4)微丸灌裝膠囊。
實(shí)施例12
本發(fā)明涉及一種五味子甲素組合物，由如下組分組成：五味子甲素(1mg)、聚維酮(150mg)、乙基纖維素(30mg)、乳糖(100mg)、羧甲基淀粉鈉(20mg)、硬脂酸鎂(5mg)
其制備方法包括如下步驟：
制備工藝：將主藥和除硬脂酸鎂之外的輔料混合均勻，以80％乙醇制軟材，200目制粒，60℃干燥，加入硬脂酸鎂，壓片。
實(shí)施例13
實(shí)施例6-12的一種五味子甲素組合物的如下用途：
在制備生精的組合物中的用途。
在制備促進(jìn)生精的組合物中的用途。
在制備促進(jìn)精子生長(zhǎng)的組合物中的用途。
在制備抑制精子數(shù)量減少的組合物中的用途。
在制備抑制精子活力減少的組合物中的用途。
在制備提高精子活力的組合物中的用途。
在制備提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的組合物中的用途。
在制備治療少精癥的組合物中的用途。
在制備治療弱精癥的組合物中的用途。
在制備提高精子運(yùn)動(dòng)性的組合物中的用途。
本發(fā)明提供了五味子甲素組合物，用于制備食品、保健品、藥品；其用途包括而不限于：提高精子活力、提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖、治療少精癥、治療弱精癥、提高精子運(yùn)動(dòng)性、生精。