本發(fā)明涉及一種新型納米診療劑，尤其涉及一種用于銅離子熒光檢測(cè)與藥物治療功能一體化的新型納米診療劑。

背景技術(shù)：

銅是人體內(nèi)一種必需的微量元素，過(guò)量攝入銅會(huì)使人體神經(jīng)系統(tǒng)受損，出現(xiàn)記憶力減退、注意力分散和情緒不穩(wěn)定等癥狀。因此，明確生理過(guò)程及細(xì)胞中銅的分布情況對(duì)于研究銅的復(fù)雜生理功能具有重要意義。所以，開發(fā)銅離子分析檢測(cè)技術(shù)是極為重要。

目前檢測(cè)Cu²⁺的方法主要有原子吸收法、比色法、熒光淬滅法等，但是以上方法有的需要大型儀器，有的需要專業(yè)人員，有的檢出限較高。常用的探針材料主要有：有機(jī)分子熒光探針、量子點(diǎn)等，但是它們存在以下缺點(diǎn)：(1)為了提高選擇性大多數(shù)銅離子探針在有機(jī)溶劑中或含有機(jī)溶劑的組分中檢測(cè)，水溶性差，無(wú)法在純水相環(huán)境或者細(xì)胞體系中得到應(yīng)用。(2)檢測(cè)不靈敏、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、不能迅速檢測(cè)等缺點(diǎn)。(3)所用探針的激發(fā)光位于紫外或者可見光區(qū)等高能量區(qū)，對(duì)細(xì)胞殺傷性大，同時(shí)生物自發(fā)熒光強(qiáng)。因此，設(shè)計(jì)合成生物毒性低、水溶性好可用于活細(xì)胞內(nèi)銅離子熒光成像探針具有重要意義。

化療也是治療腫瘤等疾病的常用方法。阿霉素(DOX)為一種蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，為細(xì)胞周期非特異性藥，其作用機(jī)制主要是阿霉素分子嵌入DNA而抑制核酸的合成，主要用于治療急性白血病、惡性淋巴瘤、肝癌、肺癌、胃癌、甲狀腺癌和神經(jīng)母細(xì)胞癌等。但是化學(xué)治療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p傷。同時(shí)，單一的藥物治療存在診斷和治療相互獨(dú)立，兩次用藥不僅延長(zhǎng)了治療周期，更增加了治療風(fēng)險(xiǎn)和患者的痛苦，也不易到達(dá)病變部位。因此，如何準(zhǔn)確有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥的早期診斷,并對(duì)病變部位進(jìn)行有效治療,是癌癥治療發(fā)展的新方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于銅離子熒光檢測(cè)與藥物治療功能一體化的新型納米診療劑及其制備方法，具有高靈敏度、高選擇性、背景熒光影響小，同時(shí)可用于銅離子熒光檢測(cè)，具有治療功能一體化的功能。

本發(fā)明為達(dá)到上述目的所采用的技術(shù)方案是：

一種用于銅離子熒光檢測(cè)與藥物治療功能一體化的新型納米診療劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)將具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(UCNPs)分散在環(huán)己烷溶液中，得到溶液A；

(2)利用反向膠束法將核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米晶進(jìn)行介孔二氧化硅包覆，先將混合溶液A與CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)反應(yīng)、再加入TEOS(四乙氧基硅烷)、NaOH、和乙醇，在50～80℃下反應(yīng)，冷卻后加入硝酸銨，再升溫至50～80℃，冷卻、離心、洗滌后得到水溶性的硅羥基化的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶，即UCNPs@mSiO₂；

(3)惰性氣氛下，將UCNPs@mSiO₂溶于甲苯中并升溫至80～95℃時(shí)，加入20μL的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基異氰酸酯，升溫至90-110℃，保持24h，冷卻，即制得表面異氰酸酯基功能化的UCNPs@mSiO₂納米晶的甲苯溶液，記為混合溶液B；

(4)往混合溶液B中加入用于單一檢測(cè)銅離子的含氨基的羅丹明B衍生物DFPP-NH₂，加熱至110℃，保持24h，冷卻，離心，用乙醇洗滌，制得銅離子檢測(cè)的增強(qiáng)型熒光探針UCNPs@mSiO₂-P。

(5)將步驟(4)得到的UCNPs@mSiO₂-P與藥物分子DOX(阿霉素)溶于去離子水中，室溫?cái)嚢?2～24小時(shí)，將所得到的混合物C離心，用去離子水洗至上清液無(wú)色，即得到納米診療劑UCNPs@mSiO₂-P-DOX。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在所述步驟(1)中，所述具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(UCNPs)環(huán)己烷分散液的制備方法采用溶劑熱法，具體包括以下步驟：

(1.1)預(yù)備混合鑭系金屬氯化物、油酸、十八烯、NaOH、NH₄F₄、丙酮、環(huán)己烷和甲醇，再預(yù)備GdCl₃或YCl₃；

(1.2)將混合鑭系金屬氯化物在100～130℃下除水，直至混合鑭系金屬氯化物變成白色固體，再加入油酸，加熱至130～160℃，固體溶解，稍冷卻，加入十八烯，升溫至140～160℃后立即停止加熱，冷卻至60℃以下，得到混合溶液A1；

(1.3)將NaOH和NH₄F₄溶于甲醇中，超聲溶解，加入混合溶液A1中，加熱至100～130℃除甲醇，抽真空0.5h，在氬氣氛圍中升溫至260～330℃，維持0.5～3h，之后在氬氣氛圍中冷卻，得到混合溶液A2；

(1.4)在混合溶液A2中加入丙酮，離心取固體，再加入環(huán)己烷，離心取上清液，重復(fù)一遍，最后溶解在環(huán)己烷中，得到混合溶液A3；

(1.5)取GdCl₃或YCl₃升溫至100-130℃，直至變成白色粉末狀，加入油酸，加熱至130-150℃，稍冷卻，加入十八烯，升溫至150℃后立即停止加熱，冷卻至60℃以下，得到混合溶液A4；

(1.6)將混合溶液A3加入混合溶液A4中，升溫至80-100℃，維持0.5-2h，在降溫至60℃以下，得到混合溶液A5；

(1.7)將NaOH和NH₄F₄溶于甲醇中，超聲溶解，加入混合溶液A5中，加熱至100-120℃除甲醇，抽真空0.5-2h，在氬氣氛圍中升溫至280-330℃，維持0.5-2h，之后在氬氣氛圍中冷卻，得到混合溶液A6；

(1.8)往混合溶液A6加入丙酮，離心取固體，再加入環(huán)己烷，離心取上清液，重復(fù)一遍，最后溶解于環(huán)己烷中，得到具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶環(huán)己烷分散液。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在所述步驟(1.1)中，所述混合鑭系金屬氯化物為YCl₃、YbCl₃與ErCl₃的組合，YCl₃、YbCl₃與TmCl₃的組合，YCl₃、YbCl₃、ErCl₃、與GdCl₃的組合之一。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，，在所述步驟(2)中，UCNPs、CTAB與TEOS的質(zhì)量體積比為(10mg-15mg):100mg:400μL。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟(3)中UCNPs@mSiO₂納米晶與甲苯的質(zhì)量體積之比為：(2-4)mg:1mL。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，在所述步驟(4)中，單一檢測(cè)銅離子的含氨基的羅丹明B衍生物DFPP-NH₂與混合溶液B的質(zhì)量體積之比為：(1-2.5)mg:1mL。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟(5)中UCNPs@mSiO₂-P與DOX的質(zhì)量比為：(5-12):1。

一種用于銅離子熒光檢測(cè)與藥物治療功能一體化的新型納米診療劑，該新型納米診療劑的能量給體與能量受體通過(guò)共價(jià)鍵相互作用結(jié)合為一體，所述能量給體為一端帶有-N＝C＝O基團(tuán)且具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(UCNPs)，所述能量受體為用于單一檢測(cè)銅離子的用于單一檢測(cè)銅離子的羅丹明B衍生物(DFPP-RhB，標(biāo)記為P)，所述UCNPs外表面還裝載有介孔二氧化硅(mSiO₂)作為藥物負(fù)載的通道。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶為NaYF₄:Yb,Er@Na YF₄、NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄、NaYF₄:Yb,Er@NaGdF₄NaYF₄:Yb,Er@NaGd F₄:Yb,Er、NaYF₄:Yb,Tm@NaYF₄與NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄中任一種。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶與探針P的質(zhì)量比為：(0.8-2):1。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的面羧基化率為：30％～70％。

本發(fā)明的有益效果為：

(1)通過(guò)優(yōu)化材料，以稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶作為能量給體構(gòu)筑的納米熒光探針，其激發(fā)光源位于近紅外光區(qū)的980nm，有效避免了高能量光的光損傷及生物背景熒光強(qiáng)的缺點(diǎn)；

(2)納米熒光探針對(duì)銅離子熒光檢測(cè)靈敏度高，選擇性強(qiáng)，可單一檢測(cè)銅離子；

(3)通過(guò)同時(shí)將藥物與熒光探針負(fù)載在體系中，可實(shí)現(xiàn)快速診斷快速治療的功能，避免了單一藥物治療的缺點(diǎn)。

上述是發(fā)明技術(shù)方案的概述，以下結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中NaYF₄:Yb,Er(a)；NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄(b)；NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂(c)；UCNPs@mSiO₂-P(d)；NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P-DOX(e)的TEM圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中納米探針NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P加入不同金屬離子后的紫外可見吸收光譜圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中納米探針NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P加入不同濃度的銅離子后的紫外可見吸收光譜圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中納米探針NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P加入不同濃度的銅離子后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。

具體實(shí)施方式

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)到預(yù)定目的所采取的技術(shù)手段及功效，以下結(jié)合附圖及較佳實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供NaYF₄:Yb,Er@NaGdF₄@mSiO₂-P-DOX及其合成方法，其包括以下步驟：

一種用于銅離子熒光檢測(cè)與藥物治療功能一體化的新型納米診療劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)將具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄)溶于環(huán)己烷溶液中，得到溶液A；

其中，所述具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄)環(huán)己烷分散液的制備方法采用溶劑熱法，具體包括以下步驟：

(1.1)1M YCl₃、1M YbCl₃、0.1M ErCl₃、1M GdCl₃、2.5-3.75ml油酸、6～8ml十八烯、0.05～0.08g NaOH、0.05～0.1g NH₄F₄、20～25ml丙酮、15～20ml環(huán)己烷和20～25ml甲醇；

(1.2)分別取390μL的YCl₃、100μL YbCl₃、100μL ErCl₃在110℃下除水，直至其變成白色固體，再加入3ml油酸，加熱至150℃，固體溶解，稍冷卻，加入7.5L十八烯，升溫至150℃后立即停止加熱，冷卻至60℃以下，得到混合溶液A1；

(1.3)將0.05gNaOH和0.075gNH₄F₄溶于5ml甲醇中，超聲溶解，加入混合溶液A1中，加熱至110℃除甲醇，抽真空0.5h，在氬氣氛圍中升溫至300℃，維持1h，之后在氬氣氛圍中冷卻，得到混合溶液A2；

(1.4)在混合溶液A2中加入約10ml丙酮，離心取固體，再加入10ml環(huán)己烷，離心取上清液，重復(fù)一遍，最后溶解在5ml環(huán)己烷中，得到混合溶液A3；

(1.5)取200μL GdCl₃升溫至110℃，直至變成白色粉末狀，加入3ml油酸，加熱至150℃，稍冷卻，加入7.5L十八烯，升溫至150℃后立即停止加熱，冷卻至60℃以下，得到混合溶液A4；

(1.6)將混合溶液A3加入混合溶液A4中，升溫至90℃，維持0.5h，在降溫至60℃以下，得到混合溶液A5；

(1.7)將0.01685gNaOH和0.00093gNH₄F₄溶于20ml的甲醇中，超聲溶解，加入混合溶液A5中，加熱至110℃除甲醇，抽真空0.5h，在氬氣氛圍中升溫至300℃，維持1h，之后在氬氣氛圍中冷卻，得到混合溶液A6；

(1.8)往混合溶液A6加入10ml丙酮，離心取固體，再加入10ml環(huán)己烷，離心取上清液，重復(fù)一遍，最后溶解于環(huán)己烷中，得到具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄)環(huán)己烷分散液。

(2)利用反向膠束法將核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米晶進(jìn)行介孔二氧化硅包覆，先將將混合溶液A與CTAB反應(yīng)、再加入TEOS、NaOH、和乙醇，在70℃下反應(yīng)，冷卻后加入硝酸銨，再升溫至60℃，冷卻、離心、洗滌后得到水溶性的硅羥基化的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶，即NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂，具體步驟為：

(2.1)預(yù)備含NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄量為10mg的混合溶液A、0.1g CTAB、400μL TEOS、300μL 2M NaOH、150ml乙醇、1.2g硝酸銨；

(2.2)將0.1g CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)溶于20ml去離子水中，加入步驟(1)預(yù)備的混合溶液A，徹夜攪拌，得到澄清透明的CTAB-NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄溶液；

(2.3)將步驟(2.2)所得的CTAB-NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄溶液中加入40ml去離子水、6ml乙醇、300μL 2M NaOH，升溫至70℃，加入400μL TEOS(四乙氧基硅烷)，保持120min。冷卻，離心洗滌，溶于20ml乙醇中；

(2.4)將1.2g硝酸銨溶于40ml乙醇中；

(2.5)將步驟(2.3)所得的溶液中加入(2.4)的硝酸銨乙醇溶液，在加乙醇至150ml，加熱至60℃，維持10min，冷卻，離心洗滌，得到水溶性的硅羥基化的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶，即NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂納米晶。

(3)將硅羥基化的上轉(zhuǎn)換納米晶即NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂與一端帶有硅羥基的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基異氰酸酯進(jìn)行水解，制備一端含有異氰酸酯基的納米晶，作為納米探針的能量給體，具體步驟為：

(3.1)預(yù)備上述步驟(2.5)制備的NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂納米晶40mg、20ml甲苯，20μL 3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基異氰酸酯；

(3.2)將預(yù)備上述步驟(2.5)制備的NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂納米晶與甲苯按照質(zhì)量體積比為：2mg:1ml將納米晶溶于甲苯中，惰性氣氛下，當(dāng)溫度上升至85℃時(shí)，加入20μL的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基異氰酸酯，升溫至110℃，保持24h，冷卻，即制得表面異氰酸酯基功能化的NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂納米晶的甲苯溶液，記為混合溶液B。

(4)將能量給體與一端帶有氨基的能量受體染料分子進(jìn)行共價(jià)鍵鍵合，構(gòu)筑含一對(duì)能量給體與能量受體，并可有效發(fā)生能量傳遞的納米探針，即制備NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P，具體步驟為：

(4.1)預(yù)備含有表面異氰酸酯基功能化的NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂納米晶40mg的混合溶液B，50mg DFPP-NH₂；

(4.2)往混合溶液B中加入單一檢測(cè)銅離子的含氨基的羅丹明B衍生物DFPP-NH₂，其中，步驟(3.2)所得納米晶與DFPP-NH₂質(zhì)量比為：0.8:1，即單一檢測(cè)銅離子的含氨基的羅丹明B衍生物DFPP-NH₂與混合溶液B的質(zhì)量體積之比為：2.5mg:1ml，加熱至110℃，保持24h，冷卻、離心，用乙醇洗滌，即制得銅離子檢測(cè)的增強(qiáng)型熒光探針NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P。

(5)將藥物分子與介孔二氧化硅通過(guò)靜電作用和氫鍵，將藥物分子負(fù)載在介孔二氧化硅孔道里，并在酸性條件下可有效發(fā)生藥物的釋放，即制備診療功能一體化的納米診療劑NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P-DOX，具體步驟為：

(5.1)預(yù)備上述步驟(4.2)制備的NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P 30mg，1mg/mL的DOX水溶液2.5ml，5～6ml的去離子水；

(5.2)將預(yù)備的NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P納米晶與DOX按照質(zhì)量比12:1的比例溶于5～6mL去離子水中，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，將所得到的混合物C離心，用去離子水洗至上清液無(wú)色，最終得到用于銅離子熒光檢測(cè)并同時(shí)實(shí)現(xiàn)藥物治療功能一體化的新型納米診療劑NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P-DOX。

一種用于銅離子熒光檢測(cè)與藥物治療功能一體化的新型納米診療劑，該新型納米診療劑的能量給體與能量受體通過(guò)共價(jià)鍵相互作用結(jié)合為一體，所述能量給體為一端帶有-N＝C＝O基團(tuán)且具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(UCNPs)，所述能量受體為用于單一檢測(cè)銅離子的羅丹明B衍生物(DFPP-RhB，標(biāo)記為P)，所述UCNPs外表面還裝載有介孔二氧化硅(mSiO₂)作為藥物負(fù)載的通道。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶為NaYF₄:Yb,Er@Na YF₄。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的面羧基化率為：30％～70％。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中NaYF₄:Yb,Er(a)；NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄(b)；Na YF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂(c)；UCNPs@mSiO₂-P(d)；NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P-DOX(e)的TEM圖。

從圖中可以看出，所合成的NaYF₄:Yb,Er納米粒子形貌規(guī)整，粒徑均一，分散性好，粒徑大小在28nm；NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂粒徑大小在32nm。包上介孔的UCNPs@mSiO₂、鍵合探針P后的NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P及負(fù)載藥物DOX的NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P-DOX納米粒子粒徑變?yōu)?0-80nm,有著良好的單分散性,甚至內(nèi)部的孔道清晰可見。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中納米探針NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P加入不同金屬離子后的紫外可見吸收光譜圖，其包括以下步驟：

(1)用去離子水配制各種金屬離子的濃溶液(0.1M)。

(2)預(yù)備納米探針NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P濃溶液，然后用去離子水稀釋。

(3)取各種金屬離子的濃溶液分別加入到2.0mL納米探針NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P的溶液中，停留3～5min然后進(jìn)行光譜測(cè)試，結(jié)果如圖2所示。

從圖中可以看出，加入其他金屬離子后紫外可見吸收光譜未曾有明顯變化，只有溶液中加入銅離子后，NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P的紫外可見吸收光譜圖在556nm附近處具有強(qiáng)的吸收峰，說(shuō)明本發(fā)明所制備的納米探針能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)銅離子的專一性識(shí)別。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中納米探針NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P加入不同濃度的銅離子后的紫外可見吸收光譜圖，其包括以下步驟：

(1)預(yù)備納米探針NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P，然后用去離子水稀釋。

(2)滴定實(shí)驗(yàn)中，用移液管吸取2.0mL納米探針NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P置于1.0cm×1.0cm石英比色皿中，用微量進(jìn)樣器向此溶液中逐滴加入銅離子后，室溫下攪拌3～5min然后進(jìn)行光譜測(cè)試，結(jié)果如圖3所示。

從圖中可以看出，隨著銅離子濃度的增加，NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P的紫外可見吸收光譜在556nm吸收強(qiáng)度增強(qiáng)，說(shuō)明NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P探針P在Cu²⁺存在下，Cu²⁺與螺環(huán)螯合導(dǎo)致其開環(huán)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)銅離子的高靈敏度檢測(cè)。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中納米探針NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P加入不同濃度的銅離子后在980nm激發(fā)光照射下的上轉(zhuǎn)換熒光光譜圖。其包括以下步驟：

(1)預(yù)備納米探針NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P，然后用去離子水稀釋。

(2)滴定實(shí)驗(yàn)中，用移液管吸取2.0mL納米探針NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P置于1.0cm×1.0cm石英比色皿中，用微量進(jìn)樣器向此溶液中逐滴加入銅離子后，室溫下攪拌3～5min然后進(jìn)行光譜測(cè)試，結(jié)果如圖4所示。

從圖中可以看出，隨著銅離子濃度的增加，NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P的熒光光譜在545nm及660nm附近的熒光呈線性下降，說(shuō)明NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P探針P在Cu²⁺存在下，通過(guò)Cu²⁺與螺環(huán)螯合導(dǎo)致其開環(huán)，能量傳遞過(guò)程加速，造成上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的熒光下降，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)銅離子的高靈敏度檢測(cè)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄@mSiO₂-P-DOX及其合成方法，其包括以下步驟：

一種用于銅離子熒光檢測(cè)與藥物治療功能一體化的新型納米診療劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)將具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄)分散在環(huán)己烷溶液中，得到溶液A；

其中，所述具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄)環(huán)己烷分散液的制備方法采用溶劑熱法，具體包括以下步驟：

(1.1)1M YCl₃、1M YbCl₃、0.1M TmCl₃、1M GdCl₃、2.5-3.75ml油酸、6～8ml十八烯、0.05～0.08g NaOH、0.05～0.1g NH₄F₄、20～25ml丙酮、15～20ml環(huán)己烷和20～25ml甲醇；

(1.2)分別取390μL的YCl₃、100μL YbCl₃、100μL TmCl₃在100℃下除水，直至其變成白色固體，再加入3ml油酸，加熱至130℃，固體溶解，稍冷卻，加入7.5L十八烯，升溫至140℃后立即停止加熱，冷卻至60℃以下，得到混合溶液A1；

(1.3)將0.05gNaOH和0.075gNH₄F₄溶于5ml甲醇中，超聲溶解，加入混合溶液A1中，加熱至100℃除甲醇，抽真空0.5h，在氬氣氛圍中升溫至260℃，維持3h，之后在氬氣氛圍中冷卻，得到混合溶液A2；

(1.4)在混合溶液A2中加入約10ml丙酮，離心取固體，再加入10ml環(huán)己烷，離心取上清液，重復(fù)一遍，最后溶解在5ml環(huán)己烷中，得到混合溶液A3；

(1.5)取200μL GdCl₃升溫至100℃，直至變成白色粉末狀，加入3ml油酸，加熱至140℃，稍冷卻，加入7.5L十八烯，升溫至150℃后立即停止加熱，冷卻至60℃以下，得到混合溶液A4；

(1.6)將混合溶液A3加入混合溶液A4中，升溫至80℃，維持2h，在降溫至60℃以下，得到混合溶液A5；

(1.7)將0.01685gNaOH和0.00093gNH₄F₄溶于20ml的甲醇中，超聲溶解，加入混合溶液A5中，加熱至100℃除甲醇，抽真空2h，在氬氣氛圍中升溫至280℃，維持2h，之后在氬氣氛圍中冷卻，得到混合溶液A6；

(1.8)往混合溶液A6加入10ml丙酮，離心取固體，再加入10ml環(huán)己烷，離心取上清液，重復(fù)一遍，最后溶解于環(huán)己烷中，得到具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄)環(huán)己烷分散液。

(2)利用反向膠束法將核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米晶進(jìn)行介孔二氧化硅包覆，先將將混合溶液A與CTAB反應(yīng)、再加入TEOS、NaOH、和乙醇，在70℃下反應(yīng)，冷卻后加入硝酸銨，再升溫至60℃，冷卻、離心、洗滌后得到水溶性的硅羥基化的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶，即NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂，具體步驟為：

(2.1)預(yù)備含NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄量為15mg的混合溶液A、0.1g CTAB、400μL TEOS、300μL 2M NaOH、150ml乙醇、1.2g硝酸銨；

(2.2)將0.1g CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)溶于20ml去離子水中，加入步驟(1)預(yù)備的混合溶液A，徹夜攪拌，得到澄清透明的CTAB-NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄溶液；

(2.3)將步驟(2.2)所得的CTAB-NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄溶液中加入40ml去離子水、6ml乙醇、300μL 2M NaOH，升溫至50℃，加入400μL TEOS(四乙氧基硅烷)，保持120min。冷卻，離心洗滌，溶于20ml乙醇中；

(2.4)將1.2g硝酸銨溶于40ml乙醇中；

(2.5)將步驟(2.3)所得的溶液中加入(2.4)的硝酸銨乙醇溶液，在加乙醇至150ml，加熱至50℃，維持10min，冷卻，離心洗滌，得到水溶性的硅羥基化的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶，即NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄@mSiO₂納米晶。

(3)將硅羥基化的上轉(zhuǎn)換納米晶即NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄@mSiO₂與一端帶有硅羥基的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基異氰酸酯進(jìn)行水解，制備一端含有異氰酸酯基的納米晶，作為納米探針的能量給體，具體步驟為：

(3.1)預(yù)備上述步驟(2.5)制備的NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄@mSiO₂納米晶40mg、10ml甲苯，20μL 3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基異氰酸酯；

(3.2)將預(yù)備上述步驟(2.5)制備的NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄@mSiO₂納米晶與甲苯按照質(zhì)量體積比為：4mg:1ml將納米晶溶于甲苯中，惰性氣氛下，當(dāng)溫度上升至80℃時(shí)，加入20μL的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基異氰酸酯，升溫至90℃，保持24h，冷卻，即制得表面異氰酸酯基功能化的NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄@mSiO₂納米晶的甲苯溶液，記為混合溶液B。

(4)將能量給體與一端帶有氨基的能量受體染料分子進(jìn)行共價(jià)鍵鍵合，構(gòu)筑含一對(duì)能量給體與能量受體，并可有效發(fā)生能量傳遞的納米探針，即制備NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄@mSiO₂-P，具體步驟為：

(4.1)預(yù)備含有表面異氰酸酯基功能化的NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄@mSiO₂納米晶40mg的混合溶液B，50mg DFPP-NH₂；

(4.2)往混合溶液B中加入單一檢測(cè)銅離子的含氨基的羅丹明B衍生物DFPP-NH₂，其中，步驟(3.2)所得納米晶與DFPP-NH₂質(zhì)量比為：2:1，即單一檢測(cè)銅離子的含氨基的羅丹明B衍生物DFPP-NH₂與混合溶液B的質(zhì)量體積之比為：2mg:1ml，加熱至110℃，保持24h，冷卻、離心，用乙醇洗滌，即制得銅離子檢測(cè)的增強(qiáng)型熒光探針NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄@mSiO₂-P。

(5)將藥物分子與介孔二氧化硅通過(guò)靜電作用和氫鍵，將藥物分子負(fù)載在介孔二氧化硅孔道里，并在酸性條件下可有效發(fā)生藥物的釋放，即制備診療功能一體化的納米診療劑NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄@mSiO₂-P-DOX，具體步驟為：

(5.1)預(yù)備上述步驟(4.2)制備的NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄@mSiO₂-P30mg，1mg/mL的DOX水溶液6ml，5～6ml的去離子水；

(5.2)將預(yù)備的NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄@mSiO₂-P納米晶與DOX按照質(zhì)量比5:1的比例溶于5～6mL去離子水中，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，將所得到的混合物C離心，用去離子水洗至上清液無(wú)色，最終得到用于銅離子熒光檢測(cè)并同時(shí)實(shí)現(xiàn)藥物治療功能一體化的新型納米診療劑NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄@mSiO₂-P-DOX。

一種用于銅離子熒光檢測(cè)與藥物治療功能一體化的新型納米診療劑，該新型納米診療劑的能量給體與能量受體通過(guò)共價(jià)鍵相互作用結(jié)合為一體，所述能量給體為一端帶有-N＝C＝O基團(tuán)且具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(UCNPs)，所述能量受體為用于單一檢測(cè)銅離子的羅丹明B衍生物(DFPP-RhB，標(biāo)記為P)，所述UCNPs外表面還裝載有介孔二氧化硅(mSiO₂)作為藥物負(fù)載的通道。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶為NaYF₄:Yb,Tm@Na GdF₄。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的面羧基化率為：30％～70％。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P-DOX及其合成方法，其包括以下步驟：

一種用于銅離子熒光檢測(cè)與藥物治療功能一體化的新型納米診療劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)將具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄)分散在環(huán)己烷溶液中，得到溶液A；

其中，所述具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄)環(huán)己烷分散液的制備方法采用溶劑熱法，具體包括以下步驟：

(1.1)1M YCl₃、1M YbCl₃、0.1M ErCl₃、1M GdCl₃、2.5-3.75ml油酸、6～8ml十八烯、0.05～0.08g NaOH、0.05～0.1g NH₄F₄、20～25ml丙酮、15～20ml環(huán)己烷和20～25ml甲醇；

(1.2)分別取275μL的YCl₃、100μL YbCl₃、100μL ErCl₃、125μL GdCl₃在130℃下除水，直至其變成白色固體，再加入3ml油酸，加熱至160℃，固體溶解，稍冷卻，加入7.5L十八烯，升溫至160℃后立即停止加熱，冷卻至60℃以下，得到混合溶液A1；

(1.3)將0.05gNaOH和0.075gNH₄F₄溶于20ml甲醇中，超聲溶解，加入混合溶液A1中，加熱至130℃除甲醇，抽真空0.5h，在氬氣氛圍中升溫至330℃，維持0.5h，之后在氬氣氛圍中冷卻，得到混合溶液A2；

(1.4)在混合溶液A2中加入約10ml丙酮，離心取固體，再加入10ml環(huán)己烷，離心取上清液，重復(fù)一遍，最后溶解在5ml環(huán)己烷中，得到混合溶液A3；

(1.5)取200μL YCl₃升溫至130℃，直至變成白色粉末狀，加入3ml油酸，加熱至130℃，稍冷卻，加入7.5L十八烯，升溫至150℃后立即停止加熱，冷卻至60℃以下，得到混合溶液A4；

(1.6)將混合溶液A3加入混合溶液A4中，升溫至100℃，維持1h，在降溫至60℃以下，得到混合溶液A5；

(1.7)將0.01685gNaOH和0.00093gNH₄F₄溶于20ml的甲醇中，超聲溶解，加入混合溶液A5中，加熱至120℃除甲醇，抽真空1h，在氬氣氛圍中升溫至330℃，維持0.5h，之后在氬氣氛圍中冷卻，得到混合溶液A6；

(1.8)往混合溶液A6加入10ml丙酮，離心取固體，再加入10ml環(huán)己烷，離心取上清液，重復(fù)一遍，最后溶解于環(huán)己烷中，得到具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(NaYF₄:Yb,Tm@NaGdF₄)環(huán)己烷分散液。

(2)利用反向膠束法將核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米晶進(jìn)行介孔二氧化硅包覆，先將將混合溶液A與CTAB反應(yīng)、再加入TEOS、NaOH、和乙醇，在70℃下反應(yīng)，冷卻后加入硝酸銨，再升溫至60℃，冷卻、離心、洗滌后得到水溶性的硅羥基化的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶，即NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂，具體步驟為：

(2.1)預(yù)備含NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄量為15mg的混合溶液A、0.1g CTAB、400μL TEOS、300μL 2M NaOH、150ml乙醇、1.2g硝酸銨；

(2.2)將0.1g CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)溶于20ml去離子水中，加入步驟(1)預(yù)備的混合溶液A，徹夜攪拌，得到澄清透明的CTAB-NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄溶液；

(2.3)將步驟(2.2)所得的CTAB-NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄溶液中加入40ml去離子水、6ml乙醇、300μL 2M NaOH，升溫至80℃，加入400μL TEOS(四乙氧基硅烷)，保持120min。冷卻，離心洗滌，溶于20ml乙醇中；

(2.4)將1.2g硝酸銨溶于40ml乙醇中；

(2.5)將步驟(2.3)所得的溶液中加入(2.4)的硝酸銨乙醇溶液，在加乙醇至150ml，加熱至80℃，維持10min，冷卻，離心洗滌，得到水溶性的硅羥基化的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶，即NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂納米晶。

(3)將硅羥基化的上轉(zhuǎn)換納米晶即NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂與一端帶有硅羥基的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基異氰酸酯進(jìn)行水解，制備一端含有異氰酸酯基的納米晶，作為納米探針的能量給體，具體步驟為：

(3.1)預(yù)備上述步驟(2.5)制備的NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂納米晶40mg、15ml甲苯，20μL 3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基異氰酸酯；

(3.2)將預(yù)備上述步驟(2.5)制備的NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂納米晶與甲苯按照質(zhì)量體積比為：2mg:1ml將納米晶溶于甲苯中，惰性氣氛下，當(dāng)溫度上升至95℃時(shí)，加入20μL的3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基異氰酸酯，升溫至100℃，保持24h，冷卻，即制得表面異氰酸酯基功能化的NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂納米晶的甲苯溶液，記為混合溶液B。

(4)將能量給體與一端帶有氨基的能量受體染料分子進(jìn)行共價(jià)鍵鍵合，構(gòu)筑含一對(duì)能量給體與能量受體，并可有效發(fā)生能量傳遞的納米探針，即制備NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P，具體步驟為：

(4.1)預(yù)備含有表面異氰酸酯基功能化的NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂納米晶40mg的混合溶液B，50mg DFPP-NH₂；

(4.2)往混合溶液B中加入單一檢測(cè)銅離子的含氨基的羅丹明B衍生物DFPP-NH₂，其中，步驟(3.2)所得納米晶與DFPP-NH₂質(zhì)量比為：2:1，即單一檢測(cè)銅離子的含氨基的羅丹明B衍生物DFPP-NH₂與混合溶液B的質(zhì)量體積之比為：1mg:1ml，加熱至110℃，保持24h，冷卻、離心，用乙醇洗滌，即制得銅離子檢測(cè)的增強(qiáng)型熒光探針NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P。

(5)將藥物分子與介孔二氧化硅通過(guò)靜電作用和氫鍵，將藥物分子負(fù)載在介孔二氧化硅孔道里，并在酸性條件下可有效發(fā)生藥物的釋放，即制備診療功能一體化的納米診療劑NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P-DOX，具體步驟為：

(5.1)預(yù)備上述步驟(4.2)制備的NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P30mg，1mg/mL的DOX水溶液4ml，5～6ml的去離子水；

(5.2)將預(yù)備的NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P納米晶與DOX按照質(zhì)量比7.5:1的比例溶于5～6mL去離子水中，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，將所得到的混合物C離心，用去離子水洗至上清液無(wú)色，最終得到用于銅離子熒光檢測(cè)并同時(shí)實(shí)現(xiàn)藥物治療功能一體化的新型納米診療劑NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄@mSiO₂-P-DOX。

一種用于銅離子熒光檢測(cè)與藥物治療功能一體化的新型納米診療劑，該新型納米診療劑的能量給體與能量受體通過(guò)共價(jià)鍵相互作用結(jié)合為一體，所述能量給體為一端帶有-N＝C＝O基團(tuán)且具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶(UCNPs)，所述能量受體為用于單一檢測(cè)銅離子的羅丹明B衍生物(DFPP-RhB，標(biāo)記為P)，所述UCNPs外表面還裝載有介孔二氧化硅(mSiO₂)作為藥物負(fù)載的通道。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶為NaY/GdF₄:Yb,Er@NaYF₄。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶的面羧基化率為：30％～70％。

本發(fā)明的重點(diǎn)主要在于，用于銅離子熒光檢測(cè)與藥物治療功能一體化的新型納米診療劑實(shí)現(xiàn)了銅離子熒光檢測(cè)與藥物治療功能一體化，具有單分散性好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于專一性檢測(cè)銅離子并實(shí)現(xiàn)藥物治療。本發(fā)明方法具有工藝簡(jiǎn)單，操作方便，結(jié)構(gòu)易控的優(yōu)勢(shì)，在細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究等領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明的技術(shù)范圍作任何限制，故采用與本發(fā)明上述實(shí)施例相同或近似的技術(shù)特征，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。