本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤細(xì)胞葉酸受體靶向的PEDF基因復(fù)合物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：色素上皮衍生因子(PEDF)是一個(gè)遍布全身組織的內(nèi)源性的50kDa的分泌型糖蛋白，在1989年作為視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的因子首先被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。隨著時(shí)間的發(fā)展，PEDF的mRNA被證實(shí)在多數(shù)胎兒或成人正常組織細(xì)胞(如血漿，心臟，肺臟，卵巢)和腫瘤中廣泛存在。PEDF有直接的抑癌特性，主要通過(guò)抗腫瘤凋亡、抗腫瘤分化以及抗腫瘤增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)；同時(shí)也有間接的抑癌特性，主要是通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡從而抗腫瘤新生血管。PEDF作為抗癌因子在一系列腫瘤研究中有著良好的治療效果，比如肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨肉瘤、結(jié)腸癌和宮頸癌等。目前廣泛用于研究的PEDF主要從哺乳動(dòng)物細(xì)胞如HEK293細(xì)胞中獲得，價(jià)格昂貴，且體內(nèi)用量高達(dá)毫克級(jí)，臨床上難以大規(guī)模應(yīng)用。直接用PEDF基因進(jìn)行治療，具有用藥劑量小的優(yōu)點(diǎn)，是目前PEDF用于腫瘤臨床治療極具前景的給藥模式。目前，用于傳遞PEDF基因的載體報(bào)道的有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒、質(zhì)粒、陽(yáng)離子脂質(zhì)體、殼聚糖微球等。逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和慢病毒這幾種病毒載體存在免疫原性、潛在的感染性及靶向性差等技術(shù)缺陷。質(zhì)粒具有簡(jiǎn)便、安全、價(jià)廉的特點(diǎn)，而且可以攜帶較大劑量的DNA，但由于體內(nèi)核酸酶等對(duì)裸DNA的降解作用，基因表達(dá)的時(shí)間很短，無(wú)法臨床應(yīng)用；陽(yáng)離子脂質(zhì)體是目前應(yīng)用較為廣泛的基因轉(zhuǎn)染載體，具有基因?qū)胄矢叩膬?yōu)點(diǎn)；殼聚糖也是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的基因轉(zhuǎn)染載體，但是目前報(bào)道的載PEDF基因的載體是殼聚糖微球，存在粒徑較大、細(xì)胞攝取效率低的技術(shù)缺陷。在本課題組前期的授權(quán)發(fā)明專利201010136539.1中，公開(kāi)了用PLGA納米粒遞送PEDF基因的技術(shù)，該納米粒在體內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)PEDF基因的高效遞送；但對(duì)腫瘤細(xì)胞缺乏選擇性，在腫瘤部位的濃集和基因表達(dá)水平有待進(jìn)一步提高。因此，本發(fā)明擬利用腫瘤細(xì)胞表面特異表達(dá)的受體這一分子生物學(xué)特征，設(shè)計(jì)主動(dòng)靶向的PEDF基因遞送載體。葉酸受體(folatereceptor，F(xiàn)R)是一種糖基化的膜糖蛋白，通常在正常組織中有較低水平的表達(dá)，但在許多惡性腫瘤中，F(xiàn)R存在高水平表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道，多種上皮來(lái)源的腫瘤包括卵巢癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、宮頸癌、腦癌、肺癌、頭頸部癌以及結(jié)直腸癌等都有葉酸受體的高表達(dá)。利用可特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的葉酸受體的小分子葉酸修飾PEDF基因遞送載體，可以實(shí)現(xiàn)腫瘤選擇性的靶向遞送，進(jìn)一步提高PEDF基因的抗腫瘤效果。發(fā)明人擬構(gòu)建一種葉酸修飾的PEDF基因復(fù)合物，利用腫瘤部位高表達(dá)的葉酸受體將編碼PEDF的質(zhì)粒選擇性遞送至腫瘤細(xì)胞；腫瘤細(xì)胞高效表達(dá)的PEDF，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化成熟、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移等多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，達(dá)到較好的抗腫瘤效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種葉酸修飾的PEDF基因復(fù)合物，目的在于靶向遞送PEDF基因至腫瘤細(xì)胞，利用高效表達(dá)的PEDF，發(fā)揮較好的抗腫瘤作用。該組合物含有：表達(dá)PEDF的質(zhì)粒、葉酸修飾脂質(zhì)體?？商砑悠渌帉W(xué)上可接受的成分，也可不添加其他成分。其中，表達(dá)PEDF的質(zhì)粒與葉酸修飾脂質(zhì)體的質(zhì)量比為1:1～1:15，優(yōu)選為1:2～1:15。該藥物組合物中的表達(dá)PEDF的質(zhì)粒，質(zhì)?？梢允侨我饪梢垣@得的質(zhì)粒，如實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的質(zhì)粒，也可以是商品化的質(zhì)粒，如pVITRO2、pAAV2、pGenesil2.1、pGenesil2.4、pCMV-Script、pBlast49等。該組合物中的葉酸修飾脂質(zhì)體，含有脂質(zhì)材料和葉酸修飾脂質(zhì)，可添加其他藥學(xué)上可接受的成分，也可不添加其他成分；其中，葉酸占總脂質(zhì)摩爾數(shù)的0.01～5％，優(yōu)選為0.05～2.5％。葉酸修飾脂質(zhì)體中所用的脂質(zhì)材料包括磷脂及其衍生物或膽固醇及其衍生物中的一種或多種；所用的葉酸修飾脂質(zhì)由葉酸與脂質(zhì)材料偶聯(lián)形成，中間可以使用間隔基，也可以不用間隔基團(tuán)，間隔基團(tuán)可選用任何能通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將葉酸與脂質(zhì)材料偶聯(lián)連接的基團(tuán)，如常用的聚乙二醇鏈(PEG，分子量200～10000Da的聚乙二醇均可)、氨基己酸等。具體地，用作脂質(zhì)材料的磷脂和膽固醇種類很多，可采用制劑領(lǐng)域常用于制備脂質(zhì)體的磷脂和膽固醇類型。具體地，制備葉酸修飾的PEDF雙基因組合物的脂質(zhì)體時(shí)，采用的脂質(zhì)材料為中性脂質(zhì)，負(fù)電荷脂質(zhì)或正電荷脂質(zhì)材料，包括：大豆磷脂、卵磷脂、腦磷脂、鞘磷脂(SM)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二棕櫚酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰膽堿(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)、雙鯨蠟磷脂酸(DCP)、硬脂酰胺(stearylamine,SA)、N-[1-(2,3-二油酰基)丙基-]-N，N，N-三甲基氯化銨[DOTMA]，N-[1-(2,3-二油?；?丙基]-N-(2-(精氨酸基酰胺)乙基-N,N-dimethylammoniumteifluoroacetate,DOSPA)，二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)，1,2-二油酰-3-磷酸膽堿(DOPC)、1,2-二油?；?3-三甲基銨丙烷(氯化物鹽)(DOTAP)、1,2–二十八烷基-SN-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、膽固醇、[N-(N'，N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲?；鵠膽甾醇鹽酸鹽(DC-膽固醇)，以及磷脂其他衍生物或膽固醇其他衍生物，包括聚乙二醇衍生化脂質(zhì)材料，等等。本發(fā)明提供的葉酸修飾脂質(zhì)體，具體制備方法可用常規(guī)脂質(zhì)體的制備方法，包括薄膜法、逆向蒸發(fā)法、注入法、超聲法、凍融法等多種制備方法。附圖說(shuō)明圖1.葉酸修飾的空白脂質(zhì)體(FLP)和葉酸修飾的PEDF基因復(fù)合物(FLP/PEDF)的透射電鏡照片。圖2.葉酸修飾的PEDF基因復(fù)合物(FLP/PEDF)能顯著減少腫瘤，提高腫瘤生長(zhǎng)抑制率。圖3.葉酸修飾的PEDF基因復(fù)合物(FLP/PEDF)能顯著減少腹水生成。圖4.葉酸修飾的PEDF基因復(fù)合物(FLP/PEDF)能顯著減少腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量。具體實(shí)施方式以下通過(guò)對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式的描述說(shuō)明但不限制本發(fā)明。實(shí)施例1～5不加間隔基的葉酸修飾脂質(zhì)制備具體投料如下：具體操作為：將葉酸(0.42mmol)、NHS(0.5mmol)、EDCI(0.5mmol)和三乙胺(4mmol)溶于5ml無(wú)水二甲亞砜中，滴加至含有氨基的磷脂或其衍生物(DSPE、SA、0.5mmol)的DMSO溶液。25℃～30℃反應(yīng)約120h～144h后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋(MWCO＝1000Da)，分別以20％(v/v)DMSO和水為透析介質(zhì)透析，透析14天后，轉(zhuǎn)移透析樣品至絲口瓶中，凍干，即得葉酸-膽固醇或葉酸-磷脂(即葉酸修飾脂質(zhì))。葉酸反應(yīng)、純化及凍干全程避光，產(chǎn)物避光保存于干燥器中。實(shí)施例6～10以α-羧基-ω-氨基聚乙二醇為間隔基的葉酸修飾脂質(zhì)制備具體投料如下：實(shí)施例編號(hào)678910α-羧基-ω-氨基聚乙二醇分子量(道爾頓)－200100035005000氨基己酸+－－--膽固醇++－--羥基修飾DC-膽固醇－－+－-PG－－－+－DCP－－－－+具體操作為：取α-羧基-ω-氨基聚乙二醇(氨基末端保護(hù))或氨基己酸(氨基末端保護(hù))0.5mmol，脂質(zhì)材料(膽固醇或磷脂)0.75mmol，4-二甲氨基吡啶0.75mmol和1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺0.75mmol溶于100ml二氯甲烷中，反應(yīng)約72～96h。減壓旋蒸除去有機(jī)溶劑，真空干燥得氨基聚乙二醇膽固醇粗產(chǎn)品。稱取葉酸1mmol、N-羥基琥珀酰亞胺2.5mmol、1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺2.5mmol和三乙胺10mmol溶于50ml無(wú)水DMSO中，加入約0.5mmol氨基聚乙二醇膽固醇粗產(chǎn)品，25～30℃反應(yīng)約72～96h，反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋(MWCO＝3500Da)，分別以20％(v/v)DMSO和水為透析介質(zhì)透析，透析7天后，轉(zhuǎn)移透析樣品至絲口瓶中，凍干，即得葉酸-聚乙二醇-膽固醇或葉酸-聚乙二醇-磷脂(即葉酸修飾脂質(zhì))。葉酸反應(yīng)、純化及凍干全程避光，產(chǎn)物避光保存于干燥器中。實(shí)施例11～15以雙氨基聚乙二醇為間隔基的葉酸修飾脂質(zhì)制備具體投料如下：實(shí)施例編號(hào)1112131415雙氨基聚乙二醇分子量(道爾頓)4002000500010001500膽固醇+－+－－羥基修飾DOPC－+－++具體操作為：將脂質(zhì)(膽固醇或磷脂)(10mmol)，丁二酸酐(50mmol)，DMAP(5mmol)溶于50mL二氯甲烷中，45℃劇烈回流，攪拌48h，得丁二?；|(zhì)(膽固醇或磷脂)。取丁二?；|(zhì)(4mmol)，1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺(10mmol)，N-羥基琥珀酰亞胺(10mmol)溶于少量二氯甲烷中，滴加至100ml的雙氨基聚乙二醇(5mmol)二氯甲烷溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)約72h～96h。反應(yīng)液用60目～80目硅膠拌樣，300目～400目硅膠濕法裝柱，干法上樣。以二氯甲烷-甲醇體系為洗脫劑，比例從80:1，60:1，40:1到20:1(體積比，v/v)，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，合并濃縮除去有機(jī)溶劑，得氨基聚乙二醇-膽固醇。將葉酸(0.42mmol)、NHS(0.5mmol)、EDCI(0.5mmol)和三乙胺(4mmol)溶于5ml無(wú)水二甲亞砜中，滴加氨基聚乙二醇-膽固醇(0.21mmol)的DMSO溶液。25℃～30℃反應(yīng)約120h～144h后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋(MWCO＝1000Da)，分別以20％(v/v)DMSO和水為透析介質(zhì)透析，透析14天后，轉(zhuǎn)移透析樣品至絲口瓶中，凍干，即得葉酸-聚乙二醇-膽固醇或葉酸-聚乙二醇-磷脂(即葉酸修飾脂質(zhì))。葉酸反應(yīng)、純化及凍干全程避光，產(chǎn)物避光保存于干燥器中。實(shí)施例16～21葉酸修飾的PEDF基因復(fù)合物的制備取葉酸修飾脂質(zhì)，先用5％葡萄糖溶液溶解，制得1mg/ml的葉酸修飾脂質(zhì)的膠束溶液。再取20mg脂質(zhì)材料，加入氯仿使溶解，37℃減壓除去氯仿，時(shí)間為1h，然后于室溫、高真空條件下保持6h以上，葡萄糖溶液水化脫膜，水浴溫度60℃，時(shí)間1h；脫膜后的混懸液轉(zhuǎn)入西林瓶中，趁熱水浴超聲，水浴溫度60℃，超聲15min，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液與PEDF基因按質(zhì)量比混合，室溫孵育30min，記為P-LP/PEDF。取葉酸修飾脂質(zhì)的膠束溶液與P-LP/PEDF按上表摩爾比混合，并置于37℃恒溫空氣浴振蕩器中，100rpm振搖1h后，即得葉酸修飾的PEDF基因復(fù)合物，記為F-P-LP/PEDF。實(shí)施例22～27葉酸修飾的PEDF基因復(fù)合物制備取脂質(zhì)材料于茄形燒瓶中，氯仿-甲醇混合溶劑溶解，37℃減壓除去有機(jī)溶劑，時(shí)間為1h，然后于室溫、高真空條件下保持6h以上，葡萄糖溶液水化脫膜，水浴溫度60℃，時(shí)間1h；脫膜后的混懸液轉(zhuǎn)入西林瓶中，趁熱水浴超聲，水浴溫度60℃，超聲1min，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，制得葉酸靶向空白脂質(zhì)體，記為F-P-LP。F-P-LP與PEDF基因按上表質(zhì)量比混合，室溫孵育30min，即制得葉酸修飾的PEDF基因復(fù)合物，記為F-P-LP/PEDF。試驗(yàn)例1表達(dá)PEDF的質(zhì)粒的構(gòu)建、擴(kuò)增和提取純化(1)pAAV2-PEDF重組質(zhì)粒的構(gòu)建工序如下：通過(guò)PCR技術(shù)從質(zhì)粒pBLAST49-hPEDF上克隆人的全長(zhǎng)PEDF基因cDNA片段，根據(jù)PEDF基因序列設(shè)計(jì)引物，上游：5'GGAATTCATGCAGGCCCTGGTGCTACTC3'；下游：5'ACGCGTCGACTTAGGGGCCCCTGGGGTCCAG3'，此引物設(shè)計(jì)有EcoRⅠ和SalⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，分別在5'端和3'端。用EcoRⅠ和SalⅠ酶切表達(dá)載體pAAV2，將擴(kuò)增后經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ酶切純化后的PEDF基因cDNA片段與線性化的pAAV2用T4DNA連接酶連接，即得pAAV2-PEDF重組質(zhì)粒。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，擴(kuò)增培養(yǎng)后，用高純度質(zhì)粒大量提取試劑盒提取純化pAAV2-PEDF重組質(zhì)粒。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，通過(guò)A260/A280的測(cè)定和瓊脂糖凝膠電泳分析pAAV2-PEDF的純度，制備的pAAV2-PEDF260/A280＝1.8～2.0；同時(shí)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，無(wú)染色體DNA、蛋白質(zhì)及RNA污染，條帶整齊清晰。(2)參照上述方法，選用pVITRO2、pGenesil2.1、pGenesil2.4、pCMV-Script或pBlast49作為載體，根據(jù)PEDF基因序列設(shè)計(jì)引物，選用適宜的酶酶切表達(dá)載體pVITRO2、pGenesil2.1、pGenesil2.4、pCMV-Script或pBlast49，將擴(kuò)增后經(jīng)適宜的酶酶切純化后的PEDF基因cDNA片段與線性化的pVITRO2、pGenesil2.1、pGenesil2.4、pCMV-Script或pBlast49用DNA連接酶連接，即得pVITRO2-PEDF、pGenesil2.1-PEDF、pGenesil2.4-PEDF、pCMV-Script-PEDF或pBlast49-PEDF重組質(zhì)粒。對(duì)比pAAV2-PEDF、pVITRO2-PEDF、pGenesil2.1-PEDF、pGenesil2.4-PEDF、pCMV-Script-PEDF或pBlast49-PEDF重組質(zhì)粒，不同重組質(zhì)粒制備的納米復(fù)合物在粒徑、zeta電位、包封率及體外釋藥特性方面皆沒(méi)有顯著性差異。同時(shí)發(fā)明人用pAAV2-PEDF、pVITRO2-PEDF、pGenesil2.1-PEDF、pGenesil2.4-PEDF、pCMV-Script-PEDF或pBlast49-PEDF重組質(zhì)粒，分別制備了復(fù)合物，預(yù)試驗(yàn)研究顯示，復(fù)合物在體外轉(zhuǎn)染效率及體內(nèi)抑瘤效果方面均沒(méi)有顯著性差異，故選擇了其中一種重組質(zhì)粒即pAAV2-PEDF進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)染效率、體內(nèi)抑瘤效果方面等研究。以下均是以pAAV2-PEDF重組質(zhì)粒制備的納米復(fù)合物進(jìn)行制劑學(xué)研究。試驗(yàn)例2表達(dá)PEDF的質(zhì)粒與葉酸修飾脂質(zhì)體的質(zhì)量比篩選取表達(dá)PEDF的質(zhì)粒與葉酸修飾脂質(zhì)體，按不同質(zhì)量比(1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12、1:15、1:20)等體積混合，即得葉酸修飾的PEDF雙基因組合物。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7鋪六孔板，使接種后六孔板內(nèi)細(xì)胞密度約40％-50％，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；待細(xì)胞密度為60％左右時(shí)，用無(wú)葉酸無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞2次，加入800μl無(wú)葉酸無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1h后再分別加入上述組合物(每孔加約2μg質(zhì)粒)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)6h后，用Westernblotting檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。具體操作位：棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，加入新鮮的含10％FBS的DMEM，2ml/孔，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)基；每孔加入100μl裂解液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至事先預(yù)冷無(wú)菌Ep管中；用細(xì)胞破碎儀超聲5s，間隔5s，重復(fù)2次；將超聲后的細(xì)胞裂解液置于100℃水浴鍋中水浴5min使蛋白變性，然后冰上靜置5min；取2μl蛋白樣品于核酸蛋白定量?jī)x上測(cè)定蛋白的濃度；向所得蛋白樣品中加入蛋白loadingbuffer，再用SDS-PAGE蛋白凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜、封閉、免疫雜交并顯色。結(jié)果顯示：表達(dá)PEDF的質(zhì)粒與葉酸修飾脂質(zhì)體的質(zhì)量比為1:1～1:20時(shí)，制得的組合物均有蛋白表達(dá)產(chǎn)物，但1:0.5幾乎沒(méi)有檢測(cè)到蛋白表達(dá)產(chǎn)物，1:2時(shí)表達(dá)產(chǎn)物相對(duì)較少；1:20的組合物對(duì)細(xì)胞的毒性較大，細(xì)胞死亡較多，1:15的組合物有輕微毒性，細(xì)胞有少許死亡。因此，綜合考慮基因表達(dá)效率和細(xì)胞毒性兩方面，表達(dá)PEDF的質(zhì)粒與葉酸修飾脂質(zhì)體的質(zhì)量比最終確定為1:1～1:15，優(yōu)選為1:2～1:15。試驗(yàn)例3葉酸修飾脂質(zhì)材料的用量篩選取不同摩爾比例的脂質(zhì)材料(葉酸占總脂質(zhì)摩爾數(shù)分別為：0、0.01％、0.05％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、2.5％、5％、8％)混合，采用薄膜法制備葉酸修飾脂質(zhì)體。葉酸占總脂質(zhì)摩爾數(shù)為0～5％，均能成功制得脂質(zhì)體，外觀呈淡藍(lán)色半透明膠體溶液，但高達(dá)8％時(shí)，制得的脂質(zhì)體膠體溶液為白色無(wú)乳光，且沉淀較多；葉酸修飾脂質(zhì)用量為5％制得的脂質(zhì)體，4℃放置2周以后，有沉淀生成，穩(wěn)定性略差，其他用量比例制備的脂質(zhì)體穩(wěn)定性均較好。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞鋪板，待貼壁24h后，棄去培養(yǎng)液，加入無(wú)血清、無(wú)葉酸DMEM稀釋制備好的不同脂質(zhì)體(葉酸占總脂質(zhì)摩爾數(shù)分別為：0、0.01％、0.05％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、2.5％)培養(yǎng)4h。然后按試驗(yàn)例2方法，用Westernblotting檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，未加葉酸修飾脂質(zhì)的脂質(zhì)體未檢出有蛋白表達(dá)，加入0.01％葉酸修飾脂質(zhì)的脂質(zhì)體有目標(biāo)蛋白檢出，但檢出量相對(duì)較少，加入0.05％～2.5％葉酸修飾脂質(zhì)的脂質(zhì)體組，目標(biāo)蛋白條帶均較清晰。因此，綜合考慮脂質(zhì)體的成型、穩(wěn)定性及基因表達(dá)效率，葉酸修飾脂質(zhì)體的葉酸修飾脂質(zhì)用量最終確定為：葉酸占總脂質(zhì)摩爾數(shù)的0.01～5％，優(yōu)選為0.05～2.5％。試驗(yàn)例4F-P-LP/PEDF對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hela腹腔轉(zhuǎn)移瘤的治療作用研究4～6周齡Balb/C雌性裸鼠腹腔接種約5×106個(gè)Hela細(xì)胞/只，接種后隨機(jī)分為將小鼠隨機(jī)分成5組，即5％葡萄糖(control)、自制FLP/PEDF、PLP/PEDF、FLP/PAAV2、PLP/PAAV2組，每組5只。每隔2天腹腔注射給藥一次，共給藥10次，給藥劑量為PEDF或者PAAV2250μg/kg。每次給藥記錄各組各只小鼠的體重情況，每次取平均值，根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)繪小鼠體重變化曲線。處死裸鼠，抽出腹水，記錄腹水體積；取出裸鼠的腫瘤組織，計(jì)數(shù)每只裸鼠腹腔內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)并測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)重量；計(jì)算腫瘤抑制率。結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3和圖4。與對(duì)照組和其它試驗(yàn)組相比，葉酸修飾的PEDF復(fù)合物(FLP/PEDF)能夠顯著減少腫瘤重量、增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)抑制率(圖2)，減少腹水(圖3)，減少腹腔腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目(圖4)。表明，葉酸修飾的PEDF復(fù)合物具有較好的抗腫瘤活性。<110>四川大學(xué)<120>腫瘤細(xì)胞葉酸受體靶向的PEDF基因復(fù)合物<140><141><160>1<210>1<211>418<212>AA<213>人工序列<220><221>misc_fiture<440>11mqalvlllcigallghsscqnpasppeegspdpdstgalveeedpffkvpvnklaaavsn61fgydlyrvrssmspttnvllsplsvatalsalslgadertesiihralyydlisspdihg121tykelldtvtapqknlksasrivfekklrikssfvapleksygtrprvltgnprldlqei181nnwvqaqmkgklarstkeipdeisilllgvahfkgqwvtkfdsrktsledfyldeertvr241vpmmsdpkavlrygldsdlsckiaqlpltgsmsiifflplkvtqnltlieesltsefihd301idrelktvqavltvpklklsyegevtkslqemklqslfdspdfskitgkpikltqvehra361gfewnedgagttpspglqpahltfpldyhlnqpfifvlrdtdtgallfigkildprgp當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3