本發(fā)明涉及一種根據(jù)角質(zhì)層特定分子自熒光的測(cè)量與分析方法，用于活體無創(chuàng)預(yù)測(cè)紫外光誘導(dǎo)的皮膚損傷。

背景技術(shù)：

陽光中的紫外線是人的皮膚受到紫外線輻射損傷的主要原因。紫外線輻射對(duì)于皮膚會(huì)產(chǎn)生多種病理作用，例如皮膚紅腫，脫皮，炎癥，潰爛，以及多種皮膚疾病等，并會(huì)產(chǎn)生大量活性氧化物，造成皮下細(xì)胞的DNA損傷，加速皮膚衰老。事實(shí)上，人體皮膚衰老90％的原因是由于紫外線照射。而紫外線誘導(dǎo)的最嚴(yán)重的疾病是皮膚癌。已有研究證明，90％以上的皮膚癌是由陽光中的紫外線照射引起的。皮膚癌患者占所有癌癥患者中的40％。全世界每年有300多萬新發(fā)皮膚癌病例。而皮膚癌基金會(huì)也指出，五分之一的美國人在一生中的某個(gè)階段會(huì)得皮膚癌。隨著人類工業(yè)化的進(jìn)展，大氣層中負(fù)責(zé)阻擋紫外線的臭氧層在不斷變薄。(臭氧層能吸收99％太陽釋放出來的紫外線)有專家曾預(yù)測(cè)，臭氧層厚度減少1％，紫外線輻射強(qiáng)度增加2％。

隨著人民生活水平的提高，人們?cè)絹碓街匾曈谄つw的保護(hù)。因此，對(duì)于皮膚紫外線損傷的檢測(cè)對(duì)于人們提高皮膚的健康水平、防止皮膚癌等重大皮膚疾病的產(chǎn)生，都具有著重大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義和臨床價(jià)值。

而在我國，由于人口壓力巨大，診斷和就醫(yī)困難，紫外皮膚損傷尚未得到足夠的重視，往往很多皮膚受創(chuàng)患者只有受到特別強(qiáng)的皮損后才會(huì)門診就醫(yī)，而使得近年來，我國乃至于全世界紫外創(chuàng)傷導(dǎo)致的皮膚病和皮膚癌患者數(shù)量逐漸增多。因此，有效的皮膚紫外損傷檢測(cè)方法，以及低成本便攜式的紫外損傷檢測(cè)設(shè)備，對(duì)于相關(guān)皮膚疾病、皮膚癌的診斷和治療意義重大。

現(xiàn)在臨床上皮膚紫外線損傷的診斷以皮膚科醫(yī)生目測(cè)為主，對(duì)醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)依賴性強(qiáng)，且只能對(duì)較嚴(yán)重的皮膚損傷進(jìn)行評(píng)估，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)紫外線造成的積累性皮膚損傷，特別是皮膚癌變的早期診斷。現(xiàn)有的皮膚損傷檢測(cè)儀器，只能通過紫外光在組織傳播過程中的吸收不同，對(duì)皮下進(jìn)行反射成像實(shí)現(xiàn)一個(gè)非常粗略的估計(jì)。原理是:紫外燈照射皮膚，檢測(cè)皮膚反射回的光線。由于正常皮膚組織和受損區(qū)域(主要為黑色素沉積區(qū)域)對(duì)光線的吸收系數(shù)不同，將反射或散射回來的光線進(jìn)行成像，從而可以對(duì)皮膚內(nèi)黑色素、水分、脂質(zhì)的含量做一個(gè)非常粗略的估計(jì)。由于激光在組織中的傳播對(duì)于散射非常敏感，而且根據(jù)瑞利散射和彌散射原理，光子散射量與波長的四次方成反比，對(duì)于紫外光這種超短波長而言，其在皮膚組織的傳播受到散射的干擾已經(jīng)非常顯著，同時(shí)紫外光在正常細(xì)胞中的吸收也非常強(qiáng)烈，因此，這種反射成像會(huì)受到非常多因素的干擾，準(zhǔn)確率和重復(fù)性都非常低。對(duì)于同樣一個(gè)人而言，在不同組織，或同樣組織中的不同肌肉狀態(tài)下的測(cè)量，可能測(cè)得的結(jié)果差異已經(jīng)與紫外受損造成的差異相當(dāng)。因此，這類儀器清晰度、靈敏度差，無法檢測(cè)紫外線造成的早期皮膚損傷，對(duì)皮膚損傷及進(jìn)一步的皮膚疾病的早期檢測(cè)和預(yù)防毫無指導(dǎo)意義，在臨床上幾乎沒有應(yīng)用。而特別地，對(duì)于皮膚科門診，往往只能使用光實(shí)驗(yàn)對(duì)皮膚的紫外敏感性做一個(gè)定性評(píng)估，其方法是，在一個(gè)非見光皮膚區(qū)域，如背部的一塊皮膚上進(jìn)行紫外光照射，然后通過這塊皮膚出現(xiàn)的紅斑面積來評(píng)價(jià)患者的皮膚紫外敏感性，既不準(zhǔn)確，也無法進(jìn)行損傷的直接檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決目前對(duì)紫外光誘導(dǎo)的皮膚損傷的有效預(yù)測(cè)問題，本發(fā)明的目的在于提出一種對(duì)紫外光誘導(dǎo)的皮膚損傷的預(yù)測(cè)方法，構(gòu)建一種基于介于角質(zhì)層特定分子的自熒光測(cè)量分析的方法，用于預(yù)測(cè)紫外線誘導(dǎo)的皮膚損傷。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種基于皮膚角質(zhì)層自發(fā)熒光的活體無創(chuàng)預(yù)測(cè)紫外線誘導(dǎo)皮膚損傷的方法，是通過角質(zhì)層自發(fā)熒光預(yù)測(cè)紫外線誘導(dǎo)的皮膚損傷，是以藍(lán)紫光波段的激發(fā)光，波長為440-560nm，激發(fā)出皮膚表皮角質(zhì)層波長為450-580nm的自發(fā)熒光，該自發(fā)熒光與紫外線造成的未來皮膚損傷程度成正比，通過分析該波長為450-580nm的自發(fā)熒光，可以對(duì)紫外線造成的皮膚損傷進(jìn)行早期預(yù)測(cè)。

進(jìn)一步的，所述方法的激發(fā)光光譜范圍波長為440-560nm激發(fā)的角質(zhì)層的波長為450-580nm的自發(fā)熒光作為檢測(cè)的標(biāo)志物。優(yōu)選為470nm到545nm。

進(jìn)一步的，所述方法采用接收光波長為450-580nm之間。優(yōu)選為450nm到550nm。

進(jìn)一步的，所述方法的激發(fā)光的照射激發(fā)位置為表皮角質(zhì)層。優(yōu)選為表皮角質(zhì)層中的角質(zhì)化細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了一種基于皮膚角質(zhì)層自發(fā)熒光的活體無創(chuàng)預(yù)測(cè)紫外線誘導(dǎo)皮膚損傷的方法的應(yīng)用。

附圖說明

圖1 UVC照射皮膚24小時(shí)后，C57小鼠角質(zhì)層綠色熒光量隨紫外輻射劑量的增加而顯著增加。圖例為20微米

圖2 UVC照射皮膚3天后，C57小鼠皮膚H&E染色代表圖。

圖3紫外光照射皮膚24小時(shí)后，皮膚自熒光光譜圖。

具體實(shí)施方式

基于角質(zhì)層自熒光的活體無創(chuàng)檢測(cè)紫外線誘導(dǎo)皮膚損傷的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面：

一、實(shí)驗(yàn)方法

1、動(dòng)物操作

我們的研究是使用雄性C57小鼠，重量在15-25g(UVC)之間，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在上海交通大學(xué)MED-X研究院進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，紫外線照射實(shí)驗(yàn)在上海交通大學(xué)MED-X研究院進(jìn)行。所有的操作流程均符合上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物保護(hù)和使用守則。輻射完成后，小鼠在動(dòng)物房中進(jìn)行飼養(yǎng)，條件為22-24℃，12小時(shí)的明/暗循環(huán)，并可自由進(jìn)食取水。一天內(nèi)，用激光共聚焦顯微鏡無創(chuàng)成像。

2、皮膚組織用激光共聚焦顯微鏡成像。

3、皮膚組織的儲(chǔ)存

皮膚取出后，取出適量組織浸泡于4％多聚甲醛，用于制作石蠟切片。剩余組織用鋁箔紙包裹好，使用液氮冷凍，之后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱長期保存。

4、皮膚組織石蠟切片

將皮膚組織浸泡4％多聚甲醛溶液24h，然后依照石蠟切片的制作方法依次浸自來水、蒸餾水、梯度酒精、二甲苯、石蠟，制作成石蠟切片。

5、皮膚石蠟切片的HE染色

將石蠟切片浸二甲苯脫蠟，然后依次浸于梯度酒精、蒸餾水，蘇木素染色10分鐘，自來水流水沖洗30min，蒸餾水浸泡30s，95％乙醇10s，伊紅復(fù)染30s，70％酒精洗滌2次，依次浸梯度酒精、二甲苯，中性樹脂封片。實(shí)驗(yàn)步驟參考碧云天公司蘇木素&伊紅染色試劑盒。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

圖1：C57小鼠耳部經(jīng)UVC照射不同時(shí)間后，24小時(shí)內(nèi)耳部皮膚角質(zhì)層的自發(fā)熒光強(qiáng)度(488nm激發(fā)，500-530nm接收)隨照射時(shí)間的延長而增強(qiáng)。比例尺為20微米，其結(jié)構(gòu)與角質(zhì)層中的角質(zhì)化細(xì)胞相符。

圖2：C57小鼠耳部皮膚經(jīng)UVC照射不同時(shí)間后，3天后耳部表皮細(xì)胞個(gè)數(shù)減少。損傷程度與角質(zhì)層自發(fā)熒光呈正相關(guān)。

圖3：C57小鼠耳部皮膚接受不同波段紫外光照射，24小時(shí)內(nèi)，角質(zhì)層自熒光的變化。顯示增加波長范圍在450-580nm。

本發(fā)明公開了基于角質(zhì)層自熒光的活體無創(chuàng)預(yù)測(cè)紫外線誘導(dǎo)皮膚損傷的方法。在受損皮膚受到波長在440-560nm波段以內(nèi)或附近的激發(fā)光照射時(shí)，在表皮角質(zhì)層產(chǎn)生450-580nm波段的自熒光會(huì)有顯著的特征性的變化：當(dāng)激發(fā)光位于440-560nm波段時(shí)，受損皮膚的角質(zhì)層自熒光會(huì)顯著性增加。因此這種綠色自發(fā)熒光是皮膚損傷的一個(gè)指針，可以預(yù)測(cè)皮膚受到的紫外線損傷的程度。依據(jù)于本發(fā)明可能設(shè)計(jì)制造出可以通過檢測(cè)該皮膚角質(zhì)層自發(fā)熒光以預(yù)測(cè)紫外誘導(dǎo)的皮膚損傷的檢測(cè)設(shè)備，以對(duì)紫外線造成的皮膚損傷進(jìn)行無創(chuàng)、快速的預(yù)測(cè)。