本發(fā)明涉及一種抑制dcf1基因的表達(dá)在制備治療肥胖藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肥胖對(duì)人體健康有顯著和廣泛的影響，目前它成為了醫(yī)療保健優(yōu)先事項(xiàng)和本世紀(jì)挑戰(zhàn)的首要任務(wù)。遺傳學(xué)研究認(rèn)為導(dǎo)致能量平衡失調(diào)是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的影響，如神經(jīng)肽y（npy）或阿黑皮素原基因（pomc）造成的影響。目前研究表明，npy能增加食物的攝入，降低產(chǎn)熱效應(yīng)等，而pomc行駛相反的作用，它能抑制食欲，增加能量消耗。肥胖是攝入的能量大于支出，以脂肪的形式儲(chǔ)存并堆積導(dǎo)致的。目前市面上經(jīng)過fda批準(zhǔn)的減肥藥很少，主要是針對(duì)脂肪酶來起作用，但長(zhǎng)期使用會(huì)引起脂肪瀉，可造成脂溶性維生素缺乏。最近還有報(bào)道其可引起肝功能損害。

樹突狀細(xì)胞因子（dendriticcellfactor1，dcf1），也稱為跨膜蛋白59（transmembraneprotein59），屬于一種單次跨膜蛋白。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)dcf1在初級(jí)神經(jīng)干細(xì)胞（ns??cs）中的表達(dá)有差異，這暗示著dcf1在神經(jīng)系統(tǒng)中行駛某角色。而神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)體重與飲食的為npy與pomc，如果有物質(zhì)能調(diào)節(jié)這兩因子，就有成為減肥藥的可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明涉及一種抑制dcf1基因的表達(dá)在制備治療肥胖藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明主要是運(yùn)用野生型（作為對(duì)照）和dcf1敲除兩種小鼠，通過行為學(xué)檢測(cè)到dcf1的缺失導(dǎo)致小鼠體重及飲食的減少。然后westernblotting和免疫組織化學(xué)檢測(cè)到npy蛋白的下調(diào)；之后證實(shí)了dcf1位于npy的上游。最后atp試劑盒檢測(cè)到dcf1敲除后，小鼠下丘腦組織及原代細(xì)胞atp水平身高。在293t細(xì)胞中分別過表達(dá)dcf1與npy,都引起細(xì)胞atp水平下降。因此，dcf1在能量平衡上有重要作用，它可以提供一種新穎的方法來治療肥胖。

附圖說明

圖1為dcf1的敲除引小鼠體重與飲食量的下降。

圖2為western證實(shí)dcf1的敲除引npy的表達(dá)下調(diào)。

圖3為免疫組織化學(xué)證實(shí)dcf1的敲除引npy的表達(dá)下調(diào)。

圖4為dcf1位于npy的上游。

圖5為dcf1的敲除導(dǎo)致atp水平的升高，過表達(dá)引起atp水平下降。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

實(shí)施例1：所有實(shí)驗(yàn)在雄性小鼠（保持在一個(gè)c57bl/6j背景）中進(jìn)行。動(dòng)物出生后，dcf1-/-和dcf1+/+小鼠在第三周時(shí)單獨(dú)飼養(yǎng)并保持12小時(shí)光照（06：00-18：00）與12小時(shí)黑暗（18：00-06：00），控制溫度（24±1℃）。食物和水可用自由采食并充足。所有的動(dòng)物處理都按照神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)準(zhǔn)則進(jìn)行。三月齡體型對(duì)比見（圖1a），體重與飲食量結(jié)果見（圖1b，1c）。(n=28，*p<0.05；**p<0.01；*p<0.001)。

實(shí)施例2：將預(yù)冷的pbs中取出目標(biāo)區(qū)域，下丘腦，海馬，皮層。然后在加有western及ip細(xì)胞裂解液的勻漿器中進(jìn)行勻漿，直至無明顯組織塊，成透明勻漿狀即可。在冰上繼續(xù)裂解30min，然后將裂解液收集于1.5mlep管中。4℃，8000rpm離心10分鐘收集上清。繼續(xù)將上清于4℃，15000rpm離心20min，再次收集上清即為組織蛋白提取液，加入相應(yīng)量的loadingbuffer，加熱變性備用。之后進(jìn)行westernblotting。電泳條件為濃縮膠80v，30分鐘；分離膠120v，90分鐘。轉(zhuǎn)膜條件25v，40分鐘。一抗稀釋比例1:1000，二抗稀釋比例1:10000。（圖2，b，c，d，，e，f都是對(duì)a的統(tǒng)計(jì)分析）為（npy,pomc/gapdh）示意圖。(n=4，*p<0.05；**p<0.01；*p<0.001)。

實(shí)施例3：免疫組織化學(xué)檢測(cè)

首先將實(shí)驗(yàn)小鼠用4%pfa灌流固定，蔗糖脫水，包埋。然后進(jìn)行冰凍切片（20um）。最后進(jìn)行免疫組化。0.01mpbs洗3次，每次5分鐘；0.1%tritonx-100-pbs通透30分鐘；0.01mpbs洗3次，每次5分鐘；2%bsa-pbs室溫封閉1小時(shí)；吸干2%bsa-pbs后，直接滴加pbs稀釋的一抗（mbp，1：500）。37℃孵育2小時(shí)，或4℃孵育過夜；吸干一抗，0.01mpbs洗3次，每次5分鐘。避光條件下，加入pbs稀釋的二抗（稀釋比例1：500）。37℃孵育2小時(shí)；吸干二抗，加入pbs稀釋的dapi（1：1000），室溫孵育10分鐘；吸干dapi，0.01mpbs洗3次，每次5分鐘；熒光封片劑封片，confocal觀察。（圖3）免疫組織化學(xué)（npy）示意圖。其中（圖3，a）是pvn區(qū)，（圖3，c）是dmh區(qū)，（圖3，e）是arc區(qū)，圖3b，圖3d，圖3f，分別是對(duì)圖3a，圖3c，圖3e，的統(tǒng)計(jì)分析。所有觀察區(qū)域均顯示，dcf1敲除小鼠的npy信號(hào)明顯減少(n=4，*p<0.05；**p<0.01；*p<0.001)。

實(shí)施例4：293t細(xì)胞在（dmem+10％fbs+1％雙抗）的培養(yǎng)基中，37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染dcf1質(zhì)粒、npy質(zhì)粒、空載、生理鹽水。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后抽蛋白western。western結(jié)果顯示，dcf1過表達(dá)使npy顯著上調(diào)(對(duì)照組相比)（圖4a，圖4b），而npy的過表達(dá)不能引起dcf1表達(dá)的變化（圖4a，4c）。由此，可以推斷出npy位于dcf1的下游，dcf1通過調(diào)節(jié)npy來介導(dǎo)下游。(n=3，*p<0.05；**p<0.01；*p<0.001)。

實(shí)施例5：用atp檢測(cè)試劑盒對(duì)相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，dcf1-/-小鼠下丘腦中atp在一月齡與野生型鼠無差異，在3個(gè)月齡下丘腦組織atp含量顯著增加（圖5a），dcf1-/-鼠下丘腦原代細(xì)胞的atp濃度也較野生型下丘腦原代細(xì)胞升高（圖5b）。dcf1和npy分別在293t細(xì)胞中過表達(dá)，使293t細(xì)胞atp濃度降低（圖5c）。這些結(jié)果表明，dcf1的缺失會(huì)引起atp的上升，可能是機(jī)體耗能增多，需要一個(gè)高的atp水平來維持生命活動(dòng)(n=3，*p<0.05；**p<0.01；*p<0.001)。

綜上所述，dcf1基因可以作治療肥胖的藥物。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種抑制Dcf1基因的表達(dá)在制備治療肥胖藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明主要是運(yùn)用野生型（作為對(duì)照）和dcf1敲除兩種小鼠，通過行為學(xué)檢測(cè)到dcf1的缺失導(dǎo)致小鼠體重及飲食的減少。然后Western?blotting和免疫組化檢測(cè)到NPY蛋白的下調(diào)；之后證實(shí)了dcf1位于NPY的上游。最后ATP試劑盒檢測(cè)到dcf1敲除后，小鼠下丘腦組織及原代細(xì)胞ATP水平身高。在293T細(xì)胞中分別過表達(dá)dcf1與NPY,都引起細(xì)胞ATP水平下降。因此，dcf1在能量平衡上有重要作用，它可以提供一種新穎的方法來治療肥胖。

技術(shù)研發(fā)人員：文鐵橋;陳瑜;馮瑞麗;王嬌
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2017.02.07
技術(shù)公布日：2017.07.04