專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種疾病易感基因檢測(cè)產(chǎn)品，具體的說(shuō)，涉及一種有關(guān)兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估的試劑盒。
背景技術(shù)：
：肥胖指人體脂肪的過(guò)量?jī)?chǔ)存，表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞的增多和(或)細(xì)胞體積的增大，即全身脂肪組織塊增大，與其它組織失去正常比例的一種狀態(tài)。肥胖癥是由遺傳和環(huán)境因素共同作用引起體重增加、脂肪積聚過(guò)多所致的慢性代謝性疾病，是引起高血壓、冠心病、2型糖尿病、膽囊炎及某些癌癥的重要誘因和共同的病理基礎(chǔ)。肥胖的發(fā)生原因有多種，按病因分為原發(fā)性(或單純性)和繼發(fā)性肥胖癥兩類(lèi)。繼發(fā)性肥胖癥存在其他明確原因如下丘腦-垂體感染、腫瘤、胰島素瘤等。原發(fā)性是指在一定的遺傳易感背景下不良的飲食習(xí)慣(攝食過(guò)多)以及靜止少動(dòng)的生活方式引起熱能攝入、儲(chǔ)存明顯多于消耗的平衡失調(diào)所致脂肪積聚、體重增加。這里主要敘述原發(fā)性肥胖癥。全世界有近3億肥胖癥患者，我國(guó)的肥胖癥發(fā)生率也迅速增加，1998年我國(guó)超重人數(shù)已愈1億，2001年全國(guó)調(diào)査超重為21.5%，肥胖為2.92%，女性肥胖(3.7%)高于男性(2.11%)，而且呈現(xiàn)不斷增加和年輕化的趨勢(shì)。肥胖嚴(yán)重影響了我國(guó)人民的身心健康。一直以來(lái)，國(guó)際上都是采用體質(zhì)指數(shù)(BM^體重/身高的平方，kg/m2)作為是否肥胖的主要衡量標(biāo)準(zhǔn)之一，但實(shí)際上，對(duì)于處在青春發(fā)育期的孩子來(lái)說(shuō)，單單這一個(gè)指標(biāo)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。一個(gè)人的體重中，既包括脂肪重量，也包括肌肉、骨骼、水等非脂肪物質(zhì)的重量。對(duì)于兩個(gè)BMI相同的人，脂肪所占比例可能并不一樣，而機(jī)體內(nèi)過(guò)度的脂肪含量(脂肪占總體重的比例過(guò)高)才是人們患上高血糖、高血脂、高血壓和脂肪肝等代謝異常疾病的關(guān)鍵因素，所以，即使是BMI相同的人，其患病幾率也是不同的。而且，成年人的身體已經(jīng)發(fā)育成熟，對(duì)于一般人而言，BMI數(shù)值的增加，基本可以反映體內(nèi)脂肪含量和比例的增加，但對(duì)于青春期的男孩來(lái)說(shuō)，BMI的增加并不伴隨脂肪比例的上升，反而可能有小幅度的下降，如此一來(lái)，只用BMI作為肥胖與否的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)就顯然會(huì)出現(xiàn)偏差了。此外，脂肪的分布部位也是影響患病幾率的因素之一。比如，四肢偏胖的人，比腹型肥胖的人危險(xiǎn)性?。煌瑯痈剐头逝值娜?，如果脂肪主要堆積在內(nèi)臟周?chē)鷦t患病的危險(xiǎn)性更大。因此，采用腰圍與身高的比值作為是否腹型肥胖的判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)兒童是有價(jià)值的。因此，家長(zhǎng)在考慮孩子是否肥胖時(shí)，至少要考慮三個(gè)因素，即體質(zhì)指數(shù)BMI、腰圍與身高的比值，以及體內(nèi)脂肪比例三項(xiàng)。當(dāng)然，目前來(lái)說(shuō)，可能家長(zhǎng)自行測(cè)量體內(nèi)脂肪比例較困難，但借用健身房或一些醫(yī)院門(mén)診中的體成分分析儀可以起到一定的初步篩查作用。需要提醒的是，這種分析儀的準(zhǔn)確度與測(cè)量時(shí)間、是否排空膀胱，甚至腳底是否有汗都有關(guān)系，誤差偏大(胖孩子的數(shù)值可能偏低，瘦孩子的則可能偏高)，所以只能作為簡(jiǎn)單的衡量，更精確的判定，還要結(jié)合醫(yī)院兒科或內(nèi)分泌科進(jìn)行診斷。即使如此，還是會(huì)受兒童臨時(shí)狀態(tài)的影響。人們希望有一種簡(jiǎn)便而客觀的方法可以進(jìn)行兒童肥胖體質(zhì)測(cè)試，提供給父母養(yǎng)育孩童，安排孩子飲食時(shí)合適的參考信息。
發(fā)明內(nèi)容為了可以簡(jiǎn)便而客觀地對(duì)兒童肥胖體質(zhì)進(jìn)行測(cè)試，本發(fā)明提供一種兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒，可以以兒童DNA樣本為測(cè)試樣本，對(duì)兒童肥胖體質(zhì)的基因進(jìn)行檢測(cè)，從而簡(jiǎn)便快捷地測(cè)試其肥胖體質(zhì)，而不需要經(jīng)過(guò)繁鎖的多方位測(cè)試，并且免受兒童臨時(shí)身體狀況的影響。該試劑盒由DNA抽提試劑，預(yù)混PCR反應(yīng)液，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照品，標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照品組成。使用時(shí)以被測(cè)兒童的DNA樣本為檢測(cè)對(duì)象，經(jīng)過(guò)樣本DNA抽提后，使用試劑盒在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)合反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行診斷。上述的預(yù)混PCR反應(yīng)液含有SYBRgreenI，以及與兒童肥胖體質(zhì)相關(guān)的PPARG和PPARA基因突變位點(diǎn)的擴(kuò)增引物；擴(kuò)增引物為包含突變位點(diǎn)的上游引物和正常的下游引物，序列如下檢測(cè)PPARG基因的擴(kuò)增引物充列如下上游引物F1(A)C5-TCTGGGAGATTCTCCTATTGACC-323bp，上游引物F1(A)G5-TCTGGGAGATTCTCCTATTGACG-323bp，下游引物R13-TCAAGGAAGGTCTATGCCGATAAC國(guó)524bp;檢測(cè)PPARA基因的擴(kuò)增引物序列如下上游引物F2C5-CAGTATTGTCGATTTCACAAGTTCC-325bp，上游引物F2G5-CAGTATTGTCGATTTCACAAGTTCG-325bp,下游引物R25-GGAACTGAGGAACGAACTGGG-321bp。上述的兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒，所述的陽(yáng)性對(duì)照品有4個(gè)，序列SEQ1:TGCTGTTATGGGTGAAACTCTGGGAGATTCTCTGCAAACAACGTGGGGGCAGGTTGTGTT分別包含如下的GGTGAAACTCTGATACACTGGCTATTGGGGTTTGTCTTCCTCCTATTGACTATCACAAGGATTTATGTAATGTTTTAATAATTCCTTCACTCCAGATACGGCTCTTGTAGSEQ2:TAGTATTAAACCCTTACATATTACCTTGTGTGCGTCAATASE(^3:ACAGAAACAAATGCCAGTATTGTCGATTTCACAAGTGCCTTTCTGTCGGGACAAACACAAAATGCCCCCAATATGTTTGCGGAGAATCTCCCTGGAAGACCGTCCCCAATAGACAGTGTACCAGAGTTTCAAACTACAAGAGCCGTATCTTCAGTGAAGGACCCATAACACCAGAAAGCGTAAAGTTCCTGGGTAAAATTCTA;AGCAATTTTAGGAAGGAACTAATCGCTTTCGCA;4ATGTCACACACCTCAGTTCCTGTGCTTCAASEQ4:ACTCTGATTAATAGCTTGATTGGGAAAATGGAAACGCACTACGGTAGGTACCTTCCTTGCCATTTCACACAGGTGGCCCTTCCAAGGGAACCAAGTCATTGCACATTTTCCAGATCAAGCTTGTAATCAGCCAGTTCGTTTATGGATGAAAGT;ACATTCATCCAGGAACGAACCATCCCGACATGT。CAAAATGACTTGGGTGTGAAATGTTGAAGCCTGTTCCCTTGGAGCAAGGAAGAGGAACTGTGCAGGGCCACCTTACCTACCGTTGTGTGATGTGAAATCGACAATACTGGCATTTGTTTC上述的兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒，所述的陰性對(duì)照品包含的序列為SEQ5:TTCGTTATTGAATCTTGTTTTGGTTCTCTTGTGTGGAATGCATTGTTCTTGCTTCTCTGGAACTTGGGATATGATGACAAAAATACGATATCTCTAAGGCTAATTGCTGTGCGGATGAAATATATTTGCACGTCAGTCTGATCCCATTATGTATATAACATTAGGAGTTGGTGCATGCTC。本發(fā)明的使用可以在兒童的任何身體條件下進(jìn)行，而不免受兒童臨時(shí)身體狀況的影響，比如測(cè)量時(shí)間，排汗情況等。只需取其DNA樣本，比如口腔樣本，更客觀方便地進(jìn)行測(cè)試?？梢詫?duì)兒童肥胖體質(zhì)評(píng)估提供更多的機(jī)會(huì)，便于推廣應(yīng)用。圖l，圖2，圖3，圖4，圖5，圖6為熒光定量PCR儀上的擴(kuò)增曲線圖。各圖上方的DeltaRnvsCycle,是指ARn隨循環(huán)變化的對(duì)數(shù)擴(kuò)增圖譜；△Rn(DeltaRn)是指在給定的一組PCR條件下所生成熒光信號(hào)的對(duì)數(shù)值。該圖的橫坐標(biāo)表示循環(huán)數(shù)(CycleNumber),縱坐標(biāo)表示熒光值(DeltaRn)。橫線表示熒光域值，曲線與熒光域值線的交叉點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)即為Ct值。圖l、圖2、圖3中橫線3表示熒光域值；曲線1表示為擴(kuò)增？八110的引物對(duì)？1八((:)+Rl，擴(kuò)增樣本所生成的擴(kuò)增曲線；曲線2為擴(kuò)增GSTP1的引物對(duì)F1G(C)+Rl，這對(duì)引物擴(kuò)增樣本所生成的擴(kuò)增曲線。圖1表示PPARG基因CC純合型樣本的產(chǎn)物擴(kuò)增曲線圖曲線1與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為Cl，曲線2與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C2。圖2表示PPARG基因GG純合型樣本的產(chǎn)物擴(kuò)增曲線圖曲線1與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C3，曲線2與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C4。圖3表示PPARG基因GC雜合型樣本的產(chǎn)物擴(kuò)增曲線圖曲線2與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C5，曲線1與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C6。圖4、圖5、圖6中橫線4表示熒光域值；曲線5表示為擴(kuò)增PPARA的引物對(duì)F2C+R2，擴(kuò)增樣本所生成的擴(kuò)增曲線；曲線6為擴(kuò)增XRCC1的引物對(duì)F2G+R2，這對(duì)引物擴(kuò)增樣本所生成的擴(kuò)增曲線。圖4表示PPARA基因CC純合型樣本的產(chǎn)物擴(kuò)增曲線圖曲線5與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C7，曲線6與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C8。圖5表示PPARA基因GC雜合型樣本的產(chǎn)物擴(kuò)增曲線圖曲線5與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C9，曲線6與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為CIO。圖6表示PPARA基因GG純合型樣本的產(chǎn)物擴(kuò)增曲線圖曲線6與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為Cll，曲線5與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C12。具體實(shí)施例-下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，下面實(shí)施例中未說(shuō)明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，或按照制造廠商所建議的步驟和條件。實(shí)施例l:試劑盒的制備。包括(1)探針的準(zhǔn)備；(2)DNA抽提試劑；(3)預(yù)混反應(yīng)液；(4)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照；(5)標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照。(1)探針的準(zhǔn)備；由通常的核苷酸引物合成儀合成。序列如下檢測(cè)PPARG基因的擴(kuò)增引物序列如下-.上游引物F1(A)C5-TCTGGGAGATTCTCCTATTGACC-323bp，上游弓I物Fl(A)G5-TCTGGGAGATTCTCCTATTGACG-323bp,下游引物Rl3-TCAAGGAAGGTCTATGCCGATAAC-524bp;檢測(cè)PPARA基因的擴(kuò)增引物序列如下上游引物F2C5-CAGTATTGTCGATTTCACAAGTTCC-325bp，上游引物F2G5-CAGTATTGTCGATTTCACAAGTTCG-325bp'下游引物R25-GGAACTGAGGAACGAACTGGG-321bp;使用前按每OD引物稀釋為100pmol/L(即lOOpmol^l)濃度的加水量，開(kāi)啟瓶蓋溶解之前最好在3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心l分鐘，防止開(kāi)蓋時(shí)引物散失。使用前，將濃溶液稀釋成工作液10pmol/ml后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(2)DNA抽提試齊廿:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>預(yù)混反應(yīng)液包括4種，每種內(nèi)含一對(duì)上下游擴(kuò)增引物，各對(duì)應(yīng)一個(gè)基因型。按lml配比量計(jì)算，共同的成分配制為100的dNTP，20^1;500U4dTaqDNAPolymerase20^1;2XQuantOneStepSYBR1300pi;10的上游引物50^U;10的下游引物50pi;RNase-freeddH20860pi。管l的l對(duì)引物為上游引物Fl(A)C5-TCTGGGAGATTCTCCTATTGACC-3，下游引物Rl3-TCAAGGAAGGTCTATGCCGATAAC墨5;管2的l對(duì)引物為上游弓I物Fl(A)G5-TCTGGGAGATTCTCCTATTGACG-3，下游引物Rl3-TCAAGGAAGGTCTATGCCGATAAC-5;管3的1對(duì)引物為上游弓1物F2C5-CAGTATTGTCGATTTCACAAGTTCC-3，下游引物R25-GGAACTGAGGAACGAACTGGG-3;管4的l對(duì)引物為上游引物F2G5-CAGTATTGTCGATTTCACAAGTTCG-3，下游引物R25-GGAACTGAGGAACGAACTGGG-3;(4)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板是含有PPARG和PPARA基因中含突變核苷酸片段構(gòu)成的Pucl8-T重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)料轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計(jì)測(cè)A260定量并稀釋到109Copy/pl，-2(TC保存。貯存存為109Copy/pl，使用濃度為105Copy/pl。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板提供4種，每種濃度為105Copy/^。序列如下SEQ1:TGCTGTTATGGGTGAAACTCTGGGAGATTCTCCTATTGACCCAGAAAGCGATTCCTTCACTGATACACTGTCTGCAAACATATCACAAGGTAAAGTTCCTTCCAGATACGGCTATTGGGGACGTGGGGGCATTTATGTAAGGGTAAAATTGCTCTTGTAGTTTGTCTTCCAGGTTGTGTTTGTTTTAATACTA，SEQ2:TAGTATTAAAACAAACACAACCTGGAAGACAAACTACAAGAGCAATTTTACCCTTACATAAATGCCCCCACGTCCCCAATAGCCGTATCTGGAAGGAACT7TTACCTTGTGATATGTTTGCAGACAGTGTATCAGTGAAGGAATCGCTTTCTGCGTCAATAGGAGAATCTCCCAGAGTTTCACCCATAACAGCA,SEG3:ACAGAAACAAATGCCAGTATTGTCGATTTCACAAGTGCCTTTCTGTCGGGATGTCACACAACGGTAGGTAAGGTGGCCCTGCACATTTTCCCAGTTCGTTCCTCAGTTCCCCTTCCTTGCTCCAAGGGAACAGATCAAGCTATGGATGAATGTGCTTCAACATTTCACACCCAAGTCATTTTGTAATCAGAGT，SEQ4:ACTCTGATTACAAAATGACTTGGGTGTGAAATGTTGAAGCACATTCATCCATAGCTTGATCTGTTCCCTTGGAGCAAGGAAGAGGAACTGAGGAACGAACTGGGAAAATGTGCAGGGCCACCTTACCTACCGTTGTGTGACATCCCGACAGAAACGCACTTGTGAAATCGACAATACTGGCATTTGTTTCTGT。(5)標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)陰性模板是含有擬南芥基因片斷180個(gè)核苷酸構(gòu)成的Pucl8-T重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)料轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計(jì)測(cè)A260定量并稀釋到109Cop*l，.2(TC保存。貯存存為109Copy/pl,使用濃度為105Copy&l。序列如下SEQ5:TTCGTTATTGAATCTTGTTTTGGTTCTCTTGTGTGGAATGCATTGTTCTTGCTTCTCTGGAACTTGGGATATGATGACAAAAATACGATATCTCTAAGGCTAATTGCTGTGCGGATGAAATATATTTGCACGTCAGTCTGATCCCATTATGTATATAACATTAGGAGTTGGTGCATGCTC。實(shí)施例2:試劑盒的使用(1)樣本的制備取樣方式使用棉簽在面頰內(nèi)擦拭IO次。注意為了保證樣本不被食物或者飲料污染，取樣前30分鐘內(nèi)請(qǐng)勿進(jìn)食和飲水。a)處理材料將在面頰內(nèi)擦拭過(guò)的棉簽轉(zhuǎn)置于2ml離心管中，用剪刀將棉簽部分從其桿上剪下，加入400^1緩沖液GA。b)加入20pl蛋白酶K溶液，渦旋IO秒混勻，56'C放置60分鐘，其間每15分鐘渦旋混勻數(shù)次。c)加入400^1緩沖液GB，充分顛倒混勻，7(TC放置10分鐘，此時(shí)溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。d)加200pl無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。e)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CR中(吸附柱CR放入收集管中)，12,000rpm(13,400xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR放回收集管中。f)向吸附柱CR中加入500^緩沖液GD，12,000rpm(13,400xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR放回收集管中。g)向吸附柱CR中加入700^1漂洗液PW，12,000rpm(13,400xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR放回收集管。h)向吸附柱CR中加入500^1漂洗液PW，12,000rpm(13,400xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液。i)將吸附柱CR放回收集管中，12,000rpm(B,400xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CR室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗。j)將吸附柱CR轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20-50^洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5分鐘，12,000rpm(13，400xg)離心2分鐘。重復(fù)一次。(2)實(shí)驗(yàn)過(guò)程a)按樣品數(shù)n(樣品數(shù)=待測(cè)樣本數(shù)+陰性對(duì)照1個(gè)+陽(yáng)性對(duì)照1個(gè))取預(yù)混PCR反應(yīng)液每管23pl分裝于反應(yīng)管中。b)將上述處理好的待測(cè)樣本和陰性、陽(yáng)性對(duì)照(務(wù)必振蕩混勻數(shù)秒)各取2ul分別加入反應(yīng)管中，混勻，低速離心數(shù)秒，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。c)PCR條件95°C10sec(95°C15sec，60°C60sec)X40個(gè)循環(huán)(3)結(jié)果分析與判斷a)定量檢測(cè)SNP的判斷標(biāo)準(zhǔn)兩曲線的Ct值之差的絕對(duì)值記為IACtl，當(dāng)IACtl《1，判斷為雜合型；當(dāng)IACtl》5，判斷為純合型。如圖，圖l中IACtl》5，表示該樣本為PPARG基因CC純合型樣本。圖2中，|ACt|》5，表示該樣本為PPARG基因GG純合型樣本。圖3中，|ACtl《l，表示該樣本為PPARG基因GC雜合型樣本。圖4中IACtl》5，表示該樣本為PPARA基因CC純合型樣本。圖5中，|ACt|《l，表示該樣本為PPARA基因GC雜合型樣本。圖6中，IACt|》5，表示該樣本為PPARA基因GG純合型樣本。b)結(jié)果分析基因型診斷結(jié)果PPARGGG+PPARAGG基因檢測(cè)結(jié)果顯示兒童肥胖發(fā)生的機(jī)率比較大。PPARGCC+PPARACC基因檢測(cè)結(jié)果顯示兒童肥胖發(fā)生的機(jī)率較小。PPARG+PPARA的其基因檢測(cè)結(jié)果顯示可能發(fā)生兒童肥胖，需要結(jié)合其他的檢查手他組合段。序列表<110>上海裕隆生物科技有限公司<120>—種兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒<160>11<210>1<211〉23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒中檢測(cè)PPARG基因序列相關(guān)突變的DNA引物，命名為上游引物F1A(C)。<400>1tctgggagattctcctattgacc23<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒中檢測(cè)PPARG基因序列相關(guān)突變的DNA引物，命名為上游引物F1A(G)。<400>2tctgggagattctcctattgacg23<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒中檢測(cè)PPARG基因序列相關(guān)突變的DNA引物，命名為下游引物Rl。<400>3caatagccgtatctggaaggaact24<210>4<211>25<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒中檢測(cè)PPARA基因序列相關(guān)突變的DNA引物，命名為上游引物F2C。<400>4cagtattgtcgatttcacaagttcc25<210>510<211〉25<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒中檢測(cè)PPARA基因序列相關(guān)突變的DNA引物，命名為上游引物F2G。<400>5cagtattgtcgatttcacaagttcg25<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒中檢測(cè)PPARA基因序列相關(guān)突變的DNA引物，命名為下游引物R2。<400>6ggaactgaggaacgaactggg21<210>7<211>193<212>DNA<213>人屬(Homo)<400>760120180193tgctgttatgggtgaaactctgggagattctcctattgacccagaaagcgattccttcactgatacactgtctgcaaacatatcacaaggtaaagttccttccagatacggctattggggacgtgggggcatttatgtaagggtaaaattgctcttgtagtttgtcttocaggttgtgtttgttttaataeta<210>8<211〉193<212>DNA<213>人屬(Homo)<400>8tagtattaaaacaaacacaacctggaagacaaactacaagagcaattttacccttacataaatgcccccacgtccccaatageegtatetggaaggaactttaccttgtgatatgtttgcagacagtgtatcagtgaaggaatcgctttctgcgtcaataggagaatctcccagagtttcaccca加cagca60120180193<210>9<211>193<212〉DNA<213〉人屬(Homo)<400>9acagaaacaaatgecagtattgtcgatttcacaagtgectttctgtcgggatgtcacaca60acggtaggtaaggtggccctgcacattttcccagttcgttcctcagttccccttccttgc12011tccaagggaacagatcaagctatggatgaatgtgcttcaacatttcacacccaagtcattttgtaatcagagt180193<210>10<211>193<212〉DNA<213>人屬(Homo)<400>10actctgattacaaaatgacttgggtgtgaaatgttgaagcacattcatccatagcttgatctgttcccttggagcaaggaagaggaactgaggaacgaactgggaaaatgtgcagggccaccttacctaccgttgtgtgacatcccgacagaaacgcacttgtgaaatcgacaatactggcatttgtttctgt60120180193<210>11<211>180<212〉DNA<213>擬南芥(Arabidopsisthaliana)<400>11ttcgttattgaatcttgttttggttctcttgtgtggaatgcattgttcttgcttctctggaacttgggatatgatgacaaaaatacgatatctctaaggctaattgctgtgcggatgaaatatatttgcacgtcagtctgatcccattatgtatataacattaggagttggtgcatgctc60120180權(quán)利要求1.一種兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒，其特征在于由DNA抽提試劑，預(yù)混PCR反應(yīng)液，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照品，標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照品組成；所述的預(yù)混PCR反應(yīng)液含有SYBRgreenI，以及與兒童肥胖體質(zhì)相關(guān)的PPARG和PPARA基因突變位點(diǎn)的擴(kuò)增引物；擴(kuò)增引物為包含突變位點(diǎn)的上游引物和正常的下游引物，序列如下檢測(cè)PPARG基因的擴(kuò)增引物充列如下上游引物F1(A)C5-TCTGGGAGATTCTCCTATTGACC-3，上游引物F1(A)G5-TCTGGGAGATTCTCCTATTGACG-3，下游引物R13-TCAAGGAAGGTCTATGCCGATAAC-5；檢測(cè)PPARA基因的擴(kuò)增引物充列如下上游引物F2C5-CAGTATTGTCGATTTCACAAGTTCC-3，上游引物F2G5-CAGTATTGTCGATTTCACAAGTTCG-3，下游引物R25-GGAACTGAGGAACGAACTGGG-3。2.如權(quán)利要求1所述的兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒，其特征在于所述的陽(yáng)性對(duì)照品有4個(gè)，分別包含如下的序列SEQ1:TGCTGTTATGATTCCTTCACTCCAGATACGGCTCTTGTAGSEQ2:TAGTATTAAACCCTTACATATTACCTTGTGTGCGTCAATASEq3:ACAGAAACAAATGTCACACACCTCAGTTCCTGTGCTTCAASE(^4:ACTCTGATTAGGTGAAACTCTGATACACTGGCTATTGGGGTTTGTCTTCCACAAACACAAAATGCCCCCAATATGTTTGCGGAGAATCTCATGCCAGTATACGGTAGGTACCTTCCTTGCCATTTCACACTGGGAGATTCTCTGCAAACAACGTGGGGGCAGGTTGTGTTCCTGGAAGACCGTCCCCAATAGACAGTGTACCAGAGTTTCTGTCGATTTCAGGTGGCCCTTCCAAGGGAACCAAGTCATTTCCTATTGACTATCACAAGGATTTATGTAATGTTTTAATAAAACTACAAGAGCCGTATCTTCAGTGAAGGACCCATAACAACAAGTGCCTGCACATTTTCCAGATCAAGCTTGTAATCAGCCAGAAAGCGTAAAGTTCCTGGGTAAAATTCTA;AGCAATTTTAGGAAGGAACTAATCGCTTTCGCA;TTCTGTCGGGCCAGTTCGTTTATGGATGAAAGT;ATAGCTTGATTGGGAAAATGGAAACGCACTCAAAATGACTCTGTTCCCTTTGCAGGGCCATGGGTGTGAAGGAGCAAGGACCTTACCTACACATTCATCCAGGAACGAACCATCCCGACATGT。ATGTTGAAGCAGAGGAACTGCGTTGTGTGATGTGAAATCGACAATACTGGCATTTGTTTC3.如權(quán)利要求l或2所述的兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒，其特征在于所述的陰性對(duì)照品包含的序列為SEQ5:TTCGTTATTGAATCTTGTTTTGGTTCTCTTGTGTGGAATGCATTGTTCTTGCTTCTCTGGAACTTGGGATATGATGACAAAAATACGATATCTCTAAGGCTAATTGCTGTGCGGATGAAATATATTTGCACGTCAGTCTGATCCCATTATGTATATAACATTAGGAGTTGGTGCATGCTC。全文摘要一種用于兒童肥胖體質(zhì)基因檢測(cè)評(píng)估試劑盒，可以克服兒童肥胖體質(zhì)檢測(cè)方法如BMI測(cè)量及脂肪測(cè)量方法在原理和操作上的局限性。本試劑盒由DNA抽提試劑，預(yù)混PCR反應(yīng)液，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照品，標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照品組成。使用時(shí)以被測(cè)兒童的DNA樣本為檢測(cè)對(duì)象，經(jīng)過(guò)樣本DNA抽提后，使用試劑盒在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)合反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行診斷。本發(fā)明提供的兒童肥胖體質(zhì)測(cè)試方法簡(jiǎn)便而客觀，而不需要經(jīng)過(guò)繁鎖的多方位測(cè)試，并且免受兒童臨時(shí)身體狀況的影響。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101684490SQ20081020058公開(kāi)日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年9月26日優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日發(fā)明者汪寧梅,穆海東,颯黎申請(qǐng)人:上海裕隆生物科技有限公司