本發(fā)明屬于中藥制劑領域，更具體地，涉及蒺藜tts-12的新應用、抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑及其制備方法。

背景技術：

須癬毛癬菌(trichophytonmentagrophytes)，又稱石膏樣毛癬菌，是一種較常見及最易從人和動物分離出的皮膚癬菌之一，其不僅能引起體股癬、手足癬、甲癬、頭癬等癬病，還能引起膿癬、膿腫和肉芽腫等深部感染。癬病極為頑固，常出現(xiàn)復發(fā)和再感染，現(xiàn)有藥物難以達到根治的效果。

以體股癬為例，其治療以西藥為主，常用的西藥抗菌藥物有吡咯類、丙烯胺類等抗真菌藥。體股癬臨床用藥以局部外用為主，市面上常見的外用制劑有硝酸益康唑乳膏、咪康唑乳膏、特比萘芬乳膏、酮康唑洗劑、水楊酸醇溶液等。隨著西藥抗真菌藥物的廣泛應用，真菌的耐藥問題日益凸顯，從中藥中尋找高效低毒的抗菌成分成為解決耐藥問題重要途徑之一，而中藥抗菌藥物中常見復方制劑，單一成分的高效制劑少見。

目前，市面上抗真菌制劑多為乳膏，凝膠劑較為少見，凝膠劑具有良好的生物相容性、載藥量大、對藥物釋放具有緩釋作用、制備工藝簡單且形狀美觀、易于涂布使用和局部給藥后易吸收不污染衣物的特點。然而，抗真菌凝膠劑在制備的過程中存在許多困難，既要考慮保證凝膠劑的外觀、穩(wěn)定性達到標準，又要保證藥物在凝膠這種基質中具有一個良好的釋放效果。

蒺藜(tribulusterrestrisl)又名白蒺藜、屈人等，是一種中藥材，入藥能平肝明目，散風行血，已發(fā)現(xiàn)具有抗衰、強壯、降血糖、抑癌、保護心腦血管等作用。蒺藜tts-12是從蒺藜全草中提取的螺甾烷型皂苷，已有研究發(fā)現(xiàn)，蒺藜tts-12具有較強的抑制白念珠菌、新生隱球菌的作用，mic值分別為1μg/ml和2μg/ml，然而，對同為真菌的申克氏孢子絲菌抑菌效果差，最低抑菌濃度均大于128μg/ml。因此，針對不同菌種的蒺藜tts-12抑菌效果是不可預料的。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供蒺藜tts-12的新應用、抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑及其制備方法。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

蒺藜tts-12在制備抑制須癬毛癬菌制劑中的應用。

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，由如下組分組成：蒺藜tts-12、卡波姆940、甘油、tts-12潛溶劑、ph調節(jié)劑、防腐劑、水。

進一步的，一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質量百分比計，由如下組分組成：蒺藜tts-120.5％～1％、卡波姆9400.5％～1.5％、甘油5％～15％、tts-12潛溶劑29％～29.5％、ph調節(jié)劑0.675％～2.025％、防腐劑0.02％～0.04％、余量為水。

作為上述配方的優(yōu)選，按質量百分比計，由如下組分組成：蒺藜tts-120.8％～1％、卡波姆9400.5％～1％、甘油10％～15％、tts-12潛溶劑29％～29.2％、ph調節(jié)劑0.675％～1.35％、防腐劑0.02％～0.04％、余量為水。

作為上述配方的優(yōu)選，按質量百分比計，由如下組分組成：蒺藜tts-121％、卡波姆9400.5％、甘油15％、tts-12潛溶劑29％、ph調節(jié)劑0.675％、防腐劑0.03％、余量為水。

作為上述配方的優(yōu)選，按質量百分比計，由如下組分組成：蒺藜tts-120.8％、卡波姆9400.5％、甘油10％、tts-12潛溶劑29.2％、ph調節(jié)劑0.675％、防腐劑0.03％、余量為水。

進一步的，所述tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質量比(2～4)：(6～8)組成。

進一步的，所述ph調節(jié)劑為三乙醇胺、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鉀中的至少一種。

進一步的，所述防腐劑為羥苯乙酯、苯甲酸鈉中的至少一種。

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑的制備方法，包括如下步驟：

1)按配方量將卡波姆940均勻撒于水中，放置10～15h，充分溶脹后，得卡波姆溶液，備用；

2)將蒺藜tts-12過110～130目篩，按配方量取篩下物與tts-12潛溶劑混合，置于200～400w超聲功率下，超聲10～20min，分散均勻后，得藥物分散液，備用；

3)按配方量，依次將甘油、藥物分散液加入卡波姆溶液中，攪拌均勻，加入ph調節(jié)劑，調節(jié)ph至6.5～7.5，加入防腐劑，補加水，攪拌均勻，即得中藥凝膠劑；

其中，抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑的組成如上所述。

本發(fā)明的有益效果是：

1)本發(fā)明的中藥凝膠劑以蒺藜tts-12作為單一主藥，蒺藜tts-12具有抑制須癬毛癬菌的作用；蒺藜tts-12制備的中藥凝膠劑體外抗菌活性顯著高于市面上聯(lián)苯芐唑凝膠劑，體內豚鼠抗感染療效與市面上鹽酸特比萘芬乳膏相當，表現(xiàn)出良好的抗真菌感染作用。

2)本發(fā)明的中藥凝膠劑組分簡單易得、成本低廉，涂布后舒適度好，易于清洗，更適合用于私密的感染部位，制備出的中藥凝膠劑具備良好的體外釋放效果并能達到良好的抗須癬毛癬菌的效果。

附圖說明

圖1：實驗例2的五組中藥凝膠劑的體外累計釋放率；

圖2：實驗例4給藥后各組豚鼠體癬癥狀評分情況，圖中，^*表示與模型組相比有顯著性差異，^**表示與模型組相比有極顯著性差異；空白組1d、4d、8d評分均為0。

具體實施方式

以下通過實施例和實驗例對本發(fā)明作進一步解釋。

本發(fā)明的抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，其主藥為蒺藜tts-12，下述配方中蒺藜tts-12為原料藥，由第二軍醫(yī)大學藥學院天然藥化教研室提供。

實施例1、中藥凝膠劑1

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質量百分比計，由如下組分組成：蒺藜tts-120.8％、卡波姆9401.5％、甘油15％、tts-12潛溶劑29.2％、三乙醇胺2.025％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質量比3：7組成。

實施例2、中藥凝膠劑2

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質量百分比計，由如下組分組成：蒺藜tts-121％、卡波姆9401.5％、甘油5％、tts-12潛溶劑29％、三乙醇胺2.025％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質量比3：7組成。

實施例3、中藥凝膠劑3

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質量百分比計，由如下組分組成：蒺藜tts-120.5％、卡波姆9401％、甘油15％、tts-12潛溶劑29.5％、三乙醇胺1.35％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質量比3：7組成。

實施例4、中藥凝膠劑4

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質量百分比計，由如下組分組成：蒺藜tts-121％、卡波姆9401％、甘油10％、tts-12潛溶劑29％、三乙醇胺1.35％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質量比3：7組成。

實施例5、中藥凝膠劑5

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質量百分比計，由如下組分組成：蒺藜tts-120.8％、卡波姆9401％、甘油5％、tts-12潛溶劑29.2％、三乙醇胺1.35％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質量比3：7組成。

實施例6、中藥凝膠劑6

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質量百分比計，由如下組分組成：蒺藜tts-121％、卡波姆9400.5％、甘油15％、tts-12潛溶劑29％、三乙醇胺0.675％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質量比3：7組成。

實施例7、中藥凝膠劑7

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質量百分比計，由如下組分組成：蒺藜tts-120.5％、卡波姆9400.5％、甘油5％、tts-12潛溶劑29.5％、三乙醇胺0.675％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質量比3：7組成。

實施例8、中藥凝膠劑8

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質量百分比計，由如下組分組成：蒺藜tts-120.5％、卡波姆9401.5％、甘油10％、tts-12潛溶劑29.5％、三乙醇胺2.025％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質量比3：7組成。

實施例9、中藥凝膠劑9

一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑，按質量百分比計，由如下組分組成：蒺藜tts-120.8％、卡波姆9400.5％、甘油10％、tts-12潛溶劑29.2％、三乙醇胺0.675％、羥苯乙酯0.03％、余量為蒸餾水；其中，tts-12潛溶劑由70％乙醇和丙二醇按質量比3：7組成。

實施例10、一種抑制須癬毛癬菌的中藥凝膠劑的制備方法

實施例1～9所述組分的中藥凝膠劑的制備方法，包括以下步驟：

1)按配方量將卡波姆940均勻撒于的蒸餾水中，放置12h，充分溶脹后，得卡波姆溶液，備用；

2)將蒺藜tts-12過120目篩，按配方量取篩下物與tts-12潛溶劑混合，置于300w超聲功率下，超聲15min，分散均勻后，得藥物分散液，備用；

3)按配方量，依次將甘油、藥物分散液加入卡波姆溶液中，攪拌均勻，加入三乙醇胺，調節(jié)ph至7.0，加入羥苯乙酯，補加蒸餾水，攪拌均勻，即得中藥凝膠劑。

實驗例1、中藥凝膠劑外觀及穩(wěn)定性評價

對實施例1～9的9組中藥凝膠劑進行外觀及穩(wěn)定性評分，評價指標、方法如下：

1)觀察凝膠的外觀、顏色、透明狀況、涂布性能；

2)耐熱、耐寒：取10g中藥凝膠劑分別置于60℃干燥箱6h，-20℃冰箱24h，觀察凝膠有無分層現(xiàn)象，外觀顏色有無變化，同時考察涂布性能；

3)離心：取10g中藥凝膠劑，4000r/min離心，每離心20min觀察一次分層情況，共離心3次。

表1、評分標準表

按評分標準表(如表1所示)對9組中藥凝膠劑進行綜合打分。

表2、9組中藥凝膠劑綜合評分

結果如表2所示，實施例1、2、5、8的配方制備的中藥凝膠劑綜合評分≤3分，屬于不合格凝膠，優(yōu)選出實施例3、4、6、7、9五組中藥凝膠劑。

實驗例2、中藥凝膠劑釋放效果評價

針對實驗例1優(yōu)選的五組中藥凝膠劑，通過體外釋放度測定作進一步優(yōu)選，體外釋放度測定方法如下：采用改進的franz擴散池(體積8ml/擴散池擴散面積3.14cm²)進行實驗，將玻璃紙固定于接收池和給藥池之間，釋放面積為3.14cm²。將每組中藥凝膠劑各2.0g分別均勻涂布于給藥池一側。在接受池內加入接受液70％乙醇，置于透皮擴散儀中37℃定速攪拌，分別于0、2、4、6、10h取接收液1ml，同時向接受池中加入等量同溫的70％乙醇；將所取接收液采用hplc-elsd法測定其藥物質量濃度。

結果如圖1所示，五組中藥凝膠劑均有較良好的體外累計釋放率，其中各實施例凝膠劑釋放率由高到低排序為：6＞4＞3＞7＞9。

實驗例3、中藥凝膠劑體外抗菌性評價

針對實驗例1優(yōu)選的五組中藥凝膠劑，通過體外抗菌性評價作進一步優(yōu)選，以瓊脂擴散法測定實施例3、4、6、7、9的中藥凝膠劑的抑菌圈直徑，并與市面上常見的抗真菌制劑聯(lián)苯芐唑凝膠進行比較，具體方法如下：

1)菌懸液的制備：將須癬毛癬菌培養(yǎng)于pda培養(yǎng)基平板中，于28℃培養(yǎng)10d后，加入0.85％氯化鈉溶液，用比濁儀調整菌液至0.5個麥氏濃度，備用；

2)凝膠劑的制備：以實施例3、4、6、7、9的中藥凝膠劑為各試驗組，并按各處方比例，去掉主藥蒺藜tts-12制備各空白凝膠，作為各組的空白對照組，聯(lián)苯芐唑凝膠作為陽性對照組；

3)培養(yǎng)基平板的制備：在pda培養(yǎng)基平板打出6mm的小孔，將孔內的瓊脂挑去，以無菌棉簽蘸取菌懸液后，將菌懸液均勻涂布于pda培養(yǎng)基平板表面后，在孔內加入中藥凝膠劑，使中藥凝膠劑充分填滿小孔，避免溢出孔外，將培養(yǎng)基置于28℃培養(yǎng)，第7d測定抑菌圈直徑，每組平行操作重復3次。

表3、5組中藥凝膠劑抑菌圈直徑

注：*表示各實施例的中藥凝膠劑與聯(lián)苯芐唑凝膠相比，有顯著性差異，**表示有極顯著性差異。

結果如表3所示，與聯(lián)苯芐唑凝膠相比，6號中藥凝膠劑抑菌圈直徑有極顯著性差異，9、4號中藥凝膠劑抑菌圈直徑有顯著性差異，優(yōu)選出實施例4、6、9號中藥凝膠劑。

實驗例4、中藥凝膠劑對豚鼠感染須癬毛癬菌模型的作用

針對實施例3、6、9中主藥蒺藜tts-12的劑量，分為低、中、高三個劑量組，其中，低劑量組為實施例3的中藥凝膠劑，中劑量組為實施例9的中藥凝膠劑，高劑量組為實施例6的中藥凝膠劑，對上述三組凝膠作用于豚鼠感染須癬毛癬菌模型進行評價，具體方法如下：

1)豚鼠感染須癬毛癬菌模型制備：取豚鼠56只，每只豚鼠后背部用剃毛刀剃毛(2.5cm×2.5cm)，然后輕涂適量脫毛膏，5min后用滅菌水清理干凈背部的毛并擦干，用手術刀刮傷皮膚至有針狀血出現(xiàn)為止，隨機取8只(雌雄各半)作為空白組，其余48只豚鼠用制備好的菌懸液涂抹于創(chuàng)面上0.4ml/d，空白組用無菌生理鹽水涂抹于創(chuàng)面上0.4ml/d，每天觀察并且重復染菌至第5天。

2)分組及給藥：成功造模后，將豚鼠隨機分為模型組、陰性對照組、陽性對照組及低、中、高劑量組；48小時內開始給藥，每只豚鼠背部給于0.4ml/d無菌生理鹽水或中藥凝膠劑；空白組、模型組給予無菌生理鹽水，陰性對照組給予空白凝膠、陽性對照組給予鹽酸特比萘芬乳膏、低、中、高劑量組分別給予3、9、6實施例的中藥凝膠劑，連續(xù)給藥7d；

3)豚鼠背部體癬癥狀評價：開始給藥后每天觀察并對背部病變程度進行豚鼠背部體癬癥狀評分(評分標準參考表4)；

4)豚鼠皮膚真菌培養(yǎng)情況：給藥7d后，第8天將豚鼠處死，用無菌生理鹽水清洗背部皮膚，取病灶部位皮膚，每只豚鼠病灶處各取3塊5×5mm皮膚，放入70％乙醇中浸泡2-3min，殺死雜菌，經(jīng)無菌生理鹽水洗凈后接種于pda培養(yǎng)基平板中，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，觀察真菌的生長情況。

表4、豚鼠背部體癬癥狀評分標準

豚鼠背部體癬癥狀評分情況如圖2所示，與空白對照組比較，第1、4、8d模型組體癬癥狀評分顯著增加，說明造模成功；與模型組比較，造模第1、4、8d，陰性對照組體癬癥狀評分差異無統(tǒng)計學意義，說明陰性對照組對模型無明顯療效；給藥第1d，除空白對照組外，各組豚鼠體癬癥狀評分差異無統(tǒng)計學意義，說明分組均勻；給藥第4d，與模型組相比，中劑量組、高劑量組能極顯著性降低體癬癥狀評分，陽性對照組顯著降低體癬癥狀評分；給藥第8d，與模型組相比，低劑量組能顯著降低體癬癥狀評分，中劑量組、高劑量組和陽性對照組能極顯著性降低體癬癥狀評分，這說明低、中、高劑量組均有不同程度的降低體癬癥狀評分，其中高劑量組與陽性對照組相比效果相當；說明中藥凝膠劑6和中藥凝膠劑9有良好的治療感染須癬毛癬菌的效果。

表5、豚鼠皮膚真菌培養(yǎng)陰性率

注：*表示與模型組相比有顯著性差異，**表示與模型組相比有極顯著性差異。

豚鼠皮膚真菌培養(yǎng)陰性率如表5所示，與模型組相比，高劑量組、中劑量組、陽性對照組皮膚真菌培養(yǎng)陰性率有顯著性差異，兩者皮膚真菌培養(yǎng)陰性率相當；說明中藥凝膠劑6和中藥凝膠劑9提高豚鼠皮膚抗真菌感染能力，尤其是須癬毛癬菌。