本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種腦靶向納米給藥系統(tǒng)，具體來說是一種腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米給藥系統(tǒng)及其制備方法。

背景技術(shù)：

由于血腦屏障(blood-brainbarrier,bbb)的存在，98％以上的藥物難以入腦，藥物的腦內(nèi)遞送技術(shù)已成為當(dāng)今藥劑學(xué)研究的熱點(diǎn)。常用的腦靶向策略主要有以下幾種：①內(nèi)源性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)、②納米系統(tǒng)包載、③通過鼻腔給藥繞過bbb、④bbb外排抑制、⑤短暫開放bbb。由于單一靶向策略提高藥物腦內(nèi)遞送的能力有限，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到腦部疾病治療的要求，目前越來越多的腦靶向研究趨于將多種靶向策略相結(jié)合以進(jìn)一步提高腦部疾病的治療效果。

中醫(yī)引經(jīng)理論認(rèn)為，通過引經(jīng)可以改變其它藥物的作用方向或部位，或使其作用側(cè)重于或集中于特定的方向和部位，這種具有可以改變其它藥物的作用方向或部位的藥物稱為引經(jīng)藥。中藥的引經(jīng)理論與西藥的靶向理論有著異曲同工之妙，即都是把藥物送到病變部位，提高藥物的選擇性作用。藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)腦部引經(jīng)藥冰片可增強(qiáng)川芎、順鉑等多種藥物在腦內(nèi)的濃度，體現(xiàn)靶向作用，為引經(jīng)與靶向的相似性關(guān)系提供了現(xiàn)代依據(jù)。冰片、石菖蒲等芳香開竅中藥是常見的腦部引經(jīng)藥。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有腦內(nèi)藥物遞送技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米給藥系統(tǒng)及其制備方法，所述的這種腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米給藥系統(tǒng)及其制備方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中的治療腦部疾病的藥物效果不佳的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)，由腦部引經(jīng)藥，納米遞藥系統(tǒng)和腦部疾病治療藥物組成，所述的腦部引經(jīng)藥為冰片或β-細(xì)辛醚中的任意一種或者兩種的組合，所述的納米遞藥系統(tǒng)為聚合物納米粒或者固體脂質(zhì)納米粒。

進(jìn)一步的，所述的聚合物納米粒為聚乙二醇化的聚酯類共聚物，其中，聚乙二醇的分子量為2000-5000，聚乙二醇化的聚酯類共聚物的分子量為20000-55000。

進(jìn)一步的，所述的固體脂質(zhì)納米粒為硬脂酸和磷脂制成的固體脂質(zhì)納米粒。

具體的，所述的固體脂質(zhì)納米?？梢杂扇８视王?如三硬脂酸)，部分甘油酯(如單硬脂酸甘油酯，甾體類(膽固醇等)等經(jīng)高壓乳勻法、乳化-溶劑揮發(fā)法、薄膜分散法或乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備。

進(jìn)一步的，所述的腦部疾病治療藥物為止痛藥，腦血管病治療藥物或抗腫瘤藥物。

進(jìn)一步的，所述的止痛藥可以是延胡索乙素、青藤堿或冬凌草甲素；腦血管病治療藥物可以是丹參酮或葛根素；抗腫瘤藥物可以是多烯紫杉醇或阿霉素。

進(jìn)一步的，所述的腦部引經(jīng)藥的質(zhì)量為腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)總質(zhì)量的2％-20％。

本發(fā)明還提供了上述的一種腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)的制備方法,腦部引經(jīng)藥通過物理包載或化學(xué)共價(jià)連接的方法修飾到聚乙二醇聚酯納米?；蚬腆w脂質(zhì)納米粒上，腦部疾病治療藥物包載于腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)中。

進(jìn)一步的，將冰片/氨基修飾的冰片或β-細(xì)辛醚/氨基修飾的β-細(xì)辛醚，通過氨基-nhs或羥基-羧基共價(jià)鍵連接到聚乙二醇化的聚酯類共聚物或者硬脂酸上，得到引經(jīng)藥修飾的聚合物材料及脂質(zhì)材料。

進(jìn)一步的，采用單乳法或復(fù)乳法制備腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)。

進(jìn)一步的，所述的腦部引經(jīng)藥通過物理包載或化學(xué)共價(jià)連接的方法修飾到聚乙二醇化的聚酯納米?；蚬腆w脂質(zhì)納米粒上。

進(jìn)一步的，物理包載法將引經(jīng)藥與腦部疾病治療藥物一起加入到油相中制備納米粒。

進(jìn)一步的，化學(xué)修飾法中引經(jīng)藥修飾的聚合物材料或脂質(zhì)材料可以但不限于：冰片硬脂酸酯，冰片接枝聚乙二醇聚乳酸，β-細(xì)辛醚接枝聚乙二醇聚乳酸。

進(jìn)一步的，氨基修飾的β-細(xì)辛醚通過以下方法制備：β-細(xì)辛醚先通過碳鏈上的雙鍵與溴化氫加成，反應(yīng)產(chǎn)物通過gabriel反應(yīng)將碳鏈上的溴轉(zhuǎn)成氨基。即通過鄰苯二甲酰亞胺和氫氧化鉀的乙醇溶液作用發(fā)生反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)猷彵蕉柞啺符}，該鹽和β-細(xì)辛醚溴代產(chǎn)物生成了n-烷基領(lǐng)苯二甲酰亞胺，然后在堿性的條件下水解得到了氨基修飾的β-細(xì)辛醚。

進(jìn)一步的，冰片接枝聚乙二醇聚乳酸，β-細(xì)辛醚接枝聚乙二醇聚乳酸通過以下方法制備：nhs-peg-plga與(r)-(+)莰胺或氨基修飾的β-細(xì)辛醚及n，n-二異丙基乙胺，在室溫下反應(yīng)即得。

進(jìn)一步的，將未修飾聚合物材料或脂質(zhì)材料，引經(jīng)藥修飾聚合物材料或脂質(zhì)材料溶解于含有腦部疾病治療藥物的有機(jī)溶劑溶液形成有機(jī)相，逐滴和水相混合，攪拌后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮、固化即得化學(xué)修飾法制備的腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)。

進(jìn)一步的，將未修飾聚合物材料或脂質(zhì)材料，引經(jīng)藥溶解于含有腦部疾病治療藥物的有機(jī)溶劑溶液形成有機(jī)相，逐滴和水相混合，攪拌后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮、固化即得物理包載法修飾的腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)。

進(jìn)一步的，將未修飾聚合物材料或脂質(zhì)材料，引經(jīng)藥修飾聚合物材料或脂質(zhì)材料加至含有腦部疾病治療藥物的有機(jī)溶液中，溶解完全后加入水相混合，探針超聲形成初乳，再加入表面活性劑溶液，探針超聲，分散，磁力攪拌，旋蒸除去有機(jī)溶劑，即得化學(xué)修飾法制備的腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)。

進(jìn)一步的，將未修飾聚合物材料或脂質(zhì)材料，引經(jīng)藥加至含有腦部疾病治療藥物的有機(jī)溶液中，溶解完全后加入水相混合，探針超聲形成初乳，再加入表面活性劑溶液，探針超聲，分散，磁力攪拌，旋蒸除去有機(jī)溶劑，即得物理包載法修飾的腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)。

本發(fā)明制備的腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米給藥系統(tǒng)可用于靜脈或鼻腔給藥，用于止痛、治療腦腫瘤和腦血管疾病(如腦缺血再灌注損傷)。并可進(jìn)一步進(jìn)行rgd等其他二級(jí)靶向分子修飾。

本發(fā)明采用的冰片或β-細(xì)辛醚為分子量小的脂溶性物質(zhì)，它們不僅本身易透過bbb，還可引藥上行，通過抑制p-糖蛋白的活性，抑制一氧化氮合成等多種機(jī)制促進(jìn)其它藥物透過bbb。此外還具有調(diào)節(jié)bbb通透性，改善bbb功能和保護(hù)腦組織的作用。

本發(fā)明的遞藥系統(tǒng)由聚合物納米?；蚬腆w脂質(zhì)納米粒組成，通過修飾的引經(jīng)藥促進(jìn)納米粒跨越血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)。本發(fā)明將引經(jīng)理論應(yīng)用于靶向給藥系統(tǒng)，以腦部引經(jīng)藥修飾微粒表面，或包載于納米粒中與治療藥物同時(shí)給藥，提供一種新型腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米給藥系統(tǒng)，由于引經(jīng)藥對(duì)腦部組織細(xì)胞的選擇性生理性改變，增加給藥系統(tǒng)對(duì)靶器官腦的識(shí)別能力，直接增強(qiáng)治療藥物在靶器官的濃集，從而降低毒性，增強(qiáng)治療效果。

本發(fā)明利用具有鼻腔粘膜和血腦屏障促透性能的腦部引經(jīng)藥為腦靶向頭基，修飾聚合物材料或脂質(zhì)材料制備的納米粒，構(gòu)建得到腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米給藥系統(tǒng)。本發(fā)明利用引經(jīng)藥促進(jìn)納米粒在鼻腔粘膜和血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)，提供一種安全有效的提高藥物腦內(nèi)遞送的方法，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明以安全有效的中醫(yī)腦部引經(jīng)藥為腦靶向功能分子，提高納米系統(tǒng)的腦內(nèi)遞送能力，安全性高，且該腦靶向功能分子為小分子化合物，與多肽蛋白類靶向功能分子相比，具有制備簡單，穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為中醫(yī)腦部引經(jīng)藥修飾腦靶向納米給藥系統(tǒng)的tem圖；其中，a為物理包載法制備的冰片修飾載葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒；b為化學(xué)修飾法制備的冰片修飾載葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒；c為化學(xué)修飾法制備的冰片修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒；d為化學(xué)修飾法制備的β-細(xì)辛醚修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒；e為物理包載法制備的冰片修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒；f為物理包載法制備的β-細(xì)辛醚修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒；g為化學(xué)修飾法制備的冰片，rgd肽共修飾載多西紫杉醇聚乙二醇聚乳酸納米粒；h為化學(xué)修飾法制備的冰片修飾載多西紫杉醇聚乙二醇聚乳酸納米粒。

圖2為冰片(bo)和β-細(xì)辛醚(as)不同修飾方法對(duì)16hbe細(xì)胞攝取載coumarin-6聚乙二醇聚乳酸納米粒的影響*p<0.05,**p<0.01。

圖3鼻腔給予物理包載(ptf-bo-sln)和化學(xué)修飾法(ptf-bo-sa-sln)制備冰片修飾載葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒后，腦內(nèi)葛根總黃酮的藥時(shí)曲線。

圖4是幾種修飾后slns的體外釋放曲線圖。

圖5顯示了，大鼠鼻腔給予含同等劑量的coumarin-6納米粒1h后，腦組織切片中coumarin-6熒光信號(hào)情況，coumarin-6-bo-sa-slns較強(qiáng)(a)，其次是coumarin-6-bo-slns組(b)和coumarin-6-np組(c)，原料藥組最弱(d)。

圖6顯示了包載丹參酮ⅱa納米粒對(duì)于缺血再灌注損傷的預(yù)防作用，模型組較普通納米粒組腦內(nèi)mda含量明顯升高，(p<0.05)。而與tsa-np組比較，冰片修飾bo-tsa-np組和β-細(xì)辛醚修飾as-tsa-np組的腦組織mda含量均顯著下降(p<0.01)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

冰片硬脂酸酯通過以下方法制備：精密稱取56.8g硬脂酸于250ml三頸燒瓶中于，加入28.6mgsocl2，70℃反應(yīng)2h后升溫至90℃反應(yīng)2h，冷卻，加50mlch2cl2備用。精密稱取30.9gbo溶于100mlch2cl2冰浴下加入上述制備的酰氯室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48h，加入三乙胺，抽濾，干燥。濾液加入乙醇沉淀，抽濾干燥即得。

實(shí)施例2

以30ml0.5％poloxamer188為水相；以30ml甲醇溶解硬脂酸、冰片硬脂酸酯、磷脂e80和葛根總黃酮，作為有機(jī)相。兩相均預(yù)熱至(75±2)℃。攪拌下，用5#針頭將有機(jī)相緩慢地注入水相中，繼續(xù)攪拌，將體系濃縮至10ml，將該體系迅速傾入1000rpm攪拌的0～2℃固化水相中，固化0.5h，定容至15ml，即得冰片化學(xué)修飾載葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒(ptf-bo-sa-slns)，見圖1b。

實(shí)施例3

以30ml0.1％poloxamer188水溶液為水相，硬脂酸(75mg)、bo(30mg)、磷脂e80(225mg)和ptf(60mg)溶解于10ml甲醇為有機(jī)相，將兩相均置于(75±2)℃條件下預(yù)熱。在1200rpm攪拌下，用5#針頭將有機(jī)相緩慢地注入水相中，繼續(xù)攪拌，將體系濃縮至10ml，將該體系迅速傾入1200rpm攪拌的0～2℃固化水相(2ml0.5％poloxamer188水溶液)中，固化0.5h，定容至15ml，即得冰片物理修飾載葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒ptf-bo-slns，見圖1a。

實(shí)施例4

將28mg材料(bo-plga-mpeg：plga-mpeg＝1：20,w/w)加至1ml含有丹參酮(1.4mg)的二氯甲烷溶液中溶解完全后，加入50μl的超純水，探針超聲30s(210w)，再加入1％的膽酸鈉2ml，探針超聲1min(間斷2s)(210w)，最后加至20ml的0.5％膽酸鈉中，磁力攪拌30min，旋蒸除去有機(jī)溶劑，即得冰片化學(xué)修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒，見圖1c。

實(shí)施例5

將28mg材料(as-plga-mpeg：plga-mpeg＝1：20,w/w)加至1ml含有丹參酮(1.4mg)的二氯甲烷溶液中溶解完全后，加入50μl的超純水，探針超聲30s(210w)，再加入1％的膽酸鈉2ml，探針超聲1min(間斷2s)(210w)，最后加至20ml的0.5％膽酸鈉中，磁力攪拌30min，旋蒸除去有機(jī)溶劑，即得β-細(xì)辛醚化學(xué)修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒，見圖1d。

實(shí)施例6

將材料(28mgas-plga-mpeg和5.0μg冰片氨)加至1ml含有丹參酮(1.4mg)的二氯甲烷溶液中溶解完全后，加入50μl的超純水，探針超聲30s(210w)，再加入1％膽酸鈉2ml，探針超聲1min(間斷2s)(210w)，最后加至20ml的0.5％膽酸鈉中，磁力攪拌30min，旋蒸除去有機(jī)溶劑，即得物理修飾法制備的冰片修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒，見圖1e。

實(shí)施例7

將材料(28mgbo-plga-mpeg和6.0μg氨基細(xì)辛醚)加至1ml含有丹參酮(1.4mg)的二氯甲烷溶液中溶解完全后，加入50μl的超純水，探針超聲30s(210w)，再加入1％膽酸鈉2ml，探針超聲1min(間斷2s)(210w)，最后加至20ml的0.5％膽酸鈉中，磁力攪拌30min，旋蒸除去有機(jī)溶劑，即得物理修飾法制備的β-細(xì)辛醚修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒，見圖1f。

實(shí)施例8

將聚合物材料以bo-peg-plga：nhs-peg-plga：mpeg-plga＝1:1:8(w/w)的比例溶解于含有0.75mg/ml多西紫杉醇的乙腈溶液，逐滴加入2ml雙蒸水，1200rpm攪拌1h后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得化學(xué)修飾法制備的冰片修飾載多西紫杉醇聚乙二醇聚乳酸納米粒，見圖1h。

實(shí)施例9

將聚合物材料以bo-peg-plga：nhs-peg-plga：mpeg-plga＝1:1:8(w/w)的比例溶解于含有0.75mg/ml多西紫杉醇的乙腈溶液，逐滴加入2ml雙蒸水，1200rpm攪拌1h后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加入1mg/mlrgd30μl，攪拌9h，即得化學(xué)修飾法制備的冰片，rgd肽共修飾載多西紫杉醇聚乙二醇聚乳酸納米粒，見圖1g。

實(shí)施例10

將ptf-bo-sa-slns、ptf-bo-slns、ptf-slns和ptf原料藥(含ptf3mg/ml)，在漏槽條件下，分別加入50ml37℃anf和5％血漿，將介質(zhì)提前在50rpm下預(yù)熱。三種制劑(ptf-bo-sa-slns、ptf-bo-slns、ptf-slns)和ptf原料藥，每種分為6份，分別裝入透析袋中，其中3份加入人工鼻液中、另外3份加入5％血漿中，于37℃、50rpm的恒溫水浴振蕩器中。在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)(0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h和12h)取樣，每次取出1ml樣品，并且補(bǔ)充1ml的37℃同種新鮮介質(zhì)。用hplc測定樣品中pue的峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出ptf濃度，得到幾種修飾后slns的體外釋放曲線圖，見圖4。

通過圖4可以看出，引經(jīng)藥修飾后并不改變納米粒的緩釋特性，修飾后的納米粒依然具有較好的緩釋效果。

實(shí)施例11

16hbe細(xì)胞，按照10⁵個(gè)/ml的密度接種至24孔板中，培養(yǎng)一天，吸去培養(yǎng)液，加入hbss平衡液(37℃，1ml/孔)預(yù)先孵育15min后，棄去hbss平衡液后，加入用hbss稀釋后的載香豆素的未修飾(coumarin-6-np)，物理修飾(bo-loaded-coumarin-6-np，as-loaded-coumarin-6-np)和化學(xué)修飾(bo-coumarin-6-np、as-coumarin-6-np)的納米粒，考察不同修飾方法、對(duì)16hbe攝取納米粒的影響。以“攝取指數(shù)(uptakeindex)”作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，即藥物濃度與細(xì)胞蛋白濃度的比值，表示單位濃度細(xì)胞蛋白中所含有的藥物濃度，結(jié)果見圖2。

圖2表明，不同修飾方法修飾后的納米粒可以顯著提高16hbe細(xì)胞對(duì)其的攝取。

實(shí)施例12

sd大鼠鼻腔給予載ptfslns(100μl，含ptf317.5μg)。給藥后，于0.5h、1h、2h、4h和8h處理取腦以質(zhì)譜測定腦內(nèi)ptf含量，考察不同修飾方法納米遞藥系統(tǒng)的腦內(nèi)遞藥特性，結(jié)果見圖3。

圖3表明，冰片修飾后的納米粒可以顯著提高其所包載葛根總黃酮的入腦量。

實(shí)施例13

取雄性sd大鼠，鼻腔給予40μg/ml游離coumarin-6(圖5，d)或含同等劑量coumarin-6的未修飾(圖5，c)，物理(圖5，b)及化學(xué)(圖5，a)修飾bo的納米粒50μl。于給藥后1h處死大鼠，分離大腦，4％多聚甲醛固定。經(jīng)pbs漂洗，蔗糖溶液脫水，經(jīng)o.c.t.包埋后，冰凍切片(片厚10μm)，用1μg/mldapi進(jìn)行染色，再用pbs漂洗，磷酸甘油封片。激光共聚焦顯微鏡觀察切片中coumarin-6熒光信號(hào)，并拍照記錄。由圖5可知，給藥1h后，腦組織切片中coumarin-6熒光信號(hào)以coumarin-6-bo-sa-slns較強(qiáng)，其次是coumarin-6-bo-slns組，原料藥組最弱。冰片修飾后的納米?？梢燥@著提高其所包載藥物的入腦量。

實(shí)施例14

大鼠在腦缺血2h再灌注24h后，進(jìn)行麻醉，直接取腦，自大腦縱裂將腦切開。將左半腦秤重，按照1∶9(w/v)比例加入冰冷的生理鹽水，從而制備成10％的腦組織勻漿液，以2500rpm，離心10min后，取其上清液，于-20℃低溫冰箱保存，用作mda含量測定。結(jié)果(見圖6)表明模型組和tsa-np組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。與tsa-np組比較，bo-tsa-np組和as-tsa-np組的腦組織mda含量均顯著下降(p<0.01)，提示引經(jīng)藥修飾納米粒能促進(jìn)丹參酮ⅱa使腦缺血再灌注大鼠的腦組織過氧化程度受到明顯抑制，對(duì)于大鼠腦缺血再灌注損傷具有很好的保護(hù)作用。