本發(fā)明涉及修飾的人類snRNA分子（下文定名為外顯子特異性U1——ExSpeU1），其適宜在基因治療方法中使用。具體地，本發(fā)明涉及能夠糾正由基因突變導(dǎo)致的并與通常非常嚴(yán)重的具有不同病史的人類疾病相關(guān)的異常剪接過程的snRNA分子。

背景技術(shù)：
許多人類遺傳疾?。s15%）由基因突變導(dǎo)致，其通過干擾正確的信使RNA細(xì)胞內(nèi)成熟，損害隨后準(zhǔn)確的蛋白生物合成并誘導(dǎo)無功能的蛋白的合成而引起疾病。通常，造成剪接缺陷的點(diǎn)突變涉及對負(fù)責(zé)加工初級轉(zhuǎn)錄物的機(jī)器識別該初級轉(zhuǎn)錄物關(guān)鍵的基因序列。位于外顯子-內(nèi)含子交界處的供體和受體位點(diǎn)，以及外顯子或內(nèi)含子中的基因特異性調(diào)控元件（CartegniL等人,2002；Pagani等人,2004）是其中最重要的序列。這些突變的結(jié)果可能引起多種分子事件，其最頻繁地與將一個外顯子排除在成熟轉(zhuǎn)錄物之外有關(guān)，即所謂的外顯子遺漏（exonskipping）。信使RNA的加工中的分子改變是長久已知的，其涉及例如外顯子遺漏，代表多種人類疾病的主要發(fā)病機(jī)制，所述多種人類疾病其中的乙型血友病、囊性纖維化和脊髓型肌萎縮，其臨床過程的嚴(yán)重度一致。不同類型的突變可誘導(dǎo)外顯子遺漏和在供體位點(diǎn)（或5’剪接位點(diǎn)）中特異性的突變，在受體位點(diǎn)（3’剪接位點(diǎn)）中的突變，或外顯子突變。作為引起外顯子遺漏的不同類型的突變的例子，以下為所描述的人類疾病的三種模型。凝血因子IX（FIX）中的缺陷是乙型血友病發(fā)病的原因，該病伴隨不同程度的出血表現(xiàn)，有時非常嚴(yán)重并使人病廢。在一些情況下，該病由剪接缺陷所導(dǎo)致。具體地，在剪接過程中，外顯子5被排除出mRNA排除由因子IX基因（F9）的外顯子5供體位點(diǎn)中的位置-2處的突變和受體位點(diǎn)中的多嘧啶序列中的位置-8和-9處的突變兩者所導(dǎo)致。目前乙型血友病治療主要基于重組外源性FIX或直接取自血漿的FIX的頻繁輸注，其局限加強(qiáng)了研究以更高效力和長期效果為特征的替代方法的需要。囊性纖維化（CF）在高加索人群中是最頻繁致死的先天性遺傳?。?500-2700個出生存活嬰兒中就有一個新生兒罹患該病。該病的病理發(fā)生續(xù)發(fā)于定名為CFTR（囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子）的蛋白的異常，該蛋白位于上皮細(xì)胞的頂膜并具有調(diào)節(jié)水電解質(zhì)交換的功能。作為CFTR改變的結(jié)果，鹽通過細(xì)胞膜的傳遞被抑制，主要導(dǎo)致可定義為“脫水的”分泌物的產(chǎn)生：非常富集鈉和氯的汗液與傾向于堵塞導(dǎo)管的濃密和粘稠的粘液，損害了多種器官和系統(tǒng)的功能。在一些研究的過程中，鑒定了CFTR基因序列中的許多改變與囊性纖維化相關(guān)聯(lián)，其引起外顯子遺漏。具體地，外顯子12的遺漏由位于外顯子自身的剪接供體位點(diǎn)中的突變和由外顯子突變所導(dǎo)致。脊髓型肌萎縮（SMA，OMIM253300，253550和253400）是隱性的常染色體神經(jīng)肌肉病，以脊髓α運(yùn)動神經(jīng)元的變性為特征，具有估計(jì)的1/10,000出生兒的患病率。SMA相關(guān)聯(lián)的臨床癥狀范圍從極其嚴(yán)重的出生后危險(xiǎn)性肌張力低下和肌無力，到較晚在童年或青春期期間發(fā)病的較輕微的形式。迄今為止，尚未鑒定對于這種根據(jù)病史的嚴(yán)重度通常在一定年齡導(dǎo)致死亡的疾病的治療。在95%的病例中，疾病由SMN1基因的缺失所導(dǎo)致。在人類基因組中，存在與SMN1同源的基因，稱作SMN2。然而，SMN2的表達(dá)由于外顯子中的同義突變導(dǎo)致信使RNA的異常成熟和隨后外顯子7的遺漏并使基因自身失活而受損。設(shè)計(jì)的提高含外顯子7的SMN2轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目的方法將因此允許使用由于SMN2的正確表達(dá)而對于SMN1基因的缺失的補(bǔ)償療法，極大地暗示了為SMA的可能有效的治療。在剪接過程中，微核RNA（snRNA）作為負(fù)責(zé)介導(dǎo)整個mRNA成熟過程的細(xì)胞機(jī)器的剪接體的必需組分起主要作用。具體地，微小U1RNA（U1snRNA），長度為164核糖核苷酸，由在人類基因組中出現(xiàn)若干拷貝的基因所編碼，且代表著核粒子U1snRNP的核糖核酸組分。U1snRNA分子具有莖和環(huán)三維結(jié)構(gòu)，且其在5’區(qū)域包括通常長為9個核苷酸的單鏈序列，該單鏈序列能夠通過互補(bǔ)性堿基配對結(jié)合前mRNA分子上的剪接供體位點(diǎn)（Horowitz等人,1994）。圖1顯示了野生型U1snRNA結(jié)構(gòu)的示意圖。顯示了5’區(qū)域中能夠識別剪接供體位點(diǎn)的序列與真核基因的初級轉(zhuǎn)錄物中的剪接供體位點(diǎn)的共有序列配對。這一序列表現(xiàn)出不同程度的保守，且位于外顯子/內(nèi)含子連接處。由U1snRNA5’區(qū)域介導(dǎo)的識別對于界定初級轉(zhuǎn)錄物上的外顯子/內(nèi)含子連接位點(diǎn)和剪接體復(fù)合物的正確組裝是關(guān)鍵的。漸增數(shù)目的與前mRNA剪接缺陷相關(guān)聯(lián)的人類遺傳疾病，及其臨床過程的常見的嚴(yán)重度，在過去幾年刺激著針對在分子水平上糾正剪接缺陷的治療分子的研究。PinottiM等人2008和PinottiM等人,2009中描述了在突變位于5’剪接位點(diǎn)的情況下，能夠在體外引起正確的外顯子增加并恢復(fù)凝血因子VIImRNA的正確剪接的修飾的U1snRNA分子的應(yīng)用。所示的機(jī)制基于修飾的U1snRNA在5’突變的剪接位點(diǎn)上的直接識別和結(jié)合。然而，由于5’剪接位點(diǎn)的相對保守和隨之而來的干擾從其他功能性野生型基因生成的轉(zhuǎn)錄物的成熟的風(fēng)險(xiǎn)，該方法出現(xiàn)治療snRNA分子對靶基因的一定程度的非特異性作用。并且，其需要使用對5’剪接位點(diǎn)中的每個突變修飾的U1snRNA。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明表明了與5’剪接位點(diǎn)的下游內(nèi)含子序列互補(bǔ)的修飾的U1snRNA（且本文定義為外顯子特異性U1，ExSpeU1），在剪接過程中，能夠恢復(fù)被不同類型的突變損害的外顯子增加。在三種治療感興趣的不同的人類遺傳疾病模型中（脊髓型肌萎縮，血友病和囊性纖維化），本發(fā)明表明了，單獨(dú)的ExSpeU1或ExSpeU1的組能夠引起每種疾病模型的相應(yīng)外顯子的增加。單獨(dú)的ExSpeU1或ExSpeU1的組糾正了由供體位點(diǎn)中的突變、受體位點(diǎn)的多嘧啶區(qū)域中的突變和調(diào)控外顯子序列中的突變導(dǎo)致的外顯子遺漏。利用ExSpeU1獲得的糾正有效性與現(xiàn)有技術(shù)中所描述的相同，但其可能保證對治療感興趣的靶基因轉(zhuǎn)錄物的作用的更高的選擇性。ExSpeU1方法允許使用單獨(dú)的修飾的U1-snRNA以用于糾正導(dǎo)致外顯子遺漏的一套組不同的基因突變。這些和其他目的通過如權(quán)利要求1中所定義的修飾的人類U1snRNA分子來達(dá)到。修飾的人類U1snRNA分子特征在于野生型人類U1snRNA的5’區(qū)域中的部分單鏈核苷酸序列被能夠與治療感興趣的含引起異常剪接的突變的靶基因的初級轉(zhuǎn)錄物上的靶核苷酸序列雜交的結(jié)合單鏈核苷酸序列所替換。U1snRNA分子的靶核苷酸序列位于由外顯子/內(nèi)含子連接位點(diǎn)（5’剪接位點(diǎn)）的下游2至50個堿基對構(gòu)成的前mRNA的區(qū)域，條件是靶核苷酸序列不包括所述外顯子/內(nèi)含子連接位點(diǎn)。優(yōu)選地，靶核苷酸序列長度為5至50個核苷酸，更優(yōu)選地為9至30個核苷酸。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的U1snRNA分子主題具有進(jìn)行靶向的和選擇性的（外顯子特異性的）作用的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槠浣Y(jié)合位于剪接供體位點(diǎn)側(cè)翼的內(nèi)含子區(qū)域中的初級轉(zhuǎn)錄物上的靶核苷酸序列，其與外顯子/內(nèi)含子連接位點(diǎn)的序列相比較表現(xiàn)出較低程度的保守。然而，令人驚奇地是，盡管在不包括外顯子/內(nèi)含子連接位點(diǎn)的靶序列上運(yùn)作，本發(fā)明的U1snRNA分子仍然能夠在存在包括外顯子突變或受體位點(diǎn)上的突變的不同類型的突變時引起外顯子的增加。本發(fā)明的另外的特征在所附權(quán)利要求中定義，其為構(gòu)成本說明書的技術(shù)教導(dǎo)的整體必需的部分。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，被結(jié)合核苷酸序列所替換的野生型U1snRNA的單鏈5’區(qū)域的部分長度為9至12個核苷酸。優(yōu)選地，被ExSpeU1所糾正的和導(dǎo)致外顯子遺漏的突變位于由內(nèi)含子/外顯子連接位點(diǎn)（3’剪接位點(diǎn)）的上游3至50個堿基對構(gòu)成的序列，外顯子突變和剪接供體位點(diǎn)的共有序列中的突變。通過舉例的方式在治療感興趣的基因中監(jiān)測凝血因子IX，SMN2和CFTR基因，其為含有與使其利用本發(fā)明的ExSpeU1來治療的疾病相關(guān)的突變的那些基因。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾的人類U1snRNA分子包括選自由SEQIDNO:1至11，更優(yōu)選地從SEQIDNO:1至10組成的組的結(jié)合核苷酸序列。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因包括啟動子序列和聚腺苷酸化信號序列。雖然其他自身已知的容易被本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員選擇的啟動子也可被使用，但是本發(fā)明人證實(shí)了編碼人類U1snRNA的基因的內(nèi)源性啟動子是尤其適宜的。下文通過舉例的方式敘述了野生型人類U1snRNA編碼基因的正鏈的序列（在序列表中定名為SEQIDNO:12），其中單鏈5’區(qū)域在修飾的U1snRNA分子中被結(jié)合序列所替換的部分為粗體。用于插入結(jié)合序列的獨(dú)特的BglII和BclI限制位點(diǎn)的序列以下劃線顯示。除以大寫字母顯示的RNA編碼區(qū)域外，SEQIDNO:12基因序列還包括其表達(dá)所需的一些調(diào)控元件，比如啟動子和聚腺苷酸化信號。5’-taaggaccagcttctttgggagagaacagacgcaggggcgggagggaaaaagggagaggcagacgtcacttccccttggcggctctggcagcagattggtcggttgagtggcagaaaggcagacggggactgggcaaggcactgtcggtgacatcacggacagggcgacttctatgtagatgaggcagcgcagaggctgacgtcttcgccacttgctgcttcaccacgaaggagttcccgtgccctgggagcgggttcaggaccgctgatcggaagtgagaatcccagctgtgtgtcagggctggaaagggctcgggagtgcgcggggcaagtgaccgtgtgtgtaaagagtgaggcgtatgaggctgtgtcggggcagaggcccaagatctgATACTTACCTGGCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCATTGCACTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGACTGCGTTCGCGCTTTCCCCTGactttctggagtttcaaaagtagactgtacgctaa-3’（SEQIDNO:12）明顯地，僅以舉例的方式提供了以上的基因序列?？蛇x地，為構(gòu)建編碼本發(fā)明的修飾的U1snRNA的基因，可使用與SEQIDNO:12同源的任何基因序列，即能夠編碼能夠有效地介導(dǎo)剪接供體位點(diǎn)的識別的U1snRNA的基因序列。在實(shí)施例的章節(jié)中詳細(xì)描述了含有不同的結(jié)合序列的本發(fā)明的不同的修飾的U1snRNA分子主題的制備方法。本發(fā)明的又一個另外的目的是包括如先前所定義的分離的基因的表達(dá)載體。雖然本身已是本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員熟知的其他類型的表達(dá)載體也可使用，但是通常優(yōu)選的表達(dá)載體是腺相關(guān)病毒載體。如先前所描述的，修飾的人類U1snRNA分子，編碼所述RNA分子的基因和包括所述基因的載體適用于由異常剪接導(dǎo)致的或與異常剪接相關(guān)聯(lián)的并以外顯子遺漏為特征的遺傳疾病的治療性處理。優(yōu)選地，但非以限制性方式地，所述疾病是囊性纖維化、乙型血友病或脊髓型肌萎縮。為達(dá)到該目的，將修飾的U1snRNA分子、所述基因和/或所述載體配制到藥物組合物中，所述藥物組合物除治療活性分子外還包括藥學(xué)上可接受的載體。載體和任選的藥物賦形劑的選擇是本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明的另一方面是用于在培養(yǎng)的細(xì)胞中恢復(fù)治療感興趣的含有引起異常剪接的突變的靶基因的正確剪接的體外方法，所述體外方法通過用如先前所定義的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞來進(jìn)行。本發(fā)明的修飾的U1snRNA分子主題通過利用本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員熟知的常規(guī)分子生物學(xué)方法來生成。為評估本發(fā)明的U1snRNA主題對糾正異常剪接過程的作用，和為鑒定最有效的那種，本發(fā)明人廣泛使用了微基因方法，該方法的應(yīng)用在科學(xué)文獻(xiàn)中廣泛記載。這一方法包括將含有導(dǎo)致剪接缺陷的突變的基因部分克隆到表達(dá)載體中，且然后將重組載體轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的細(xì)胞中。通過RT-PCR對源自感興趣的基因的部分的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行分析，從而允許鑒定來源于異常剪接過程的長度異常的mRNA分子。修飾的U1snRNA與微基因的共轉(zhuǎn)染之后正常長度的感興趣的轉(zhuǎn)錄物的出現(xiàn)及其測序，代表了U1snRNA分子恢復(fù)正確的剪接過程的能力的明確指示。然而，正確信使RNA加工的恢復(fù)和具有實(shí)際治療意義的最終蛋白水平的恢復(fù)之間的類推還不明確。為此，本發(fā)明人使用了雜交微基因方法，其允許剪接和所表達(dá)的蛋白的研究。該方法由本發(fā)明人引入以研究凝血因子VII中的剪接突變（Pinotti等人,2009）。這一方法包括將整個編碼序列中的在含有導(dǎo)致剪接缺陷的突變的區(qū)域中包含一些內(nèi)含子的基因的部分克隆到表達(dá)載體中（“剪接勝任cDNA構(gòu)建體”），并隨后將重組載體轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的細(xì)胞中。通過RT-PCR對源自感興趣的基因的部分的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行的分析，以及合成的蛋白的水平和活性的測量允許對生物功能的恢復(fù)的評估。通過示例的方式提供了以下的實(shí)施例，且并不限制所附權(quán)利要求中所定義的本發(fā)明的范圍。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：修飾的U1snRNA的生成通過以下程序生成修飾的U1snRNA：用BglII和BclI限制酶消化包含野生型U1-snRNA基因的序列，即未修飾的U1-snRNA的質(zhì)粒。用含有結(jié)合序列的雙鏈寡核苷酸替換由該兩個限制位點(diǎn)之間構(gòu)成的序列。以下表1中描述了每個寡核苷酸的正向序列和反向序列，并以所用的寡核苷酸來命名所得的修飾的U1-snRNA。并且，圖2顯示了U1snRNA基因元件的示意圖。標(biāo)示了通過其制備不同的修飾的U1snRNA的克隆策略。圖2顯示了插入到質(zhì)粒載體（pGEM）中的具有啟動子元件DSE和PSE，編碼U1snRNA的區(qū)域（在中部），和3’加工盒的U1snRNA基因。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以箭頭示出。BglII和BclI限制位點(diǎn)之間的序列包括編碼單鏈U1snRNA尾巴的區(qū)域，其已被用于特異性生成表1中所示的修飾的U1snRNA的寡核苷酸所替換。表1實(shí)施例2：將微基因轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)細(xì)胞中并分析剪接產(chǎn)物通過利用Lipofectamine（脂質(zhì)體）進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染將包含載體插入到細(xì)胞中。在用Trizol提取總細(xì)胞RNA后，用特異性的引物通過RT-PCR分析RNA。反應(yīng)在兩步中發(fā)生：利用隨機(jī)引物作為模板通過逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA鏈，和通過DNA聚合酶擴(kuò)增所得的cDNA。在終體積25μl的混合物中進(jìn)行PCR反應(yīng)，該混合物包含：-5μl的AMV/Tfl5x緩沖液，適宜于上述兩種酶正確行使功能；-1μl的10mMdNTP混合物；-50pmol的正向引物和50pmol的反向引物；-2μl的25mMMgSO4；-2μl的細(xì)胞提取的RNA；-1μl的AMV-RT（0.1μ/μl），1μl的TflDNA聚合酶；-適量的超純H2O逆轉(zhuǎn)錄步驟在45℃下進(jìn)行4...