本發(fā)明屬于生物技術(shù)、生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及到一種可用于抑制寨卡病毒、登革病毒及黃熱病病毒感染的小分子藥物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

寨卡病毒(zikavirus，zikv)、登革病毒(denguevirus，denv)及黃熱病病毒(yellowfevervirus，yfv)均屬于黃病毒科黃病毒屬，具有包膜蛋白的二十面體病毒。它們的基因組為一條正向單鏈rna,共有約10800個(gè)核苷酸，編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(prm、env、capsid)和七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b、ns5)。

以近期流行的zikv為例，zikv是蟲(chóng)媒病毒中的一種，主要由白天活動(dòng)的伊蚊叮咬傳播，但其傳播方式還有母嬰垂直傳播、性傳播及輸血傳播。

第一株zikv于1947年在烏干達(dá)寨卡森林的恒河猴中被首次分離得到，第二株病毒于1948年在同一地區(qū)的白線斑蚊(aedes.africanus)分離得到。在2007年前，只偶爾出現(xiàn)人類(lèi)感染病例。2007年4月，zikv在西太平洋密克羅尼西亞的雅浦(yap)島上首次爆發(fā)，出現(xiàn)49例zikv感染確診病例，59例zikv感染疑似病例。2013年-2014年，zikv在法國(guó)波利尼西亞、復(fù)活節(jié)群島、庫(kù)克群島、新蘇格蘭再次暴發(fā)流行。2015年4月在巴西的爆發(fā)導(dǎo)致目前(2016年5月18日)全球60個(gè)國(guó)家出現(xiàn)zikv的感染。

zikv感染導(dǎo)致發(fā)燒、疹子、關(guān)節(jié)疼痛、肌肉疼痛、頭痛和結(jié)膜炎等癥狀，但癥狀多較溫和，為自限性疾病，一般2～7天后自行好轉(zhuǎn)。人感染后可獲得持久的終生免疫，目前沒(méi)有感染后再次感染的報(bào)道。

但是目前已證實(shí)zikv感染孕婦后，病毒可穿透胎盤(pán)屏障，或可導(dǎo)致嬰兒出現(xiàn)小頭癥或其他比較嚴(yán)重的腦損傷，尤其是在懷孕的前3個(gè)月。同時(shí)，zikv感染可能還與吉蘭-巴雷(guillain-barre)綜合征有關(guān)。

登革熱是由denv引起的由蚊子傳播的熱帶病。患者大約會(huì)在感染后3到14天后發(fā)作，癥狀包括發(fā)熱、頭痛、肌肉和關(guān)節(jié)痛，還有典型性的麻疹樣皮疹。少部分患者病情可進(jìn)一步惡化，出現(xiàn)登革出血熱，威脅生命，患者有出血、血小板減少和血漿蛋白滲出，或者進(jìn)展為登革休克綜合征，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)兇險(xiǎn)的低血壓休克。

黃熱病是由yfv引起的由蚊子傳播的急性病毒病，癥狀通常包括發(fā)燒、冷顫、食欲下降、惡心、肌肉痛(特別是背部)與頭痛。癥狀通常在發(fā)病5天內(nèi)會(huì)改善。有些病人會(huì)在癥狀改善1到2天后，發(fā)燒再度發(fā)生，出現(xiàn)腹痛，肝臟損傷導(dǎo)致黃疸，這類(lèi)病患并發(fā)出血和腎衰竭的風(fēng)險(xiǎn)較高。

然而，目前國(guó)際上尚未有效預(yù)防和/或治療zikv和denv感染的疫苗或藥物。雖然已經(jīng)針對(duì)yfv感染已有一種疫苗被開(kāi)發(fā)出來(lái)，但是目前尚未開(kāi)發(fā)出特效的藥物。目前，預(yù)防zikv、denv和yfv感染的主要措施是防止蚊蟲(chóng)的叮咬，而對(duì)zikv、denv和/或yfv感染的治療是對(duì)癥治療，緩解其疾病癥狀。所以亟需研究針對(duì)zikv、denv和/或yfv的特效藥物，希望能夠?yàn)楦腥緕ikv的孕婦提供特異性治療，以減少小頭癥嬰兒的出生，同時(shí)也為了防止預(yù)防和/或治療吉蘭-巴雷綜合征；還希望能夠預(yù)防或者治療由denv感染引起的登革熱以及由yfv感染引起的黃熱病。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可以抑制寨卡病毒(zikv)、登革病毒(denv)和/或黃熱病病毒(yfv)感染的小分子藥物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)zikv、denv和/或yfv感染的預(yù)防和/或治療。

在第一方面，本發(fā)明提供了一種抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染的方法，包括給予有效量的孟魯司特鈉。

在第二方面，本發(fā)明提供了孟魯司特鈉在制備用于抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染的藥物中的用途。

在第三方面，本發(fā)明提供了孟魯司特鈉在制備用于治療和/或預(yù)防寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染相關(guān)病癥或疾病的藥物中的用途。

通過(guò)使用孟魯司特鈉，zikv感染無(wú)論是在細(xì)胞水平上還是在動(dòng)物水平上均被有效地且特異地抑制，denv和yfv感染也被有效地且特異地抑制。同時(shí)毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，孟魯司特鈉對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性。

附圖說(shuō)明

圖1示出孟魯司特鈉對(duì)zikv毒株sz01感染bhk21細(xì)胞和vero細(xì)胞的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉可以有效抑制sz01對(duì)bhk21細(xì)胞和vero細(xì)胞的感染，ic50值分別約為0.33μm和1.21μm。

圖2示出孟魯司特鈉對(duì)zikv毒株flr感染bhk21細(xì)胞和vero細(xì)胞的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉可以有效抑制flr對(duì)bhk21細(xì)胞和vero細(xì)胞的感染，ic50值分別約為2.45μm和2.96μm。

圖3示出孟魯司特鈉對(duì)zikv毒株mr766感染bhk21細(xì)胞和vero細(xì)胞的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉可以有效抑制mr766對(duì)bhk21細(xì)胞和vero細(xì)胞的感染，ic50值分別約為1.78μm和1.92μm。

圖4示出孟魯司特鈉對(duì)denv-2和yfv-17d感染bhk21細(xì)胞的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉可以有效抑制denv-2和yfv-17d對(duì)bhk21細(xì)胞的感染，ic50值分別約為1.66μm和1.46μm。

圖5示出孟魯司特鈉在體外對(duì)人冠狀病毒hcov-oc43的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉對(duì)該毒株無(wú)明顯的抑制活性。

圖6示出孟魯司特鈉在體外對(duì)人冠狀病毒hcov-229e的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉對(duì)該毒株無(wú)明顯的抑制活性。

圖7示出孟魯司特鈉對(duì)bhk21細(xì)胞的毒性；從圖中可以看出，孟魯司特鈉無(wú)明顯毒性，其半數(shù)毒性濃度cc50>20000nm。

圖8示出孟魯司特鈉對(duì)ag6小鼠感染zikv毒株sz01的抑制；從圖中可以看出，與vehicle(dmso)相比，孟魯司特鈉明顯改善ag6小鼠的生存率。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)下文的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體技術(shù)方案作進(jìn)一步清楚和完整的描述。需要理解的是，下文中具體描述的技術(shù)方案僅用于示例目的，無(wú)意于以任何方式對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍進(jìn)行限制。在不背離本發(fā)明的精神和宗旨的情況下，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改。本發(fā)明的保護(hù)范圍由隨附的權(quán)利要求書(shū)來(lái)進(jìn)行限定。

如上所述，本發(fā)明的目的在于提供一種可以抑制寨卡病毒(zikv)、登革病毒(denv)和/或黃熱病病毒(yfv)感染的小分子藥物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)zikv、denv和/或yfv感染的預(yù)防和/或治療。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人以小分子藥物庫(kù)為基礎(chǔ)進(jìn)行了篩選工作，目的是篩選出具有抑制zikv病毒活性的小分子，用于對(duì)zikv感染的預(yù)防和/或治療。經(jīng)篩選，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，孟魯司特鈉表現(xiàn)出良好且特異的抑制zikv的活性。另外，本發(fā)明人還意外地發(fā)現(xiàn)，除了對(duì)zikv病毒良好且特異的抑制活性之外，孟魯司特鈉還表現(xiàn)出良好且特異的抑制denv和yfv的活性。

具體地，本發(fā)明人首先在細(xì)胞水平上研究了孟魯司特鈉對(duì)幾種zikv毒株感染bhk21和vero細(xì)胞的抑制作用，以及孟魯司特鈉對(duì)denv-2和yfv-17d感染bhk21細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該藥物可以有效抑制zikv的活性，其中抑制毒株sz01對(duì)bhk21細(xì)胞和vero細(xì)胞感染的半數(shù)抑制濃度ic50分別約為0.33μm和1.21μm，抑制毒株flr對(duì)bhk21細(xì)胞和vero細(xì)胞感染的ic50分別約為2.45μm和2.96μm，抑制毒株mr766對(duì)bhk21細(xì)胞和vero細(xì)胞感染的ic50分別約為1.78μm和1.92μm。該藥物還能有效抑制denv-2和yfv-17d的活性，抑制denv-2對(duì)bhk21細(xì)胞感染的半數(shù)抑制濃度ic50約為1.66μm，抑制yfv-17d對(duì)bhk21細(xì)胞感染的半數(shù)抑制濃度ic50約為1.46μm。

其次，本發(fā)明人還在動(dòng)物水平上研究了孟魯司特鈉對(duì)zikv的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)孟魯司特鈉對(duì)sz01毒株感染ag6小鼠也具有抑制作用，能明顯改善ag6小鼠的生存率。

再次，本發(fā)明人還在細(xì)胞水平上研究了孟魯司特鈉對(duì)兩株人冠狀病毒毒株感染hct-8和huh7細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然孟魯司特鈉對(duì)寨卡病毒、登革病毒和黃熱病病毒感染具有抑制作用，但對(duì)人冠狀病毒感染卻無(wú)明顯的抑制活性，由此表明孟魯司特鈉對(duì)上述黃病毒的抑制作用是特異的。

另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，孟魯司特鈉不具有明顯細(xì)胞毒性。在本發(fā)明中，發(fā)明人以bhk21細(xì)胞為例對(duì)孟魯司特鈉的細(xì)胞毒性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性，半數(shù)毒性濃度cc50>20000nm。因此，孟魯司特鈉具有較好的安全性。

基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人由此達(dá)成了本申請(qǐng)要求保護(hù)的發(fā)明。

在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述之前，首先對(duì)孟魯司特鈉作簡(jiǎn)單介紹。

孟魯司特鈉的英文名為montelukastsodium，其分子式為c35h35clno3s·na，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示：

孟魯司特鈉目前是一種已經(jīng)fda批準(zhǔn)用于臨床治療哮喘和過(guò)敏性鼻炎的藥物，為口服的白三烯受體拮抗劑，能特異性抑制氣道中的半胱氨酰白三烯(cyslt1)受體，改善氣道炎癥，有效控制哮喘癥狀。孟魯司特鈉在fda制定的藥物對(duì)妊娠的危險(xiǎn)性等級(jí)分類(lèi)中為b類(lèi)，具有較好的安全性，并且有文獻(xiàn)報(bào)道其還具有降低神經(jīng)炎癥，提升海馬神經(jīng)發(fā)生，改善老年動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶的作用。

因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染的方法，包括給予有效量的孟魯司特鈉。

所述方法可以直接在動(dòng)物體或者人體上實(shí)施，用于直接抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)寨卡病毒感染相關(guān)病癥或疾病的預(yù)防和/或治療。所述方法也可以在組織或者細(xì)胞水平上實(shí)施，用于例如進(jìn)行科學(xué)研究之目的。換言之，所述方法可以實(shí)施用于預(yù)防目的和/或治療目的，也可以實(shí)施用于非預(yù)防目的和/或非治療目的。

在此使用的術(shù)語(yǔ)“有效量”是指孟魯司特鈉能夠有效地抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、給藥方式等因素來(lái)確定所述有效量。

在第二方面，本發(fā)明提供了孟魯司特鈉在制備用于抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染的藥物中的用途。

在一個(gè)實(shí)施方案中，孟魯司特鈉與其它藥物聯(lián)合用于制備所述用于抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染的藥物。

所述其它藥物可以是，例如，恩利卡生(emricasan)、7-去氮-2’-c-甲基腺苷(7-deaza-2’-c-methyladenosine，7-deaza-2’-cma)、2’-c-甲基腺苷(2’-c-methyladenosine，2’-cma)、2’-c-甲基胞苷(2’-c-methylcytidine,2’-cmc)、2’-c-甲基鳥(niǎo)苷(2’-c-methylguanosine,2’-cmg)、2’-c-甲基尿苷(2’-c-methyluridine,2’-cmu)、(-)-表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯((-)-epigallocatechingallate,egcg)、氯硝柳胺(niclosamide)，但不限于此。

在第三方面，本發(fā)明提供了孟魯司特鈉在制備用于治療和/或預(yù)防寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染相關(guān)病癥或疾病的藥物中的用途。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寨卡病毒感染相關(guān)病癥或疾病是寨卡病毒感染引起的小頭癥或吉蘭-巴雷綜合征。

在本文中，當(dāng)述及用于治療和/或預(yù)防寨卡病毒感染引起的小頭癥時(shí)，是指將有效量的所述藥物直接給予寨卡病毒感染的孕婦，從而間接地治療該孕婦腹中胎兒所患小頭癥和/或間接地預(yù)防胎兒患上小頭癥。

小頭癥是指頭部遠(yuǎn)小于其他同齡和同性嬰兒頭部的新生兒畸形。若伴有腦發(fā)育不良，小頭癥嬰兒可能會(huì)有發(fā)育障礙。小頭癥從輕微到嚴(yán)重不等。造成小頭癥可能有許多原因，其中包括寨卡病毒感染。

吉蘭-巴雷綜合征是一種很少見(jiàn)但是很?chē)?yán)重的疾病，往往發(fā)生在病毒或者細(xì)菌感染后的幾天到幾周內(nèi)，會(huì)造成嚴(yán)重的神經(jīng)損傷，常見(jiàn)癥狀包括肌肉無(wú)力、疼痛、感官障礙，在相當(dāng)嚴(yán)重的情況下會(huì)造成癱瘓。吉蘭-巴雷綜合征是以周?chē)窠?jīng)和神經(jīng)根的脫髓鞘病變及小血管炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為病理特點(diǎn)的自身免疫性周?chē)窠?jīng)病，經(jīng)典型的吉蘭-巴雷綜合征被稱(chēng)為急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(aidp)，臨床表現(xiàn)為急性對(duì)稱(chēng)性弛緩性肢體癱瘓。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述登革病毒感染相關(guān)病癥或疾病是登革熱。

如前文所描述，登革熱是由denv引起的由蚊子傳播的熱帶病?；颊叽蠹s會(huì)在感染后3到14天后發(fā)作，癥狀包括發(fā)熱、頭痛、肌肉和關(guān)節(jié)痛，還有典型性的麻疹樣皮疹。少部分患者病情可進(jìn)一步惡化，出現(xiàn)登革出血熱，威脅生命，患者有出血、血小板減少和血漿蛋白滲出，或者進(jìn)展為登革休克綜合征，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)兇險(xiǎn)的低血壓休克。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述黃熱病病毒感染相關(guān)病癥或疾病是黃熱病。

如前文所描述，黃熱病是由yfv引起的由蚊子傳播的急性病毒病，癥狀通常包括發(fā)燒、冷顫、食欲下降、惡心、肌肉痛(特別是背部)與頭痛。癥狀通常在發(fā)病5天內(nèi)會(huì)改善。有些病人會(huì)在癥狀改善1到2天后，發(fā)燒再度發(fā)生，出現(xiàn)腹痛，肝臟損傷導(dǎo)致黃疸，這類(lèi)病患并發(fā)出血和腎衰竭的風(fēng)險(xiǎn)較高。

在一個(gè)實(shí)施方案中，孟魯司特鈉與其它藥物聯(lián)合用于制備所述用于抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染的藥物。

所述其它藥物可以是，例如，恩利卡生、7-去氮-2’-c-甲基腺苷、2’-c-甲基腺苷、2’-c-甲基胞苷、2’-c-甲基鳥(niǎo)苷、2’-c-甲基尿苷、(-)-表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯或氯硝柳胺，但不限于此。

本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，zikv、denv和yfv感染均在細(xì)胞水平上被有效地且特異地抑制，使用孟魯司特鈉還可以在動(dòng)物水平上有效地抑制zikv感染。同時(shí)毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，孟魯司特鈉對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性。因此，可以使用孟魯司特鈉抑制寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染，進(jìn)而預(yù)防和/或治療寨卡病毒、登革病毒和/或黃熱病病毒感染相關(guān)病癥或疾病，例如小頭癥、吉蘭-巴雷綜合征、登革熱或黃熱病。

實(shí)施例

實(shí)施例1.孟魯司特鈉在體外對(duì)zikv、denv和yfv感染的抑制

孟魯司特鈉抑制zikv、denv和yfv感染的實(shí)驗(yàn)操作可以參考文獻(xiàn)：zhiwusun,etal.,intranasaladministrationofmaleicanhydride-modifiedhumanserumalbuminforpre-exposureprophylaxisofrespiratorysyncytialvirusinfection；viruses2015,7,798-819；doi:10.3390/v7020798，具體如下：

(1)將zikv、denv和yfv通過(guò)分別接種c6/36細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增(參考scichinalifesci,doi:10.1007/s11427-016-5043-4)。

(2)使用無(wú)血清dmem在96孔板中梯度稀釋孟魯司特鈉，使其濃度分別為80μm、40μm、20μm、10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm，每孔加藥體積為50μl，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

(3)使用無(wú)血清dmem稀釋zikv(毒株分別為sz01、mr766、flr)、denv-2或yfv-17d，使得病毒的終濃度為100tcid50(半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量)/ml,按照每孔50μl的量將病毒加入(2)中的96孔板，同時(shí)設(shè)置病毒感染的陽(yáng)性組和無(wú)病毒無(wú)藥物的陰性組。病毒與藥物37℃條件下孵育1小時(shí)30分鐘。

(4)使用edta-egta消化液消化處理bhk21或vero細(xì)胞，使用含2％fbs的dmem將該細(xì)胞稀釋為2*10⁵/ml，并按100μl/孔的量加入

(3)中的96孔板。之后在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)。

(5)至陽(yáng)性組細(xì)胞出現(xiàn)明顯cpe(致細(xì)胞病變效應(yīng))導(dǎo)致細(xì)胞全部死亡時(shí)，使用cck8檢測(cè)孟魯司特鈉對(duì)病毒的抑制活性。cck8檢測(cè)的具體操作如下：

a)小心吸棄96孔板中的培養(yǎng)基，加入新鮮的含2％fbs的dmem，繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)。

b)將1mlcck8溶液加入9ml含2％fbs的dmem中(一塊96孔板的用量)，顛倒混勻，得到cck8反應(yīng)液。

c)小心吸棄96孔板中的培養(yǎng)基，將b)中所述的cck8反應(yīng)液加入96孔中，每孔100μl。

d)37℃條件下培養(yǎng)1小時(shí)，之后在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的od450吸光度值。

(6)計(jì)算孟魯司特鈉的抑制活性，使用的公式為：孟魯司特鈉的抑制活性＝(a藥物孔-a病毒孔)*100/(a無(wú)藥物孔-a病毒孔)，其中a藥物孔是指含有藥物、病毒、細(xì)胞和cck8的孔的吸光度，a病毒孔是指含有病毒、細(xì)胞和cck8的孔的吸光度，a無(wú)藥物孔是指只含有細(xì)胞和cck8的孔(無(wú)藥物無(wú)病毒)的孔的吸光度。

抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示：首先，孟魯司特鈉可以較好地抑制zikv的感染，抑制毒株sz01對(duì)bhk21細(xì)胞和vero細(xì)胞感染的半數(shù)抑制濃度ic50分別約為0.33μm和1.21μm(圖1)；抑制毒株flr對(duì)bhk21細(xì)胞和vero細(xì)胞感染的ic50分別約為2.45μm和2.96μm(圖2)；抑制毒株mr766對(duì)bhk21細(xì)胞和vero細(xì)胞感染的ic50分別約為1.78μm和1.92μm(圖3)。其次，孟魯司特鈉還可以較好地抑制denv-2和yfv-17d的感染，抑制denv-2對(duì)bhk21細(xì)胞感染的半數(shù)抑制濃度ic50約為1.66μm，抑制yfv-17d對(duì)bhk21細(xì)胞感染的半數(shù)抑制濃度ic50約為1.46μm(圖4)。

實(shí)施例2.孟魯司特鈉在體外對(duì)hcov-oc43和hcov-229e感染的抑制

(1)將人冠狀病毒毒株hcov-oc43(100tcid50)和hcov-229e(500tcid50)分別與如實(shí)施例1所制備的梯度稀釋的孟魯司特鈉混合，并將由此得到的混合液在37℃條件下孵育30分鐘。

(2)將hcov-oc43與孟魯司特鈉的混合液加入鋪有單層hct-8細(xì)胞的96孔板中，將hcov-229e與孟魯司特鈉混合液加入鋪有單層huh7細(xì)胞的96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將所述96孔板于33℃(hcov-oc43)或32℃(hcov-229e)孵育2小時(shí)，之后更換新鮮培養(yǎng)基。

(3)至陽(yáng)性組細(xì)胞出現(xiàn)明顯cpe(致細(xì)胞病變效應(yīng))時(shí)，使用cck8檢測(cè)孟魯司特鈉對(duì)病毒的抑制活性，cck8檢測(cè)的具體操作參見(jiàn)實(shí)施例1。

抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示：孟魯司特鈉對(duì)hcov-oc43(圖5)和hcov-229e(圖6)均無(wú)明顯的抑制活性，結(jié)合實(shí)施例1的結(jié)果可以得出如下結(jié)論：孟魯司特鈉對(duì)上述黃病毒的抑制具有一定的特異性。

實(shí)施例3孟魯司特鈉對(duì)bhk21細(xì)胞的毒性檢測(cè)

孟魯司特鈉對(duì)bhk21細(xì)胞的毒性檢測(cè)操作可以參考文獻(xiàn)：zhiwusun,etal.,intranasaladministrationofmaleicanhydride-modifiedhumanserumalbuminforpre-exposureprophylaxisofrespiratorysyncytialvirusinfection.viruses2015,7,798-819；doi:10.3390/v7020798)，具體如下：

(1)使用無(wú)血清dmem稀釋孟魯司特鈉，使其濃度分別為40μm、20μm、10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm、0.3125μm，每孔加藥體積為100μl，每個(gè)濃度設(shè)置2個(gè)重復(fù)。

(2)使用edta-egta消化液消化處理bhk21細(xì)胞，使用含2％fbs的dmem將細(xì)胞稀釋為4*10⁵/ml，并按100μl/孔的量加入(1)中的96孔板。之后在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)4天。

(3)小心吸棄96孔板中的培養(yǎng)基，加入新鮮的含2％fbs的dmem，繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)。

(4)將1mlcck8溶液加入9ml含2％fbs的dmem中(一塊96孔板的用量)，顛倒混勻，得到cck8反應(yīng)液。

(5)小心吸棄96孔板中的培養(yǎng)基，將(4)中所述的cck8反應(yīng)液加入96孔中，每孔100μl。

(6)37℃，5％co2條件下培養(yǎng)1小時(shí)，之后在酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的od450吸光度值。

(7)計(jì)算細(xì)胞的活性，使用的計(jì)算方法為：細(xì)胞活性＝(a藥物孔-a無(wú)細(xì)胞孔)*100/(a無(wú)藥物孔-a無(wú)細(xì)胞孔)，其中a藥物孔是指含有藥物、細(xì)胞和cck8的孔的吸光度，a無(wú)細(xì)胞孔是指不含藥物和細(xì)胞、只含有cck8的孔的吸光度，a無(wú)藥物孔是指不含藥物、只含細(xì)胞和cck8的孔的吸光度。

毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：孟魯司特鈉對(duì)bhk21細(xì)胞無(wú)明顯毒性，其半數(shù)毒性濃度cc50>20000nm(圖7)。

實(shí)施例4.孟魯司特鈉在小鼠模型中對(duì)zikv感染的抑制

發(fā)明人在此以zikv病毒為例，進(jìn)一步研究孟魯司特鈉在體內(nèi)對(duì)黃病毒感染的作用。孟魯司特鈉在小鼠模型中對(duì)zikv感染的抑制實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行：

(1)將20只ag6小鼠分成兩組(藥物組和對(duì)照組)，每組10只，藥物組以45mg/kg腹腔注射給藥，對(duì)照組腹腔注射dmso。

(2)8小時(shí)后，每只ag6小鼠腹腔注射1000pfu(空斑形成單位)的sz01病毒。病毒注射完畢后，藥物組以45mg/kg腹腔注射給藥，對(duì)照組腹腔注射dmso。

(3)藥物組連續(xù)7天以相同方式給藥，對(duì)照組連續(xù)7天以相同方式注射dmso，并每天觀測(cè)小鼠生存率。

小鼠模型抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示：孟魯司特鈉可以較好地抑制zikv毒株sz01對(duì)ag6小鼠的感染，從圖8中可以看出，與vehicle(dmso)相比，孟魯司特鈉明顯改善ag6小鼠的生存率。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明并不限于上述示例的細(xì)節(jié)，在不背離本發(fā)明的精神和宗旨的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到本文所描述技術(shù)方案的變化方案，并且該變化方案也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍由隨附權(quán)利要求所限定。

另外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書(shū)通過(guò)實(shí)施方式來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案。本說(shuō)明書(shū)的這種敘述方案僅為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將本說(shuō)明書(shū)當(dāng)作一個(gè)整體，各個(gè)實(shí)施方式中的技術(shù)方案可以適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其它實(shí)施方式。