本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及麒麟菜多肽防治肺纖維化的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺纖維化(pulmonaryfibrosis，pf)是常見的呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥，近年來(lái)發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì)，對(duì)人類的健康造成極大威脅。
基于美國(guó)胸科學(xué)會(huì)(ats)、歐洲呼吸學(xué)會(huì)(ers)、日本呼吸學(xué)會(huì)(jrs)和拉丁美洲胸科學(xué)會(huì)(alat)共同制定的《特發(fā)性肺纖維化診治循證指南》指出，一些藥物對(duì)ipf患者有潛在作用，對(duì)于用藥欲望強(qiáng)烈的患者可從以下4種治療方案中選擇：(1)n-乙酰半胱氨酸+硫唑嘌呤+潑尼松；(2)n-乙酰半胱氨酸單藥治療；(3)抗凝治療；(4)吡非尼酮。但是，以上藥物的使用會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，因此尋找防治肺纖維化有效天然藥物，一直是國(guó)內(nèi)外藥物研究的熱點(diǎn)。從天然活性物質(zhì)中尋找新的防治肺纖維化藥物或藥物前體的一個(gè)重要策略。
麒麟菜(eucheuma)，也叫雞腳菜、雞膠菜，屬藻類的藻體肥厚多肉，圓柱狀，扁壓或扁平，輻射或兩側(cè)分枝，該屬約有20種，中國(guó)約有5種，為熱帶性海藻，具有很高的藥用價(jià)值。麒麟菜多肽組份來(lái)源于麒麟菜，本發(fā)明人團(tuán)隊(duì)前期研究(專利201510163788.2)從麒麟菜原料中制得一種多肽提取物，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該提取物具有很好的抗血小板聚集，延長(zhǎng)出血時(shí)間和凝血時(shí)間，抑制血栓形成的新性能，可以將該提取物應(yīng)用于制備抗血小板聚集或抗血栓的藥物、藥物組分、藥物前體或保健品。
目前國(guó)內(nèi)外均尚未有麒麟菜多肽組份防治肺纖維化的相關(guān)研究，未有用麒麟菜多肽組份作防治肺纖維化藥物或保健品使用的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有肺纖維化治療藥物的缺陷和不足，提供一種低分子量麒麟菜多肽組份及其在防治肺纖維化的應(yīng)用。本發(fā)明從麒麟菜中純化獲得的麒麟菜多肽組份，能夠顯著地抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化形成，具有顯著的防治肺纖維化功能。
本發(fā)明的目的是提供一種麒麟菜多肽在制備防治肺纖維化的藥物或保健品中的應(yīng)用。
本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
本發(fā)明公開了麒麟菜多肽在制備防治肺纖維化的藥物或保健品中的應(yīng)用。
具體地，麒麟菜多肽防治肺纖維化的用法：可單一使用；也可作為防治纖維化藥物或保健品其中一個(gè)組份使用。所述應(yīng)用包括作為防治肺纖維化藥物和保健品組分，或利用麒麟菜多肽組份作為防治肺纖維化藥物前體改造，或與治療肺纖維化藥物聯(lián)合應(yīng)用治療肺纖維化。
麒麟菜多肽在防治肺纖維化的應(yīng)用可以有如下多種方法：
方法1：口服麒麟菜多肽1～10mg/kg，每天一次，連續(xù)服藥至少35天。
方法2：注射麒麟菜多肽1～10mg/kg，每天一次，連續(xù)服藥至少35天。
方法3：與目前使用的治療肺纖維化藥物聯(lián)合應(yīng)用，口服麒麟菜多肽1～10mg/kg，每天一次。
具體優(yōu)選地，所述麒麟菜多肽由如下方法制備得到：麒麟菜粉碎后利用hcl溶液勻漿和氯化鉀溶液制得粗提液，粗提液過(guò)濾、柱層析純化分離得到單一電泳條帶的分子量低于10kda的多肽組份。
更具體地，所述麒麟菜多肽由如下方法制備得到：
s1.取新鮮麒麟菜粉碎，加入濃度為15～25mmol/l的hcl溶液勻漿制得粗制液，所述hcl溶液的加入量按每千克麒麟菜加入8～12l；
s2.粗制液中加入適量飽和氯化鉀溶液至氯化鉀的濃度為1.3～1.8％；
s3.將步驟s2的粗制液離心分離，取上清液，上清液粗過(guò)濾后采用凝膠柱層析分離，使用濃度為15～25mmol/l的hcl溶液洗脫，洗脫峰有兩組；
s3.收集第二組洗脫產(chǎn)物，調(diào)節(jié)溶液酸堿度至ph值6.0～7.0后，離心分離，上清液冷凍干燥制得所需提取物。
其中，優(yōu)選地，所述凝膠柱層析采用的凝膠柱為葡聚糖g-50凝膠柱。
優(yōu)選地，所述葡聚糖g-50凝膠柱的柱高為28～32cm，內(nèi)徑寬度為1.8～2.2cm。
更優(yōu)選地，所述葡聚糖g-50凝膠柱的柱高30cm，內(nèi)徑寬度2.0cm。
優(yōu)選地，所述凝膠柱層析分離時(shí)，粗制液的上樣高度為凝膠柱柱高的5～10％。
優(yōu)選地，所述凝膠柱層析分離時(shí)，洗脫液的流速控制為0.8～1.2ml/min。
優(yōu)選地，所述上清液粗過(guò)濾具體為采用2～4層紗布過(guò)濾，所述紗布為本領(lǐng)域過(guò)濾常用的紗布。
優(yōu)選地，步驟s1或s3所述離心分離為低速離心分離，具體離心的轉(zhuǎn)速為8000～12000轉(zhuǎn)/min，離心時(shí)間為13～18min。
一種包含有麒麟菜多肽的防治肺纖維化的藥物或保健品，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
具體地，藥物或保健品的劑型可以有如下使用形式：
(1)可制成粉劑，用生理鹽水溶解口服。
(2)可制成注射針劑，按注射針劑要求使用。
(3)可制添加糖飲料，制成口服液產(chǎn)品。
使用條件無(wú)特殊要求，可在室溫條件下使用，劑量為：1～10mg/kg/每天，按蛋白多肽組份類食品或藥物的條件使，同時(shí)參照目前市面的防治肺纖維化藥物和保健品的適用范圍。
本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，麒麟菜多肽組份具有很好的防治肺纖維化的效果，肺組織中羥脯氨酸(hyp)及血漿中丙二醛(mda)的含量明顯降低；血漿中總超氧化物歧化酶(t-sod)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(gsh-px)的含量明顯增加?？梢岳迷摮煞种苽浞乐畏卫w維化的藥物或藥物組分或藥物前體。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明從麒麟菜中純化獲得的麒麟菜多肽組份能夠顯著地抑制肺纖維化形成，具有顯著的防治肺纖維化功能，在肺纖維化防治方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值和前景。
附圖說(shuō)明
圖1為小鼠肺組織切片he染色觀察(×200)；a.對(duì)照組；b.模型組；c.麒麟菜多肽低劑量組；d.麒麟菜多肽中劑量組；e.麒麟菜多肽高劑量組；f.吡非尼酮組。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
除非特別說(shuō)明，實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。
實(shí)施例1麒麟菜多肽的制備
1、制備麒麟菜多肽
取1kg麒麟菜粉碎，用10l20mmol/lhcl溶液勻漿制備成粗制液，若溶液粘稠，則加入氯化鉀至濃度1.5％；將所得粗制液用8000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，收集上清液，將上清液用三層紗布過(guò)濾，用葡聚糖g-50(sephadexg-50)分離(柱高30cm，內(nèi)徑寬度2.0cm，上樣品高度為柱高5～10％)。平衡后，用20mmol/lhcl溶液洗脫，流速1.0ml/min，洗脫峰有兩組，收集第二組洗脫產(chǎn)物，調(diào)節(jié)溶液酸堿度至ph6.0～7.0，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，上清液冷凍干燥制得所需提取物。
2、經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)證實(shí)是單一電泳條帶，分子量低于10kda的多肽組份。
實(shí)施例2防治肺纖維化實(shí)驗(yàn)
1、試驗(yàn)方法
(1)動(dòng)物：spf級(jí)km小鼠，22g±2g，60只，雌性。
(2)分組
小鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為以下各組：對(duì)照組、模型組、吡非尼酮組(50mg/kg)、麒麟菜多肽低劑量組(1mg/kg)、麒麟菜多肽中劑量組(5mg/kg)、麒麟菜多肽高劑量組(10mg/kg)，每組10只。
(3)用1％戊巴比妥鈉按照50mg/kg的劑量腹腔注射麻醉小鼠后，仰臥固定于操作臺(tái)，用鑷子拉出舌頭暴露氣管，在冷光源放大鏡下緩慢注入5mg/kg博萊霉素。注射完畢后迅速豎起鼠板，旋轉(zhuǎn)3分鐘，使藥液在肺內(nèi)均勻分布。對(duì)照組同前方法氣管內(nèi)注入等體積等滲鹽水。10天后開始以0.1ml/10g進(jìn)行灌胃給藥，對(duì)照組及模型組灌胃等體積的等滲鹽水，其余各組灌胃相應(yīng)劑量的藥物，連續(xù)給藥至35天，每天1次。
(4)取材與指標(biāo)測(cè)定：
給藥35天后將小鼠麻醉取血處死，分離得到完整的兩肺組織，稱重，取右肺上葉同一部位，用4％的多聚甲醛固定48小時(shí)，石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法(he)染色供組織病理學(xué)觀察。
取左肺中葉同一部位進(jìn)行肺組織hyp含量的檢測(cè)。
收集血漿，檢測(cè)t-sod、mda、gsh-px含量。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用spss17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以p≤0.05表示為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2、結(jié)果
(1)小鼠肺組織hyp含量分析
各組小鼠肺組織hyp含量
表1小鼠肺組織hyp含量分析
注：與正常組比較：*p<0.01；與模型組比較：#p<0.01。
(2)小鼠血漿t-sod、mda、gsh-px含量分析
各組小鼠血漿t-sod、mda、gsh-px含量
表2小鼠血漿t-sod、mda、gsh-px含量分析
注：與正常組比較：*p<0.01；與模型組比較：#p<0.01。
(3)肺組織病理變化分析
如圖1，對(duì)照組肺結(jié)構(gòu)清晰，模型組肺泡間隔顯著變寬，肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，萎縮塌陷嚴(yán)重，膠原纖維顯著增多，出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而麒麟菜多肽低、中、高劑量組及吡非尼酮組肺纖維化逐步減輕。