本發(fā)明屬于藥品制劑技術(shù)領(lǐng)域，具有涉及一種染料木素-維生素e琥珀酸酯-聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯納米膠束的制備方法。

背景技術(shù)：

染料木素(4′,5,7-三羥基異黃酮，genistein，gen)，又名染料木黃酮、金雀異黃酮，淡黃色至淺褐色粉末，是一種植物雌激素，存在于人及動(dòng)物食用的各種植物中，尤其在大豆、三葉草、苜蓿、燕麥、大麥、黑麥、小麥、玉米中含量較高。廣泛的流行病學(xué)動(dòng)物研究和體外實(shí)驗(yàn)表明，gen對(duì)癌癥、心血管疾病、骨質(zhì)疏松和絕經(jīng)后癥狀等有一定的療效。目前gen膠囊作為i類新藥已經(jīng)進(jìn)入臨床ii期研究，然而gen具有低溶解性，高滲透性，在生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中屬染料木素-維生素e琥珀酸酯-聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯納米膠束于bcsii，水中的溶解度很低，只有0.13μg/ml(37℃)，口服生物利用度較低。

目前尚無(wú)關(guān)于改善gen水溶性與生物利用度方法的報(bào)道，因此解決gen在水中溶解度低以及提高gen的生物利用度成為亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決染料木素在水中溶解度低以及提高其生物利用度，本發(fā)明利用復(fù)配表面活性劑的原理，以聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯(tpgs)和天然維生素e琥珀酸酯(ves)制備gen-ves-tpgs納米膠束，gen的口服生物利用度得到顯著的提高，且膠束粒徑小，穩(wěn)定性高。

本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：

染料木素-維生素e琥珀酸酯-聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯納米膠束的制備方法，具體操作方法為：

稱取染料木素、天然維生素e琥珀酸酯、聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯，加入無(wú)水乙醇中超聲溶解，35-45℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，加入磷酸鹽緩沖液，在45-55℃的條件下攪拌水化2-5h，然后于4℃，離心，上清液經(jīng)過(guò)細(xì)胞粉碎儀破碎，微孔濾膜濾過(guò)，濾液即為澄清透明的gen-ves-tpgs納米膠束。

由于使用pbs水化較水作為水化溶劑形成的膠束具有更好的澄明度及更小的粒徑，因此水化時(shí)采用pbs為溶劑。

作為優(yōu)選，所述染料木素、天然維生素e琥珀酸酯、聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯和無(wú)水乙醇的質(zhì)量比為3-5:10-25:50-125:4。

作為優(yōu)選，所述的磷酸鹽緩沖液的加入量為1.7-3.3ml/mg染料木素。

作為優(yōu)選，所述的磷酸鹽緩沖液的ph為7.1-7.3。

作為優(yōu)選，所述的離心操作的轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心時(shí)間為10min。

作為優(yōu)選，所述的微孔濾膜的孔徑為0.2-0.3μm。

聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯(tpgs)是由天然維生素e琥珀酸酯(ves)的羧基與聚乙二醇(peg)酯化而成，hlb值約為13～17，具有良好的兩親性和較好的水溶性，無(wú)明顯的生殖毒性，是一種安全的輔料。由于tpgs的兩親性以及良好的水溶性，在藥物傳遞系統(tǒng)中有著廣泛的應(yīng)用，在制備膠束時(shí)，隨著tpgs在水中濃度變化可得到各向同性的球狀、圓筒狀、正反六角形、反球狀膠束。tpgs與其他表面活性劑相比，其生育酚酯的結(jié)構(gòu)具有較好的抗氧化性，更有助于增加制劑的穩(wěn)定性。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明以聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯為表面活性劑，采用天然維生素e琥珀酸酯復(fù)配，制備出粒徑、zeta電位大小合適的gen-ves-tpgs納米膠束，所制備gen-ves-tpgs納米膠束澄明度好，平均粒徑為(43.50±1.65)nm，包封率為(98.99±0.69)％，載藥量為(2.57±0.04)％；膠束呈球形，可見(jiàn)明顯的囊泡結(jié)構(gòu)，gen原料藥和納米膠束在體外均呈現(xiàn)緩釋特征；大鼠ig藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，所構(gòu)建的gen納米膠束生物利用度為gen原料藥的162.96％。

附圖說(shuō)明

圖1為gen-ves-tpgs納米膠束粒徑分布和tem圖。

圖2為gen-ves-tpgs膠束和gen原料藥釋藥曲線圖。

圖3為大鼠口服gen原料藥與gen-ves-tpgs納米膠束后時(shí)間-血藥濃度曲線。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

采用薄膜分散法制備gen-ves-tpgs納米膠束：精密稱取6mggen、30mgves、200mgtpgs適量，加入10ml無(wú)水乙醇超聲溶解，40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，加入15ml的磷酸鹽緩沖液(pbsph7.2)，在50℃的條件下攪拌水化3h，然后于4℃，10000r/min離心10min，上清液經(jīng)過(guò)細(xì)胞粉碎儀破碎，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，濾液即為澄清透明的gen-ves-tpgs納米膠束。

采用透射電子顯微鏡(tem)觀察納米膠束粒子形態(tài)，取適量的納米膠束溶液滴加在銅網(wǎng)上，用濾紙?jiān)谶吘壩ザ嘤嗟募{米膠束，然后滴加1％的醋酸雙氧鈾負(fù)染，自然晾干后觀察膠束粒子形態(tài)，見(jiàn)圖1。在最終的處方工藝下所制備的納米膠束的平均粒徑為(43.50±1.65)nm，多分散系數(shù)為0.17±0.04，zeta電位為(-30.33±1.55)mv，表明所制備的納米膠束粒徑大小合適，粒徑均一，表面呈負(fù)電荷，膠束形態(tài)完整，呈球形，分布均勻，可見(jiàn)明顯的囊泡結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例2

采用薄膜分散法制備gen-ves-tpgs納米膠束：精密稱取8mggen、20mgves、210mgtpgs適量，加入10ml無(wú)水乙醇超聲溶解，35℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，加入13.6ml的磷酸鹽緩沖液(pbsph7.1)，在55℃的條件下攪拌水化2h，然后于4℃，10000r/min離心10min，上清液經(jīng)過(guò)細(xì)胞粉碎儀破碎，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，濾液即為澄清透明的gen-ves-tpgs納米膠束。

實(shí)施例3

采用薄膜分散法制備gen-ves-tpgs納米膠束：精密稱取10mggen、50mgves、180mgtpgs適量，加入10ml無(wú)水乙醇超聲溶解，45℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，加入33ml的磷酸鹽緩沖液(pbsph7.3)，在45℃的條件下攪拌水化5h，然后于4℃，10000r/min離心10min，上清液經(jīng)過(guò)細(xì)胞粉碎儀破碎，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，濾液即為澄清透明的gen-ves-tpgs納米膠束。

gen-ves-tpgs納米膠束包封率的測(cè)定

采用高速離心法(10000r/min，10min，4℃)除去膠束中的游離藥物，上清液經(jīng)過(guò)細(xì)胞粉碎儀破碎，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，濾液即為載藥膠束。分別取1ml離心前的膠束溶液和載藥膠束溶液，加入適量的無(wú)水乙醇，超聲破壞膠束結(jié)構(gòu)后，稀釋至10ml，精密吸取0.1ml用無(wú)水乙醇稀釋至10ml，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，測(cè)定膠束中g(shù)en的量，計(jì)算包封率；同時(shí)將載藥膠束溶液在-80℃冰箱中預(yù)凍24h后，取出，放入凍干機(jī)凍干12h后(真空度＜10pa)取出，得到膠束凍干品。稱取一定量的膠束凍干品，加入無(wú)水乙醇超聲溶解破壞，測(cè)定gen的量，計(jì)算載藥量。

包封率＝納米膠束中g(shù)en量/gen的投藥量

載藥量＝凍干膠束中g(shù)en量/凍干膠束的質(zhì)量

不同的藥物-載體比例對(duì)gen-ves-tpgs納米膠束包封率、載藥量、平均粒徑、zeta電位的影響見(jiàn)表1：

表1：

從表1中可以看出：膠束的包封率及載藥量隨著ves用量的增加先增加后降低，在此基礎(chǔ)上固定ves與tpgs的量，考察不同藥物-載體比例下膠束的包封率、載藥量、平均粒徑、zeta電位，結(jié)果見(jiàn)表1。當(dāng)藥物-載體比例為3∶115時(shí)膠束的包封率接近99％，膠束澄明度好，未離心出游離藥物，載體基本能將投入的gen全部包封。隨著藥物-載體比例增大，膠束包封率一直下降，在藥物-載體比為4∶115時(shí)，水化后的膠束中有明顯可見(jiàn)不溶性藥物及載體析出，隨著藥物-載體比例增大，水化后的膠束中游離藥物與載體逐漸增加，當(dāng)藥物-載體比例為6∶115時(shí)，膠束的包封率僅為(50.56±0.81)％。5個(gè)不同藥物-載體比例下的膠束載藥量接近，可知在水化體積一定時(shí)形成的載藥膠束中藥物濃度基本固定，膠束疏水內(nèi)核中的藥物基本飽和，無(wú)法再進(jìn)一步包封更多的藥物進(jìn)去。

體外釋藥行為考察

選擇gen原料藥作為對(duì)照，精密稱取30mg的gen原料藥，精密加入3ml無(wú)水乙醇，超聲溶解，精密移取0.5ml，用pbs(ph7.2±0.1)定容至10ml，形成0.5mg/ml的gen混懸液^[14]。稱取含有5mggen的納米膠束凍干品，加入pbs溶脹后，定容到10ml，得到含gen0.5mg/ml的納米膠束溶液。分別吸取2ml的gen混懸液與納米膠束溶液放入處理好的透析袋中，兩端扎緊。將透析袋置于50ml釋放介質(zhì)中(ph7.2±0.1的pbs，含2％聚山梨酯-80)。原料藥組和膠束組分別平行3組，于(37.0±0.5)℃恒溫水浴振蕩(50r/min)。分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72、84、96h取1ml含藥釋放介質(zhì)，同時(shí)補(bǔ)加同溫1ml空白釋放介質(zhì)，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，續(xù)濾液采用高效液相色譜項(xiàng)方法測(cè)定gen量，具體測(cè)試條件為：c18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(60∶40)，體積流量1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，柱溫28℃，進(jìn)樣量10μl，理論塔板數(shù)不低于2800。累積釋放曲線見(jiàn)圖2。結(jié)果表明gen原料和納米膠束在體外均呈現(xiàn)緩釋特征，由于被膠束包裹，納米膠束緩釋效果比原料藥明顯。

藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究

gen原料藥組和膠束組各6只sd大鼠，分別ig給予gen0.5％cmc-na混懸液和gen凍干膠束pbs復(fù)溶液，給藥量為65mg/kg。分別在ig給藥后5、10、20、30、40min及1、2、3、5、8、12、24h經(jīng)過(guò)眼眶取血0.6ml，8000r/min離心10min，吸取300μl血漿，加入800μl醋酸乙酯，渦旋1min，離心，吸取上清液，下層液體再加入400μl醋酸乙酯，渦旋1min，離心，吸取上層液體合并到第1次萃取液中，40℃水浴下氮?dú)獯蹈?，加?00μl無(wú)水乙醇，超聲，渦旋混勻后離心，吸取上清液至微量進(jìn)樣管中，經(jīng)hplc分析，測(cè)定gen的血藥濃度。

藥動(dòng)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取gen對(duì)照品10.6mg，用無(wú)水乙醇稀釋得到質(zhì)量濃度分別為2.544、1.02、0.407、0.163、0.065、0.026μg/ml的gen對(duì)照品溶液，按hplc法測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，gen質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝61370x+2.3802，線性范圍為0.026～2.544μg/ml，r＝0.9996，線性關(guān)系良好。

gen混懸液與gen-ves-tpgs納米膠束的血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3，從圖3可以看出：將gen制備成gen-ves-tpgs納米膠束后在大鼠體內(nèi)的生物利用度有較大提高。

以上僅列舉了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限制于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所作的任何改變均落入本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。