本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種能促進蛋白質(zhì)或多肽口服吸收的酵母細胞壁微粒制劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

近年來，越來越多的蛋白質(zhì)多肽藥物進入臨床實驗或臨床治療階段，其主要給藥方式為注射途徑，但實踐顯示，由于大多數(shù)蛋白質(zhì)和多肽藥物體內(nèi)生物半衰期短，需要頻繁給藥，病人順應(yīng)性極差；所以開發(fā)非注射途徑的蛋白質(zhì)多肽制劑成為目前藥劑學(xué)領(lǐng)域研究的熱點，也是有關(guān)領(lǐng)域需要重點突破的課題。臨床實踐表明，口服給藥是最方便也最為安全的臨床用藥途徑，但是蛋白質(zhì)和多肽藥物存在以下幾個問題，導(dǎo)致口服生物利用度很低，無法起到較好的治療效果：1.胃液中不穩(wěn)定，易被胃蛋白酶快速降解；2.可受腸道內(nèi)的蛋白酶的降解；3.蛋白質(zhì)和多肽藥物親水性強，細胞膜通透性差；4.蛋白質(zhì)分子量大，是導(dǎo)致膜通透性差的一個原因。目前提高蛋白質(zhì)多肽藥物口服吸收的研究已非常廣泛，主要包括以下幾種方法：1.采用滲透促進和蛋白酶抑制劑可在一定程度上提高其生物利用度，但是由于其存在較為嚴重的毒性，其發(fā)展前景尚不可預(yù)知；2.采用轉(zhuǎn)鐵蛋白(tf)、細胞穿膜肽tat等修飾提高細胞的通透性；3.采用微粒給藥系統(tǒng)提高胰島素的口服生物利用度是目前研究最為熱門的方面，微粒給藥系統(tǒng)可以在一定程度上保護藥物免受酶的降解，同時可以提高藥物跨膜的能力，目前主要的有納米粒、脂質(zhì)體、微乳以及復(fù)乳等；但是目前的微粒給藥系統(tǒng)仍然不能顯著的提高其生物利用度，主要原因在于粒子無法大量跨過腸細胞膜而轉(zhuǎn)運藥物。

研究顯示，腸道內(nèi)存在一種特殊的結(jié)構(gòu)-派爾氏結(jié)(peyer’spatch)，派爾氏結(jié)可以吞噬較大的顆粒，并將其運送至淋巴循環(huán)，從而進入體循環(huán)而發(fā)揮藥物療效；而酵母細胞壁顆粒中富含β-葡聚糖，可特異性的靶向于m細胞，從而增加其轉(zhuǎn)運效果。本申請的發(fā)明人基于上述現(xiàn)有技術(shù)的依據(jù)，以及酵母細胞壁價廉易 得，可直接使用面包酵母制得，且具有較好的安全性，適合作為藥物給藥系統(tǒng)的材料的優(yōu)勢，擬提供一種促進蛋白多肽藥物口服吸收的酵母細胞壁微粒制劑，借助酵母細胞壁具有較大的空腔，和具有很高的載藥量的特點，通過增加m細胞的靶向作用增加體內(nèi)的生物利用度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種促進蛋白多肽藥物口服吸收的酵母細胞壁微粒制劑，通過酵母細胞壁顆粒載蛋白質(zhì)或多肽提高其口服生物利用度。本發(fā)明制劑生物利用度且效果可維持較長的時間，使用方便，重現(xiàn)性好。

基于現(xiàn)有技術(shù)中，由于蛋白質(zhì)多肽藥物在胃腸道中不穩(wěn)定，易受到胃腸道中各種蛋白酶的降解作用，且跨膜能力很差，導(dǎo)致生物利用度極低，酵母細胞壁顆粒可直接靶向于派爾氏結(jié)的m細胞，而m細胞具有很強的轉(zhuǎn)運微粒的能力，且藥物包裹在酵母細胞壁顆粒中也可避開胃腸道中蛋白酶的破壞，從而可以增加其在胃腸道中的穩(wěn)定性；但是如果將蛋白質(zhì)或多肽藥物直接包載在酵母細胞壁微粒中，在胃腸道中極易從細胞壁孔道中泄露的缺陷，本發(fā)明通過對其在酵母細胞壁微粒內(nèi)部進行凝膠化作用而使蛋白質(zhì)或多肽藥物能保留在內(nèi)部，從而通過m細胞大量轉(zhuǎn)運酵母細胞壁顆粒，而增加蛋白質(zhì)多肽進入體循環(huán)內(nèi)的濃度，進而增加蛋白多肽藥物的口服生物利用度。

本發(fā)明提供如下技術(shù)方案解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題：

本發(fā)明的一種促進蛋白質(zhì)和多肽藥物口服吸收的酵母細胞壁微粒制劑，其特征在于，由蛋白質(zhì)或多肽藥物、藥物輔料和酵母細胞壁顆粒組成，所述的蛋白質(zhì)或多肽藥物或與輔料共同被包裹于酵母細胞壁中，在一定溫度下實現(xiàn)內(nèi)部凝膠化。

本發(fā)明中，所述的酵母細胞壁顆粒通過面包酵母制得。

本發(fā)明中，所述的輔料選自泊洛沙姆、海藻酸鈉或殼聚糖。

本發(fā)明中，所述的泊洛沙姆是泊洛沙姆407或188，或二者的混合物。

本發(fā)明中，所述的泊洛沙姆407的濃度為10-50％，泊洛沙姆188的濃度為 10-50％，泊洛沙姆407與188的比例為5:1-4。

本發(fā)明中，所述的海藻酸鈉與鈣離子或殼聚糖配合使用，其中海藻酸鈉與鈣離子的比例為1:0.1-5，海藻酸鈉與殼聚糖的比例為1:0.1-5。

本發(fā)明中，所述的蛋白質(zhì)或多肽藥物為其水溶液，ph為1.0-8.0，濃度為0.1-10mg/ml。

本發(fā)明中，所述的含蛋白質(zhì)或多肽藥物的酵母細胞壁微粒制劑通過兩步法制備，其包括，首先制備蛋白質(zhì)或多肽的水溶液，然后將酵母細胞壁粉末分散在該溶液中，所述蛋白質(zhì)或多肽擴散進入酵母細胞壁內(nèi)部，最后通過調(diào)節(jié)ph至蛋白質(zhì)多肽的等電點附近，將其沉淀，離心，洗滌，加入輔料溶液，進行內(nèi)部凝膠化。

所述的制備方法中，當(dāng)輔料使用海藻酸鈉時，需在除掉外相蛋白質(zhì)或多肽以及輔料后，再加入鈣離子或殼聚糖對內(nèi)部海藻酸鈉進行交聯(lián)；當(dāng)輔料使用泊洛沙姆時，需在低溫下操作使其為溶液態(tài)，在除掉外相蛋白質(zhì)或多肽以及輔料后，升高溫度使其內(nèi)部凝膠化。

本發(fā)明的一個實施例中，首先以胰島素為模型藥物，制備載胰島素的內(nèi)部凝膠化酵母細胞壁微粒，并進一步對其進行體內(nèi)外評價。

其中，提供了一種促進胰島素口服生物利用度的酵母細胞壁微粒，其由胰島素、輔料和酵母細胞壁顆粒組成，其中活性成分胰島素被包載于酵母細胞壁內(nèi)部，所述輔料為可凝膠化的材料；

所述的胰島素的濃度優(yōu)選為0.1-100mg/ml；

所述的酵母細胞壁微粒由面包酵母制得，面包酵母通過酸堿處理，干燥得酵母細胞壁微粒。

所述的凝膠化材料包括泊洛沙姆188、407以及海藻酸鈉中的一種或幾種。

本發(fā)明中，通過下述方法制備所述的載胰島素酵母細胞壁微粒：

稱取一定量的酵母細胞壁粉末分散在胰島素溶液中，渦旋混合均勻，用1m的鹽酸調(diào)節(jié)ph至2，然后在4℃條件下200rpm磁力攪拌2h，用1m的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至5.6(胰島素的等電點附近)，使胰島素大量析出沉淀，使孵育在 酵母細胞壁內(nèi)腔和孔道中的胰島素沉積在這些腔道內(nèi)部；重復(fù)上述操作3次，通過反復(fù)調(diào)節(jié)ph增加在酵母細胞壁內(nèi)部沉積的胰島素的量，提高載藥量；然后2000g離心10min，棄上清的胰島素，加入特定濃度的ph7.0的凝膠化材料溶液，在室溫條件下孵育4h；最后2000g離心10min收集沉淀，改變條件實現(xiàn)內(nèi)部凝膠化，在濾紙上用熱水洗去殘留的輔料溶液和胰島素。

所述的凝膠化材料選自泊洛沙姆407、188以及海藻酸鈉中的一種或幾種，其中優(yōu)選泊洛沙姆407.

本發(fā)明制得的載胰島素的內(nèi)部凝膠化的酵母細胞壁微粒(以下簡稱為p-ins-gms)，用馬爾文測定粒徑和電位，用掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)如圖1所示。

本發(fā)明通過體外穩(wěn)定性和體內(nèi)降糖實驗的比較，結(jié)果表明，本發(fā)明通過酵母細胞壁微粒包載胰島素，并對其進行內(nèi)部凝膠化，提高了胰島素在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性，并且通過靶向m細胞增加了胰島素的口服生物利用度。

附圖說明

圖1顯示了：空白酵母細胞壁微粒(gms)(a)和它的橫切面(b)，胰島素凝膠化酵母細胞壁微粒(p-ins-gms)(c)以及橫切面(d)的掃描電鏡圖；空白gms和p-ins-gms粒徑圖(e)。

圖2.為凝膠化(ins-gms)和凝膠化(p-ins-gms)酵母細胞壁微粒在不含酶的sgf(a)和sif(b)中的釋放，

其中顯示了胰島素在含酶的sgf(c)和sif(d)中的降解曲線。

圖3.為口服給予不同胰島素制劑在正常大鼠(a)和糖尿病大鼠(b)體內(nèi)的降血糖曲線(n＝4)，其中顯示，正常大鼠和糖尿病大鼠降糖曲線上面積與劑量的相關(guān)性(c)。

具體實施方式

實施例1

制備酵母細胞壁顆粒粉末：取面包酵母100g，加入1lnaoh(1m)溶液，于80℃恒溫水浴鍋內(nèi)孵育1h，50rpm慢速攪拌。然后2000g離心10min，收集沉淀，將沉淀重新分散于1l純水中，用2m的鹽酸調(diào)節(jié)ph至4.5左右，50rpm慢速攪拌下于55℃恒溫水浴鍋中孵育1h，再次2000g離心10min收集沉淀，依次分別用1l純水洗一次，200ml異丙醇洗四次，200ml丙酮洗兩次，最后收集沉淀，真空干燥，稱量計算產(chǎn)率；

包載胰島素：稱取1g制備的酵母細胞顆粒發(fā)(gms)粉末分散在5ml胰島素(ins)溶液中(10mg/ml)，渦旋混合均勻，用1m的鹽酸調(diào)節(jié)ph至2，然后在4℃條件下200rpm磁力攪拌2h，用1m的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至5.6(ins的等電點附近)，ins大量析出沉淀，使孵育在gms內(nèi)腔和孔道中的ins沉積在這些腔道內(nèi)部；重復(fù)上述操作3次，通過反復(fù)調(diào)節(jié)ph增加在gms內(nèi)部沉積的ins的量，從而提高載藥量；然后2000g離心10min，棄上清的ins，加入特定濃度的ph7.0的poloxamer溶液，在室溫條件下孵育4h，最后2000g離心10min收集沉淀，升溫到tgel以上使gms內(nèi)部的poloxamer形成凝膠態(tài)，在濾紙上用熱水洗去殘留的poloxamer和ins；

取制備的載胰島素的內(nèi)部凝膠化的酵母細胞壁微粒(以下簡稱為p-ins-gms)，用馬爾文測定粒徑和電位，用掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)如圖1所示。

實施例2載胰島素的內(nèi)部凝膠化的酵母細胞壁微粒的體外釋放和抗酶降解實驗

體外釋放實驗：準備10ml不含酶的人工胃液或者人工腸液，在恒溫水浴振蕩器中預(yù)熱到37℃，取適量凍干的胰島素酵母細胞壁微粒(p-ins-gms)，加入到不含酶的人工胃液或者人工腸液中，在第0.25、0.5、0.75、1、1.5和2h取樣200μl并補充等量的預(yù)熱的不含酶的人工胃液或者人工腸液，樣品8000g離心后過0.25μm濾膜后進樣，計算釋放的ins含量，其釋放曲線如見圖2所示；

抗酶降解實驗：準備10ml的人工胃液或者人工腸液，在恒溫水浴振蕩器中預(yù)熱到37℃，取適量凍干的p-ins-gms，加入到人工胃液(sgf)或者人工腸液(sif)中，取樣時間點為0.5、1、2h(sgf)以及0.5、1、4h(sif)，其余操作同前，取出的樣品8000g離心后棄上清液，用純水洗一次并離心，取沉淀用β-葡聚糖酶消化30min，渦旋后8000g離心取上清液，稀釋至合適的濃度并過0.25μm濾膜后進樣，計算剩余的ins含量，其穩(wěn)定性結(jié)果如圖2所示。

實施例3載胰島素的內(nèi)部凝膠化的酵母細胞壁微粒的口服降血糖實驗

正常大鼠以及糖尿病大鼠，分別隨機分為6組，每組4只，實驗前禁食12h，可自由飲水，6組制劑分別為p-ins-gms(以胰島素計量分別為10、30和50iu/kg)，未固化的酵母細胞壁微粒ins-gms(30iu/kg)，空白的內(nèi)部泊洛沙姆凝膠化的酵母細胞壁微粒p-gms以及ins溶液組(2iu/kg)，其中，除ins溶液組為皮下注射給藥外，其余制劑組均為灌胃給藥；

各組制劑在給藥之后特點時間點，于大鼠尾靜脈取血，滴加一滴在血糖儀試紙的感應(yīng)區(qū)測定即時血糖值，每個時間點測3次取平均值，測定的血糖值繪制成血糖-時間曲線；結(jié)果顯示，正常大鼠及糖尿病大鼠體內(nèi)血糖-時間曲線如圖3所示。