本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種長鏈非編碼rnarp11-224o19.2抑制劑在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：肝癌是一種具有轉(zhuǎn)移率高、病死率高、預(yù)后差的高度惡性腫瘤，對(duì)人類健康和生命造成嚴(yán)重威脅。肝癌的病因至今尚不完全明確，一般認(rèn)為誘因包括慢性乙型和丙型肝炎病毒感染、酒精濫用、毒物污染食物的攝入等。目前，肝癌的主要治療手段有肝移植、手術(shù)切除、放療、化療和靶向治療，肝癌患者的短期存活率有一定增加，但總體死亡率和術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然居高不下。長鏈非編碼rna(longnoncodingrna，lncrna)是一類內(nèi)源性長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼rna分子，起初它被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有生物學(xué)功能。越來越多的證據(jù)表明，lncrna是一類具有重要生物學(xué)功能的rna，能夠在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平通過介導(dǎo)dna甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑等生物學(xué)過程來發(fā)揮調(diào)控功能。rp11-224o19.2是一種長鏈非編碼rna，位于第1號(hào)染色體chr1:218517538-218519020，hg19，基因序列長度為1483bp，轉(zhuǎn)錄本長度為557bp。目前rp11-224o19.2的功能尚未見報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種長鏈非編碼rnarp11-224o19.2抑制劑在制備治療腫瘤的藥物中的用途及治療腫瘤的藥物。rp11-224o19.2抑制劑：為抑制rp11-224o19.2表達(dá)的物質(zhì)，包括阻斷和/或干擾rp11-224o19.2表達(dá)的化合物、核苷酸序列等。本發(fā)明提供了一種長鏈非編碼rnarp11-224o19.2抑制劑在制備治療腫瘤的藥物中的用途。其中，所述治療腫瘤的藥物為抑制rp11-224o19.2表達(dá)的藥物。進(jìn)一步地，所述抑制rp11-224o19.2表達(dá)的藥物為sirna藥物。其中，所述sirna的核苷酸序列如seqidno：1所示。sirna為雙鏈分子，其中，seqidno：1所示的序列為正向序列。seqidno：2所示的序列為反向序列。seqidno：1：gcaugacucugcagccauattseqidno：2：uauggcugcagagucaugctt其中，所述治療腫瘤的藥物為治療肝癌的藥物。本發(fā)明還提供了一種治療腫瘤的藥物，它是以rp11-224o19.2抑制劑為活性成分，加上學(xué)上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的制劑。其中，所述rp11-224o19.2抑制劑為抑制rp11-224o19.2表達(dá)的藥物。其中，所述抑制rp11-224o19.2表達(dá)的藥物為sirna藥物。和/或，所述治療腫瘤的藥物為治療肝癌的藥物。其中，所述sirna的核苷酸序列如seqidno：1所示。本發(fā)明還提供了一種sirna分子，序列如seqidno：1所示。本發(fā)明還提供了檢測rp11-224o19.2表達(dá)的試劑在制備肝癌篩查和/或肝癌預(yù)后診斷的試劑中的用途。本發(fā)明還提供了一種肝癌篩查和/或肝癌預(yù)后診斷的試劑盒，它包含任選的用于檢測rp11-224o19.2表達(dá)水平的試劑。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制rp11-22o19.2表達(dá)能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低tgfb2表達(dá)水平，從而達(dá)到治療腫瘤的效果，尤其對(duì)肝癌治療效果顯著，小分子rp11-224o19.2sirna可以作為靶向腫瘤的藥物，應(yīng)用前景良好。另外，通過檢測rp11-224o19.2的表達(dá)水平，可以篩查待檢人群患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)，及對(duì)肝癌患者的預(yù)后情況做出預(yù)測，可用于臨床肝癌的輔助診斷及預(yù)后判斷。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1下調(diào)rp11-224o19.2的表達(dá)抑制hepg2細(xì)胞的增殖、克隆形成并誘導(dǎo)凋亡。a：轉(zhuǎn)染sirna后顯著地下調(diào)rp11-224o19.2的表達(dá)，b：下調(diào)rp11-224o19.2抑制hepg2細(xì)胞的增殖，c：下調(diào)rp11-224o19.2抑制hepg2細(xì)胞的克隆形成，d：下調(diào)rp11-224o19.2誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞的凋亡圖2下調(diào)rp11-22o19.2的表達(dá)抑制hepg2細(xì)胞的遷移和侵襲。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(a)和transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(b)表明hepg2細(xì)胞的遷移能力在rp11-224o19.2下調(diào)后被抑制了，c：transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)rp11-224o19.2的表達(dá)抑制hepg2細(xì)胞的侵襲。圖3rp11-224o19.2調(diào)控機(jī)制的初步研究。a：gse77314數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果表明tgfb2在肝癌中上調(diào)，b：tcga數(shù)據(jù)集驗(yàn)證了tgfb2的上調(diào)，c：tgfb2的表達(dá)量在rp11-224o19.2被干擾后顯著地下調(diào)了圖4rp11-224o19.2在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)并與腫瘤大小密切相關(guān)。gse77509(a)和tcga(b)數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果表明rp11-224o19.2在肝癌組織中上調(diào)，gse77509(c)和tcga(d)數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果表明rp11-224o19.2能作為生物標(biāo)記物將肝癌組織和正常組織區(qū)分開，e：根據(jù)rp11-224o19.2的相對(duì)表達(dá)量將50個(gè)臨床病例分為高表達(dá)和低表達(dá)組，f：高表達(dá)的rp11-224o19.2與更高階的腫瘤大小分期相關(guān)。具體實(shí)施方式下面以實(shí)施例作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1靶向于rp11-224o19.2的sirna設(shè)計(jì)及篩選1、靶向于rp11-224o19.2的sirna設(shè)計(jì)與合成靶向于rp11-224o19.2的sirna及其相應(yīng)的對(duì)照sirna(negativecontrolsirna)由我們自行設(shè)計(jì)，序列見表2，然后委托公司合成雙鏈的sirna序列。2、實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)不同的處理?xiàng)l件將細(xì)胞分為3組，實(shí)驗(yàn)組(rp11-224o19.2-sirna組)為轉(zhuǎn)染了干擾效率高的sirna的hepg2細(xì)胞；陰性對(duì)照組(negativecontrolsirna組)為轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照sirna的hepg2細(xì)胞；空白組(control組)為不進(jìn)行任何處理的hepg2細(xì)胞。hepg2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)操作如下：1)細(xì)胞復(fù)蘇：肝癌hepg2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，從液氮罐中小心地取出凍存的hepg2細(xì)胞凍存管，迅速置于37℃的恒溫水浴鍋(金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)中，將凍存管緩慢搖晃使其迅速解凍。解凍完成后迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有5ml10％fbs(法國biowest公司)dmem培養(yǎng)基(美國gibco公司)的10ml離心管中，用5ml移液槍(美國thermo公司)輕輕吹打細(xì)胞懸液使其充分混勻。將10ml離心管放入高速冷凍離心機(jī)(德國hermle公司)中以1200r/min離心5min。離心后小心地將上清液吸棄，用5ml10％fbsdmem培養(yǎng)液重懸沉淀的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至10cm的細(xì)胞培養(yǎng)板(美國corning公司)中并補(bǔ)齊培養(yǎng)液至10ml，將培養(yǎng)板置于37℃含有5％co2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本panasonic公司)中培養(yǎng)，次日更換細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。2)細(xì)胞傳代：當(dāng)在倒置顯微鏡(日本olympus公司)下觀察到hepg2細(xì)胞的生長密度達(dá)到80％-90％時(shí)，細(xì)胞需要進(jìn)行傳代，將所有儀器設(shè)備準(zhǔn)備完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于超凈工作臺(tái)。首先將培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)基吸棄，用4ml無菌的pbs洗2次后加入1ml0.25％的胰酶(美國thermo公司)后迅速置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化。消化1min后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)觀察到細(xì)胞變圓并漂浮流動(dòng)時(shí)，立即用5ml10％fbsdmem培養(yǎng)液終止消化，用5ml移液槍充分吹下細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，放入高速冷凍離心機(jī)中以1200r/min離心5min。離心后小心地吸棄上清液，用5ml10％fbsdmem培養(yǎng)液重懸沉淀的細(xì)胞，將細(xì)胞懸液一分為二后轉(zhuǎn)移至10cm的細(xì)胞培養(yǎng)板中并補(bǔ)齊培養(yǎng)液至10ml，將培養(yǎng)板置于37℃含有5％co2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：操作步驟如下：1)將生長狀態(tài)良好并處于對(duì)數(shù)生長期的肝癌hepg2細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，按3×105個(gè)/孔的接種密度將細(xì)胞接種于6孔板中，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2)第二天待細(xì)胞密度達(dá)到80％左右時(shí)，吸棄舊培養(yǎng)基，用pbs洗2次，每孔加入1.5ml無雙抗的10％fbsdmem培養(yǎng)基；3)轉(zhuǎn)染試劑配置：對(duì)于每一個(gè)孔的轉(zhuǎn)染試劑的配置，取兩個(gè)潔凈無菌的1.5mlep管，先用250μl無雙抗的dmem培養(yǎng)基稀釋5μl濃度為100μm的sirna并輕輕混勻，然后再用250μl無雙抗的dmem培養(yǎng)基稀釋5μllipofectaminetm6000轉(zhuǎn)染試劑(上海碧云天生物公司)并輕輕混勻，在室溫環(huán)境下靜置5min；4)靜置5min后，將sirna稀釋后加入到含有l(wèi)ipofectaminetm6000轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基中并輕輕混勻，在室溫環(huán)境下靜置20min；轉(zhuǎn)染時(shí)，保證sirna的終濃度為50nm，lipofectamine6000的用量取決于sirna的用量，保證lipofectamine6000的體積和sirna的體積一樣；5)靜置20min后，將混勻后的混合物均勻地加入到各孔中，輕輕搖晃混勻，放入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；6)培養(yǎng)6h后，先將舊培養(yǎng)基吸棄，用pbs洗2次，每孔加入2ml含雙抗的10％fbsdmem培養(yǎng)基，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h；7)轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。3、提取各組的總rna并逆轉(zhuǎn)為cdna總rna提?。恨D(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞。用提前預(yù)冷的depc(江蘇凱基生物公司)處理的pbs洗2次，之后6孔板中每孔都加入1mltrizol試劑(美國invitrogen公司)并反復(fù)吹打充分裂解細(xì)胞，隨后將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)入無菌無酶的1.5mlep管中。按照trizol試劑的使用說明書進(jìn)行總rna的提取，提前將高速冷凍離心機(jī)預(yù)冷至4℃。首先向1.5mlep管中加入200μl氯仿(成都科龍化工)，加入后立即上下顛倒并用力搖晃，混勻后將ep管放在冰山靜置10min。接下來將ep管放入高速冷凍離心機(jī)中以4℃、12000r/min離心15min，離心后ep管中液體分為三層。用移液槍小心地吸取400μl的水相rna到另一無酶的1.5mlep管中，注意槍頭不要伸的太下，防止dna污染。以等體積的比例加入異丙醇(成都科龍化工)400μl，上下顛倒幾次而充分混勻，冰上放置10min。將1.5mlep管放入高速冷凍離心機(jī)中以4℃、12000r/min離心10min。棄上清液，加入提前預(yù)冷的1ml75％的乙醇，冰上放置10min，充分洗滌沉淀。將1.5mlep管放入高速冷凍離心機(jī)中以4℃、12000r/min離心5min，用槍頭將上清液吸棄。敞開ep管，室溫晾干后加入30μl的depc處理水，室溫下充分溶解沉淀。rna純度、濃度檢測：取1μlrna在酶標(biāo)儀上進(jìn)行rna純度和濃度的檢測，本底為depc水，rna純度以od260/od280＝1.8-2.0為合格，將rna純度和濃度數(shù)據(jù)保存好。rna完整性檢測：提前將制膠模具和梳子用二次蒸餾水洗好并組裝好，待模具干燥后組裝起來，加入提取制好的1％瓊脂糖凝膠(已加核酸染料)，待凝膠凝固后放入電泳槽中(北京六一儀器廠)，加入0.5×tbe電泳液(北京天根生物公司)沒過膠面。取1μlrna和1μl10×loadingbuffer(北京天根生物公司)以及1μldepc水混勻，用移液槍將混勻后的rna加入到樣品槽中，用電壓80v電泳20min。電泳完成后在genegenius凝膠成像分析系統(tǒng)(美國syngene公司)中觀察電泳條帶并拍照。rna逆轉(zhuǎn)錄：rna逆轉(zhuǎn)錄使用美國invitrogen公司的m-mlv第一鏈合成試劑盒，根據(jù)試劑盒的使用說明選擇建立20μl的反應(yīng)體系(可逆轉(zhuǎn)錄1ng-5μg總rna)，并按照試劑盒使用說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。將以下組分加入無核酸酶的微量pcr離心管中：各組分加入后立即瞬離混勻，然后將微量pcr管放入pcr儀(美國appliedbiosystems公司)以65℃孵育5min，完成后迅速置于冰上冷卻2min以上。之后在每個(gè)微量pcr管中加入如下組分：各組分加入后瞬離混勻，在37℃下孵育2min，隨后加入1μlm-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶，再瞬離混勻。將微量pcr管放入pcr儀中并設(shè)置好如下程序，先在25℃孵育10min，然后在37℃孵育50min，最后在70℃加熱15min以終止反應(yīng)。將逆轉(zhuǎn)好的cdna放于-80℃冰箱保存。4、熒光定量pcr檢測sirna熒光定量pcr引物設(shè)計(jì)：利用ncbi網(wǎng)站的引物設(shè)計(jì)軟件“primerblast”對(duì)rp11-224o19.2以及內(nèi)參gapdh的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，tm值均設(shè)定在60℃左右。引物詳細(xì)信息如表1。表1rp11-224o19.2和gapdh的qrt-pcr引物rp11-224o19.2的相對(duì)定量：將轉(zhuǎn)染了不同sirna的各組的cdna模板稀釋1倍作為實(shí)時(shí)熒光定量pcr的cdna模板(三個(gè)重復(fù)孔)，選擇三步擴(kuò)增法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，退火溫度均為60℃，設(shè)置40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品三次平行重復(fù)，熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)所用的試劑盒為faststartessentialdnagreenmaster(瑞士羅氏公司)。反應(yīng)體系如下(反應(yīng)體系為14μl)：實(shí)時(shí)熒光定量pcr的程序設(shè)置如下：5、sirna篩選結(jié)果在靶向于rp11-224o19.2的sirna的篩選中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了其中一組sirna的rp11-224o19.2的表達(dá)量(數(shù)值為0.319385312±0.133813761)較陰性對(duì)照組(表達(dá)數(shù)值為1.000000003±0.082696094)顯著下降了(下調(diào)了70％，見圖1a)，表明這條sirna對(duì)rp11-224o19.2的干擾效率達(dá)到70％，干擾效果良好，因此我們將其命名為rp11-224o19.2-sirna(見表2)。表2篩選得到的sirna和相應(yīng)的對(duì)照sirna的序列因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)的sirna序列對(duì)rp11-224o19.2的干擾效率高，可用于高效抑制rp11-224o19.2表達(dá)。實(shí)施例2靶向于rp11-224o19.2的sirna用于治療肝癌本實(shí)驗(yàn)采用轉(zhuǎn)染sirna的方式抑制rp11-224o9.2的表達(dá)，驗(yàn)證其對(duì)肝癌的作用。一、抑制rp11-224o19.2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、克隆形成和凋亡的影響1、cck8實(shí)驗(yàn)檢測hepg2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)步驟如下：1)將轉(zhuǎn)染好的實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的hepg2細(xì)胞以及未處理的空白組的hepg2細(xì)胞按照3000個(gè)/孔的鋪板密度鋪板于96孔板中，每個(gè)96孔板設(shè)置6孔實(shí)驗(yàn)組、6孔陰性對(duì)照組和6孔空白組，另設(shè)6孔只加培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)零，一共接種5個(gè)96孔板，鋪板完成后將96孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2)按照預(yù)定的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，細(xì)胞分別培養(yǎng)24h、48h、72h、96h和120h后，取出96孔板，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔避光加入含有10％cck8的新鮮培養(yǎng)基100μl，放入培養(yǎng)箱中孵育1.5h；3)孵育完成后，使用酶標(biāo)儀在450nm處檢測各孔的吸光度(od450值)；4)每組都先用調(diào)零孔的平均od450值進(jìn)行調(diào)零，然后計(jì)算每組的平均od450值，細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)組(陰性對(duì)照組)平均od450值/空白組平均od450值×100％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3和圖1b。表3rp11-224o19.2-sirna對(duì)hepg2細(xì)胞增殖的影響可見，與空白組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了rp11-224o19.2-sirna的hepg2細(xì)胞的增殖能力在轉(zhuǎn)染鋪板后的第3天開始被顯著抑制，隨著時(shí)間的延長，抑制作用更加顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，說明了hepg2細(xì)胞的增殖能力在轉(zhuǎn)染了rp11-224o19.2-sirna后被顯著削弱。因此抑制rp11-224o19.2可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，rp11-224o19.2的抑制劑可以用于治療肝癌。2、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測hepg2細(xì)胞形成克隆的能力實(shí)驗(yàn)步驟如下：1)將轉(zhuǎn)染好的實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的hepg2細(xì)胞以及未處理的空白組的hepg2細(xì)胞按照200個(gè)/孔的鋪板密度分別鋪板于不同的6孔板中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)分組接種1個(gè)6孔板；2)鋪板完成后，每孔補(bǔ)加培養(yǎng)基至5ml，輕輕搖晃培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻分散，放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3周；3)每隔3天觀察一次，當(dāng)每個(gè)孔板出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，吸棄舊培養(yǎng)基，用pbs洗2次；4)用4％多聚甲醛固定30min，吸棄固定液；5)每孔加入1ml的0.1％結(jié)晶紫進(jìn)行染色，染色時(shí)間為20min；6)染色完成后，吸棄染色液，用pbs沖洗，室溫下干燥；7)拍照，對(duì)肉眼可見的克隆數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4和圖1c。表4rp11-224o19.2-sirna對(duì)hepg2細(xì)胞克隆形成的影響組別克隆數(shù)空白對(duì)照組control21±2.915475947陰性對(duì)照組negativecontrol18.6±3.209361307rp11-224o19.2-sirna組11.6±1.341640786可見，與空白組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了rp11-224o19.2-sirna的hepg2細(xì)胞所形成的克隆數(shù)量顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，這說明hepg2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染了rp11-224o19.2-sirna后其增殖能力明顯減弱。因此抑制rp11-224o19.2可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的克隆形成能力，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖，rp11-224o19.2的抑制劑可以用于治療肝癌。3、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測hepg2細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟如下：細(xì)胞凋亡使用流式細(xì)胞儀(美國beckmancoulter公司)進(jìn)行檢測，所用的凋亡試劑盒為annexin-v-fluosstainingkit(瑞士roche公司)，本次檢測由成都里來生物公司協(xié)助完成。將處于對(duì)數(shù)生長期的hepg2細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的密度鋪于6孔板中，待細(xì)胞長至80％左右時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，空白組不處理，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染negativecontrolsirna，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染rp11-224o19.2-sirna，轉(zhuǎn)染48h后分別收集各組細(xì)胞。將各組細(xì)胞以1200r/min離心5min，吸棄上清；各組細(xì)胞加入500μlpbs洗滌，以1200r/min離心5min，吸棄上清。將annexin-v-fluos、碘化丙啶(pi)、bindingbuffer緩沖液以1:1:48混勻，避光放置，作為工作液；取空白組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別加入100μl工作液，避光孵育10min；再加入300μlbindingbuffer重懸，上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5和圖1d。表5rp11-224o19.2-sirna對(duì)hepg2細(xì)胞凋亡的影響組別克隆數(shù)空白對(duì)照組control10.02333333±4.084242076陰性對(duì)照組negativecontrol12.86333333±2.181291666rp11-224o19.2-sirna組23.87333333±0.657292426可見，與空白組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了rp11-224o19.2-sirna的hepg2細(xì)胞凋亡率顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，這說明rp11-224o19.2表達(dá)下調(diào)后可促進(jìn)hepg2細(xì)胞凋亡。因此抑制rp11-224o19.2可以顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，rp11-224o19.2的抑制劑可以用于治療肝癌。二、抑制rp11-224o19.2對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響1、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測hepg2細(xì)胞的體外遷移能力實(shí)驗(yàn)步驟如下：將轉(zhuǎn)染好的實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的hepg2細(xì)胞以及未處理的空白組的hepg2細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的鋪板密度鋪于6孔板中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)分組鋪1個(gè)6孔板。待細(xì)胞長至90％左右時(shí)，用10μl的無菌槍頭在每個(gè)孔中均勻地劃3條直線，用pbs輕輕的洗去劃落的細(xì)胞，加入2ml不含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。分別在劃痕后0h、24h和48h在倒置顯微鏡(日本olympus公司)下觀察并拍照，計(jì)算不同細(xì)胞分組的相對(duì)遷移距離，相對(duì)遷移距離＝0h劃痕的寬度-24h(48h)劃痕的寬度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6和圖2a。表6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)考察對(duì)hepg2細(xì)胞體外遷移能力的影響可見，與空白組和陰性對(duì)照組相比，rp11-224o19.2表達(dá)被抑制后能顯著地抑制hepg2細(xì)胞的體外遷移能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)，這說明hepg2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染了rp11-224o19.2-sirna后其遷移能力明顯減弱。因此抑制rp11-224o19.2可以顯著地抑制hepg2細(xì)胞的體外遷移，rp11-224o19.2的抑制劑可以用于治療肝癌。2、transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測hepg2細(xì)胞的體外遷移能力實(shí)驗(yàn)步驟如下：將轉(zhuǎn)染好的實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的hepg2細(xì)胞以及未處理的空白組的hepg2細(xì)胞用無血清的培養(yǎng)基重懸，并將其密度調(diào)整為5×104個(gè)/ml，取200μl細(xì)胞懸液加入到transwell小室(美國corning公司)的上室中，并在下室中加入500μl含20％fbs的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出。先將小室中的舊培養(yǎng)基吸棄，用pbs洗幾次，然后用干凈棉簽輕輕地擦去上室中未遷移的細(xì)胞。接下來在室溫環(huán)境下用4％多聚甲醛固定30min，固定后用0.1％結(jié)晶紫染色20min，再用pbs洗幾次。最后在倒置顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算遷移到下室的細(xì)胞個(gè)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7和圖2b。表7transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)考察對(duì)hepg2細(xì)胞遷移的影響組別遷移細(xì)胞數(shù)空白對(duì)照組control236±13.11487705陰性對(duì)照組negativecontrol232.6666667±11.01514109rp11-224o19.2-sirna組126±6可見，在rp11-224o19.2表達(dá)下調(diào)后，hepg2細(xì)胞的體外遷移能力與空白組和陰性對(duì)照組相比被明顯地削弱了，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，這說明hepg2細(xì)胞在rp11-224o19.2表達(dá)下調(diào)后其體外遷移能力明顯減弱了。因此抑制rp11-224o19.2可以顯著地抑制hepg2細(xì)胞的體外遷移，rp11-224o19.2的抑制劑可以用于治療肝癌。3、transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測hepg2細(xì)胞的體外侵襲能力實(shí)驗(yàn)步驟如下：提前將基質(zhì)膠matrigel(美國bd公司)放入4℃冰箱中過夜融化，將matrigel按1:8的比例用dmem稀釋，每個(gè)transwell小室中加入100μl稀釋后的matrigel進(jìn)行包被，放入培養(yǎng)箱中孵育過夜。將轉(zhuǎn)染好的實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的hepg2細(xì)胞以及未處理的空白組的hepg2細(xì)胞用無血清的培養(yǎng)基重懸，并將其密度調(diào)整為5×104個(gè)/ml，取200μl細(xì)胞懸液加入到transwell小室的上室中，并在下室中加入500μl含20％fbs的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出。先將小室中的舊培養(yǎng)基吸棄，用pbs洗幾次，然后用干凈棉簽輕輕地擦去上室中未遷移的細(xì)胞。接下來在室溫環(huán)境下用4％多聚甲醛固定30min，固定后用0.1％結(jié)晶紫染色20min，再用pbs洗幾次。最后在倒置顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算侵襲到下室的細(xì)胞個(gè)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8和圖2c。表8transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)考察對(duì)hepg2細(xì)胞體外侵襲能力的影響組別侵襲細(xì)胞數(shù)空白對(duì)照組control256±14.4222051陰性對(duì)照組negativecontrol251±13rp11-224o19.2-sirna組109.3333333±4.163331999可見，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與空白組和陰性對(duì)照組相比，hepg2細(xì)胞的體外侵襲能力在rp11-224o19.2表達(dá)下調(diào)后被顯著地抑制了，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，這說明hepg2細(xì)胞在rp11-224o19.2表達(dá)下調(diào)后其侵襲能力明顯減弱。因此抑制rp11-224o19.2可以顯著地抑制hepg2細(xì)胞的體外侵襲，rp11-224o19.2的抑制劑可以用于治療肝癌。綜上，靶向rp11-224o19.2的sirna可以有效抑制rp11-224o19.2表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，rp11-224o19.2的抑制劑對(duì)肝癌的治療效果顯著。三、抑制rp11-224o19.2對(duì)tgfb2的表達(dá)水平影響1、tgfb2在肝癌中的表達(dá)tgfb2的表達(dá)量分別提取自數(shù)據(jù)集gse77314和tcga數(shù)據(jù)庫中肝癌的rna-seq表達(dá)量文件。通過對(duì)下載的rna-seq表達(dá)量文件比較分析發(fā)現(xiàn)，tgfb2在肝癌組織中的表達(dá)量顯著高于正常組織(圖3a)。此外，篩選自tcga數(shù)據(jù)庫中肝癌的rna-seq表達(dá)量文件的分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了tgfb2在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)(圖3b)。2、熒光定量pcr方法檢測rp11-224o19.2表達(dá)量下調(diào)后的tgfb2表達(dá)量取按照實(shí)施例1方法提取的rna制備的兩種cdna，即轉(zhuǎn)染rp11-224o19.2-sirna的hepg2細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染了negativecontrolsirna的陰性hepg2細(xì)胞對(duì)照組。然后熒光定量pcr方法檢測tgfb2表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)：利用ncbi網(wǎng)站的引物設(shè)計(jì)軟件“primerblast”對(duì)tgfb2以及內(nèi)參gapdh的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物詳細(xì)信息如表9。表9tgfb2和gapdh的qrt-pcr引物tgfb2的相對(duì)定量：將不同分組的cdna模板稀釋1倍作為實(shí)時(shí)熒光定量pcr的cdna模板(三個(gè)重復(fù)孔)，選擇三步擴(kuò)增法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，退火溫度均為60℃，設(shè)置40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品三次平行重復(fù)，熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)所用的試劑盒為faststartessentialdnagreenmaster(瑞士羅氏公司)。反應(yīng)體系如下(反應(yīng)體系為14μl)：實(shí)時(shí)熒光定量pcr的程序設(shè)置如下：3、rp11-224o19.2抑制后的tgfb2的表達(dá)水平結(jié)果見圖3c?？梢?，陰性對(duì)照組的tgfb2表達(dá)量為1±0.052835971，，在rp11-224o19.2表達(dá)被抑制后，tgfb2的表達(dá)量下調(diào)了88％(數(shù)值為0.118222992±0.004975651)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。tgfb2基因?qū)儆趖gfβ超家族，文獻(xiàn)報(bào)道下調(diào)tgfb2的表達(dá)能顯著地抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、遷移和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制rp11-224o19.2的表達(dá)可以顯著下調(diào)tgfb2表達(dá)，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，達(dá)到治療腫瘤的效果。實(shí)施例3rp11-224o19.2表達(dá)水平與肝癌的關(guān)系分析rp11-224o19.2在肝癌中的表達(dá)：數(shù)據(jù)分析方法如下：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用spss19.0軟件(ibmspss)進(jìn)行分析，以student'st-test計(jì)算的組間p<0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異閾值，作圖用origin8.0和graphpadprism5軟件完成。按照rp11-224o19.2的表達(dá)量倍數(shù)變化(foldchange)對(duì)50個(gè)肝癌臨床病例進(jìn)行分類，rp11-224o19.2的表達(dá)量倍數(shù)變化與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析由spss19.0軟件完成，兩個(gè)樣本間分析采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的mann-whitneyutest方法，三個(gè)樣本間分析采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的kruskal-wallistest方法，p<0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異閾值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：通過對(duì)20對(duì)肝癌與正常組織樣本的rna-seq表達(dá)量進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)rp11-224o19.2在肝癌組織中的表達(dá)量明顯高于正常組織(p＝0.0146)(圖4a)。對(duì)另一項(xiàng)50對(duì)肝癌與正常組織樣本的rna-seq表達(dá)量進(jìn)行分析，同樣證實(shí)rp11-224o19.2在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)(p＝0.00148,圖4b)。另外，通過不同組數(shù)據(jù)的分析表明，rp11-224o19.2的表達(dá)量表現(xiàn)出對(duì)肝癌組織較高的診斷準(zhǔn)確性(p＝0.00065，見圖4c；p＝0.00034，見圖4d)?？梢姡瑀p11-224o19.2的表達(dá)水平與肝癌呈正相關(guān)，rp11-224o19.2的高表達(dá)會(huì)顯著提高患肝癌的可能性，因此，可以通過檢測待檢人群的rp11-224o19.2的表達(dá)水平，將肝癌的易感人群篩查出來，用于臨床肝癌的輔助診斷。已知肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致門靜脈血栓(pvtt)，并使肝癌患者有差的預(yù)后狀況。數(shù)據(jù)分析表明，rp11-224o19.2在pvtt中的表達(dá)量高于腫瘤組織，說明rp11-224o19.2與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移正相關(guān)(圖4a)。為了進(jìn)一步探究rp11-224o19.2的表達(dá)量與肝癌患者的預(yù)后關(guān)系，我們將50個(gè)肝癌臨床病例按照rp11-224o19.2的表達(dá)量倍數(shù)變化分為兩類，31個(gè)高表達(dá)病例是指rp11-224o19.2的foldchange≥2，19個(gè)低表達(dá)病例是指rp11-224o19.2的foldchange<2，并且高表達(dá)組的rp11-224o19.2的表達(dá)量倍數(shù)變化值顯著比低表達(dá)組高(p＝3.94e-09，mann-whitneyutest)(圖4e)。我們將rp11-224o19.2表達(dá)量與肝癌的臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析，得到的結(jié)果如表10所示。此外，高表達(dá)的rp11-224o19.2與肝癌患者的晚期腫瘤分期密切相關(guān)(p＝0.029，kruskal-wallistest)(圖4f)?？梢?，rp11-224o19.2的表達(dá)量可以用于預(yù)測肝癌患者預(yù)后狀況，rp11-224o19.2表達(dá)量越高，肝癌患者的預(yù)后情況越差。表10rp11-224o19.2表達(dá)量與臨床病理特征的相關(guān)性備注：有些臨床數(shù)據(jù)缺失，p<0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異閾值因此，通過檢測rp11-224o19.2的表達(dá)水平，可以篩查待檢人群患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)，及對(duì)肝癌患者的預(yù)后情況做出預(yù)測，可用于臨床肝癌的輔助診斷及預(yù)后判斷。綜上，抑制rp11-22o19.2表達(dá)能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低tgfb2表達(dá)水平，從而達(dá)到治療腫瘤的效果。另外，通過檢測rp11-224o19.2的表達(dá)水平，可以篩查待檢人群患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)，及對(duì)肝癌患者的預(yù)后情況做出預(yù)測，可用于臨床肝癌的輔助診斷及預(yù)后判斷。sequencelisting<110>西南交通大學(xué)<120>長鏈非編碼rnarp11-224o19.2抑制劑的用途<130>gy138-17p1197<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>rp11-224o19.2-sirna正義鏈<400>1gcaugacucugcagccauatt21<210>2<211>21<212>dna<213>rp11-224o19.2-sirna反義鏈<400>2uauggcugcagagucaugctt21<210>3<211>21<212>dna<213>陰性對(duì)照sirna正義鏈<400>3uucuccgaacgugucacgutt21<210>4<211>21<212>dna<213>陰性對(duì)照sirna反義鏈<400>4acgugacacguucggagaatt21<210>5<211>20<212>dna<213>rp11-224o19.2正向引物<400>5cgaaccgttgagggagtgtg20<210>6<211>20<212>dna<213>rp11-224o19.2反向引物<400>6aggccccatacacaactgaa20<210>7<211>19<212>dna<213>gapdh正向引物<400>7gttggtatcgtggaaggac19<210>8<211>18<212>dna<213>gapdh反向引物<400>8aaaggtggaggagtgggt18<210>9<211>20<212>dna<213>tgfb2正向引物<400>9ccaaagggtacaatgccaac20<210>10<211>25<212>dna<213>tgfb2反向引物<400>10cagatgcttctggatttatggtatt25當(dāng)前第1頁12