長鏈非編碼rna loc401317的原位雜交探針、試劑及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種長鏈非編碼RNA LOC401317的原位雜交探針、試劑及其應用。該長鏈非編碼RNA LOC401317可以用于制備鼻咽癌患者的預后制劑，特別是制備出原位雜交檢測法預測鼻咽癌患者預后的試劑盒。通過研究證實LOC401317在鼻咽癌組織中表達下調(diào)，低表達LOC401317的鼻咽癌患者比高表達LOC401317的鼻咽癌患者預后差，因此，將LOC401317的表達用于鼻咽癌患者的預后預測，可以為鼻咽癌患者的預后提供強有力的分子生物學依據(jù)，具有深遠的臨床意義和重要的推廣應用前景。
【專利說明】長鏈非編碼RNA L0C401317的原位雜交探針、試劑及其應 用

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學領域，具體涉及長鏈非編碼RNA L0C401317的原位雜 交探針、試劑及其應用方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 鼻咽癌是常見高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，容易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預后較差。研究 表明，這種腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多步驟、多階段的復雜過程，其中抑癌基因的失 活與癌基因的激活發(fā)揮了關鍵的作用。
[0003] TP53基因（編碼P53蛋白）自1979年被克隆以來，一直是腫瘤分子生物學研究領 域最引人注目的重要抑瘤基因之一。大量的證據(jù)表明，TP53基因通過調(diào)控一系列信號轉(zhuǎn)導 通路廣泛參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在細胞受到各種致癌因素的刺激時，P53蛋白 激活并通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游關鍵靶基因的表達，阻滯細胞周期、誘導細胞分化、啟動細胞衰老 及凋亡、參與DNA損傷修復維持基因組的穩(wěn)定、調(diào)節(jié)能量代謝和抑制腫瘤血管生成，從而阻 止腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有的研究發(fā)現(xiàn)，TP53基因是包括鼻咽癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中最常 見的突變基因之一，33%?76%的患者存在TP53基因異常。因此，恢復鼻咽癌中TP53基因 功能或逆轉(zhuǎn)其下游信號通路，對鼻咽癌的治療具有重要的意義。
[0004] 長鏈非編碼 RNAs (long non-coding RNAs, IncRNAs)是一類長度超過 200nt、缺少 特異完整的開放閱讀框、無或很少有蛋白編碼功能的RNAs分子。最近的研究表明，IncRNAs 通過在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平廣泛調(diào)節(jié)基因的表達，它們參與了生物體生長、發(fā)育、 衰老及死亡等重要生命活動的調(diào)控。越來越多的研究表明IncRNAs的異常表達或功能缺失 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。一些IncRNAs分子在腫瘤的診斷和治療方面具有重要的意 義，且可以作為腫瘤預后判斷新的分子標記。目前，已經(jīng)克隆的人類IncRNAs基因已超過4 萬多個，但絕大部分IncRNA的功能未知。
[0005] 為了尋找鼻咽癌中TP53基因調(diào)控的下游IncRNAs及其在鼻咽癌中的應用價值，我 們在鼻咽癌細胞系中轉(zhuǎn)染TP53基因，收集不同時間點的細胞用新一代IncRNAs芯片檢測了 已知IncRNA的表達水平。芯片檢測的結(jié)果顯示，IncRNA L0C401317的表達差異最顯著，其 表達明顯上調(diào)，提示L0C401317可能具有抑瘤基因的作用。
[0006] 我們構(gòu)建了表達L0C401317的真核表達載體，轉(zhuǎn)染到鼻咽癌細胞株中，在體外培 養(yǎng)系統(tǒng)和裸鼠移殖瘤體內(nèi)模型中均證實IncRNA L0C401317可明顯抑制鼻咽癌細胞的增殖， 抑制腫瘤細胞的生長，因此L0C401317是一個新的抑瘤性IncRNA。將L0C401317真核表達 載體負載到多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒上制成納米基因轉(zhuǎn)運體，多聚賴氨酸修飾的硅納 米顆粒，可保護L0C401317載體免受核酸酶降解，延長作用時間，且有更高的轉(zhuǎn)染效率。
[0007] 進一步地，我們檢測了 L0C401317在臨床離體腫瘤樣本中的表達水平，并分析了 L0C401317表達水平與臨床病例資料的相關性。我們從鼻咽癌及相對應的正常對照組織中 抽提RNA后通過逆轉(zhuǎn)錄，實時定量PCR，檢測了 L0C401317的表達情況，結(jié)果顯示L0C401317 在鼻咽癌組織中表達下調(diào)。我們隨后又利用原位雜交的方法，進一步在存檔石蠟樣本驗證 了 L0C401317在鼻咽癌中表達顯著下調(diào)，因此針對L0C401317的檢測制劑可用于鼻咽癌的 輔助診斷，結(jié)合臨床回訪資料進行生存曲線分析發(fā)現(xiàn)L0C401317表達低的患者其生存時間 短于該IncRNA表達高的患者，因此針對該IncRNA的檢測制劑也可以用于鼻咽癌的預后判 斷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供長鏈非編碼RNA L0C401317的原位雜交探針、試劑及其應用 方法，利用長鏈非編碼RNA L0C401317序列可以制備用于鼻咽癌輔助診斷或者預后預測的 制劑。
[0009] lncRNAsL0C401317的應用方法，用于制備鼻咽癌輔助診斷或者療效預測的制劑， 該長鏈非編碼RNA L0C401317的序列見SEQ NO: 1。
[0010] 所述的鼻咽癌輔助診斷或者療效預測的制劑為原位雜交檢測試劑。
[0011] 所述的原位雜交檢測試劑中包括用于原位雜交檢測L0C401317表達的寡核苷酸 探針，序列如下：
[0012] L0C401317 探針 I : 5 ' -TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3，
[0013] L0C401317 探針 2 :5，-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3，。
[0014] 所述的原位雜交檢測試劑為試劑盒。
[0015] 試劑盒中含有上述用于原位雜交檢測L0C401317表達的寡核苷酸探針：
[0016] L0C401317 探針 I : 5，-TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3，
[0017] L0C401317 探針 2 :5，-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3，；
[0018] 陽性對照探針（檢測看家基因 GAPDH):
[0019] GAPDH 探針 1 :5' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'
[0020] GAPDH 探針 2 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'。
[0021] 試劑盒中還含有：地高辛寡核苷酸加尾試劑、抗地高辛-辣根過氧化物酶復合物 檢測試劑、DAB染色試劑；
[0022] 其它常規(guī)生物化學試劑，包括20x檸檬酸鈉緩沖溶液（saline sodium citrate, SSC)，硫酸葡聚糖（Dextran sulphate)，去離子甲醜胺（Deionized Formamide), 多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脫氧腺苷酸（polydeoxyadenylic acid, Poly dA)，變性剪切的娃精 DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)， 酵母轉(zhuǎn)運1?熟(}^381:1：-1?敵，〖1?敵)，二硫蘇糖醇（01'1')，5〇1鄧罕氏緩沖液（〇6111^1(1丨8'8 solution),磷酸緩沖液（PBS buffer),胃蛋白酶K,牛血清白蛋白（BSA),三乙醇胺 (TEA)，醋酸酐，阻斷試劑（Blocking reagent agent)，TNB 緩沖液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 5 % 阻斷試劑），TNT 緩沖液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 05% Tween 20) 〇
[0023] 我們通過原位雜交在鼻咽癌和正常鼻咽上皮存檔石蠟組織標本中發(fā)現(xiàn)L0C401317 在鼻咽癌中表達顯著下調(diào)，且L0C401317的表達與預后密切相關，L0C401317表達低的患者 更快地死亡，提示L0C401317可作為鼻咽癌預后預測的分子標志。本發(fā)明為鼻咽癌的輔助 診斷和預后預測提供了強有力的分子生物學工具，具有深遠的臨床意義和重要的推廣應用 前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為TP53基因可誘導IncRNA L0C401317表達情況；
[0025] A :在鼻咽癌細胞系中轉(zhuǎn)染TP53基因表達載體0、12、24和48小時后用實時熒光定 量PCR檢測TP53基因的表達，TP53基因 mRNA表達水平顯著上調(diào)；
[0026] B :在鼻咽癌細胞系中轉(zhuǎn)染TP53基因表達載體0、12、24和48小時后用Western Blotting方法檢測TP53基因的表達，TP53基因蛋白表達水平顯著上調(diào)；
[0027] C :在鼻咽癌細胞系中轉(zhuǎn)染TP53基因表達載體0、12、24和48小時后用熒光素酶報 告基因活性方法檢測TP53基因表達的p53蛋白作為核轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，p53轉(zhuǎn)錄活性 顯著上調(diào)；
[0028] D :在鼻咽癌細胞系中轉(zhuǎn)染TP53基因表達載體12、24和48小時后利用IncRNA芯 片檢測細胞內(nèi)IncRNA表達水平的變化，本圖顯示了細胞中轉(zhuǎn)染TP53基因后表達上調(diào)最顯 著的30個基因；
[0029] E :實時熒光定量PCR技術(shù)驗證IncRNA芯片的結(jié)果，轉(zhuǎn)染TP53基因后細胞中 IncRNA L0C401317的表達顯著上調(diào)；
[0030] 圖2為在鼻咽癌細胞中導入IncRNA L0C401317抑制鼻咽癌細胞的生長情況；
[0031] A :生長曲線實驗表明在鼻咽癌細胞中轉(zhuǎn)染L0C401317表達載體后細胞生長速度 減慢；
[0032] B :流式細胞分析儀檢測轉(zhuǎn)染L0C401317表達載體后，鼻咽癌細胞周期阻滯于GO/ Gl期；
[0033] C :流式細胞分析儀檢測轉(zhuǎn)染L0C401317表達載體后，凋亡的鼻咽癌細胞明顯增 多；
[0034] 圖3為動物實驗證實IncRNA L0C401317抑制鼻咽癌細胞的生長和增殖情況；
[0035] A :在鼻咽癌細胞中轉(zhuǎn)染L0C401317表達載體后，注射到裸鼠腋窩皮下，每周測量 移殖瘤大小，L0C401317可顯著抑制鼻咽癌細胞的增殖；
[0036] B :35天后處死裸鼠，大體觀察表明重表達L0C401317組移殖瘤最?。?br> [0037] C :處死裸鼠后取出移殖瘤比較和測量移殖瘤大小，重表達L0C401317組移殖瘤最 小；
[0038] 圖4為利用實時熒光定量PCR的方法檢測鼻咽癌離體樣本中L0C401317的表達情 況；L0C401317在鼻咽癌（T)中的表達比正常對照（N)樣本中顯著下調(diào)；
[0039] 圖5為原位雜交檢測L0C401317在鼻咽癌及正常鼻咽粘膜中的表達情況；左圖為 鼻咽癌組織，右圖為正常鼻咽粘膜組織（放大倍數(shù)：200X)，L0C401317在鼻咽癌中表達水 平較低；
[0040] 圖6為鼻咽癌中L0C401317的表達與患者的預后相關分析；L0C401317表達低或 者不表達的患者更快的死亡。

【具體實施方式】
[0041] 以下結(jié)合【具體實施方式】進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0042] 實施例1，在鼻咽癌細胞中導入TP53基因，IncRNA L0C401317表達顯著上調(diào)
[0043] 1.材料與方法：
[0044] I. 1試劑及試劑盒
[0045] 瓊脂糖（agrose)等常用生化試劑、膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限 公司，利用RNeasy? Mini Kit(Qiagen)抽提試劑盒抽提高質(zhì)量的RNA，Superscript? III (Invitrogen)試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。熒光素酶報告基因檢測試劑盒 Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega公司。本發(fā)明所用的鼻咽癌細胞 HNE2為中南大學腫瘤研究所保存。細胞培養(yǎng)所用RPMI1640培基和胎牛血清，及消化細胞 所用的胰蛋白酶均為美國Gibco公司產(chǎn)品。IncRNA芯片為安捷倫公司產(chǎn)品，該芯片規(guī)格為 4*180K，其中 IncRNAs 探針 46506 條。
[0046] ΤΡ53真核表達質(zhì)粒購自美國Clontech公司，用于檢測ρ53蛋白轉(zhuǎn)錄活性的 pp53-TA-luc熒光素酶報告質(zhì)粒購自碧云天公司。
[0047] 實時熒光定量檢測引物序列有：
[0048] ΤΡ53 基因上游引物：5' -CCCTTCCCAGAAAACCTACC-3'
[0049] ΤΡ53 基因下游引物：5' -CTCCGTCATGTGCTGTGACT-3'
[0050] 內(nèi)參看家基因 GAPDH 上游引物：5' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
[0051] 內(nèi)參看家基因 GAPDH 下游引物：5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'
[0052] L0C401317 上游引物：5，-CTTTCTTGCTGGCATCGTTACC-3，
[0053] L0C401317 下游引物：5 ' -CTTGCCCCTCTAAGAACTTCGT-3 '
[0054] Western blotting檢測ρ53蛋白及內(nèi)參基因 GAPDH表達的抗體購自Cell Signaling Technology 公司。
[0055] I. 2細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
[0056] 將生長狀態(tài)良好的鼻咽癌細胞HNE2按2 X IO5個細胞/孔接種于6孔板中，將6孔 板置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)細胞生長至50-70%密度即可開始TP53真核表達載 體的轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染過程如下：
[0057] 在無菌EP管中加入3 μ 1的Iipofectamine 2000于100 μ 1無血清培養(yǎng)基中混勻 靜置5min ;將ΤΡ53表達載體加入100 μ 1無血清培養(yǎng)基中；然后與上述包含Iipofectamine 的100 μ 1無血清培養(yǎng)基溫和混勻，室溫靜置30分鐘，使DNA與脂質(zhì)體形成復合體；用 D-Hank' s液洗滌細胞3次；將上述混合物中加入800 μ 1無血清培養(yǎng)基（無抗生素），溫和 混勻后加入6孔板中的1個孔；將6孔板置于CO2培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)6小時，然后棄上清， 加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12、24和48小時。
[0058] 1. 3實時熒光定量法檢測TP53基因和L0C401317的表達
[0059] 鼻咽癌細胞HNE2轉(zhuǎn)染TP53真核表達載體后于0、12、24和48小時收集細胞，抽提 細胞中的總RNA，2 μ g RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進行實時熒光定量PCR。
[0060] 實時熒光定量PCR反應體系
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 長鏈非編碼RNA L0C401317的應用方法，其特征在于，用于制備鼻咽癌輔助診斷或 者療效預測的制劑，該長鏈非編碼RNA L0C401317的序列見SEQ N0:1。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用方法，其特征在于，所述的鼻咽癌輔助診斷或者療效預 測的制劑為原位雜交檢測試劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用方法，其特征在于， 所述的原位雜交檢測試劑中包括用于原位雜交檢測L0C401317表達的寡核苷酸探針， 序列如下： L0C401317 探針 1 :5' -TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3' L0C401317 探針 2 :5' -AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3'。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應用方法，其特征在于， 所述的原位雜交檢測試劑為試劑盒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用方法，其特征在于， 試劑盒中含有用于原位雜交檢測L0C401317表達的寡核苷酸探針： L0C401317 探針 1 :5' -TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3' L0C401317 探針 2 :5' -AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3' ； 試劑盒中還含有陽性對照探針， GAPDH 探針 1 :5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3' GAPDH 探針 2 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3,。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用方法，其特征在于， 試劑盒中還含有：地高辛寡核苷酸加尾試劑、抗地高辛-辣根過氧化物酶復合物檢測 試劑、DAB染色試劑； 其它常規(guī)生物化學試劑，包括20x SSC，硫酸葡聚糖，去離子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚 脫氧腺苷酸，變性剪切的娃精DNA，酵母轉(zhuǎn)運RNA，二硫蘇糖醇，50xDenhardts' s solution, PBS buffer,胃蛋白酶K,牛血清白蛋白，三乙醇胺，醋酸酐， 丁咄緩沖液卬117.5的0.1]\11'1^8-(：1+0.1511恥(：1+0.5%阻斷試劑； TNT 緩沖液：pH7. 5 的 0? 1M Tris-Cl+0. 15M NaCl+0. 05% Tween 20。
7. 用于制備鼻咽癌輔助診斷或者療效預測的原位雜交檢測試劑的寡核苷酸探針，序列 如下： L0C401317 探針 1 :5' -TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3' L0C401317 探針 2 :5' -AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3'。
8. 用于鼻咽癌輔助診斷或者療效預測的原位雜交檢測試劑，是包含有權(quán)利要求7所述 的寡核苷酸探針的試劑盒。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的原位雜交檢測試劑，其特征在于，試劑盒中還含有陽性對照 探針： GAPDH 探針 1 :5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3' GAPDH 探針 2 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3,。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的原位雜交檢測試劑，其特征在于， 試劑盒中還含有：地高辛寡核苷酸加尾試劑、抗地高辛-辣根過氧化物酶復合物檢測 試劑、DAB染色試劑； 其它常規(guī)生物化學試劑，包括20x SSC，硫酸葡聚糖，去離子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚 脫氧腺苷酸，變性剪切的娃精DNA，酵母轉(zhuǎn)運RNA，二硫蘇糖醇，50xDenhardts' s solution, PBS buffer,胃蛋白酶K,牛血清白蛋白，三乙醇胺，醋酸酐， 丁咄緩沖液卬117.5的0.1]\11'1^8-(：1+0.1511恥(：1+0.5%阻斷試劑； TNT 緩沖液：pH7. 5 的 0? 1M Tris-Cl+0. 15M NaCl+0. 05% Tween 20。
【文檔編號】C12N15/11GK104388543SQ201410584311
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】李桂源, 曾朝陽, 熊煒, 龔朝建, 李小玲, 張文玲, 李夏雨, 曾勇, 周鳴, 馬健, 彭淑平, 向波 申請人:中南大學