本發(fā)明涉及中藥材活性提取物制備，具體涉及一種冬蟲夏草提取物的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、冬蟲夏草(chinese?cordyceps)是真菌冬蟲夏草菌(ophiocordyceps?sinensis(berk))侵染寄生于宿主蝙蝠蛾科幼蟲(hepialidae)后形成殘余的蟲體、菌核與真菌子座的復(fù)合物，是我國傳統(tǒng)的名貴補(bǔ)益藥材。冬蟲夏草藥用歷史悠久，經(jīng)考證最早引用是從古代的藏醫(yī)藥籍《藏本草》最早文字記載了冬蟲夏草具有“補(bǔ)腎、潤肺”的功能。冬蟲夏草具有多種活性物質(zhì)，如核苷、甾醇、蟲草酸、蛋白、多糖等，其中多糖是冬蟲夏草具有藥理活性的主要貢獻(xiàn)者之一。冬蟲夏草多糖主要包含胞內(nèi)及胞外多糖，占冬蟲夏草總質(zhì)量的3-8％?；诂F(xiàn)今的研究可知，冬蟲夏草中多糖的作用包括抑氧化、抑腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血糖等。

2、但現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于冬蟲夏草提取物的研究較少，如何獲取活性更好的冬蟲夏草提取物，提高冬蟲夏草資源的利用率，開發(fā)冬蟲夏草新產(chǎn)品，如何節(jié)約原材料，降低冬蟲夏草產(chǎn)品生產(chǎn)成本，是研究人員所要解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、現(xiàn)有技術(shù)中，雖然冬蟲夏草活性多糖已得到廣泛研究，但對非水溶性多糖的研究鮮少。本發(fā)明以冬蟲夏草中的非水溶多糖為目標(biāo)，進(jìn)一步挖掘冬蟲夏草中具有免疫、抗腫瘤活性的物質(zhì)，提高冬蟲夏草資源的利用率。有利于冬蟲夏草新產(chǎn)品的開發(fā)，并通過節(jié)約原材料的方式，降低冬蟲夏草產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。

2、為達(dá)上述目的，本發(fā)明提供一種冬蟲夏草提取物及其制備方法和應(yīng)用。

3、第一方面，本發(fā)明提供一種冬蟲夏草提取物。

4、一種冬蟲夏草提取物，所述冬蟲夏草提取物的制備方法包括：提取和柱層析。

5、在一些實(shí)施例中，所述提取包括：乙醇提取、水提取和堿水溶液提取。

6、在一些實(shí)施例中，所述乙醇提取包括用乙醇溶液3回流提取。

7、在一些實(shí)施例中，所述水提取包括將乙醇溶液3回流提取后的冬蟲夏草粉末再用水回流提取。

8、在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液提取包括將水回流提取后的冬蟲夏草粉末烘干后再用堿水溶液在惰性氣體氛圍條件下提取。

9、在一些實(shí)施例中，所述制備方法還包括在所述提取前先進(jìn)行浸泡和滲漉。

10、在一些實(shí)施例中，所述浸泡和滲漉包括將冬蟲夏草粉末用乙醇溶液1浸泡；再用乙醇溶液2滲漉。

11、在一些實(shí)施例中，所述制備方法還包括在提取后進(jìn)行第一后處理。

12、在一些實(shí)施例中，所述第一后處理包括過濾，中和及濃縮，洗滌。

13、在一些實(shí)施例中，所述柱層析包括用陰離子交換層析柱分離，經(jīng)第二后處理，得到所述冬蟲夏草提取物。

14、在一些實(shí)施例中，一種冬蟲夏草提取物，其制備方法包括：

15、(1)浸泡和滲漉：將冬蟲夏草粉末用乙醇溶液1浸泡；再用乙醇溶液2滲漉；

16、(2)乙醇提?。簼B漉后的冬蟲夏草粉末用乙醇溶液3回流提?。?/p>

17、(3)水提?。阂掖既芤?回流提取后的冬蟲夏草粉末再用水回流提??；

18、(4)堿水溶液提?。核亓魈崛『蟮亩x夏草粉末烘干后再用堿水溶液在惰性氣體氛圍條件下提??；

19、(5)過濾：將堿水溶液提取后的冬蟲夏草粉末過濾，收集濾液；

20、(6)中和及濃縮：將濾液用酸中和，收集上清液，濃縮，得到濃縮液；

21、(7)沉淀和離心：將濃縮液與乙醇溶液4混合，靜置沉淀，離心，收集沉淀物；

22、(8)洗滌：沉淀物依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌，得到冷堿提取物ncap(冷堿提取多糖)；和

23、(9)柱層析：將冷堿提取物ncap用陰離子交換層析柱分離，經(jīng)第二后處理，得到所述冬蟲夏草提取物。

24、在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液1為90％vol-98％vol的乙醇水溶液。在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液1為93％vol-97％vol的乙醇水溶液。在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液1為90％vol、91％vol、92％vol、93％vol、94％vol、95％vol、96％vol、97％vol或98％vol的乙醇水溶液。在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液1為95％vol的乙醇水溶液。

25、在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液2為90％vol-98％vol的乙醇水溶液。在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液2為90％vol、91％vol、92％vol、93％vol、94％vol、95％vol、96％vol、97％vol或98％vol的乙醇水溶液。在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液2為95％vol的乙醇水溶液。

26、在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液3為75％vol-85％vol的乙醇水溶液。在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液3為78％vol-82％vol的乙醇水溶液。在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液3為75％vol、76％vol、77％vol、78％vol、79％vol、80％vol、81％vol、82％vol、83％vol、84％vol或85％vol的乙醇水溶液。在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液3為80％vol的乙醇水溶液。

27、在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液4為90％vol-98％vol的乙醇水溶液。在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液4為93％vol-97％vol的乙醇水溶液。在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液4為90％vol、91％vol、92％vol、93％vol、94％vol、95％vol、96％vol、97％vol或98％vol的乙醇水溶液。在一些實(shí)施例中，所述乙醇溶液4為95％vol的乙醇水溶液。

28、在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液中的堿包括氫氧化鈉或氫氧化鉀。

29、在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液中的堿的濃度為1wt％-5wt％。在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液中的堿的濃度為1wt％、2wt％、3wt％、4wt％或5wt％。在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液中的堿的濃度為3wt％。

30、在一些實(shí)施例中，所述浸泡步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用4ml-100ml乙醇溶液1進(jìn)行浸泡。在一些實(shí)施例中，所述浸泡步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、30ml、35ml、40ml、45ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml或100ml乙醇溶液1進(jìn)行浸泡。在一些實(shí)施例中，所述浸泡步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用4ml-10ml乙醇溶液1進(jìn)行浸泡?；蛘呙?g所述冬蟲夏草粉末采用6ml乙醇溶液1進(jìn)行浸泡。

31、在一些實(shí)施例中，所述滲漉步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用10ml-100ml乙醇溶液2進(jìn)行滲漉。在一些實(shí)施例中，所述滲漉步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用10ml、12ml、14ml、16ml、18ml、20ml、25ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml或100ml乙醇溶液2進(jìn)行滲漉。在一些實(shí)施例中，所述滲漉步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用14ml乙醇溶液2進(jìn)行滲漉。

32、在一些實(shí)施例中，所述乙醇提取步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用5ml-100ml乙醇溶液3進(jìn)行回流提取。在一些實(shí)施例中，所述乙醇提取步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用5ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml或100ml乙醇溶液3進(jìn)行回流提取。在一些實(shí)施例中，所述乙醇提取步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用8ml乙醇溶液3進(jìn)行回流提取。

33、在一些實(shí)施例中，所述水提取步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用5ml-100ml水進(jìn)行回流提取。在一些實(shí)施例中，所述水提取步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用5ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml或100ml水進(jìn)行回流提取。在一些實(shí)施例中，所述水提取步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用10ml水進(jìn)行回流提取。

34、在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液提取步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用5ml-100ml堿水溶液進(jìn)行提取。在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液提取步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用5ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml或100ml堿水溶液進(jìn)行提取。在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液提取步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用10ml堿水溶液進(jìn)行提取。

35、在一些實(shí)施例中，所述沉淀和離心步驟中，所述濃縮液與乙醇溶液4的體積比為1:2-1:10。在一些實(shí)施例中，所述沉淀和離心步驟中，所述濃縮液與乙醇溶液4的體積比為1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。在一些實(shí)施例中，所述沉淀和離心步驟中，所述濃縮液與乙醇溶液4的體積比為1:4。

36、在一些實(shí)施例中，所述浸泡的溫度為10℃-35℃。在一些實(shí)施例中，所述浸泡的溫度為15℃-30℃。在一些實(shí)施例中，所述浸泡的溫度為20℃-25℃。

37、在一些實(shí)施例中，所述乙醇提取的提取溫度為75℃-80℃。在一些實(shí)施例中，所述乙醇提取的提取溫度為75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃。

38、在一些實(shí)施例中，所述水提取的提取溫度為90℃-100℃。在一些實(shí)施例中，所述水提取的提取溫度為90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃。在一些實(shí)施例中，所述水提取的提取溫度為95℃。

39、在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液提取的提取溫度為5℃-15℃。在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液提取的提取溫度為5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃。在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液提取的提取溫度為10℃。

40、在一些實(shí)施例中，所述濃縮為于60℃-70℃進(jìn)行濃縮。在一些實(shí)施例中，所述濃縮為于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃進(jìn)行濃縮。在一些實(shí)施例中，所述濃縮為于60℃進(jìn)行濃縮。

41、在一些實(shí)施例中，所述沉淀為于2℃-10℃進(jìn)行沉淀。在一些實(shí)施例中，所述沉淀為于2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃進(jìn)行沉淀。在一些實(shí)施例中，所述沉淀為于4℃進(jìn)行沉淀。

42、在一些實(shí)施例中，所述柱層析中的后處理包括：中和，濃縮，透析除鹽，以及干燥。在一些實(shí)施例中，所述第二后處理中所述中和為采用0.1mol/l-6.0mol/l鹽酸水溶液中和。在一些實(shí)施例中，所述第二后處理中所述中和為采用0.2mol/l-6.0mol/l鹽酸水溶液中和。在一些實(shí)施例中，所述第二后處理中所述中和為采用0.2mol/l-1.0mol/l鹽酸水溶液中和。在一些實(shí)施例中，所述第二后處理中所述中和為采用0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l、0.5mol/l、0.6mol/l、0.7mol/l、0.8mol/l、0.9mol/l、1.0mol/l、1.5mol/l、2.0mol/l、3.0mol/l、4.0mol/l、5.0mol/l或6.0mol/l鹽酸水溶液中和。

43、在一些實(shí)施例中，所述干燥為凍干。

44、在一些實(shí)施例中，所述浸泡的時(shí)間為8小時(shí)-20小時(shí)。在一些實(shí)施例中，所述浸泡的時(shí)間為8小時(shí)、9小時(shí)、10小時(shí)、11小時(shí)、12小時(shí)、13小時(shí)、14小時(shí)、15小時(shí)、16小時(shí)、17小時(shí)、18小時(shí)、19小時(shí)或20小時(shí)。在一些實(shí)施例中，所述浸泡的時(shí)間為12小時(shí)。

45、在一些實(shí)施例中，所述乙醇提取的提取時(shí)間為1h-8h。在一些實(shí)施例中，所述乙醇提取的提取時(shí)間為2h-4h。在一些實(shí)施例中，所述乙醇提取的提取時(shí)間為1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h或8h。

46、在一些實(shí)施例中，所述乙醇提取包括所述滲漉后的冬蟲夏草粉末用乙醇溶液3回流提取后換用新的乙醇溶液3再重復(fù)回流提取1-4次。在一些實(shí)施例中，所述乙醇提取包括所述滲漉后的冬蟲夏草粉末用乙醇溶液3回流提取后換用新的乙醇溶液3再重復(fù)回流提取1次、2次、3次或4次。

47、在一些實(shí)施例中，所述水提取的時(shí)間為1-8h。在一些實(shí)施例中，所述水提取的時(shí)間為2h-4h。在一些實(shí)施例中，所述水提取的時(shí)間為2h、3h或4h。

48、在一些實(shí)施例中，所述水提取包括所述乙醇溶液3回流提取后的冬蟲夏草粉末用水回流提取后換用新的水再重復(fù)回流提取1-7次。在一些實(shí)施例中，所述水提取包括所述乙醇溶液3回流提取后的冬蟲夏草粉末用水回流提取后換用新的水再重復(fù)回流提取1次、2次、3次、4次、5次、6次或7次。

49、在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液提取的提取時(shí)間為12h-48h。在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液提取的提取時(shí)間為12h、15h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、35h、40h、45h或48h。

50、在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液提取包括所述水回流提取后的冬蟲夏草粉末用堿水溶液提取后換用新的堿水溶液再重復(fù)提取2-5次。在一些實(shí)施例中，所述堿水溶液提取包括所述水回流提取后的冬蟲夏草粉末用堿水溶液提取后換用新的堿水溶液再重復(fù)提取2次、3次、4次或5次。

51、在一些實(shí)施例中，所述第一后處理中所述中和采用酸進(jìn)行中和，所述酸包括鹽酸或鹽酸水溶液、磷酸或磷酸水溶液、甲酸或甲酸水溶液中的至少一種。

52、在一些實(shí)施例中，所述步驟(6)中所述中和中所述酸包括鹽酸或鹽酸水溶液、磷酸或磷酸水溶液、甲酸或甲酸水溶液中的至少一種。

53、在一些實(shí)施例中，所述鹽酸水溶液中鹽酸的濃度為1mol/l-10mol/l。在一些實(shí)施例中，所述鹽酸水溶液中鹽酸的濃度為1mol/l、2mol/l、3mol/l、4mol/l、5mol/l、6mol/l、7mol/l、8mol/l、9mol/l或10mol/l。在一些實(shí)施例中，所述鹽酸水溶液中鹽酸的濃度為5mol/l-7mol/l。在一些實(shí)施例中，所述鹽酸水溶液中鹽酸的濃度為6mol/l。

54、在一些實(shí)施例中，所述惰性氣體包括氮?dú)?、氦氣、氖氣、氬氣、氪氣或氙氣中的至少一種。

55、在一些實(shí)施例中，所述陰離子交換層析柱的填料為deae-52。

56、在一些實(shí)施例中，所述陰離子交換層析柱的內(nèi)徑為1cm-3cm；所述陰離子交換層析柱的長度為10cm-50cm。在一些實(shí)施例中，所述陰離子交換層析柱的內(nèi)徑為1cm、2cm、2.6cm或3cm；所述陰離子交換層析柱的長度為10cm、15cm、20cm、25cm、30cm、35cm、40cm、45cm或50cm。

57、在一些實(shí)施例中，所述陰離子交換層析柱的內(nèi)徑為1cm，所述陰離子交換層析柱的長度為10cm。

58、在一些實(shí)施例中，所述陰離子交換層析柱的內(nèi)徑為2.6cm，所述陰離子交換層析柱的長度為30cm。

59、在一些實(shí)施例中，所述分離包括將冷堿提取物ncap預(yù)處理，得到樣品溶液，然后將樣品溶液施加到陰離子交換層析柱上進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液。

60、在一些實(shí)施例中，所述預(yù)處理包括：將冷堿提取物ncap溶于堿性水溶液中，加熱溶解，冷卻至室溫，用酸性水溶液中和，用水作為透析外液透析除鹽，再用tris-hcl緩沖液作為透析外液透析，收集透析內(nèi)液，離心，取上清液，得到樣品溶液。

61、在一些實(shí)施例中，所述堿性水溶液為氫氧化鈉水溶液。

62、在一些實(shí)施例中，所述堿性水溶液中堿的濃度為0.2mol/l-0.7mol/l。在一些實(shí)施例中，所述堿性水溶液中堿的濃度為0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l、0.5mol/l、0.6mol/l或0.7mol/l。在一些實(shí)施例中，所述堿性水溶液中堿的濃度為0.5mol/l。

63、在一些實(shí)施例中，所述酸性水溶液為鹽酸水溶液。

64、在一些實(shí)施例中，所述酸性水溶液中酸的濃度為0.2mol/l-0.7mol/l。在一些實(shí)施例中，所述酸性水溶液中酸的濃度為0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l、0.5mol/l、0.6mol/l或0.7mol/l。在一些實(shí)施例中，所述酸性水溶液中酸的濃度為0.5mol/l。

65、在一些實(shí)施例中，所述tris-hcl緩沖液的ph為6.0-8.0。在一些實(shí)施例中，所述tris-hcl緩沖液的ph為6.0、6.5、7.0、7.5或8.0。在一些實(shí)施例中，所述tris-hcl緩沖液的ph為7.0。

66、在一些實(shí)施例中，所述tris-hcl緩沖液中tris-hcl的濃度為0.01mol/l-0.50mol/l。在一些實(shí)施例中，所述tris-hcl緩沖液中tris-hcl的濃度為0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.04mol/l、0.05mol/l、0.10mol/l、0.20mol/l、0.30mol/l、0.40mol/l或0.50mol/l。在一些實(shí)施例中，所述tris-hcl緩沖液中tris-hcl的濃度為0.02mol/l。

67、在一些實(shí)施例中，所述透析的截留分子量為3.0kda-20.0kda。在一些實(shí)施例中，所述透析的截留分子量為3.0kda-10.0kda。在一些實(shí)施例中，所述透析的截留分子量為3.0kda-3.5kda。在一些實(shí)施例中，所述透析的截留分子量為3.5kda-5.0kda。所述透析的截留分子量為3.0kda、3.5kda、4.0kda、4.5kda、5.0kda、6.0kda、7.0kda、8.0kda、9.0kda或10.0kda。

68、在一些實(shí)施例中，所述分離步驟中所述樣品溶液中樣品(以冷堿提取物ncap投料量計(jì)算)與陰離子交換層析柱的填料的質(zhì)量比為1:80-1:400。在一些實(shí)施例中，所述分離步驟中所述樣品溶液中樣品(以冷堿提取物ncap投料量計(jì)算)與陰離子交換層析柱的填料的質(zhì)量比為1:80、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350或1:400。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，所述分離步驟中所述樣品溶液中樣品(以冷堿提取物ncap投料量計(jì)算)與陰離子交換層析柱的填料的質(zhì)量比為1:80。

69、在一些實(shí)施例中，所述梯度洗脫為：

70、以ph?6.0-8.0的0.01mol/l-0.50mol/l的tris-hcl緩沖液為buffer?a，以0.3mol/l-3.0mol/l的nacl水溶液為buffer?b，以0.1mol/l-2.0mol/l的naoh水溶液為buffer?c，流速為0.5ml/min-8.0ml/min，洗脫過程如下：

71、(1)buffer?a洗脫1.00-10.00倍陰離子交換層析柱體積；

72、(2)0％-50％buffer?b和100％～50％buffer?a勻速變化比例洗脫1.00-10.00倍陰離子交換層析柱體積；

73、(3)50％-100％buffer?b和50％～0％buffer?a勻速變化比例洗脫0.30-4.00倍陰離子交換層析柱體積；

74、(4)100％buffer?b洗脫1.00-10.00倍陰離子交換層析柱體積；

75、(5)buffer?c洗脫1.60-16.00倍陰離子交換層析柱體積。

76、在一些實(shí)施例中，所述buffer?a中tris-hcl的濃度為0.01mol/l-0.05mol/l。在一些實(shí)施例中，所述buffer?a中tris-hcl的濃度為0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.04mol/l或0.05mol/l。

77、在一些實(shí)施例中，所述buffer?b中nacl的濃度為0.5mol/l-2mol/l。在一些實(shí)施例中，所述buffer?b中nacl的濃度為0.8mol/l-1.5mol/l。在一些實(shí)施例中，所述buffer?b中nacl的濃度為0.5mol/l、0.6mol/l、0.7mol/l、0.8mol/l、0.9mol/l、1.0mol/l、1.1mol/l、1.2mol/l、1.3mol/l、1.4mol/l、1.5mol/l或2.0mol/l。

78、在一些實(shí)施例中，所述buffer?c中naoh的濃度為0.1mol/l-1.0mol/l。在一些實(shí)施例中，所述buffer?c中naoh的濃度為0.3mol/l-0.8mol/l。在一些實(shí)施例中，所述buffer?c中naoh的濃度為0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l、0.5mol/l、0.6mol/l、0.7mol/l、0.8mol/l、0.9mol/l或1.0mol/l。

79、在一些實(shí)施例中，所述buffer?a的ph為6.0、6.5、7.0、7.5或8.0。

80、在一些實(shí)施例中，所述梯度洗脫的(1)步驟中buffer?a的洗脫體積為1.00、2.00、3.00、3.14、4.00、5.00、6.00、6.37、7.00、8.00、9.00或10.00倍陰離子交換層析柱體積。

81、在一些實(shí)施例中，所述梯度洗脫的(2)步驟的洗脫體積為1.00、2.00、3.00、3.14、4.00、5.00、6.00、6.37、7.00、8.00、9.00或10.00倍陰離子交換層析柱體積。

82、在一些實(shí)施例中，所述梯度洗脫的(3)步驟的洗脫體積為0.30、0.50、0.80、0.90、1.00、1.10、1.20、1.27、1.30、1.40、1.50、1.60、1.70、1.80、1.90、2.00、2.50、3.0、3.50或4.00倍陰離子交換層析柱體積。

83、在一些實(shí)施例中，所述梯度洗脫的(4)步驟的洗脫體積為1.00、2.00、3.00、3.14、4.00、4.50、5.00、5.03、5.50、6.00、6.37、6.50、7.00、8.00、9.00或10.00倍陰離子交換層析柱體積。

84、在一些實(shí)施例中，所述梯度洗脫的(5)步驟的洗脫體積為1.60、2.00、3.00、3.14、4.00、4.50、5.00、5.03、5.50、6.00、6.37、6.50、7.00、8.00、9.00、10.00、11.00、12.00、13.00、14.00、15.00或16.00倍陰離子交換層析柱體積。

85、在一些實(shí)施例中，所述流速為0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min、1.5ml/min、2.0ml/min、2.5ml/min、3.0ml/min、3.5ml/min、4.0ml/min、4.5ml/min、5.0ml/min、5.5ml/min、6.0ml/min、6.5ml/min、6.8ml/min、6.9ml/min、7.0ml/min、7.2ml/min、7.5ml/min或8.0ml/min。

86、在一些實(shí)施例中，所述梯度洗脫為：

87、以ph7.0的0.02mol/l的tris-hcl緩沖液為buffer?a，以1.0mol/l的nacl水溶液為buffer?b，以0.50mol/l的naoh水溶液為buffer?c，流速為1ml/min，洗脫過程如下：

88、(1)buffer?a洗脫1.00-10.00倍陰離子交換層析柱體積；

89、(2)0％-50％buffer?b和100％～50％buffer?a勻速變化比例洗脫1.00-10.00倍陰離子交換層析柱體積；

90、(3)50％-100％buffer?b和50％～0％buffer?a勻速變化比例洗脫0.30-4.00倍陰離子交換層析柱體積；

91、(4)100％buffer?b洗脫1.00-10.00倍陰離子交換層析柱體積；

92、(5)buffer?c洗脫1.60-16.00倍陰離子交換層析柱體積。

93、在一些實(shí)施例中，一種冬蟲夏草提取物，其制備方法包括：

94、(1)浸泡和滲漉：將冬蟲夏草粉末用95％vol乙醇水溶液浸泡8小時(shí)-20小時(shí)；再用95％vol乙醇水溶液滲漉；所述浸泡步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用4ml-20ml的95％vol乙醇水溶液進(jìn)行浸泡；所述滲漉步驟中，每1g所述冬蟲夏草粉末采用10ml-25ml的95％vol乙醇水溶液進(jìn)行滲漉；

95、(2)乙醇提取：滲漉后的冬蟲夏草粉末用80％vol乙醇水溶液回流提??；每1g所述冬蟲夏草粉末采用5ml-20ml的80％vol乙醇水溶液進(jìn)行回流提取；所述滲漉后的冬蟲夏草粉末用乙醇溶液3回流提取后換用5ml-20ml新的80％vol乙醇水溶液重復(fù)回流提取1-4次；

96、(3)水提?。?0％vol乙醇水溶液回流提取后的冬蟲夏草粉末再用水回流提?。幻?g所述冬蟲夏草粉末采用5ml-20ml水進(jìn)行回流提?。凰?0％vol乙醇水溶液回流提取后的冬蟲夏草粉末用水回流提取后換用5ml-20ml新的水重復(fù)回流提取4-7次；

97、(4)堿水溶液提?。核亓魈崛『蟮亩x夏草粉末再用3wt％濃度的naoh水溶液在惰性氣體氛圍條件下提??；每1g所述冬蟲夏草粉末采用5ml-20ml?3wt％濃度的naoh水溶液進(jìn)行提??；所述水回流提取后的冬蟲夏草粉末用堿水溶液提取后換用5ml-20ml新的3wt％濃度的naoh水溶液重復(fù)提取2-5次；

98、(5)過濾：將堿水溶液提取后的冬蟲夏草粉末過濾，收集濾液；

99、(6)中和及濃縮：將濾液用鹽酸水溶液中和，收集上清液，濃縮，得到濃縮液；

100、(7)沉淀和離心：將濃縮液與95％vol乙醇水溶液混合，靜置沉淀，離心，收集沉淀物；

101、(8)洗滌：沉淀物依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌，得到冷堿提取物ncap；和

102、(9)柱層析：將冷堿提取物ncap預(yù)處理，得到樣品溶液，然后將樣品溶液施加到陰離子交換層析柱上進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，優(yōu)選收集buffer?c的洗脫液，經(jīng)第二后處理，得到所述冬蟲夏草提取物；

103、所述陰離子交換層析柱的填料為deae-52；所述梯度洗脫為：

104、以ph7.0的0.02mol/l的tris-hcl緩沖液為buffer?a，以1.0mol/l的nacl水溶液為buffer?b，以0.50mol/l的naoh水溶液為buffer?c，流速為0.5ml/min-8.0ml/min，洗脫過程如下：

105、(1)buffer?a洗脫1.00-10.00倍陰離子交換層析柱體積；

106、(2)0％-50％buffer?b和100％～50％buffer?a勻速變化比例洗脫1.00-10.00倍陰離子交換層析柱體積；

107、(3)50％-100％buffer?b和50％～0％buffer?a勻速變化比例洗脫0.30-4.00倍陰離子交換層析柱體積；

108、(4)100％buffer?b洗脫1.00-10.00倍陰離子交換層析柱體積；

109、(5)buffer?c洗脫1.00-1.60倍陰離子交換層析柱體積。

110、在一些實(shí)施例中，所述流速為1.0ml/minx(陰離子交換層析柱內(nèi)徑÷1cm)2，所述陰離子交換層析柱內(nèi)徑的單位為cm或換算為cm。

111、在一些實(shí)施例中，所述柱層析操作中，在梯度洗脫前，還包括裝柱及平衡：將deae-52填料按常規(guī)操作進(jìn)行預(yù)處理，再用1.0mol/l?nacl水溶液浸泡后進(jìn)行濕法裝柱；裝柱后用buffer?a平衡層析柱。

112、在一些實(shí)施例中，所述常規(guī)操作包括：將deae-52填料用水浸泡，過濾除水，再用酸水溶液(如鹽酸水溶液)浸泡，再用水洗滌至ph為中性，過濾除水，再用堿水溶液(如氫氧化鈉水溶液)浸泡，然后用水洗滌至ph為中性。在一些實(shí)施例中，所述常規(guī)操作包括：將deae-52填料用水浸泡1h-4h，過濾除水，再用0.2mol/l-1.0mol/l的鹽酸水溶液浸泡1h-4h，再用水洗滌至ph為中性，過濾除水，再用0.2mol/l-1.0mol/l的氫氧化鈉水溶液浸泡1h-4h，然后用水洗滌至ph為中性。在一些實(shí)施例中，所述常規(guī)操作包括：將deae-52填料用水浸泡2h，過濾除水，再用0.5mol/l的鹽酸水溶液浸泡2h，再用水洗滌至ph為中性，過濾除水，再用0.5mol/l的氫氧化鈉水溶液浸泡2h，然后用水洗滌至ph為中性。

113、第二方面，本發(fā)明提供一種制備方法。

114、一種冬蟲夏草提取物的制備方法，其特征在于，包括第一方面所述制備方法。第三方面，本發(fā)明提供一種第一方面所述冬蟲夏草提取物或第二方面所述制備方法所得冬蟲夏草提取物的應(yīng)用。

115、一種第一方面所述冬蟲夏草提取物或者第二方面所述制備方法所得冬蟲夏草提取物在制備用于提高免疫力和/或抗腫瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

116、在一些實(shí)施例中，一種第一方面所述冬蟲夏草提取物或者第二方面所述制備方法所得冬蟲夏草提取物在制備用于提高tnf-α(腫瘤壞死因子-α)濃度和/或抗結(jié)腸癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

117、在一些實(shí)施例中，所述提高免疫力和/或抗腫瘤的產(chǎn)品為藥物產(chǎn)品。

118、在一些實(shí)施例中，所述提高免疫力的產(chǎn)品為保健品產(chǎn)品。

119、有益效果

120、相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

121、本發(fā)明所提供冬蟲夏草提取物具有良好的提高免疫力和/或抗腫瘤的技術(shù)效果，尤其是在提高tnf-α濃度和/或抗結(jié)腸癌上，且遠(yuǎn)比冷堿提取物ncap和洗脫程序的其他洗脫液中的提取物的免疫力和/或抗腫瘤活性更高(例如具有更好的提高tnf-α濃度活性和/或更高的抗結(jié)腸癌活性)，具有預(yù)料不到的優(yōu)異技術(shù)效果，另外，本發(fā)明所提供的冬蟲夏草提取物的制備方法有利于提高冬蟲夏草資源的利用率。有利于冬蟲夏草新產(chǎn)品的開發(fā)，并通過節(jié)約原材料的方式，降低冬蟲夏草產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。

122、術(shù)語說明

123、在本發(fā)明的描述中，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上，除非另有明確具體的限定。

124、術(shù)語“室溫”表示環(huán)境溫度，指溫度在大約10℃至大約30℃，或大約20℃至30℃，或大約25℃。

125、在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

126、術(shù)語“v/v”表示體積比。

127、術(shù)語“％vol”表示體積百分比。

128、術(shù)語“wt％”表示質(zhì)量百分比。

129、術(shù)語“kda”表示千道爾頓，為重均分子量的單位。術(shù)語“da”表示道爾頓，為重均分子量的單位。

130、術(shù)語“kgy”表示千戈瑞，是kilogray的縮寫，為吸收劑量單位，用于衡量由電離輻射導(dǎo)致的“能量吸收劑量”(簡稱吸收劑量)的物理單位，它描述了單位質(zhì)量物體吸收電離輻射能量的大小。

131、本發(fā)明所述“中和”是指調(diào)節(jié)ph至6.5-7.5。

132、deae-52填料表示deae-cellulose填料,也即二乙氨基乙基纖維素填料，其cas號為9013-34-7。

133、在下面的內(nèi)容中，無論是否使用“大約”或“約”等字眼，所有在此公開了的數(shù)字均為近似值。每一個(gè)數(shù)字的數(shù)值有可能會(huì)出現(xiàn)1％、2％、5％、7％、8％、10％、15％或20％等差異。每當(dāng)公開一個(gè)具有n值的數(shù)字時(shí)，任何具有n+/-1％,n+/-2％,n+/-3％,n+/-5％,n+/-7％,n+/-8％,n+/-10％,n+/-15％or?n+/-20％值的數(shù)字會(huì)被明確地公開,其中“+/-”是指加或減。