本發(fā)明涉及生物材料領(lǐng)域，尤其涉及礦化蛋白膜及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、引導(dǎo)骨再生（gbr）術(shù)是治療骨損傷疾病的經(jīng)典方法，需要使用gbr膜防止軟組織生長到骨缺損區(qū)域，具有優(yōu)異屏障效果的gbr膜是骨損傷疾病治療成功的關(guān)鍵。根據(jù)臨床需求，gbr膜首先應(yīng)該起到隔絕細(xì)胞的作用，能夠阻止軟組織相關(guān)細(xì)胞的通過。另外，具有生物功能性gbr膜的使用能夠提高骨組織再生速度，從而縮短治療周期。gbr膜可以分為不可吸收型和可吸收型兩大類，均在臨床中具有廣泛的應(yīng)用。其中不可吸收型gbr膜能夠為骨再生提供更好的屏障，不存在力學(xué)性能下降的問題，但是需要后期手術(shù)取出易造成二次傷害。相反，可吸收型gbr膜具有可降解性，但屏障能力會逐漸下降而影響治療效果。因此，亟需發(fā)展新型的gbr膜來解決可降解性和功能性難以平衡的問題。

2、水凝膠，尤其是基于生物大分子的水凝膠，具有可降解性和力學(xué)性能可調(diào)性，在多種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中展現(xiàn)出巨大潛力。然而在力學(xué)性能方面，合成水凝膠與許多天然水凝膠仍存在較大差距，例如軟骨和皮膚能夠在50%以上含水量的條件下同時保持高的強(qiáng)度、剛度和韌性。雖然最近在合成水凝膠領(lǐng)域有了許多重要突破，尤其是雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠甚至可以媲美天然皮膚的韌性。但是合成水凝膠的韌性往往來源于高伸長率，剛性仍然較差，在應(yīng)用中難以提供有效的支撐作用。而在gbr膜的使用場景中，支撐性能夠為骨的再生提供空間，有利于提高骨的再生速度。為了更好的滿足gbr應(yīng)用需求，水凝膠材料的剛性亟待提升。仿生礦化是提高材料剛性的有效方法，但礦化又容易產(chǎn)生材料的脆性。為了制備兼具高韌性和剛性的水凝膠材料，通過酶促礦化的策略實現(xiàn)了無定型礦化物在水凝膠基質(zhì)中的原位生長，得到了剛性和韌性相結(jié)合的礦化水凝膠材料，同時無機(jī)礦化物還賦予了材料生物活性。但是化學(xué)合成材料的生物相容性問題限制了進(jìn)一步生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，因此開發(fā)基于蛋白水凝膠的酶促礦化方法有望實現(xiàn)兼具優(yōu)異機(jī)械性能、生物相容性和生物活性的新型gbr膜的制備。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了礦化蛋白膜及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種用于引導(dǎo)骨再生的礦化蛋白膜及其制備方法，本發(fā)明中的礦化蛋白膜具有優(yōu)異的力學(xué)性能，可以有效隔絕軟組織細(xì)胞，同時具有優(yōu)異的生物相容性和生物活性，可有效促進(jìn)骨缺損部位的修復(fù)再生。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了礦化蛋白膜，包括：蛋白膜和礦化物；所述礦化物包括：羥基磷灰石礦化物。

4、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述礦化蛋白膜中，所述蛋白膜包括：彈性蛋白和官能化或未官能化的聚乙二醇。

5、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述礦化蛋白膜中，所述彈性蛋白和所述官能化或未官能化的聚乙二醇的質(zhì)量比為4:3。

6、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述礦化蛋白膜中，所述彈性蛋白具有：

7、（1）、如seq?id?no:1所示的氨基酸序列；或

8、（2）、如（1）所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個氨基獲得的氨基酸序列，且與（1）所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

9、（3）、與（1）或（2）所示的氨基酸序列至少有80%同一性的氨基酸序列。

10、在本發(fā)明的一些實施方案中，seq?id?no:1的序列為：mgqgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgvgsggrpsdsygapgggnpvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgwhhhhhh。

11、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述礦化蛋白膜中所述彈性蛋白包括：節(jié)肢彈性蛋白和正電性類彈性蛋白。

12、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述礦化蛋白膜中所述節(jié)肢彈性蛋白具有如seq?idno:2所示的氨基酸序列：vgsggrpsdsygapgggnp。

13、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述礦化蛋白膜中所述正電性類彈性蛋白具有如seq?id?no:3所示的氨基酸序列：vpgkgvpgkgvpgkgvpgkgvpgkg。

14、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述礦化蛋白膜中所述官能化包括：雙醛基官能化。

15、本發(fā)明還提供了上述礦化蛋白膜的制備方法，所述礦化蛋白膜經(jīng)所述礦化物原位礦化于所述蛋白膜中獲得。

16、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法，包括如下步驟：

17、s1：將所述彈性蛋白、所述官能化或未官能化的聚乙二醇和堿性磷酸酶混合，第一交聯(lián)；

18、s2：將所述第一交聯(lián)后的產(chǎn)物第二交聯(lián)，獲得所述蛋白膜；

19、s3：將所述蛋白膜與礦化原料混合，獲得所述礦化蛋白膜。

20、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法中，所述礦化原料包括：甘油磷酸鈣。

21、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法中，所述礦化原料以溶液的形式添加；所述礦化原料的溶液的濃度為11g/l。

22、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法中，所述礦化原料的溶液經(jīng)所述礦化原料與三乙醇胺緩沖液混合后獲得。

23、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法s3中所述混合的時間為6~24h。

24、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法s3中所述混合的時間為6h、12h或24h。

25、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法中所述彈性蛋白以溶液的形式添加，所述彈性蛋白的溶液的終濃度為20~200?mg/ml。

26、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法中所述彈性蛋白的溶液的終濃度為100?mg/ml。

27、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法中所述官能化或未官能化的聚乙二醇以溶液的形式添加，所述官能化或未官能化的聚乙二醇的溶液的終濃度為50~300?mg/ml。

28、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法中所述官能化或未官能化的聚乙二醇的溶液的終濃度為200?mg/ml。

29、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法中所述第一交聯(lián)包括：亞胺鍵交聯(lián)；所述第二交聯(lián)包括：光交聯(lián)。

30、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法中所述第一交聯(lián)的溫度為37℃，時間為2h。

31、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法中所述第二交聯(lián)的時間為3min，光照強(qiáng)度為3.8?mw/cm2。

32、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法中所述光交聯(lián)包括添加光引發(fā)劑和氧化劑的步驟；

33、所述光引發(fā)劑包括：三聯(lián)吡啶釕；所述氧化劑包括：過硫酸根離子。

34、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述制備方法中所述氧化劑包括：過硫酸銨或過硫酸鉀。

35、本發(fā)明還提供了上述礦化蛋白膜和/或上述制備方法獲得的礦化蛋白膜在制備骨修復(fù)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

36、本發(fā)明還提供了產(chǎn)品，包括：上述礦化蛋白膜和/或上述制備方法獲得的礦化蛋白膜。

37、本發(fā)明提供一種用于引導(dǎo)骨再生的礦化蛋白膜，具體由節(jié)肢彈性蛋白水凝膠礦化模板和原位礦化形成的磷酸鈣礦化物組成，其中蛋白水凝膠由節(jié)肢彈性蛋白經(jīng)過兩步化學(xué)交聯(lián)得到，節(jié)肢彈性蛋白氨基酸序列為mgqg[vgsggrpsdsygapgggnp(vpgkg)5vpg]16wh6；該礦化蛋白膜可用于促進(jìn)骨缺損部位修復(fù)再生。本發(fā)明所述的礦化蛋白膜產(chǎn)品具有優(yōu)異的力學(xué)性能，包括較高的楊氏模量、斷裂強(qiáng)度和柔韌性，還具有生物相容性和生物活性，可以有效隔絕軟組織細(xì)胞，可用于促進(jìn)骨缺損部位的修復(fù)再生。此外，本發(fā)明制備工藝簡單、無需特殊設(shè)備、成本低、綠色環(huán)保，利于下一代組織屏障膜和骨修復(fù)材料的開發(fā)推廣。