本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程，特別涉及一種細(xì)胞球模塊化生物墨水制備方法及其在心肌梗死治療領(lǐng)域應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、干細(xì)胞移植已被證明是一種很有前景的治療損傷器官/組織的方法，如心肌組織梗死，或復(fù)雜疾病，包括糖尿病和骨關(guān)節(jié)炎。心肌細(xì)胞不可逆死亡引起的心肌梗死(mi)可損害心肌功能，導(dǎo)致心力衰竭。干細(xì)胞移植具有自我再生、免疫調(diào)節(jié)作用和營養(yǎng)作用，如血管生成、抗纖維化和抗凋亡，已被證明是心肌梗死后縮小梗死面積和恢復(fù)心功能的一種很有前景的治療方法。然而，心肌梗死后，病理微環(huán)境的初始階段是由缺氧缺血誘導(dǎo)的高水平蛋白酶和活性氧(ros)，這不僅導(dǎo)致局部心臟細(xì)胞和移植干細(xì)胞的細(xì)胞活力大幅下降，而且減少了細(xì)胞的植入，從而影響了治療效果。此外，心肌細(xì)胞的創(chuàng)傷會引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致單核細(xì)胞的募集，單核細(xì)胞可以在梗死部位分化為巨噬細(xì)胞。由于初始巨噬細(xì)胞(m0型)可以在環(huán)境提示下向促炎m1或抗炎m2巨噬細(xì)胞極化，危險的心肌梗死微環(huán)境通常會導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致心力衰竭。這也會對周圍的健康細(xì)胞或移植的治療細(xì)胞產(chǎn)生有害的毒性作用。因此，在心肌梗死部位糾正這種嚴(yán)重的炎癥微環(huán)境，并觸發(fā)巨噬細(xì)胞向有利于愈合的m2表型極化，可能會促進(jìn)損傷心臟組織的愈合。基于此，基于干細(xì)胞移植的免疫調(diào)節(jié)治療可以糾正巨噬細(xì)胞極化，從而啟動級聯(lián)反應(yīng)，將促炎微環(huán)境逆轉(zhuǎn)為促愈合微環(huán)境，這被認(rèn)為是心肌梗死治療的一種很有前景的策略。具體來說，為了使干細(xì)胞治療能夠重塑心肌梗死的促炎微環(huán)境(如缺氧、高水平ros、蛋白酶和炎癥因子的過度產(chǎn)生等)，需要在治療過程中對各種生物事件進(jìn)行精確的協(xié)調(diào)和管理，然而，這仍然是心肌修復(fù)領(lǐng)域的一個挑戰(zhàn)。

2、由于(同種異體)干細(xì)胞直接移植治療心肌梗死面臨著由于宿主免疫清除和不良病理微環(huán)境導(dǎo)致的低愈合效果，研究者努力克服這些障礙，以提高干細(xì)胞治療心肌修復(fù)的療效?？紤]到心肌梗死早期以缺氧缺血、氧化應(yīng)激和炎癥期為特征，研究者提出了用缺氧/化學(xué)條件或基因重編程預(yù)處理干細(xì)胞以提高細(xì)胞存活率和/或功能的策略。此外，有研究表明，與傳統(tǒng)的二維(2d)結(jié)構(gòu)細(xì)胞移植相比，三維(3d)結(jié)構(gòu)干細(xì)胞或細(xì)胞球體移植更有效地治療心肌梗死。因為在缺氧條件下保留細(xì)胞活力，并增強組織修復(fù)營養(yǎng)分泌的作用。盡管取得了這些進(jìn)展，但在改善預(yù)處理對細(xì)胞的作用時間、提供對外部應(yīng)激的保護(hù)以及屏蔽異體細(xì)胞免受免疫清除方面仍存在挑戰(zhàn)。因此，人們努力將細(xì)胞包裹在生物材料中，如多糖或蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生承載細(xì)胞的凝膠或貼片，作為抵抗外部應(yīng)激和宿主免疫系統(tǒng)的保護(hù)層。不幸的是，大多數(shù)包封策略只能在介導(dǎo)供體-宿主反應(yīng)中提供單一功能，而未能認(rèn)識到操縱周圍環(huán)境生態(tài)位的重要性，因此在治療效果方面表現(xiàn)出不足。因此，同時改善供體細(xì)胞功能和逆轉(zhuǎn)不良病理微環(huán)境的創(chuàng)新方法被認(rèn)為是進(jìn)一步應(yīng)用于心肌梗死治療的更有前景的策略。

3、本發(fā)明提出了一種細(xì)胞球模塊化生物墨水的制備方法及其在心肌修復(fù)治療領(lǐng)域應(yīng)用策略，通過在細(xì)胞球體上引入蛋白質(zhì)/多酚復(fù)合涂層，并結(jié)合顆粒凝膠形成可打印的生物墨水，涂層作為多功能裝甲，提供針對宿主免疫系統(tǒng)的免疫保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)治療，以逆轉(zhuǎn)敵對微環(huán)境，促進(jìn)梗死心肌組織的愈合過程。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于提供一種細(xì)胞球模塊化生物墨水的制備方法及其在心肌修復(fù)治療領(lǐng)域應(yīng)用。

2、本發(fā)明通過層層自組裝在干細(xì)胞球體周圍生成蛋白/多酚保護(hù)層，其中多酚作為交聯(lián)劑與蛋白結(jié)合，酚類具有清除ros的能力。此外，蛋白和多酚組成的涂層能夠改變干細(xì)胞分泌的旁分泌因子，通過激活糖酵解，促進(jìn)血管生成和免疫調(diào)節(jié)。進(jìn)一步將具有涂層的干細(xì)胞球體與顆粒凝膠相結(jié)合，形成剪切變稀，可注射可打印的生物墨水。將其移植到心肌梗死大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與裸細(xì)胞球體治療相比，通過介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向促愈合的m2表型極化，明顯減輕了局部炎癥和隨后的纖維化，并改善了梗死心肌組織的心功能。

3、本發(fā)明采用如下技術(shù)方案來實現(xiàn)。

4、本發(fā)明提供了一種具有組織修復(fù)功能的細(xì)胞球模塊化生物墨水，模塊化生物墨水由細(xì)胞球和顆粒微凝膠組成；所述顆粒凝膠的干重質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-50％，體積分?jǐn)?shù)大于0.5；所述細(xì)胞球在球體表面引入一層自組蛋白與多酚涂層；所述顆粒凝膠提供可注射、可打印性能；所述載細(xì)胞球的直徑為40-1000um。

5、上文所述的技術(shù)方案中，進(jìn)一步地，所述模塊化生物墨水中細(xì)胞數(shù)量為2～10000個，優(yōu)選為100～3000個。

6、本發(fā)明提供了一種具有涂層的干細(xì)胞球制備方法，包括以下幾個步驟：

7、(1)培養(yǎng)細(xì)胞球的pdms多微孔裝置的制作

8、微孔pdms裝置中間有一個方形容器。方形容器底部有1024個孔。每口厚度為0.6mm的梯形井，上側(cè)面的正方形長度為0.46mm，下側(cè)面正方形長度為0.25mm。采用投影微立體光刻技術(shù)制作主模。然后，將主模具嵌入金屬鋁構(gòu)件中。將蓋板放置在主模具上，用螺絲固定四個角，獲得總裝配模具。將脫氣的pdms預(yù)聚液倒在模具上，85℃固化。將固化后的微孔pdms裝從裝配模具中取下，滅菌、親水處理。用去離子水和無血清細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗后，將其用于細(xì)胞球培養(yǎng)。

9、(2)將步驟(1)所述的pdms多微孔裝置用于細(xì)胞球培養(yǎng)。細(xì)胞懸液將采用4種不同的細(xì)胞密度，獲得不同尺寸的球體，并測量每個球體的直徑。

10、(3)將步驟(2)所述的細(xì)胞球收集，洗滌后。將收集的球體與天然聚合物孵育，然后離心除去上清。將多酚類物質(zhì)加入包被球體中輕輕混合后分離與上清。天然聚合物層依次與多酚類物質(zhì)層交替沉積在球體上。

11、(4)將步驟(3)所述的具有涂層的細(xì)胞球和微流控制備的顆粒凝膠作為可注射或可打印材料，經(jīng)密堆積后，利用生物打印的方式實現(xiàn)載生物活性物質(zhì)的微凝膠的精確排布。

12、上文所述的技術(shù)方案中，所述另一種聚合物材料為天然聚合物或合成聚合物的一種或者二種以上的組合，所述天然聚合物包括細(xì)胞外基質(zhì)、海藻酸、海藻酸鹽、海藻酸鹽衍生物、透明質(zhì)酸、殼聚糖、瓊脂糖、葡聚糖；蛋白類膠原、明膠、明膠衍生物、纖維蛋白、瓊脂、基質(zhì)膠、蛋白多糖、糖蛋白、層連接蛋白。

13、上文所述的技術(shù)方案中，具體而言，步驟(3)中所述的被包埋活體細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實施目的的不同進(jìn)行選擇；

14、所述活體細(xì)胞一般為原代培養(yǎng)細(xì)胞、傳代培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞株培養(yǎng)細(xì)胞和雜合體中的一種或二種以上的組合；

15、上文所述的技術(shù)方案中，利用集成微流控芯片制備微凝膠的過程，主要包括如下步驟：

16、①聚合物溶解于水或pbs或培養(yǎng)基中制備溶液，隨后加入交聯(lián)反應(yīng)引發(fā)劑，得到水凝膠預(yù)聚體溶液，作為制備油包水乳液體系的第一相水相溶液，另一相將細(xì)胞加入上述溶液中得水凝膠預(yù)聚體溶液，作為制備油包水乳液體系的第二相水相溶液；

17、②將含有非離子表面活性劑的礦物油(石蠟/二甲基硅油)作為油包水乳液體系的油相；或含氟化表面活性劑的氟化油，作為油包水乳液體系的油相。

18、上文所述的技術(shù)方案中，所述多通道微流控芯片：各通道優(yōu)先流速及更優(yōu)選流速為單通道的倍增，例如，兩通道微流控芯片為單通道流速的2倍，三通道微流控芯片為單通道的流速的3倍，以此類推。

19、上文所述的技術(shù)方案中，具體而言，所述第一相和第二相水相流速總和與第一重油相的流速比為1:0.01～1之間，優(yōu)選1:0.05～0.5；第一重油相流速和第二重油相流速比為1:0.1～50，優(yōu)選1:0.5～10。

20、上文所述的技術(shù)方案中，所述交聯(lián)反應(yīng)引發(fā)劑包括①配位反應(yīng)引發(fā)劑(選自鈣-乙二胺四乙酸的螯合物水溶液、鈣-氨三乙酸的螯合物水溶液、碳酸鈣納米顆粒、硫酸鈣納米顆粒、磷酸鈣納米顆粒中一種或幾種的組合)，所述引發(fā)劑的終濃度以鈣含量記為10-1000mm；②具有良好生物相容性的光化學(xué)反應(yīng)引發(fā)劑(選自2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone,i2959)、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亞膦酸鋰(lithium?phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate,lap)、偶氮引發(fā)劑va086(2,2'-(diazene-1,2-diyl)bis(n-(2-hydroxyethyl)-2-methylpropanamide)、安息香甲基醚(2-methoxy-2-phenyl-acetophenon)、伊紅y(eosiny)中一種或幾種的組合)，光照波長為365nm-780nm，光照時間0.00001s-600s；③溫度介導(dǎo)的交聯(lián)劑，交聯(lián)溫度為0-40℃；④酶催化反應(yīng)所用酶(選自歧化酶、凝血酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶中一種)。

21、上文所述的技術(shù)方案中，所述微流控技術(shù)制備得到的顆粒凝膠產(chǎn)品直徑為20～500μm；粒徑分布的離散系數(shù)在0.01～20％，

22、上文所述的技術(shù)方案中，步驟(4)是將步驟(3)制備的具有涂層的細(xì)胞球和微流控制備的顆粒凝膠作為可打印的生物墨水，借助三維(3d)移動平臺，通過按需逐點打印和層層疊加的方式，達(dá)到精確構(gòu)建三維復(fù)雜結(jié)構(gòu)的目的。

23、上文所述的技術(shù)方案中，將所述的用于注射或生物打印的顆粒凝膠是由微流控制備的微凝膠進(jìn)行密堆積，置于打印容器中，進(jìn)行生物打印。其中，具有涂層的細(xì)胞球和微流控制備的顆粒凝膠密堆積方法可以是離心，過濾，以及抽濾等化工操作單元。

24、上文所述的技術(shù)方案中，進(jìn)一步地，顆粒凝膠的材料包括胞外基質(zhì)、透明質(zhì)酸、殼聚糖、瓊脂糖、葡聚糖或蛋白類膠原、明膠、明膠衍生物、纖維蛋白、瓊脂、基質(zhì)膠、蛋白多糖、糖蛋白、層連接蛋白；所述顆粒凝膠與細(xì)胞球的混合方式，包括對流混合或剪切混合；所述對流混合通過機械攪拌或翻轉(zhuǎn)設(shè)備，使顆粒整體移動或翻轉(zhuǎn)，從而實現(xiàn)混合；所述剪切混合，通過施加剪切力，使顆粒在混合過程中相互摩擦和擠壓，從而打破顆粒間的團聚現(xiàn)象，達(dá)到均勻混合的效果。

25、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有的有益效果如下：

26、(1)本發(fā)明設(shè)計了一種基于微芯片的快速制備細(xì)胞球模塊化生物墨水的新方法，實現(xiàn)細(xì)胞球的大量生產(chǎn)，保證了較高的細(xì)胞活性。

27、(2)本發(fā)明提出了一種基于生物材料涂層設(shè)計結(jié)合間充質(zhì)干細(xì)胞球體的心肌梗死治療策略。該生物材料涂層能夠調(diào)控病理心肌梗死微環(huán)境，同時具有多種功能，包括保護(hù)供體細(xì)胞免受宿主免疫清除；通過清除ros和刺激msc促愈合旁分泌重塑促炎微環(huán)境，顯著提高了干細(xì)胞治療效果。進(jìn)一步闡明了該涂層對干細(xì)胞影響潛在的治療機制。

28、(3)本發(fā)明可通過生物打印技術(shù)將有涂層的干細(xì)胞球顆粒凝膠精確排布。其中，有涂層的干細(xì)胞球顆粒凝膠可被用作組織構(gòu)建塊，以創(chuàng)建三維(3d)組織和器官，形成單細(xì)胞精度、高細(xì)胞密度仿生組織微單元。

29、(4)本發(fā)明采用技術(shù)能夠有效保證細(xì)胞活性；且利用可注射直接原位遞送細(xì)胞用于疾病治療或生物打印方式能夠?qū)崿F(xiàn)三維復(fù)雜結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。