專利名稱：具有優(yōu)越效能的α-黑素細(xì)胞刺激激素片段的線狀和環(huán)狀類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新的、先前未報道過的α-MSH線狀和環(huán)狀片段類似物;通過局部使用這些類似物在脊椎動物中刺激黑素細(xì)胞的方法，以及在該方法中有用的組合物。
脊椎動物的皮膚、毛發(fā)以及容貌的顏色是由某些例如黑素細(xì)胞這樣的帶顏色的細(xì)胞的數(shù)目和分布情況決定的，這些細(xì)胞的數(shù)目和分布是受遺傳控制的。在哺乳動物中，黑素細(xì)胞分布在表皮的基層、皮膚-表皮的接合處以及毛囊里。這些黑素細(xì)胞中的色素(黑色素)的合成是由一種分布在細(xì)胞器中的酶，即酪氨酸酶和黑素前體的活性控制的。在酪氨酸酶的活化下，正常黑色素(棕黑色)或褐黑色素(黃紅色)的顏色就沉積在該細(xì)胞器內(nèi);在完成黑色素化后，黑素前體就成為黑素體，更具體地說，取決于顏色，成為正常黑色素或褐黑色素。〔參見Fitzpatrick，T.B.，Y.Hori，K.Toda，M.Seiji，Jap.J.Derm.79278(1969)〕。黑素體被送到皮膚的周圍角質(zhì)化細(xì)胞，或者通過被稱為細(xì)胞毛發(fā)分泌的過程送到正在生長的毛發(fā)毛干內(nèi)的細(xì)胞中。
雖然黑色素的合成以及毛發(fā)的型式是按遺傳學(xué)的方式表達(dá)的，但在某些哺乳動物中小囊黑素生成和毛發(fā)顏色的變化會受α-向黑素(也稱為α-黑素細(xì)胞刺激激素，即α-MSH)的激素控制，這種α-向黑素是一種具有如下化學(xué)式的線狀十三肽Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2.
這種代表腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的前十三個氨基酸的序列的激素是由垂體的部分媒介物分泌的一種大分子量的蛋白質(zhì)前體(Proopiomelanocortin)，它刺激腺苷酸環(huán)化酶的活性、酪氨酸酶的活性和刺激隨后的黑色素的生成〔參見Hadley，M.E.，C.B.Howard，V.J.Hruby，T.K.Sawyer，andY.C.S.Young，PigmentCell6323(1980)〕。
人類僅在胎兒的垂體中才明顯發(fā)現(xiàn)有α-MSH，而在成人中并未發(fā)現(xiàn)。成人的黑色素生成水平是按遺傳方式?jīng)Q定的，并且結(jié)構(gòu)上被呈現(xiàn)出來。超過這一基本水平的各種不同的黑色素的合成直接依賴于紫外光如日光的刺激，強烈的太陽照射能增加黑色素的形成，伴隨著使皮膚變暗。這種反應(yīng)可能是一種演變適應(yīng)的過程以保護人體免受紫外線的老化和誘變性質(zhì)的影響。較低水平紫外線照射的結(jié)果引起表皮產(chǎn)生低水平的黑色素合成，使皮膚顏色變淺，引起較少的阻斷效應(yīng)使皮膚能吸收更大量的輻射。雖然成人不在垂體中合成α-MSH，但人的黑素細(xì)胞會對這種激素以及它的一種消旋制劑作出響應(yīng)。
人類皮膚色素沉著不是起因于黑素細(xì)胞中的黑色素生成的局部缺陷，但是對許多這樣的色素沉著不足障礙的病因尚不清楚。
據(jù)估計，世界人口約有1%遭受某種形式的色素沉著不足這種機能障礙的困擾，雖然知道在皮下施用α-MSH及α-MSH的某種類似物時能使兩棲動物變黑，以及在肌肉注射α-MSH時，α-MSH同切除腎上腺的人的皮膚變暗有關(guān)聯(lián)〔Lerner，A.B.，andJ.S.McGuire，N.E.J.Med.270539-546(1964)〕，但是這些用藥途徑并不適合于為達(dá)到并維持這種期望達(dá)到的效果所必須的反復(fù)使用。在本發(fā)明前尚沒有治療這些色素沉著不足病癥的足夠好的措施。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)能夠經(jīng)過皮下注射方式有效地施用α-MSH和α-MSH的某種類似物，這些化合物能影響處于活性狀態(tài)的黑素細(xì)胞刺激黑色素的形成。因此按照本發(fā)明，現(xiàn)在有可能和方便地使用包含α-MSH類似物的有關(guān)組合物來實現(xiàn)諸如后天性色素著色不足機能障礙的康復(fù)，其中包括糠疹、白糠疹、花斑癬、白斑、自發(fā)的滴狀黑色素過少癥，以及脫色痣。再者，現(xiàn)在有可能通過局部使用α-MSH類似物實現(xiàn)使因衰老產(chǎn)生的灰發(fā)變黑。還可以通過局部使用這些類似物產(chǎn)生變黑作用來提高市場上動物毛皮的價值。此外，還有可能在完全沒有太陽或紫外光照射情況下實現(xiàn)使皮膚變黑。
所有以前的對于從垂體分離出來的α-MSH有關(guān)的肽的研究都表明，Met4-Glu5-His6-Phe7-Arg8-Try9-Gly10序列作為共同的有效核心的不變關(guān)系。(上述序列為蛋氨酸-谷氨酸-組氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-色氨酸-甘氨酸)。已經(jīng)提出建議，這種七肽序列是Proopiomelanocortin引起的激素的活性部位。
根據(jù)α-MSH(以及它的類似物和片段)與其生物效能在結(jié)構(gòu)上的關(guān)系，通過使用離體青蛙皮膚生物測定系統(tǒng)可知，α-MSH的活性部位似乎是Met-Glu-His-Phe-Arg-Tsp-Gly的共同的有效核心序列。已經(jīng)合成了這種片段(α-MSH4-10)并且在青蛙皮膚中對它的黑素細(xì)胞刺激活性進行了檢驗，結(jié)果表明，這種片段與天然激素相比是一種弱促效藥。在作出本發(fā)明之前，尚未研究過在位置5(Glu)和10(Gly)上的氨基酸的交換。由以前的構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的研究工作可知，(見美國專利No4，457，864和4，485，039以及美國專利申請No.825，262)。在活性線狀核心七肽中，用正亮氨酸置換蛋氨酸能得到一種有效的α-MSH類似物。此外，在位置7用它的對映體d-苯丙氨酸置換苯丙氨酸產(chǎn)生了具有更大生物效應(yīng)的類似物，該類似物在兩個公認(rèn)的生物測定中(青蛙和蜥蜴的皮膚)具有持久的活性。下面的表總結(jié)了這樣的一些研究結(jié)果。
α-MSH的選擇性片段以它們對青蛙(RanaPipiens)皮膚和蜥蜴(AnolisCarolinensis)的生物活性肽相對效力青蛙蜥蜴alpha-MSH1.01.0Ac-[Nle4，D-Phe7]-alpha-MSH1-13NH260.0 5.0Ac-alpha-MSH4-10NH20.0003 0.004Ac-[Nle4]-alpha-MSH4-10NH20.002 0.06Ac-[Nle4]-alpha-MSH4-11NH20.002 1.0Ac-[Nle4，D-Phe7]-alpha-MSH4-10NH20.02 10.0Ac-[Nle4，D-Phe7]-alpha-MSH4-11NH20.16 8.0對這些結(jié)構(gòu)活性關(guān)系進行的研究揭示出兩個重要因素(1)用氧化穩(wěn)定的氨基酸Nle置換具有可氧化的側(cè)鏈的Met氨基酸使該肽片段的生物活性提高了大約10倍，以及(2)用D-Phe置換在位置7的L-Phe，并將Lys保持在位置11進一步提高了這種α-MSH的生物活性。
除了對線性α-MSH類似物進行的研究之外，還合成了一些結(jié)構(gòu)形態(tài)上被限定的α-MSH化合物，并對它們的生物效力進行了測試。其中一個類似物研究是
-α-MSH1-13NH2，在青蛙皮膚生物測定中它的活性大約是天然α-MSH激素的活性的10倍。在蜥蜴皮膚生物測定中，它的效能大約是α-MSH效能的兩倍。設(shè)計和合成這些以前的環(huán)狀α-MSH類似物是基于對在α-MSH的活性核心(His6-Phe7-Arg8-Trp9)的中心處β回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)(β-Turn Structure)的考慮，以及基于這種結(jié)構(gòu)型式對生物活性的重要性。
根據(jù)這種環(huán)狀α-MSH類似物經(jīng)典的結(jié)構(gòu)活性的研究可得到如下幾點結(jié)論1)在位置4(Met)和位置10(Gly)之間通過用半胱氨酸的等配物置換進行環(huán)合在青蛙皮膚生物測定中使黑素細(xì)胞的分散活性提高了不少于30倍，并且在蜥蜴皮膚中活性提高了不少于2倍。2)在這些環(huán)狀類似物中用D-Phe7代替Phe7使青蛙皮膚中的活性加強，并且使蜥蜴皮膚生物測定的活性為4倍。3)在13位上存在Lys得到比沒有Lys的類似物具有更大活性的類似物。4)從23節(jié)的環(huán)開始，減少或增大二硫化物橋的環(huán)的大小使得到的類似物的生物活性嚴(yán)重的下降。
下表中給出了對環(huán)狀α-MSH類似物的研究結(jié)果
在青蛙和蜥蜴皮膚生物鑒定中環(huán)狀α-MSH類似物體外相對效能效能＊肽類似物青蛙蜥蜴氨基酸置換的影響alpha-MSH1.01.0
-alpha-MSH1-13NH210.0 2.0
-alpha-MSH4-13NH230.0 0.6
-alpha-MSH4-13NH26.0 6.0
-alpha-MSH4-12NH210.0 1.5
-alpha-MSH4-12NH220.0 6.0
-alpha-MSH4-11NH20.16 0.07
-alpha-MSH4-11NH22.5 3.0
-alpha-MSH4-10NH20.06 0.003
-alpha-MSH4-10NH20.75 0.5
環(huán)的大小的影響＊＊
-alpha-MSH4-13NH230.0 0.60
-alpha MSH4-13NH230.0 1.0
-alpha-MSH4-13NH20.06 0.06
-alpha-MSH4-13NH20.06 0.70＊生物效能是相對于α-MSH在劑量應(yīng)答曲線的直線部分測得的＊＊環(huán)的大?。叫纬稍撾牡沫h(huán)的鍵的數(shù)目Maa＝2-巰基乙酸Mpa＝3-β巰基乙酸Hcy＝高半胱氨酸為了進一步研究α-MSH4-10片段的結(jié)構(gòu)與效能的關(guān)系，我們系統(tǒng)地研究了一系列以前未報導(dǎo)過的線狀α-MSH4-10類似物的向黑素活性的結(jié)構(gòu)要求，重點放在5位和10位上置換的影響。
根據(jù)對線狀α-MSH類似物研究所獲得的結(jié)果，我們接著研究了不同種類的結(jié)構(gòu)上限定的α-MSH。簡而言之，我們制作了4-10個具有如下一般結(jié)構(gòu)式的α-MSH片段Ac-〔Nle4-Xxx5，D-Phe7，Yyy10〕-α-MSH4-10NH2，其中Xxx氨基酸是谷氨酸(Glu)或者是天門冬氨酸(Asp)(即為單氨基二羧酸的一種);
Yyy氨基酸是一種堿性氨基酸，賴氨酸，
氨酸，2，4-二氨基丁酸(Dab)或2，3二氨基丙酸(Dap)。在下面表格中列出的Ac-α-MSH4-10線性類似物是利用P-甲基二苯甲基胺樹脂作為載體，用固相肽合成法合成的。并且用以前對于α-向黑素及其類似物所采用的相關(guān)方法進行純化。
α向黑素類似物的結(jié)構(gòu)編號主要序列123456789101112131 Ac-Ser-Try-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH22 Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH23 Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH24 Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH25 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH26 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-NH27 Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH28 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH29 Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH210 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH211 Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH212 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH213 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dap-NH214 Ac-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Lys-NH215 Ac-Nle-Asp-His-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2
類似物1.alpha-MSH2.Ac-[Nle4，D-Phe7，Lys10，Gly11]-alpha-MSH1-13NH23.Ac-[Nle4，Asp5，D-Phe7，Lys10，Gly11]-alpha-MSH1-13NH24.Ac-[Nle4，D-Phe7，Lys10，Gly11]-alpha-MSH4-13NH25.Ac-[Nle4，Asp5，D-Phe7，Lys10，Gly11]-alpha-MSH4-13NH26.Ac-[Nle4，Asp5，D-Phe7]-alpha-MSH4-10NH27.Ac-[Nle4，D-Phe7，Lys10，]-alpha-MSH4-10NH28.Ac-[Nle4，Asp5，D-Phe7，Lys10]-alpha-MSH4-10NH29.Ac-[Nle4，D-Phe7，Orn10]-alpha-MSH4-10NH210.Ac-[Nle4，Asp5，D-Phe7，Orn10]-alpha-MSH4-10NH211.Ac-[Nle4，D-Phe7，Dab10]-alpha-MSH4-10NH212.Ac-[Nle4，Asp5，D-Phe7，Dab10]-alpha-MSH4-10NH213.Ac-[Nle4，Asp5，D-Phe7，Dap10]-alpha-MSH4-10NH214.Ac-[Nle4，Lys10，]-alpha-MSH4-10NH215.Ac-[Nle4，Asp5，Lys10]-alpha-MSH4-10NH2按照下述實例來生產(chǎn)α-MSH片段的線狀類似物例1Ac-〔Nle4，D-Phe7，Lys10，Gly11〕-α-MSH1-13NH2該化合物的制備是通過肽合成的固相方法，使用過量三倍的氨基酸，將N-Boc-Val(術(shù)語“Boc”指叔丁基氧羰基)偶聯(lián)到P-甲基二苯甲基胺樹脂(2.0克PMBHA樹脂，0.7毫摩爾NH2/克樹脂)上。90分鐘后，用二氯甲烷洗滌該樹脂、中和，并用醋酸酐-吡啶混合物使其氨基乙?；?。30分鐘后用水合茚三酮試驗檢測不到樹脂上有可起反應(yīng)的氨基。將每一個氨基酸殘基偶聯(lián)到正在生長的肽鏈上的一套方法包括如下步驟1)用4份30毫升CH2Cl2洗滌，每次洗滌2分鐘;2)用30毫升48%的三氟醋酸(在含2%苯甲醚的二氯甲烷中)裂解Boc基團，一次處理5分鐘，第二次20分鐘;3)用4份30毫升二氯甲烷洗滌，每次2分鐘;4)加兩份30毫升在二氯甲烷中的10%的二異丙乙胺進行中和，并且每次搖動2分鐘;5)用4份30毫升二氯甲烷洗滌，每次2分鐘;6)加入在5毫升二氯甲烷中的3倍的Boc氨基衍生物(在該情況下是2.1毫摩爾)、在DMF(除了N-Boc-NimTosHis情況外)中的每毫升含1摩爾N-羥基苯并三唑的HOBt溶液2.4毫升，(“NimTos”指n-咪唑甲苯磺?；?，再加入2.4毫升的(在DMF中含1mmol/ml Dcc)DDc，然后將該混合物搖晃2-3小時(在Trp，Arg和His的情況下，用DMF作偶聯(lián)溶劑);7)在完成偶聯(lián)后(水合茚三酮陰性)用3份30毫升二氯甲烷洗滌，每次2分鐘;8)用3毫升100%乙醇洗滌，每次2分鐘;9)用4份30毫升二氯甲烷洗滌，每次1分鐘。在進行了下述的Nα-Boc氨基酸(或衍生物)的分段偶聯(lián)后(按加入次序)，即獲得與其標(biāo)題化合物相對應(yīng)的被保護的肽樹脂Nα-Boc-Prog;Nα-Boc-Gly;Nα-Boc-Lys-(Nε-Zclz);
Nα-Boc-Ni-For-Trp;Nα-Boc-Ng-Tos-Arg;Nα-Boc-D-Phe;
Nα-Boc-Nim-Tos-His(項Ng意指N-胍基;Ni意指N-吲哚基;2-Clz指2-氯代苯甲酸基甲醇)。將得到的Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(Nε-2Clz)-Gly-Pro-Val-P-MBHA樹脂分成四份。把該被保護的肽樹脂的四分之一(1.0克-0.5毫摩爾)與Nα-Boc;r-Bzl-Glu;Nα-Boc-Nle;Nα-Boc-Ser(O-Bzl);Nα-Boc-Tyr(0-2BrZ);Nα-Boc-Ser(O-Bzl)(項“2BrZ”意指2溴代芐基氧代甲醇)偶聯(lián)之后轉(zhuǎn)化為被保護的標(biāo)題肽樹脂。在偶聯(lián)了最后的氨基酸后，除去Nα-Boc保護基團，中和氨基、在20毫升二氯甲烷中用過量10倍的N-乙酰-咪唑使被保護的肽Nα-乙酰化，得到的被保護的肽樹脂，Ac-Ser-(O-Bzl)-Tyr(0-2-Brz)-Ser(O-Bzl)-Nle-Glu(r-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(Nε-2-Clz)-Gly-Pro-Val-p-MBHA樹脂在真空中干燥。用液態(tài)HF將被保護的肽樹脂(1.0克)從上述樹脂中裂解出來。在真空中0℃下將易揮發(fā)的物質(zhì)蒸發(fā)后，該干燥的產(chǎn)品用乙醚(3×30毫升)洗滌，并用30%的HoAc水溶液(3×30毫升)進行提取，并凍干。將該肽粉(530毫克)分成兩份(每份260毫克)，一份溶解在1.5毫升的醋酸銨緩沖劑(pH4.5)中，通過一個柱體過濾器過濾到一個CMC柱(2.0×30.0厘米)的頂部，并用250毫升的各為0.01(pH4.5);0.1(pH6.8)和0.2(pH6.8)M的NH4OAc洗提。在280nm處檢出的主峰是在0.1M的末端和0.2M NH4OAc的前一半之間被提洗出來的，將其凍干，得到142.3毫克的白色粉末。在制備HPLC上純化80毫克這種肽粉末，收集和凍干該主峰部份，得到63毫克的該標(biāo)題肽。
例2Ac-〔Nle4，Asp5，D-Phe7，Lys10，Gly11〕-α-MSH1-13NH2該化合物是從1.0克(～0.5mmol)的Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg-(Ng-Tos)-Trp-Ni-For)-Lys-(Nε-2-ClZ)-Gly-Pro-Val-P-MBHA樹脂，通過分段偶聯(lián)Nα-Boc-Asp(β-Bzl);Nα-Boc-Nle，Nα-Boc-Ser(0-Bzl);Nα-Boc-Tyr(0-2-Brz);Nα-Boc-Ser(0-Bzl)而制備得來的。每一次偶聯(lián)的處理方法都與前所述相同。在N末端Boc基團去保護和中和后，通過在二氯甲烷中過量10倍的N-乙酰咪唑來實現(xiàn)被保護的十三肽樹脂的乙?；饔?5小時)。在真空中干燥Ac-Ser(0-Bzl)-Tyr(0-2-Brz)-Ser(0-Bzl)-Nle-Asp(β-Bzl)-His(Ni-Tos)-D-Phe-Arg-(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(Nε-2-Clz)-Gly-Pro-Val-P-MBHA樹脂，得到1.8克被保護的肽樹脂。用液態(tài)HF裂解1.0克被保護的肽樹脂，并在蒸發(fā)易揮發(fā)性物質(zhì)后用乙醚(3×30毫升)洗滌，用30%HOAc水溶液(3×30毫升)提取此肽，將其凍干。把一份十三肽粗制品(200毫克)溶解在1.5毫升的NH4OAc緩沖劑(pH4-5)中，使其通過一個柱體過濾器過濾到CMC柱(2.0×30.0厘米)的頂部，使用與實例1所提及的相同的NH4OAc不連續(xù)梯度的順序來進行洗脫。在凍干處理后被分離出來的肽是152毫克。用HPLC進一步純化100毫克的這種肽粗制品得到67毫克本標(biāo)題肽。
例3Ac-〔Nle4，D-Phe7，Lys10，Gly11〕-α-MSH4-13NH2本標(biāo)題肽是從1.0克(0.5mmol)的Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)Lys(Nε-2-Clz)-Gly-Pro-Val-P-MBHA樹脂，通過固相技術(shù)在分段偶聯(lián)了Nα-Boc-Glu(r-Bzl)和Nα-Boc-Nle之后合成得來的。每一個偶聯(lián)反應(yīng)的實現(xiàn)方式都與上述各實例相同，不同在于N末端的乙酰化過程是通過在二氯甲烷中過量2倍的1∶1的乙酸酐-吡啶進行1個小時實現(xiàn)的。按實例2中所說的純化方法獲得肽4，得到一種白色粉末，產(chǎn)率為22%。
例4Ac-〔Nle4，Asp5，D-Phe7，Lys10，Gly11〕-α-MSH4-13NH2從如實例1那樣制備的1.0克(～0.5毫摩爾)的Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(Nε-2-ClZ)-Gly-Pro-Val-P-MBHA樹脂通過分段偶聯(lián)Nα-Boc-Asp(β-Bzl)和Nα-Boc-Nle制備出標(biāo)題肽。在處理所得到的保護的肽樹脂時使用的技術(shù)與實例1描述的相同。按照實例1所描述的CMC色譜法從130毫克粗制肽得到53毫克所需要的HPLC純肽。
例5Ac-〔Nle4，D-Phe7，Lys10〕-α-MSH4-10NH2將2.7克P-甲郊諄肥髦 .7毫摩爾NH2/克樹脂)懸浮在二氯甲烷中，并且用30毫升二份的二氯甲烷洗滌3次，然后把被洗滌的樹脂在二氯甲烷中搖動2小時，濾出溶劑，將膨脹了的MBHA樹脂中和并按實例1所述把它與氨基酸偶聯(lián)起來。下述這些氨基酸衍生物被偶聯(lián)到該樹脂上(按偶聯(lián)的次序)Nα-Boc-D-Lys(Nε-2-Clz)，Nα-Boc-Trp-(Ni-For)，Nα-Boc-Arg(Ng-Tos)，Nα-Boc-D-Phe，Nα-Boc-His-(Nim-Tos)。將所得到的Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(Nα-2-Clz)-P-MBHA樹脂分成兩份。其中的一份進行分段偶聯(lián)Nα-Boc-Glu(r-Bzl)和Nα-Boc-Nle。把得到的肽樹脂debokylated并用在二氯甲烷中的過量2倍的1∶1乙酸酐-吡啶混合物將N末端乙?；?小時。用二氯甲烷洗滌并將其在真空中干燥，得到被保護的肽樹脂2.1克。用無水液態(tài)HF-苯甲酰-二硫化乙烷(17毫升HF，2毫升苯甲醚，1毫升二硫化乙烷)來裂解1.7克這種被保護的肽樹脂，在蒸發(fā)出易揮發(fā)物質(zhì)后，將該已干燥并裂解的肽用3×30毫升無水乙醚洗滌，并用3×30毫升的30%HOAC水溶液提取，將這種肽的含水提取物凍干，得到700毫克肽粗制品。將300毫克肽粗制品溶解在2毫升NH4OAc緩沖劑(PH4.5)內(nèi)，使其通過一個柱體過濾器被過濾到CMC柱的頂部。收集其主峰并凍干，得到172毫克白色粉末狀肽。用HPLC提純110毫克粗制肽，得到50毫克純凈的本標(biāo)題肽。
例6Ac-〔Nle4Asp5，D-Phe，Lys10〕-α-MSH4-10NH2本標(biāo)題化合物的被保護的肽樹脂是從1.8克Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg-(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(Nε-2-Clz)-P-MBHA通過分段偶聯(lián)Nα-Boc-Asp(β-Bzl)和Nα-Boe-Nle制得的，每一個偶聯(lián)反應(yīng)都是用過量3倍N-Boc氨基酸(或衍生物)、過量2.4倍的DCC和過量2.4倍的HOBt按照與前面所述相同的措施完成的。在偶聯(lián)了最后的氨基酸后，除去Nα-Boc保護基團，中和氨基，并用過量2倍的1∶1乙酸酐吡啶混合物在二氯甲烷中乙?；?小時。用二氯甲烷洗滌該Ac-Nle-Asp(β-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp-(Ni-For)-Lys(Nε-2-ClZ)-P-MBHA樹脂，在真空中干燥得到2.1克。1.5克被保護的肽樹脂樣品通過液態(tài)HF裂解并按實例5所述方法處理，在HPLC純化112毫克的CMC色譜純的肽以后得到64毫克標(biāo)題肽。
例7Ac-〔Nle4，Asp5，D-Phe7，Dab10〕-α-MSH4-10NH2如實例5那樣合成標(biāo)題化合物的被保護的肽樹脂，其差別在于在偶聯(lián)方案中分別用Nα-Boc-Dab(Nr-Z)和N-Boc-Asp(-Bzl)來分別代替Nα-Boc-Lys(Nε-2Clz)和Nα-Boc-Glu(r-Bzl)，從而得到Ac-Nle-Asp(β-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Dab(Nr-z)-P-MBHA樹脂。如實例5所述進行裂解和處理該肽樹脂后得到一種白色粉末的肽12，產(chǎn)率為36%。
例8Ac-〔Nle4，Asp5，D-Phe7，Dap10〕-α-MSH4-10NH2如實例5相同的方法合成本標(biāo)題化合物的被保護肽樹脂。區(qū)別在于在偶聯(lián)方案中，用Nα-Boc-Dap(Nβ-z)代替Nα-Boc-Lys(Nε-2-clz)，以及用Nα-Boc-Asp(β-Bzl)代替Nα-Boc-Glu(r-Bzl)，得到Ac-Nle-Asp(β-Bzl)-His-(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Dap(Nβ-Z)-P-MBHA樹脂。從該樹脂裂解出肽，按實例5所述方法處理，得到呈白色粉末的所需肽，產(chǎn)率36%。
例9Ac-〔Nle4，Lys10〕-α-MSH4-10NH2按例5所述的方法合成標(biāo)題化合物的被保護的肽樹脂，區(qū)別在于在偶聯(lián)方案中，用Nα-Boc-Phe代替Nα-Boc-D-Phe，得到Ac-Nle-Glu(r-Bzl)-His(Nim-Tos)-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Sys-(Nε-2-Clz)-P-MBHA樹脂。裂解出和處理肽，得到標(biāo)題化合物，產(chǎn)率為40%。
例10Ac-〔Nle4，Asp5，Lys10〕-α-MSH4-10NH2按實例5所述的方法合成本標(biāo)題化合物的被保護的肽樹脂，差別在于在偶聯(lián)方案中用Nα-Boc-Phe代替Nα-Boc-D-Phe，以及用Nα-Boc-Asp(β-Bzl)代替Nα-Boc-Glu(-r-Bzl)，得到Ac-Nle-Asp(β-Bzl)-Phe-Arg(Ng-Tos)Trp(Ni-For)-Lys(Nε-2-Clz)-P-MBHA樹脂。從該樹脂中裂解出肽，除去保護基團，并如前所述之方法純化該標(biāo)題化合物，得到一種呈白色粉末狀的產(chǎn)品，產(chǎn)率37%。
在下面的表格中給出了前面所述各個實例的線狀類似物的生物效能，其中“P”表示長期活性(“+”＝有，“-”＝無)“ND”表示該樣品末進行該特定的試驗。
生物效能剩余活性類似物青蛙蜥蜴青蛙蜥蜴11.01.0P(-)P(-)26.08.0P(+)P(-)39.08.0P(+)P(-)40.88.0P(+)P(+)51.010.0P(+)P(+)60.18.0P(-)P(-)70.28.0P(-)P(-)80.78.0P(-)P(-)90.68.0P(-)P(-)100.910.0NDP(-)110.910.0P(±)P(±)120.950.0P(-)P(-)130.28.0P(-)P(-)140.0010.08P(+)P(-)150.0040.08P(+)P(-)對線性的結(jié)構(gòu)上受約束的α-MSH類似物所獲得的這些結(jié)果導(dǎo)致了對一種不同種類的受約束的類似物，即結(jié)構(gòu)上被約束為環(huán)狀α-MSH類似物的研究。
用普通的固相合成技術(shù)來進行環(huán)狀向黑素肽類似物的固相肽合成。概括地說，用過量3倍的Boc保護的氨基酸衍生物、過量2.4倍的1毫摩爾/毫升的N-羥基苯丙三唑(HOBt)的DMF溶液(除His情況以外)以及過量2.4倍的1毫摩爾/毫升的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的DMF溶液將N叔丁基氧羰基(Boc)保護的氨基酸和它們的衍生物偶聯(lián)到P-甲基二苯甲胺樹脂上。該偶聯(lián)反應(yīng)在二氯甲烷中進行1-3小時，用水合茚三酮和/或氯醌試驗來監(jiān)測上述反應(yīng)，需要時上述反應(yīng)可重復(fù)進行。氨基酸反應(yīng)的側(cè)鏈被保護如下Lys，2，4-二氯芐氧羥基;Orn、Dab和Dap芐氧羥基;Trp，甲酰;Arg，甲苯磺酰基;His，甲苯磺?；?Glu和Asp，苯甲基酯。在二氯代甲烷中含2%苯甲醚的48%的三氟乙酸每次處理5和20分鐘來進行N-Boc保護基團的裂解。
將每一個氨基酸殘端結(jié)合到正在增長的肽鏈中的一套操作由以下步驟組成1)用CH2Cl2(4×30毫升，1分鐘/洗滌)洗滌;2)在每一步中通過二次用在含有2%苯甲醚的CH2Cl2中48%的TFA溶液處理(時間為5分鐘和20分鐘)以除去Boc保護;3)用CH2Cl2洗滌(2×30毫升);4)用在CH2Cl2中的10%的二異丙基乙胺中和(2×30毫升)每次3分鐘;5)用CH2Cl2洗滌(3×30毫升，每次洗滌2分鐘)，6)加入在20毫升CH2Cl2中的Boc保護的氨基酸衍生物(除了在Trp、Arg、和His的情況下，由于溶解度的問題而用DMF代替了CH2Cl2外)，然后加HOBt，再是DCC，接著搖晃1-3小時;7)用CH2Cl2洗滌(3×30毫升，每次洗滌2分鐘);8)用100%乙醇洗滌(3×30毫升，每次洗滌2分鐘)，監(jiān)測偶聯(lián)的完成情況，在偶聯(lián)了最后的氨基酸后，除去N-Boc保護基團，中和氨基，并用在CH2Cl2中的過量10倍的N-乙酰咪唑或用在CH2Cl2中乙酸酐∶吡啶為1∶1的混合物(過量2倍，1小時)使該氨基乙?；?br> 用含10%苯甲醚和8%1，2-二硫化乙烷的無水液態(tài)HF(1克樹脂用10毫升)將肽從該樹脂中去保護和分離出來，在0℃下進行45分鐘。在真空中蒸發(fā)了易揮發(fā)物質(zhì)后，用乙醚或乙酸乙酯(3×30毫升)洗滌這些游離肽，用30%的乙酸水溶液(3×30毫升)和蒸餾水(3×30毫升)提取，將該合并了的含水提取物凍干，從而得到呈白色粉末的肽粗制品。在陽離子交換羧甲基纖維素(CMC)樹脂上通過柱色譜方法，使用如下的不連續(xù)梯度的銨乙酸酯緩沖劑來純化每一種肽250毫升0.01M NH4OAc(pH4.5);250毫升的0.01M NH4OAc(PH6.8);250毫升的0.01M NH4OAc(PH6.8)和250毫升的0.2M NH4OAc(PH6.8)。在0.01M NH4OAc(PH6.8)的最后部份到0.1M NH4OAc(PH6.8)緩沖劑的前一半期間提洗出來的主峰(280nm檢測)經(jīng)凍干得到一種呈白色粉末的精制肽。
構(gòu)成本發(fā)明的一部份的環(huán)狀α-向黑素類似物的結(jié)構(gòu)被列出在下表中
按照下述各實例制備本發(fā)明的肽類似物。
例11Ac-
-α-MSH4-13NH2從1.0克Nα-Boc-Val-P-MBHA樹脂(0.7毫摩爾的Nα-Boc-Val)起始在分段偶聯(lián)了下述的Nα-Boc-保護的氨基酸(按加入順序)后制備出標(biāo)題化合物的被保護的肽樹脂Nα-Boc-Pro;Nα-Boc-Gly;Nα-Boc-Lys(Nε-2，4-Clz);Nα-Boc-Trp(Ni-For);Nα-Boc-Arg-(Ng-Tos);Nα-Boc-D-Phe;Nα-Boc-His(Nim-Tos);Nα-Boc-Glu(r-Bzl);Nα-Boc-Nle。在偶聯(lián)了最后的氨基酸后，除去Nα-Boc保護基團，中和氨基，并用在二氯甲烷中過量10倍的N-乙酰咪唑?qū)ζ湟阴；?6-8小時)，或者用在二氯甲烷中2倍過量的乙酸酐∶吡啶(1∶1)的混合物乙?；?-2小時。得到被保護的肽樹脂Ac-Nle-Glu(r-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp-(Ni-For)Lys(Nε-2，4-Clz)-Gly-Pro-Val-P-MBHA。將1.0克(0.6毫摩爾)的被保護的這種肽樹脂(在有1毫升苯甲醚和0.8毫升1，2-二硫代乙烷存在的情況下用10毫升無水HF在0℃處理45分鐘。在真空中蒸發(fā)HF、苯甲醚和1，2-二硫代乙烷后，用3份30毫升乙醚洗滌該干燥的產(chǎn)品混合物，并且用3份30毫升30%乙酸來提取這種肽。凍干該肽的含水提取物，獲得325毫克呈白色粉末的Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2肽粗制品。將150毫克的Ac-〔Nle4，D-Phe7，Lys10，Gly11〕-α-MSH4-13NH2粗品進行純化處理。這種純化方法包括將這種肽粗品溶解在2-4毫升0.01M的NH4OAc(PH4.5)中，在羧甲基纖維素柱(2.0×25.0厘米)上用0.01M(PH4.5)，0.1和0.2M NH4OAc(pH6.8)(每種250毫升)的不連續(xù)梯度進行色譜分離。在280mn處檢測到的主峰是在0.1M NH4OAc(pH6.8)緩沖劑的前一半被提洗出來的，凍干，得到104毫克的白色粉末。把CMC純的Ac〔Nle4，D-Phe7，Lys10，Gly11〕-α-MSH4-13NH2用0.1%三氟乙酸緩沖劑和乙腈作為有機改性劑，在Vydac218TP15-16C18RP(25厘米×25厘米)半制備柱上進行HPLC進一步純化。100毫克該肽經(jīng)HPLC純化后得到74毫克純的Ac-〔Nle4，D-Phe7，Lys10，Gly11〕-α-MSH4-13NH2肽。40毫克純Ac-〔Nle4，D-Phe7，Lys10m-Gly11〕-α-MSH4-13樣品溶解在1毫升5%的Hcl水溶液中，在二乙胺乙基纖維素(鹽酸形式)柱(1.0×15.0厘米)上用100毫升5%的Hcl水溶液進行色譜分離，在280nm處監(jiān)測被洗提的峰。凍干收集到的肽峰，獲得35毫克的Ac-〔Nle4，D-Phe7，Lys10，Gly11〕-α-MSH4-13NH2×Hcl鹽。將該肽鹽溶解在3毫升的無水DMF中并且沒有仲胺(在減壓下從水合茚三酮中蒸餾出來的)。將脫水的K2HPO4加到這種在DMF中的肽溶液中，在一個冰鹽浴中將這種反應(yīng)混合物冷卻到0℃，并且加進17毫升二苯磷?；B氮化物，在0℃時攪拌該反應(yīng)混合物，然后將整個反應(yīng)燒瓶送到12℃的冷藏室內(nèi)。在12℃溫度下攪拌反應(yīng)混合物過夜。用HPLC(用0.1%的三氟乙酸/CH3CN的Vydac柱，25.0厘米×4.6厘米)監(jiān)測反應(yīng)的完成情況。而且，用水合茚三酮試驗來檢測成環(huán)的完成情況。在用10%HOAC水溶液驟停該反應(yīng)后，通過使用30%的HOAC在P4聚丙烯酰胺柱(80.0厘米×1.0厘米)上進行脫鹽處理使Ac-〔Nle4，Glu5，D-Phe7，Lys10，Gly11〕-α-MSH4-13NH2純化，并且用半制備HPLC進行純化，得到16毫克環(huán)狀肽Ac-〔Nle4，Glu5，D-Phe7，Lys10，Gly11〕-α-MSH4-13NH2。
例12Ac-
-α-MSH4-10NH2該標(biāo)題化合物是從2.0克的Nα-Boc-Lys(Nε-2，4-Cl2z)-P-MBHA樹脂(1.0毫摩爾的Nα-Boc-Lys(N2-2，4Cl2z)出發(fā)制備出來的，對所說化合物的被保護肽樹脂是在分段偶聯(lián)了下述Nα-Boc-保護的氨基酸(按加入的次序)后被制備的Nα-Boc-Trp(Ni-For);Nα-Boc-Arg(Ng-Tos);Nα-D-Phe;Nα-Boc-His(Nim-Tos)。所得到的被保護的肽樹脂Ac-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(Nε-2，4-Cl2z)-P-MBHA樹脂被分成兩半，一份1.4克(0.5毫摩爾)被保護的五肽樹脂部分在偶聯(lián)了Nα-Boc-Glu(r-Bzl)和Nα-Boc-Nle后就轉(zhuǎn)化成被保護的標(biāo)題肽的樹脂。在偶聯(lián)了最后的氨基酸后除去Nα-Boc保護基團，中和該氨基，并按范例11所述乙?；?，從而得到這種被保護的肽樹脂Ac-Nle-Glu(r-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(Nε-2，4，Cl2z)-P-MBHA樹脂。將1.0克這種被保護的樹脂進行液態(tài)HF的裂解，并按范例11所述處理這種肽，最后得到356毫克呈白色粉末的Ac-〔Nle4，D-Phe7，Lys10〕-α-MSH4-10NH2粗制肽。通過和范例11相同的處理方法使40毫克這種純肽成環(huán)，得到13毫克HPLC純的Ac-
-α-MSH4-10NH2。
例13Ac-
-α-MSH4-10NH2從1.4毫克(0.5毫摩爾)的Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(Nε-2，4-Cl2z)-P-MBHA樹脂，通過分段偶聯(lián)Nα-Boc-Asp(β-Bzl)和Nα-Boc-Nle來制備該標(biāo)題化合物的被保護的肽樹脂。每一個偶聯(lián)反應(yīng)都是通過下述的按通用固相肽工藝所規(guī)定的同樣偶聯(lián)方案進行的。在偶聯(lián)了最后一個氨基酸后，除去Nα-Boc保護基團，中和該氨基，并按范例11所述乙?；?，得到這種被保護的肽樹脂Ac-Nle-Asp(β-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(Nε-2，4-Cl2z)-P-MBHA樹脂。按范例11所述將1.0克真空干燥的肽樹脂樣品裂解和處理，得到370毫克的Ac-〔Nle4，Asp5，D-Phe7，Lys10〕-α-MSH4-10NH2粗品。用與范例11相同的步驟純化一份這種七肽粗品(110毫克)，得到82毫克呈白色粉末狀的線狀標(biāo)題肽。將40.0毫克純的Ac-〔Nle4，Asp5，D-Phe7，Lys10〕-α-MSH4-10NH2進行成環(huán)處理，在進行HPLC純化后，得到12毫克純的Ac-
-α-MSH4-10NH2。
例14Ac-
-α-MSH4-10NH2使用通用固相技術(shù)中所述的偶聯(lián)方案使1.0克P-MBHA樹脂(0.7毫摩爾/克)裝載Nα-Boc-Orn(nr-z)。在經(jīng)1小時偶聯(lián)后，停止該反應(yīng)，樹脂被洗滌、中和，并且樹脂上游離的氨基用在二氯甲烷中2倍過量的乙酸酐∶吡啶為1∶1的混合物乙?；?小時。然后，以下的這些氨基酸分段偶聯(lián)到該樹脂上Nα-Boc-Trp(Ni-For);Nα-Boc-Arg(Ng-Tos);Nα-Boc-D-Phe;Nα-Boc-His(Nim-Tos);Nα-Boc-Asp(β-Bzl);Nα-Boc-Nle。每一個偶聯(lián)反應(yīng)都是遵照按通用固相肽工藝所規(guī)定的同一偶聯(lián)方案實現(xiàn)的。在偶聯(lián)了最后的氨基酸后，除去Nα-Boc保護基團，中和和乙?；揘端氨基酸，從而得到這種被保護的肽樹脂Ac-Nle-Asp(β-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Orn(Nr-z)-P-MBHA樹脂。按例11所述的裂解和處理1.0克真空干燥的肽樹脂，得到332毫克的粗品Ac-〔Nle4，Asp5，D-Phe7，Orn10〕-α-MSH4-10NH2。通過使用例11中的方法純化105毫克這種七肽粗品，得到78毫克呈白色粉末狀的線狀肽。對40.0毫克純的Ac-〔Nle4，Asp5，D-Phe7，Orn10〕-α-MSH4-10NH2樣品進行成環(huán)處理，其步驟與范例11相同，適當(dāng)處理后得到15毫克純的Ac-
-α-MSH4-10NH2。
例15Ac-
-α-MSH4-10NH2使用通用固相技術(shù)中報導(dǎo)的偶聯(lián)方案，將1.0克P-MBHA樹脂(0.7毫摩爾/克)和Nα-Boc-Dab(Nr-z)偶聯(lián)。在一個小時偶聯(lián)后，停止反應(yīng)，洗滌和中和該樹脂，樹脂上未起反應(yīng)的氨基用在二氯甲烷中1倍過量的乙酸酐∶吡啶(1∶1)的混合物乙?；?小時。然后，通過分段偶聯(lián)將下面的這些氨基酸偶聯(lián)到該樹脂上Nα-Boc-Trp ;Nα-Boc-Arg(Ng-Tos);Nα-Boc-D-Phe;Nα-Boc-His(Nim-Tos);Nα-Boc-Asp;和Nα-Boc-Nle。在偶聯(lián)了最后的氨基酸后，除去Nα-Boc保護基團，中和該N端氨基，并按范例11所述乙酰化，從而得到這種被保護的肽樹脂Ac-Nle-Asp(β-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Dab(Nr-z)-P-MBHA樹脂。1.0克真空干燥的這種肽樹脂被裂解和處理，從而得到318.2毫克的Ac-〔Nle4，Asp5，D-Phe7，Dab10〕-α-MSH4-10NH2粗品。將100.0毫克的這種七肽粗品純化，得到78.2毫克呈白色粉末的線狀肽。將45.0毫克的純Ac-〔Nle4，Asp5，D-Phe7，Dab10〕-α-MSH4-10NH2按以前討論的那樣成環(huán)并進行處理，得到13.2毫克純的Ac-
-α-MSH4-10NH2。
例16Ac-
-α-MSH4-10NH2
使用通用固相技術(shù)中報導(dǎo)的偶聯(lián)方案，將1.0克P-MBHA樹脂(0.7毫摩爾/克)與Nα-Boc-Dap(Nβ-Z)偶聯(lián)。在1小時偶聯(lián)后停止反應(yīng)，洗滌并中和該樹脂，在樹脂上未起反應(yīng)的氨基用在二氯甲烷中2倍過量的乙酸酐∶吡啶為1∶1的混合物乙酰化1小時。然后，通過分段偶聯(lián)將下面這些氨基酸偶聯(lián)到該樹脂上Nα-Boc-Trp(Ni-For);Nα-Boc-Trp(Ni-For);Nα-Boc-Arg(Ng-Tos);Nα-Boc-D-Phe;Nα-Boc-His(Nim-Tos);Nα-Boc-Asp(β-Bzl);Nα-Boc-Nle。在偶聯(lián)了最后一個氨基酸后，除去Nα-Boc保護基團，中和該N端氨基，并如范例11所述進行乙?；?，得到被保護的肽樹脂Ac-Nle-Asp(β-zl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Dap(β-z)-P-MBHA樹脂。按范例11所述裂解和處理1.0克真空干燥的這種肽樹脂，得到310.8毫克Ac-〔Nle4，Asp5，D-Phe7，Dap10〕-α-MSH4-10NH2粗品。按范例11所述的方法純化115.0毫克這種七肽粗品，從而得到82.5毫克呈白色粉末狀的線狀肽。如前所述，將38.3毫克純的Ac-〔Nle4，Asp5，D-Phe7，Dap10〕-α-MSH4-10NH2結(jié)成環(huán)狀并如前述的方法進行純化，得到11.3毫克純的Ac-
-α-MSH4-10NH2。
α-MSH，其線狀或環(huán)狀類似物的生物效能是由它們在體外青蛙和蜥蜴生物測定中刺激黑素體彌散的能力確定的。這一體外測定能給出清晰的截止劑量響應(yīng)曲線(在2.5×10-11和4×10-10M之間)，這種測定能檢測出10-11M的最小α-MSH濃度。這種測定是以導(dǎo)致皮膚變黑的外皮皮膚黑素細(xì)胞樹枝狀過程中黑素體(黑色素顆粒)的離心彌散為基礎(chǔ)。所有的原溶液都是從一種儲備溶液(104M)經(jīng)一系列稀釋得到的。在這些測定中所用的青蛙(Rans Pipiens)是從Kons Scientific，Germantown，WI得到的，而使用的蜥蜴(Anolis Carolinensis)是來源于Snake Farm，La Place，LA。下表中報導(dǎo)了環(huán)狀α-向黑素類似物的生物活性生物活性剩余活性類似物青蛙蜥蜴青蛙蜥蜴161.01.0P(-)P(-)171.06.0P(+)P(+)180.59.0P(+)P(+)190.590.0P(+)P(+)201.020.0P(-)P(-)211.05.0P(-)P(-)220.015.0P(-)P(-)我們以前的專利(4，457，864和4，485，039，它們公開的內(nèi)容通過引用被全部結(jié)合進來)表明了α-MSH或ACTH活性部位的結(jié)構(gòu)限制的重要性。通過使用CyS氨基酸對Met-4和Gly-10的假等排代換完成的在位置4和10的α-MSH成環(huán)約束使得合成類似物的黑素細(xì)胞彌散活性增大了許多倍。與它們的線狀祖系體相比，環(huán)狀類似物生物效能的增強明顯依賴于所用的生物測定系統(tǒng)。我們主要的興趣是要得到對蜥蜴皮膚上具有高效能的類似物，這是因為蜥蜴測定的活性和哺乳動物的這種活性是線性相關(guān)的。
-α-MSH環(huán)狀類似物的主要特征是它們在蜥蜴皮膚生物測定中表現(xiàn)出低活性，而在青蛙皮膚中表現(xiàn)出高活性;和最佳的環(huán)的大小〔23節(jié)的環(huán)〕相比，在環(huán)的大小減小(22節(jié)的環(huán))或增加(24節(jié)的環(huán))時其活性都減少500倍。由位置5和位置20的氨基酸之間的酰胺鍵合的α-MSH的結(jié)構(gòu)約束產(chǎn)生一組環(huán)狀化合物，它們構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。環(huán)的大小集中在23節(jié)環(huán)。化合物19在蜥蜴皮膚中給出了最高的生物效能，而在青蛙皮膚生物測定中生物效能的變化不大。環(huán)狀類似物和它的線狀祖系體之間生物效能增加的數(shù)量級是10倍。環(huán)狀類似物18的生物效能和它的線狀類似物相比沒有受到多大的影響，但是該環(huán)狀類似物具有長期活性的現(xiàn)象卻是一個重大的變化。C端三肽，Gly-Pro-Val，如在化合物17中所顯示的那樣，對這些類似物的效能無任何影響。在這些環(huán)狀的酯肽中存在一個重要的因素，即和線狀肽相比，環(huán)狀肽的活性延長。本發(fā)明化合物在下述一個或多個特征上優(yōu)于α-MSH由體內(nèi)或體外青蛙和/或蜥蜴測定測得的生物效能;在這些測定中體內(nèi)效應(yīng)的持久性;和/或抗血漿酶引起的降解作用。
本發(fā)明有用的化合物可以經(jīng)透皮方式給藥，并且可按本專業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法和步驟，按由所希望的給藥方式?jīng)Q定的適當(dāng)組合物進行配制。例如，適于本發(fā)明使用的化合物可與各種常用的基質(zhì)配制或混合成各種制劑，例如膏，油膏，凝膠，洗劑或噴劑，取決于個體皮膚的組成部分所希望的敷用方式。在制造這些制劑的過程中，還可以與常用的增厚劑、潤滑劑、表面活性劑、顏料、香料、防腐劑、填充劑和乳化劑等混合起來，所有這些都是眾所周知的，并在配制皮膚制劑配方中習(xí)慣使用的。典型的情況下，這些非活性組分將會構(gòu)成最終制劑的較大部分。制造這些組合物最好使它們能緩慢釋放或隨時間釋放來傳遞。
本發(fā)明化合物值得注意的性能還使它們可以用作現(xiàn)行診斷、治療和基礎(chǔ)研究方案中α-MSH和〔Nle4〕-α-MSH的替代品。顯然，在診斷領(lǐng)域，本發(fā)明的化合物，尤其是那些已經(jīng)用了放射性碘標(biāo)記的或者已與r輻射發(fā)射體相偶聯(lián)的化合物，特別適用于依據(jù)在黑素瘤細(xì)胞中與向黑素受體的聯(lián)系來定位或分出這種黑素瘤細(xì)胞。本發(fā)明化合物的血漿穩(wěn)定性使這些化合物在提議的靶組織已知有高濃度向黑素受體的選擇性藥物傳輸系統(tǒng)中成為首要的候選藥品。預(yù)期在顏色改變相關(guān)南窒籩校痙⒚韉幕銜鎪瓜值慕細(xì)叩納鐨в統(tǒng)志沒钚栽諳惹岸蘊烊淮嬖詰暮謁叵赴碳ぜに睪退暮銑衫嗨莆鎪岬降鈉淥鐨вΨ矯嬉脖灰謊儐殖隼礎(chǔ)
權(quán)利要求
1.一種線狀的α-向黑素類似物，它是從包含下述類似物的組中被選擇出來的Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-NH2Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH2Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH2Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH2Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH2Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dap-Nh2Ac-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2Ac-Nle-Asp-His-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2。
2.一種環(huán)狀的α-向黑素類似物，它是從包含下述類似物的組中被選擇出來的
3.一種制造從包括下述類似物的組中選擇出來的線狀α-向黑素類似物的方法Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH2Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-NH2Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH2Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH2Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH2Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH2Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dap-NH2Ac-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2Ac-Nle-Asp-His-Phe-Arg-Trp-Lys-NH2該方法包括如下步驟將Nα-叔丁基、氧羰基-Val偶聯(lián)到P-甲基二苯甲基胺樹脂上，乙?；浒被?，分段偶聯(lián)適當(dāng)?shù)挠蒒-叔-丁基氧羰基基團保護的氨基酸，并在完成每一偶聯(lián)步驟后除去這樣的保護基團，中和氨基，乙?；脑摌渲狭呀獬鲎罱K的類似物。
4.一種制造從包括下述類似物的組中選擇出來的環(huán)狀α-向黑素類似物的方法
包括如下步驟將Nα-叔-丁基氧羰基-Val偶聯(lián)到P-甲基二苯甲基胺樹脂上，乙酰化其氨基，分段偶聯(lián)適當(dāng)?shù)挠蒒-叔-丁基氧羰基基團保護的氨基酸，在完成每一偶聯(lián)步驟后，除去該保護基團，中和該氨基，乙?；脑摌渲戏至殉鲎罱K的類似物。
全文摘要
本發(fā)明公開了AC-NLe
文檔編號A61K38/00GK1032795SQ88104090
公開日1989年5月10日 申請日期1988年5月21日 優(yōu)先權(quán)日1987年5月22日
發(fā)明者維克托·J·赫魯比, 費哈德·A·阿奧貝迪, 麥·E·哈德利 申請人:大學(xué)專利有限公司