專利名稱：鉑-(iv)-二胺復(fù)合物、制備該類化合物的方法、至少含有一個(gè)鉑化合物的具有抗腫瘤作用 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于鉑-(Ⅳ)-二胺復(fù)合物、制備該類化合物的方法、含有該類型化合物的具有抗腫瘤作用的制劑，以及具有抗腫瘤作用的成形制劑。
大約20年以前，美國(guó)生物化學(xué)家B。Rosenberg等發(fā)現(xiàn)，順式-二胺-二氯鉑(順式-鉑)具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性(B.Rosenberg，L.VanCamp，J.Trosko和V.H。Mansour，Nature222，1969，385-386頁(yè))。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在腫瘤治療中，尤其在卵巢瘤和睪丸瘤的治療中，該化合物與其他抗腫瘤劑并用具有重要的用途。但是順式-鉑有許多十分不良的付作用。它可引起患者嚴(yán)重的惡心，并伴有嘔吐。此外，它還有腎、骨髓和神經(jīng)毒性，并可損害聽力。將D.Th.Sleijfer，S.Meijer和M.H.Mulder的文章Cis-platinareviewofclinicalapplicationsandrenaltoxicity(Pharm.Weekbl.〔Sci.〕1985，7237～244頁(yè))收編在本申請(qǐng)中作為參考。從1970年以來，對(duì)于順式-鉑作用的機(jī)制，具有較高抗腫瘤活性和/或迄今抗腫瘤活性不敏感的類似物、降低毒付作用的類似物和/或改進(jìn)物理和藥學(xué)性質(zhì)的類似物進(jìn)行了廣泛的研究。
許多鉑-二胺類復(fù)合物可以從文獻(xiàn)中查到。但是仍然十分需要已改進(jìn)其特性的新的抗腫瘤劑，具體來說，十分需要對(duì)于順式-鉑有抗性的或有嚴(yán)重抗性的腫瘤具有活性的化合物。將兩篇近期的綜述、論文收編在本申請(qǐng)中作為參考，例如E.W.SternTheSearchforNewPlatinumAntitumorAgentsProgress，ProblemsandProspects，inPlatinumandotherMetalCoordinationCompoundsinCancerChemotherapy，由MarinoNicolini編輯，由MartinusNijhoff出版，波士頓，Dordrecht，蘭開斯特，ISBN0-89838-358-7，1988，519-526頁(yè);H.A.Meinema，Platinaverbindingenterbestrijdingvanvankankersynthese，eigenschappenenstructuuractiviteitsrelaties(治療癌的鉑類化合物合成、性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系)，Pharm.Weekbl.123(1988)，549～552頁(yè)。
二胺-鉑復(fù)合物在德國(guó)專利申請(qǐng)79.04740中已有敘述，其特征在于，結(jié)構(gòu)式1
中R1和R2相互獨(dú)立地代表氫原子，或者代表取代或未取代的烷基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基，同時(shí)R1和R2與它們所連接的碳原子一起可以是取代或未取代的環(huán)烷基，R3和R4相互獨(dú)立地代表氫原子，或者代表取代或未取代的烷基、芳基或芳烷基，并且X代表陰離子基團(tuán)。
二胺一鉑復(fù)合物在德國(guó)專利申請(qǐng)8204067中已有敘述，其特征在于，結(jié)構(gòu)式圖式1中R1和R2均代表乙基，或者R1和R2與它們所連接的碳原子一起可以是苯基(這里需要指出的是，實(shí)例表明它不是苯基而是環(huán)烷基)，R3和R4均代表氫原子，并且各個(gè)X代表氯代乙酸酯基或硝酸酯基，或者兩個(gè)基團(tuán)X一起代表丙二酸酯基，乙基丙二酸酯基、羥基丙二酸酯基、羧基鄰苯二甲酸酯基、環(huán)丁烷-1，1一二羰酸酯基或草酸酯基，或者上述基團(tuán)的之一為鈉鹽。
國(guó)家癌癥研究所(NationalCancerInstitute，貝塞斯達(dá)，USA)和癌癥治療研究的歐州組織(EuropeanOrganizationforResearchontheTreatmentofCancer，布魯塞爾，比利時(shí)，)進(jìn)行的廣泛研究表明，上述化合物對(duì)癌具有顯著的治療活性。與實(shí)際應(yīng)用的治療癌的其他已知鉑復(fù)合物相比，上述復(fù)合物有較低的腎毒性。
德國(guó)專利申請(qǐng)80，00032(現(xiàn)在專利號(hào)181.434)敘述了具有抗腫瘤作用的鉑復(fù)合物式2，
其中R1和R2相互獨(dú)立地代表氫原子，或者代表取代或未取代的烷基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基，同時(shí)R1和R2與它們所連接的碳原子一起可以是取代或未取代的環(huán)烷基，R3和R4相互獨(dú)立地代表氫原子，或者代表取代或未取代的烷基或芳烷基，并且X和Y代表相同或不同的陰離子基團(tuán)。上述化合物對(duì)許多類型的癌具有作用，并且有減低的腎毒性。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)式圖中式3化合物(TNO-40)對(duì)于順式-二胺-二氯-鉑(順式-鉑)已產(chǎn)生抗性的腫瘤細(xì)胞具有非常好的作用。
式3化合物對(duì)于不同類型的腫瘤具有顯著的作用。從帶有腫瘤的小白鼠的試驗(yàn)結(jié)果表明，與未處理的對(duì)照組(C)相比，處理組(T)的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)。T/C×100%(T/C%)值大于或等于125，表明具有顯著的治療活性。
抗L1210白血病的最大T/C(%)為193(4mg/kg)，而對(duì)照組試驗(yàn)順式-鉑的最大T/C(%)為138(6mg/kg);抗B黑素瘤的最大T/C(%)為163(0.8mg/kg)，而順式-鉑的最大T/C(%)為171(1.6mg/kg)，抗皮下注射移植的M5076肉瘤，靜脈注射治療最大的T/C(%)為126(3mg/kg)，而順式-鉑最大的T/C(%)為135(4mg/kg)。
尤其使人感興趣的是該化合物(TNO-40)對(duì)于順式-鉑已產(chǎn)生抗性的人卵巢癌A2780的細(xì)胞系(A2780/124和2780/DDP)具有抗腫瘤作用。這里判斷標(biāo)準(zhǔn)是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度IC50A2780/124或IC50A2780/DDP與IC50A2780的比值≤4.0。對(duì)于TNO-40，比值分別為3.3和3.6。對(duì)于順式-鉑，相應(yīng)的比值分別為10和12.6。
按照實(shí)質(zhì)上已知的方法，將得到的有效化合物制成藥用制劑。其中可應(yīng)用常用的添加劑。
本發(fā)明的有效化合物可以按照實(shí)質(zhì)上已知的方法制備。以下述實(shí)例詳細(xì)敘述制備方法。
實(shí)例Ⅰa順式-二氯-1，1-雙(氨甲基)環(huán)戊烷-鉑-(Ⅱ)35.5g(0.086mol)氯亞鉑酸鉀(K2PtCl4)和17.2g1，1-雙(氨甲基)-環(huán)戊烷二鹽酸鹽溶于200ml蒸餾水中。
將溶液溫?zé)嶂?0°-95℃。
以一定的速度加入6.9gNaOH在70ml蒸餾水中的溶液，以致于使PH≤7(最終PH＝7.5)。
生成的固體物質(zhì)用抽濾法濾出，并用蒸餾水(50ml)和丙酮(25ml)漂洗。經(jīng)干燥的固體物質(zhì)溶于600～800ml液態(tài)氨中。濾去不溶部分。蒸發(fā)氨以后，產(chǎn)物用2NHCl(50ml)和蒸餾水(100ml)洗滌，并于干燥器中用氫氧化鉀干燥。干重為23g(68%)。
元素分析計(jì)算值(%，按重量計(jì))C21.33H4.09N7.11實(shí)測(cè)值(%，按重量計(jì))C21.25H4.13N7.27′H-NMR譜(溶劑為DMSO-d6，VARIAN T-60)(相對(duì)于TMS的化學(xué)位移，以ppm表示)CH2(環(huán))1.46
CH2(NH2)2.18NH24.90(衛(wèi)星信號(hào)4.30和5.)實(shí)例Ⅰb四氯-1，1-雙(氨甲基)環(huán)戊烷-鉑-(Ⅳ)3g(0.008mol)順式-二氯-1，1-雙(氨甲基)環(huán)戊烷-鉑-(Ⅱ)懸浮于40ml蒸餾水中。
將懸浮液溫?zé)嶂?0℃，隨后邊攪拌邊通入氯氣1小時(shí)。
向反應(yīng)混合物中通入空氣，以除去多余的氯氣(溫度＝70℃)。
使反應(yīng)混合物冷卻，用抽濾法濾出固體物質(zhì)，用蒸餾水洗滌，在減壓下用氫氧化鉀干燥，得到2.6g(73%)黃色固體物質(zhì)。
元素分析計(jì)算值(%，按重量計(jì))C1808H3.47N6.02實(shí)測(cè)值(%，按重量計(jì))C18.06H3.46N6.14′H-NMR譜(溶劑為DMSO-d6，VARIAN T-60)(相對(duì)于TMS的化學(xué)位移，以ppm表示)CH2(環(huán))1.50CH2(NH2)2.23NH26.80(衛(wèi)星信號(hào)6.33和7.20)實(shí)例Ⅰc順式-硫酸根合-反式-二氯-1，1-雙(氨甲基)環(huán)戊烷-鉑-(Ⅳ)將3.5g(0.0075mol)四氯-1，1-雙(氨甲基)-環(huán)戊烷-鉑-(Ⅳ)懸浮于110ml蒸餾水中。向該懸浮液中加入2.21g(0.007mol)硫酸銀，混合物在避光下攪拌24小時(shí)。
濾出生成的氯化銀，用蒸餾水(20ml)漂洗。
清晰的黃色濾液于減壓下蒸發(fā)，得到3.0g(81%)黃色固體物質(zhì)。
元素分析計(jì)算值(%，按重量計(jì))，含二個(gè)結(jié)晶水C5.98H3.83N5.32pt37.07Cl13.47O18.24S6.09實(shí)測(cè)值(%，按重量計(jì))C16.05H3.94N5.35pt36.99Cl13.65O18.08S6.09′H-NMR譜(溶劑為D2O，VARIAN T-60)(相對(duì)于三甲基甲硅烷基丙烷磺酸鈉鹽的化學(xué)位移，以ppm表示)CH2(環(huán))1.63CH2(NH2)2-2.6H2O/D2O4.73測(cè)定以上制備的化合物的生物效果。
體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)鉑復(fù)合物在體外對(duì)下述細(xì)胞系的細(xì)胞毒性作用B16-F10鼠黑素瘤、HCT-116人結(jié)腸癌、A2780人卵巢癌以及對(duì)順式-鉑有抗性的A2780的兩個(gè)亞系。將B16-F10細(xì)胞系保存在由Earle氏鹽(Gibco)、2mmolL-谷氨酰胺、2.06mmol丙酮酸鈉、胰島素(0.26單位/ml)、青霉素/鏈霉素(分別為10單位/ml和10mcg/ml)、MEM非必需氨基酸(0.6%，按重量計(jì)，Gibco)和小牛血清(10%，按重量計(jì)，Hyclone)組成的伊格爾最低必需培養(yǎng)液(MEM)中。將HCT-116細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充有2mmolL-谷氨酰胺、0.12mmolL-絲氨酸、0.17mmol天冬酰胺、1.5mmol丙酮酸鈉、MEM必需氨基酸(0.625%，按重量計(jì)，Gibco)、MEM非必需氨基酸(0.67%，按重量計(jì)，Gibco)、MEM維生素(0.6%，Gibco)、小牛血清(10%，按重量計(jì)，Hyclone)和青霉素/鏈霉素(分別為10單位/ml和10mcg/ml)的McCoy氏5A改良培養(yǎng)液(Gibco)中。將A2780細(xì)胞系培養(yǎng)在補(bǔ)充有小牛血清(10%，按重量計(jì)，Hyclone)、2mmolL-谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素的RPMI培養(yǎng)液1640(Gibco實(shí)驗(yàn)室)中。將所有的細(xì)胞系置于含5%(按體積計(jì))CO2和高大氣濕度的恒溫箱中，于37℃保溫。
呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞通過溫和的胰蛋白酶消化作用收集，并將4000個(gè)細(xì)胞加到96孔微量滴定板(Costar)中。將微量滴定板置于含5%(按體積計(jì))CO2的恒溫箱中，于37℃保溫一夜，使細(xì)胞粘附在微量滴定板上。然后用鉑復(fù)合物或順式-鉑處理細(xì)胞，并保溫72小時(shí)。將微量滴定板翻轉(zhuǎn)過來并搖動(dòng)，以除去培養(yǎng)基、有藥理學(xué)活性的化合物以及與滴定板粘附不牢的細(xì)胞。加入甲醛水溶液(10%)的磷酸鹽緩沖液-生理鹽水溶液，固定細(xì)胞10分鐘。除去固定物，在空氣中干燥微量滴定板，用0.0075%(按重量計(jì))的結(jié)晶紫染色15分鐘，洗滌兩次，在空氣中干燥。色斑用0.2ml0.1M乙酸/乙醇(1∶1)溶解，用Dynatech MR 600型微量滴定板讀數(shù)計(jì)測(cè)定光密度。借助吸光度值的線性回歸分析，計(jì)算半數(shù)抑制濃度，即IC50值(引起50%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的濃度，以mcg/ml表示)。
在體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果列于表A。所研究的化合物對(duì)5種細(xì)胞系均有細(xì)胞毒作用。但是最重要的事實(shí)是對(duì)順式-鉑有抗性的A2780人卵巢癌的二個(gè)亞系細(xì)胞(A2780/124和A2780/DDP)對(duì)本發(fā)明化合物敏感，這可以由IC50比值等于或小于4.0證明。
對(duì)L1210鼠白血病的作用研究鉑復(fù)合物對(duì)L1210鼠白血病的抗腫瘤作用。將L1210白血病的106腹水細(xì)胞通過腹膜內(nèi)注射接種到體重為20g的CDF1小白鼠體內(nèi)。在通過腹膜內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞的當(dāng)天開始給予該活性復(fù)合物。通過腹膜內(nèi)注射給予不同劑量的復(fù)合物。每個(gè)劑量用6只小白鼠為一組，給藥當(dāng)天以單次劑量給予復(fù)合物。試驗(yàn)中10只對(duì)照組小白鼠給予生理鹽水溶液。用順式-二胺-二氯-鉑(順式-鉑)處理的小白鼠作為陽(yáng)性對(duì)照。處理前將小白鼠稱重，處理后第5天或第6天再次稱重，各組動(dòng)物體重的平均變化作為評(píng)價(jià)毒性大小的指標(biāo)。每天檢查動(dòng)物的死亡率，在30天后結(jié)束試驗(yàn)。根據(jù)T/C%確定抗腫瘤的活性，T/C%是用有效復(fù)合物處理組平均存活時(shí)間與用生理鹽水溶液處理的對(duì)照組平均存活時(shí)間的比值再乘以100而得到。用生理鹽水溶液處理的小白鼠平均存活時(shí)間一般為7天。當(dāng)T/C≥125%時(shí)，受試化合物被認(rèn)為是有效的。
表B總結(jié)了該復(fù)合物對(duì)L1210鼠白血病的抗腫瘤效果。表B還列出了各個(gè)試驗(yàn)劑量測(cè)得的T/C%值。在本試驗(yàn)觀察的各個(gè)劑量下，所研究的化合物TNO-40是有效的，在4mg/kg劑量下最大的T/C為193%。
抗B16黑素瘤的作用評(píng)價(jià)有效化合物(TNO-40)對(duì)B16黑素瘤的抗腫瘤作用。每組10只BDF1小白鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射接種0.5ml10%(重量/體積)B16黑素瘤的均勻組織勻漿懸液。在移入腫瘤細(xì)胞后1天開始經(jīng)腹膜內(nèi)注入該有效化合物，每天給藥一次，連續(xù)9天。在每次試驗(yàn)中，對(duì)照組給予生理鹽水溶液，用順式-鉑處理組作為陽(yáng)性對(duì)照。每天統(tǒng)計(jì)存活的小白鼠數(shù)，60天后停止試驗(yàn)。用該有效化合物處理的小白鼠與對(duì)照組小白鼠的平均存活時(shí)間的比值(T/C%)作為抗腫瘤作用的指標(biāo)。當(dāng)T/C(%)為125時(shí)，受試化合物被認(rèn)為是有效的。
表C總結(jié)了這些金屬?gòu)?fù)合物的試驗(yàn)結(jié)果，表中還列出了各個(gè)劑量下測(cè)得的T/C(%)。每次注射量為0.4、0.8和1.6mg/Kg時(shí)，本發(fā)明化合物是有效的，每次注射0.8mg/Kg劑量時(shí)，最大T/C(%)為163。
抗M5076網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤的作用還評(píng)價(jià)了本發(fā)明的復(fù)合物對(duì)經(jīng)皮下注射移植的M5076肉瘤的抗腫瘤作用。每組8只BDF1小白鼠，經(jīng)皮下注射接種M5076腫瘤。在移植腫瘤之后第5天開始經(jīng)靜脈給小白鼠復(fù)合物，并且在第9、13和17天再各給1次。因此總共給予4次復(fù)合物。試驗(yàn)了復(fù)合物的4個(gè)劑量。本試驗(yàn)還包括用生理鹽水溶液處理組和用順式-鉑處理組作為對(duì)照。每天統(tǒng)計(jì)小白鼠存活數(shù)，試驗(yàn)在75～80天之后結(jié)束。根據(jù)a)和b)確定化合物的抗腫瘤作用，a)是用有效化合物處理的小白鼠與對(duì)照組小白鼠平均存活時(shí)間的比值(T/C%)，b)是用有效化合物處理的小白鼠經(jīng)皮下移植的腫瘤長(zhǎng)至重1g所需要的平均時(shí)間與對(duì)照組小白鼠經(jīng)皮下移植的腫瘤達(dá)到重1g所需要的平均時(shí)間的差值(T-C)。如果T/C≥125%，或T-C≥13天，那么該復(fù)合物被認(rèn)為是有效的。
用鉑復(fù)合物試驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)在表D中，表中給出了各個(gè)劑量下的T/C和T-C。每次注射量為3、4mg/Kg時(shí)，研究的化合物是有效的，其T/C%值分別為126%和125%，T-C值分別為16.8天和20.3天。
表B
＊腹膜內(nèi)注射，劑量為mg/kg，1天1次。
表C對(duì)B16黑素瘤的抑制作用
＊腹膜內(nèi)注射，每次注射的劑量為mg/kg，每1-9天給藥。
表D對(duì)M5076肉瘤的抑制作用
＊靜脈注射，劑量為mg/kg，第5、9、13和17天給藥。
說明書所提到的化合物的分子式如下
權(quán)利要求
1.結(jié)構(gòu)式3所示的鉑-(Ⅳ)-二胺復(fù)合物。
2.制備式3化合物的方法，該方法的特征在于，使式4化合物
與氯亞鉑酸鉀(K2ptcl4)反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物氯化，并且與硫酸銀反應(yīng)。
3.具有抗腫瘤作用的制劑，其特征在于其中含有至少一種式3所示化合物作為有效化合物。
4.具有抗腫瘤作用的成形制劑，其特征在于其中含有式3所示化合物
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于鉑-(N)-二胺復(fù)合物(式3)，制備該化合物的方法，以及含有該化合物的具有抗腫瘤作用的制劑。此外，本發(fā)明還包括含有該化合物的具有抗腫瘤作用的制劑。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1040591SQ89106648
公開日1990年3月21日 申請(qǐng)日期1989年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1988年8月31日
發(fā)明者弗朗西斯科·沃比克, 哈門·安尼·梅尼馬 申請(qǐng)人:荷蘭梯恩歐應(yīng)用科學(xué)研究會(huì)