專利名稱：神經(jīng)肽y激動劑和其不完全激動劑的制作方法
本申請是1988，8，26提出的，序列號為237，591申請的繼續(xù)申請。
本發(fā)明涉及新的肽衍生物，它是神經(jīng)肽Y的激動劑。
豬神經(jīng)肽Y(PNPY)是有36個氨基酸的肽，它屬于在整個中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛分布的單一家族肽。在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)已發(fā)現(xiàn)了NPY的受體。在腦中，NPY是飲食的強興奮劑，并可促進促黃體生成激素、生長激素和催乳激素的分泌，產(chǎn)生心血管抑制作用。NPY還具有強的外周血管收縮作用，據(jù)報道它可造成短暫的心肌缺血從而引起心腹痛。作為這些受體激動劑的藥物在治療與生殖系統(tǒng)有關(guān)的疾病(如青春期早熟，子宮內(nèi)膜異位，乳腺癌，前列腺癌)中，可增加食欲，降低性行為，降低促甲狀腺生成激素，催乳激素，促黃體生成激素的分泌，故可用作避孕藥，該藥物可在性犯罪中降低性沖動，還可通過刺激釋放來降低生長激素水平，該類藥物可用作外周血管舒張藥和降壓藥。本發(fā)明化合物可用于治療飲食疾病如神經(jīng)性厭食。
具有下式1-4的新的肽衍生物
其中X1是E或D;
X2是S或A;
X3是S或A;
X4是L、I、M、Nle或V;
X5是L、I、M、Nle或V;
X6是Q、P、H或I;
Tc是OR1或NHR′其中R1是氫或(C1-C4)烷基;
Q是-NH-(CH2)n-CO2-;其中n是1-11的整數(shù)，
和其藥用鹽是神經(jīng)肽Y的激動劑。這些肽衍生物可增加熱血動物的血壓，也可用于治療飲食疾病如神經(jīng)性厭食。
下面是本說明書中使用的氨基酸及氨基和羧基末端基團的常用縮寫Ala(或A)-丙氨酸Val(或V)-纈氨酸Leu(或L)-亮氨酸Ile(或I)-異亮氨酸Pro(或P)-脯氨酸Met(或M)-蛋氨酸Ser(或S)-絲氨酸Thr(或T)-蘇氨酸Cys(或C)-半胱氨酸Cys(或C)-D-半胱氨酸Tyr(或Y)-酪氨酸Asn(或N)-天冬酰胺ASp(或D)-天冬氨酸Lys(或K)-賴氨酸Arg(或R)-精氨酸His(或H)-組氨酸Glu(或E)-各氨酸Nle-正亮氨酸Aoc-8-氨基辛酸＃-NH2
烷基包括直鏈、支鏈和環(huán)烷基，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、仲戊基、環(huán)戊基、己基、異己基、環(huán)己基和環(huán)戊甲基。含2至10個碳原子的酰基是指含1或2個羰基的直鏈、支鏈、環(huán)狀的飽和和未飽的?；?，如乙?；?、苯甲酰基、琥珀酰基、馬來酰基，和戊二酰基，氨基末端氨基酸的氨基被兩個烷基或?；〈哪切╇囊猜湓诒景l(fā)明肽的范圍內(nèi)。
除甘氨酸外，天然氨基酸含于性碳原子。除另有特殊說明，這里指的光學活性氨基酸是L-構(gòu)型的。
式1多肽可與任何無毒有機或無機酸形成藥用鹽。適宜成鹽的無機酸有鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸和酸性金屬鹽如正磷酸一氫鈉和硫酸氫鉀。適宜成鹽的有機酸有單、雙和三羧酸，例如，乙酸、葡糖酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、甲酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來酸、羧基馬來酸、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水楊酸、2-苯氧基苯甲酸和磺酸(如甲磺酸，2-羥基乙磺酸。羧基末端氨基酸的鹽包括無毒羧酸與任何適宜的無機或有機堿形成的鹽。這些鹽包括堿金屬鹽(如鈉和鉀);堿土金屬鹽(如鈣和鎂);包括鋁的ⅢA族輕金屬鹽;有機伯、仲、叔胺鹽。例如，三烷基胺，如三乙基胺，普魯卡因、二芐基胺、乙胺(l-ethenamine)，N，N′-二芐乙二胺，二氫樅胺，N-(低級)烷基哌啶和任何其它適宜的胺。
化合物中的一些基團是優(yōu)選的。申請人認為X1是谷氨酸的式1的肽衍生物較好。申請人還認為X2和X3分別為絲氨酸(S)和丙氨酸(A)，X4和X5分別為亮氨酸(L)和異亮氨酸(I)，Tc為NH2，Q為Aoc的式1的肽衍生物較好。式1-4的最好肽衍生物分別為下面的式5-8肽衍生物。
本發(fā)明蛋白質(zhì)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備。這些方法包括固相序列法，它是采用已建立的自動法，如使用自動肽合成儀。
用于固相制備多肽的樹脂載體可是本領(lǐng)域常用的任何適宜樹脂，優(yōu)選已與0.5至3%二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯，該聚苯乙烯被轉(zhuǎn)變?yōu)閷谆郊谆坊蚨郊谆?用于制備C-末端酰胺)或被氯甲基化或羥甲基化，從而使其能與開始加入的α-氨基保護的氨基酸(用于制備C-末端烷基酰胺和酯)形成酯。
羥甲基化的樹脂實例見Bodanszky，等，Chem.Ind.(London)38，1597-98(1966)。氯甲基化的樹脂可從加利福尼亞，Richmond，BioRad實驗室買到，其制備見Stewart等，“固相肽合成”(Freeman&Co.，舊金山1969)，第1章，1-6頁。保護的氨基可通過Gisin方法，HelvChemActa，56，1476(1973)，結(jié)合到樹脂上，許多結(jié)合有保護的氨基酸的樹脂是可買到的。例如，制備羧基末端是Thr的本發(fā)明多肽，所使用的結(jié)合有叔丁氧羰基(Boe)保護的Thr的芐基化、羥甲基化的苯乙酰胺甲基樹脂(PAM)是可買到的。
下面是α-氨基保護的氨基酸偶聯(lián)到樹脂載體上，保護基用任何適宜的方法脫掉，如用溶于二氯甲烷的三氟乙酸，只使用三氟乙酸或溶在二噁烷中的HCl。脫保護在0℃至室溫進行。對于除去特殊α-氨基保護基可使用其它常規(guī)斷開劑。除去α-氨基保護基后，可將其它氨基保護的氨基酸按所需順序逐步偶聯(lián)。多氨基酸可預(yù)先與樹脂承載的氨基酸序列偶聯(lián)，然后再通過溶液方法偶聯(lián)。
被引入多肽的每個氨基酸的α-氨基保護基可是本領(lǐng)域已知的任何保護基。使用的α-氨基保護基種類有(1)酰類保護基，如甲酰基，三氟乙?；彵蕉柞；妆交酋；?，苯磺?；趸?苯亞磺?；郊讈喕酋；?，鄰硝基苯氧乙酰基和α-氯丁?；?(2)芳香尿烷類保護基，如芐氧羰基和取代的芐氧羰基，如對-氯芐氧羰基，對-硝基芐氧羰基，對-溴芐氧羰基，對-甲氧芐氧羰基，1-(對-二苯基)-1-甲基乙氧羰基，α，α-二甲基-3，5-二甲氧芐氧羰基，二苯甲氧羰基和9-芴基甲氧羰基(Fmoc);(3)脂肪尿烷類保護基，如叔丁氧羰基(Boe)，二異丙基甲氧羰基，異丙氧羰基，乙氧羰基和烯丙氧羰基;(4)環(huán)烷基尿烷類保護基，如環(huán)戊氧羰基，金剛烷氧羰基和環(huán)己氧羰基;(5)硫代尿烷類保護基，如苯硫代羰基;(6)烷基類保護基，如三苯甲基和芐基;和(7)三烷基硅烷基，如三甲基硅烷。優(yōu)選的α-氨基保護基是叔丁氧羰基或Fmoc。
在本技術(shù)領(lǐng)域范圍內(nèi)選擇適宜的偶聯(lián)劑。具體適宜的偶聯(lián)劑(其中所加的氨基酸是Gln，Asn或Arg)是N，N′-二異丙基碳化二亞胺和1-羥基-苯并三唑。用這些偶聯(lián)劑是為了防止形成腈和內(nèi)酰胺。其它偶聯(lián)劑有(1)碳化二亞胺(如N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺和N-乙基-N′-(Y-二甲基氨基丙基碳化二亞胺);(2)氨基氰(如N，N′-二芐基氨基氰);(3)烯酮亞胺;(4)異噁唑鎓鹽(isoxazolim salts)(如N-乙基-5-苯基-異噁唑鎓-3′-磺酸鹽);(5)含芳香雜環(huán)酰胺的單環(huán)氮，其特征為環(huán)上含1至4個氮，如咪唑酰胺，吡唑酰胺和1，2，4-三唑酰胺。使用的特殊雜環(huán)酰胺有N，N′-羰基二咪唑和N，N′-羰基-二-1，2，4-三唑;(6)烷氧化的乙炔(如乙氧乙炔);(7)可與氨基酸的羧基部分形成混合酸酐的試劑(如氯甲酸乙酯和氯甲酸異丁酯)或與被偶聯(lián)的氨基酸形成對稱酸酐(如Boc-Ala)2-O)的試劑;(8)含氮雜環(huán)化合物，其中環(huán)上氮含羥基(如N-羥基苯并三唑，N-羥基琥珀酰胺和1-羥基苯并三唑)。其它用于肽偶聯(lián)的活性劑見Kapoor，J.Pharm.Sci.，59，PP.1-27(1970)。申請人認為對除Arg，Asn和Gln以外的所有氨基酸用對稱酸酐作偶聯(lián)劑較好。
每份保護的氨基酸或氨基酸序列被引入到約超四倍量的固相反應(yīng)物中，偶聯(lián)是在二甲基甲酰胺∶二氯甲烷(1∶1)或僅在二甲基甲酰胺或優(yōu)選僅在二氯甲烷中進行，如果偶聯(lián)進行不完全，應(yīng)在固相反應(yīng)物中進行下一個氨基酸的偶聯(lián)之前，在除去α-氨基保護基前，繼續(xù)進行前一個偶聯(lián)反應(yīng)。在每階段合成中偶聯(lián)反應(yīng)進行的情況可通過水合茚三酮反應(yīng)(見E.Kaise等，Analyt.Biochem.34，595(1970))監(jiān)測。
在得到所需氨基酸序列后，從樹脂中脫去肽。這可通過水解進行，如用甲硫酸，甲苯酚或硫代甲苯酚的氫氟酸溶液處理結(jié)合多肽的樹脂。
在固相肽合成領(lǐng)域中已知許多氨基酸在鏈制備期間需要保護。適宜保護基的使用和選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)并取決于要保護的氨基酸和肽上存在的其它保護的氨基酸。側(cè)鏈保護基的選擇標準在于該保護基必須在斷裂α-氨基的保護基時不脫去。例如，賴氨酸的適宜側(cè)鏈保護基是芐氧羰基和取代的芐氧羰基(如2-氯芐氧羰基，對-硝基芐氧羰基，3，4-二氯芐氧羰基)，取代基選自鹵素(如氯，溴，氟)和硝基;甲苯磺?；?叔戊氧羰基;叔丁氧羰基和二異丙甲氧羰基。蘇氨酸和絲氨酸的醇羥基可由下列基團保護乙?；郊柞；?，叔丁基，三苯甲基，芐基，2，6-二氯芐基和芐氧羰基。天冬氨酸和各氨酸的羧基可用芐基或環(huán)己基保護。優(yōu)選保護基是芐基。
保護基可通過本領(lǐng)域熟知的方法脫去。典型的保護基脫去是在肽鏈合成完成后進行的，但保護基也可在任何其它適宜期間脫去。
式1肽衍生物作為神經(jīng)肽Y激動劑的能力是采用Lunberg等，Eur.J.Pcol.145，21-9(1988)所述方法，通過這些肽與碘化的神經(jīng)肽Y竟爭受體的能力說明的。125I-Bolton-Hunter-神經(jīng)肽Y結(jié)合是在豬脾粗膜中進行的。來自冷凍脾的膜按前述制備并用于速激肽結(jié)合研究(Buck等，1984)。等分的膜(大約15mg組織)于室溫，在含肽類似物，130mM NaCl，2.7mM KCl，2mMMgCl2，1.8mM CaCl2，20mMHEPES，4mg/ml BSA，40μg/ml桿菌肽，4μg/ml亮肽素和4μg/ml抑糜蛋白酶素的緩沖液(7.4)中培養(yǎng)2小時，BHNPY濃度為0.1nM，非專一性結(jié)合由含1μMPNPY得以證明。樣品快速濾過預(yù)先在0.5%組蛋白浸泡過夜的華特曼GF/C濾器(類型Ⅱ-AS;Sigma)，然后用冰冷卻的普通HEPES-鹽緩沖液(PH7.4)洗滌兩次。受試肽的IC50取竟爭曲線的6至10點計算，利用該方法測得實例1和2的肽衍生物IC50＜50nM。
由于本發(fā)明肽衍生物可作為神經(jīng)肽Y的激動劑，則這些化合物具有價值的藥理活性，如升壓、血管收縮，動脈收縮，結(jié)腸松馳和胃排空減小。本發(fā)明NPY激動劑的顯著醫(yī)療用途是治療飲食疾病，如神經(jīng)性厭食。
本發(fā)明肽衍生物的劑量要求能激動神經(jīng)肽Y，并產(chǎn)生升壓和血管收縮及其它作用，劑量取決于患者，治療的嚴格條件和所選擇的肽衍生物，劑量范圍為0.2mg至250mg/患者體重kg/每天。對于具體患者可很快確定適宜劑量。優(yōu)選每日給藥1至4次，每次含活性化合物5mg至100mg。
這里使用的術(shù)語“患者”指哺乳動物如靈長類動物，其包括人、羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠和小鼠。
雖然一些肽衍生物可通過腸胃道口服，但申請人認為非口服給藥較好，例如，皮下、靜脈、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi);貯存注射(depotinzection);植入物;或?qū)⒑景l(fā)明衍生物制成噴霧劑，以噴霧或干粉形式通過鼻、喉、支氣管的粘膜吸收給藥。
用于非腸道給藥的化合物可制成注射用的溶液或懸浮液。該注射液包括本發(fā)明化合物，生理用稀釋劑，藥用載體，指無菌液體，如水和油，另外還可加或不加表面活劑性和其它藥用添加劑。這些制劑中使用的油是指石油，動物油，植物油和合成的天然油，例花生油，豆油及礦物油。通常水，鹽水，葡萄糖水溶液和有關(guān)的糖溶液，乙醇和脂肪族二元醇類如乙二醇和聚乙二醇是優(yōu)選的液體載體，尤其是用于制備注射液。
本發(fā)明化合物可以貯存注射或植入物制劑形式服用，該制劑是以使活性成份持續(xù)釋放的方式配制的。該活性成份可壓入小丸或小圓柱體內(nèi)并以貯存注射液或移入體形式移入皮下或肌肉內(nèi)。植入物可用惰性材料，如生物降解聚合物或人工硅酮，如Dow-Corning公司制造的硅化橡膠和硅酮橡膠。
下面是說明本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明并不限制于這些實施例。
實施例1

的制備通過固相方法，采用Applied Biosystems Model430-A肽合成儀，以0.5mmol等級，在對-甲基二苯甲基胺樹脂(0.4mmol/g;肽Intl)上合成標題肽衍生物。所有上式中氨基酸都可雙偶聯(lián)成Nα-叔-Boc-保護的氨基酸的對稱酸酐，但不包括可由DCC/HOBT法雙偶聯(lián)的Arg、Asn、Gln。側(cè)鏈保護如下Arg(Tos)，Asp(Chx)，Cys(pMBzl)，Glu(Bzl)，His(Tos)，Ser(Bzl)，Tyr(2-BrZ)，Thr(Bzl)，Lys(2-Clz)。從樹脂載體上脫下肽(0.25mmol，理論值)，然后于-5℃，含5%苯甲醚的HF溶液中脫保護40分鐘。真空脫HF后，用30%乙酸和水從樹脂中萃取肽。溶液從樹脂中濾出，然后凍干，保留的肽通過制備型高壓液相色譜，在DynamaxC-18柱(41.4×250mm;Rainin)上，用溶在0.1%三氟乙酸的乙腈作洗脫劑來純化。肽的純度和特性由分析型高壓液相色譜分析(Vydal218TP54柱，4.60×250mm，2.0ml/分鐘，Tc-1.9分鐘，線性梯度，含在1%TFA中的15-40%乙腈，時間25分多鐘)，氨基酸分析(AAA)(含8%苯酚的6NHCl;106℃，20-40小時)，快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)(M-ScanLtd.)。
AAAaB-1.96;T-1.03;S-1.62;P-1.88;A-1.96;I-2.84;L-2.14;Y-4.04;H-1.09;R-4.06.
a6NHCl，24Hr，106℃.
FAB-MS(M+H)+3311.2±1mu.
實施例2制備

用固相法，采用Applied Biosystem Model430A肽合成儀，以0.5mmol級別，在對-甲基二苯甲基胺樹脂(0.4mmol/g，肽Intl)上合成標題肽衍生物，式中所有氨基酸可雙偶聯(lián)成Nα-t-Boc-保護的氨基酸的對稱酸酐，但不包括可被DCC/HOBT法雙偶聯(lián)的Arg、Asn、Gln。側(cè)鏈氨基酸保護如下Arg(Tos)，Asp(Chx)，Cys(pMBzl)，Glu(Bzl)，His(Tos)，Ser(Bzl)，Tyr(2-Brz)，Thr(Bzl)，Lys(2-Clz)。從樹脂載體上斷開肽(0.25mmol，理論值)，然后于-5℃，含5%苯甲醚的HF液體中脫保護40分鐘。真空除去HF后，用30%乙酸和水萃取樹脂中肽。將萃取液稀釋到1升，用氫氧化銨將PH調(diào)至8至9，然后加入氰鐵酸鉀直到溶液變黃(約25ml)。攪拌30分鐘后，用冰醋酸將PH降至＜5，該溶液與25ml澄清的AC3×4A樹脂(BioRad)攪拌2小時。從樹脂中濾出溶液，然后凍干。保留的肽通過制備型HPLC，在DynamaxC-18柱上(41.4×250mm;Rainin)，用含在0.1%三氟乙酸中的乙腈作洗脫劑進行純化。肽的純度和特性用分析型HPLC(Vgdac218TP54柱，4.6C×250mm，2.0ml/分鐘，Tc-1.9分鐘，線性梯度為溶在0.1%TFA的15-40%乙腈，需時＞25分鐘)來分析。氨基酸分析(AAA)(含8%苯酚的6NHCl;106℃;20-40小時)，快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)(M-SeanLtd)。
AAAaB-1.89;T-0.99;S-1.68;Z-1.13;P-0.93;A-1.03;L-1.09;I-2.07;Y-3.88;H-0.94;R-3.06.
a6N HCl，24 Hr，106℃.
FAB-MS2888.0±1mu.
實施例3

的制備用實施例2的步驟制備標題化合物。
AAAaB-2.03;T-1.05;S-1.83;Z-1.10;P-1.98;A-2.04;L-2.07;I-1.93;Y-3.91;K-1.02;H-0.98;R-3.87.
a6N HCl，24 Hr，106℃.
FAB-MS3327±1mu.
實施例4

的制備用實施例2的步驟制備標題化合物。
AAAaB-1.00;S-1.00;T-1.01;Z-1.03;L-0.99;I-1.86;Y-2.06;H-0.97;R-2.97;K-1.10.
a6N HCl，24 Hr，106℃.
FAB-MS2193±m(xù)u.
用相似方法制備實施例5-12化合物。
實施例

實施例5-12化合物具有下面特征


權(quán)利要求
1.下式的肽衍生物或其藥用鹽
其中X1是E或D；X2是S或A；X3是S或A；X4是L、I、M、Nle或V；X5是L、I、M、Nle或V；X6是Q、P、H或I；TC是OR′或NHR′；其中R′是氫或(C1-C4)烷基；Q是-NH-(CH2)n-CO2-；其中n是1-11的整數(shù)。
2.權(quán)利要求1的肽衍生物，其中X2是A。
3.權(quán)利要求1的肽衍生物，其中X3是S。
4.權(quán)利要求1的肽衍生物，其中X4是I。
5.權(quán)利要求1的肽衍生物，其中X5是I。
6.權(quán)利要求1的肽衍生物，其中X6是Q。
7.權(quán)利要求1的肽衍生物，其中Q是Aoc。
8.權(quán)利要求1的肽衍生物，該肽衍生物如下
9.活化神經(jīng)肽Y受體的方法，其特征為將受體與權(quán)利要求1-8中一肽衍生物相接觸。
10.用其治療低血壓患者方法，其特征為將有效量的權(quán)利要求1-8的一肽衍生物給患者服用。
11.用其治療厭食疾病的方法，其包括將有效量的權(quán)利要求1-8的一肽衍生物給患者服用。
全文摘要
NPY激動劑是天然NPY的衍生物。采用常規(guī)競爭結(jié)合和生化分析及在各種情況下這些衍生物的使用確定了激動機制，其中也介紹了所指的神經(jīng)肽Y。
文檔編號A61P9/02GK1042155SQ8910652
公開日1990年5月16日 申請日期1989年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1988年8月26日
發(fā)明者克爾斯蒂南思基·約翰·里納德 申請人:默里多藥物公司