專利名稱：蛋白質(zhì)化合物，編碼核苷酸序列，產(chǎn)生細(xì)胞系和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種本質(zhì)上為蛋白質(zhì)的組合物，該組合物能選擇性抑制對(duì)雌激素敏感的腫瘤細(xì)胞的分裂和/或能對(duì)所說腫瘤細(xì)胞施加細(xì)胞毒性作用。本發(fā)明也涉及一種從人脂肉瘤分離到的能在培養(yǎng)中分裂的細(xì)胞系(該培養(yǎng)過程中細(xì)胞系產(chǎn)生所說組合物)以及涉及于其中存在所述組合物的條件培養(yǎng)基中的該細(xì)胞系的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明還涉及所說產(chǎn)物在診斷和臨床上的應(yīng)用。
現(xiàn)有技術(shù)中已知大量能在體外生長(zhǎng)的最初從人腫瘤分離到的細(xì)胞系。這些細(xì)胞系在研究其生理學(xué)性質(zhì)方面以及特異因子的產(chǎn)生方面特別有用。
至今盡管有大量嘗試，但在現(xiàn)有技術(shù)中仍然沒有發(fā)現(xiàn)已知的具有與脂肪細(xì)胞(adiposecell或adipocytes)相關(guān)的分化表型的細(xì)胞系，也沒有發(fā)現(xiàn)已知的屬于脂肉瘤類的腫瘤分離到的細(xì)胞系。如果這些細(xì)胞源于基質(zhì)組織(目前很少知道該組織的特性，考慮到鄰近組織所起的某些功能，該組織被認(rèn)為起控制作用)則特別有用。事實(shí)上，體內(nèi)在有激素睪酮存在的乳腺中，脂細(xì)胞誘導(dǎo)上皮組織退化[Kratochwill，K.Developmentandlossofandrogenresponsivenessintheemtryonicrudimentofthdmousemammarygland.Dev.Biol61∶358-365，1977]，因而施加旁作用(Paracrineaction)，這種作用可能被所說脂細(xì)胞釋放的一種或多種化合物介導(dǎo)[Kratochwill，K.1987，incellularandMolecularBiologyofMammaryCancer一書(D.Medina，W.K.dweel，G.Heppner，e.E.Anderson，eds.pp1-8Plenum，NewYork]。
上述研究具體給出以能完成體內(nèi)觀察到的功能的細(xì)胞系的體外分離和生長(zhǎng)所需的證據(jù)。
本發(fā)明的作者第一次分離到能夠在培養(yǎng)中分裂，具有脂細(xì)胞表型相關(guān)表型的細(xì)胞系，并表述其特性。令人驚奇的是，該細(xì)胞系在條件培養(yǎng)基為主的培養(yǎng)基中產(chǎn)生至少一種能夠選擇性抑制源于對(duì)雌激素敏感的上皮(epithelila)腫瘤的上皮腫瘤細(xì)胞分裂的化合物。
“與脂細(xì)胞表型相關(guān)表型”一詞是指至少一種象脂類合成一樣脂細(xì)胞特有的分化特征的表現(xiàn)形式?！吧掀つ[瘤細(xì)胞”一詞是指源于上皮腫瘤的腫瘤細(xì)胞，所說細(xì)胞已被分離出或仍存在于腫瘤塊上。“雌激素敏感上皮腫瘤”一詞是指由帶有至少一種屬于雌性激素類激素受體的細(xì)胞所組成的腫瘤。“條件培養(yǎng)基”一詞是指在適合于細(xì)胞生長(zhǎng)的溫度、溫度和PH條件下，在其中培養(yǎng)所述細(xì)胞至少6小時(shí)的培養(yǎng)基?！耙种萍?xì)胞分裂能力”是指在所說細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)至少3天后化合物在培養(yǎng)中抑制至少50%細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。
因此，明顯需要辨別和鑒定能夠選擇性抑制源于雌激素敏感性上皮瘤的瘤細(xì)胞分裂的這些化合物的特性。
近期出版的文獻(xiàn)[MendelsohnM.E.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，11212-11216，1991]中公開了“熱休克”(“heatshock”)P27人蛋白[HSD27，已由HickeyE.等識(shí)別和定序，Nucl.AcidsRes.，14，104127-4145(1986)]具有199aa氨基酸序列，與和雌激素-受體相關(guān)的蛋白質(zhì)序列相同并稱作P29[CofferA.I.等，CancerRessearch45，3686-3693，1990]。
最近[Carper S.W.等，Nucl.Acids Res.18，6457，1990]一種從肺癌A549細(xì)胞系獲得的CDNA克隆已被定序，該克隆的核苷酸序列編碼205個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其中首先的193個(gè)氨基酸與已知的人HSp27的那些氨基酸恰好一致。與編碼194位氨基磺酸酯殘基的密碼Z相對(duì)應(yīng)處檢測(cè)出插入了兩個(gè)胞嘧啶殘基，它決定了讀碼(reading frame)移向位于核苷酸序列6161-618位處的下一個(gè)終止密碼Z處，這種插入引起HSp27蛋白質(zhì)C-端序列的修飾，使最后5個(gè)氨基酸不同(從195位到199位)并表現(xiàn)出延長(zhǎng)6個(gè)氨基酸(從200位到205位)。
在描述過的現(xiàn)有技術(shù)的蛋白質(zhì)中，沒有證據(jù)表明其中任何一種具有對(duì)腫瘤細(xì)胞分裂的抑制活性。
在從LSA細(xì)胞系產(chǎn)生和分泌的化合物中，本發(fā)明的發(fā)明人識(shí)別出一種化合物，并鑒定了其特性，它的組合物本質(zhì)上實(shí)際是蛋白質(zhì)，能選擇性抑制雌激素敏感腫瘤上皮細(xì)胞分裂，并能對(duì)這些腫瘤細(xì)胞施加細(xì)胞毒性作用。發(fā)明人表述了所說化合物的生物化學(xué)特性，將其稱作P1LSA，并測(cè)定了其氨基酸序列，證明它由205個(gè)氨基酸組成。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)所說氨基酸序列除一單個(gè)氨基酸外與Carper S.W(文獻(xiàn)出處同上)測(cè)定的人HSp27蛋白質(zhì)序列相同。所觀察到的不同是在194位氨基酸(精氨酸取代脯氨酸)，由編碼蛋白質(zhì)HSp27的序列的581位處以鳥嘌呤取代了胞嘧啶而決定的。
因此，發(fā)明人識(shí)別出一種對(duì)雌激素敏感上皮腫瘤細(xì)胞具特異性的具抗腫瘤生物活性的新化合物。
發(fā)明人識(shí)別了編碼蛋白質(zhì)P1LSA的核苷酸序列，并且測(cè)定了其氨基酸序列。
相應(yīng)的，本發(fā)明的一個(gè)目的是一種化合物，其組合物在本質(zhì)上實(shí)際上是蛋白質(zhì)的，所說化合物能夠選擇性抑制雌激素敏感上皮腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞分裂和/或能對(duì)所說腫瘤施加細(xì)胞毒性活性;所說的化合物的分子量范圍為27到30千道爾頓(KDa);所說化合物也含有基本上同源于相應(yīng)的人蛋白質(zhì)HSp27(熱休克p27)序列的從1位氨基酸到193位氨基酸的氨基酸序列，或者說關(guān)系到具生物活性的所述化合物的一個(gè)片斷。
“基本上同源的氨基酸序列”一詞是指在本發(fā)明的范圍內(nèi)不引起蛋白質(zhì)生物活性喪失的50%到100%同源的所指序列?！吧锘钚浴币辉~是指能選擇性抑制雌激素敏感性上皮腫瘤細(xì)胞分裂(抑制細(xì)胞生長(zhǎng)活性)和/或?qū)λf腫瘤細(xì)胞施加細(xì)胞毒性作用的能力。
按照本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其組合物在本質(zhì)上實(shí)際是蛋白質(zhì)的所說化合物在其羧基末端含有一種基本上同源于以下序列的氨基酸序列GluAlaAlaLysSerAspGluThrAlaAlaLys-NH2優(yōu)選的所說本質(zhì)上為蛋白質(zhì)的化合物包含下列氨基酸序列
MetThrGluArgArgValProPheSerLeuLeuArgGlyProSer15TrpAspProPheArgAspTrpTyrProHisSerArgLeuPheAsp30GlnAlaPheGlyLeuProArgLeuProGluGluTrpSerGlnTrp45LeuGlyGlySerSerTrpProGlyTyrValArgProLeuProPro60AlaAlaIleGluSerProAlaValAlaAlaProAlaTyrSerArg75AlaLeuSerArgGlnLeuSerSerGlyValSerGluIleArgHis90ThrAlaAspArgTrpArgValSerLeuAspValAsnHisPheAla105ProAspGluLeuThrValLysThrLysAspGlyValValGluIle120ThrGlyLysHisGluGluArgGlnAspGluHisGlyTyrIleSer135ArgCysPheThrArgLysTyrThrLeuProProGlyValAspPro150ThrGlnValSerSerSerLeuSerProGluGlyThrLeuThrVal165GluAlaProMetProLysLeuAlaThrGlnSerAsnGluIleThr180IleProValThrPheGluSerArgAlaGlnLeuGlyGlyArgGlu195AlaAlaLysSerAspGluThrAlaAlaLys205.
按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，所說本質(zhì)上為蛋白質(zhì)的化合物由LSA細(xì)胞(DSMACC.N.2029)產(chǎn)生，優(yōu)選由所說細(xì)胞在培養(yǎng)基中分泌。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是作為藥用的組合物，優(yōu)選用于骯腫瘤，更優(yōu)選用于治療雌激素敏感上皮腫瘤。該組合物含有本發(fā)明的本質(zhì)上為蛋白質(zhì)的化合物或其生理學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是根據(jù)本發(fā)明使用本發(fā)明的所說的本質(zhì)上為蛋白質(zhì)的化合物或其生理學(xué)上可接受的鹽制備用于抗腫瘤治療的藥用化合物，優(yōu)選用于治療雌激素敏感性上皮腫瘤。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是含有編碼本發(fā)明的化合物(其組合物根據(jù)本發(fā)明本質(zhì)上是蛋白質(zhì)的)的核苷酸序列的核酸。優(yōu)選所說核酸包含以下核苷酸序列
ATGACCGAGCGCCGCGTCCCCTTCTCGCTCCTGCGGGGCCCCAGC45TGGGACCCCTTCCGCGACTGGTACCCGCATAGCCGCCTCTTCGAC90CAGGCCTTCGGGCTGCCCCGGCTGCCGGAGGAGTGGTCGCAGTGG135TTAGGCGGCAGCAGCTGGCCAGGCTACGTGCGCCCCCTGCCCCCC180GCCGCCATCGAGAGCCCCGCAGTGGCCGCGCCCGCCTACAGCCGC225GCGCTCAGCCGGCAACTCAGCAGCGGGGTCTCGGAGATCCGGCAC270ACTGCGGACCGCTGGCGCGTGTCCCTGGATGTCAACCACTTCGCC315CCGGACGAGCTGACGGTCAAGACCAAGGATGGCGTGGTGGAGATC360ACCGGTAAGCACGAGGAGCGGCAGGACGAGCATGGCTACATCTCC405CGGTGCTTCACGCGGAAATACACGCTGCCCCCCGGTGTGGACCCC450ACCCAAGTTTCCTCCTCCCTGTCCCCTGAGGGCACACTGACCGTG495GAGGCCCCCATGCCCAAGCTAGCCACGCAGTCCAACGAGATCACC540ATCCCAGTCACCTTCGAGTCGCGGGCCCAGCTTGGGGGCCGAGAA585GCTGCAAAATCCGATGAGACTGCCGCCAAGTAA618本發(fā)明的另一個(gè)目的在于含有本發(fā)明核苷酸序列的質(zhì)?；蚴删w型載體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是能在體外分裂并且具有與脂細(xì)胞相關(guān)表型的哺乳綱細(xì)胞系，它也在其條件培養(yǎng)基中產(chǎn)生至少一種能選擇性抑制腫瘤細(xì)胞分裂，優(yōu)選上皮腫瘤細(xì)胞，更優(yōu)選源于雌激素敏感性上皮腫瘤細(xì)胞分裂的化合物。
按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，所說細(xì)胞系從脂肉瘤(優(yōu)選來源于人)分離出，這種細(xì)胞系更優(yōu)選地是寄存于DSM登記號(hào)為2029的LSA細(xì)胞系。再一次強(qiáng)調(diào)根據(jù)本發(fā)明所說細(xì)胞系產(chǎn)生具有上述公開序列的實(shí)際上為蛋白質(zhì)的化合物。
本發(fā)明另一個(gè)目的是以本文所公開的和要求保護(hù)的細(xì)胞系的生長(zhǎng)為條件的培養(yǎng)基。
優(yōu)選所說條件培養(yǎng)基包括至少一種能選擇性抑制腫瘤細(xì)胞(優(yōu)選上皮腫瘤細(xì)胞，更優(yōu)選源于雌激素敏感上皮腫瘤的細(xì)胞)分裂的化合物，更優(yōu)選的所說化合物是本發(fā)明公開的蛋白質(zhì)化合物。
按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，所說培養(yǎng)基以生長(zhǎng)LSA細(xì)胞系(DSMACC.N.2029)為條件。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是使用所說條件培養(yǎng)基產(chǎn)生治療腫瘤(優(yōu)選上皮腫瘤，更優(yōu)選雌激素敏感腫瘤)的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是使用所說條件培養(yǎng)基提純，鑒別和表征至少一種能選擇性抑制腫瘤細(xì)胞，(優(yōu)選上皮腫瘤細(xì)胞，更優(yōu)選源于雌激素敏感上皮腫瘤的細(xì)胞)分裂的化合物。
本發(fā)明將用一些實(shí)施例來加以公開，這些實(shí)施例僅用來解釋和說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明。這里供參考的附圖有附

圖1表示LSA系在有和無血清存在的兩種情況下的生長(zhǎng)曲線;
附圖2a表示人正常胸腺細(xì)胞的細(xì)胞熒光分析結(jié)果;
附圖2b表示LSA細(xì)胞的細(xì)胞熒光分析結(jié)果;
附圖3表示在各種細(xì)胞系中摻入3[H]-胸苷的LSA-CM刺激條形圖。其中，1是對(duì)照樣品，2是在1/4稀度時(shí)的LSA-CM，3是在1/2稀度時(shí)的LSA-CM，4是未稀釋時(shí)的LSA-CM，5是對(duì)照樣品，6是未稀釋時(shí)的LSA-CM，7是對(duì)照樣品，8是未稀釋時(shí)的LSA-CM;
附圖4表示在有和無LSA-CM存在時(shí)的兩種情況下MCF-7細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線;
附圖5表示在有和無LSA-CM存在時(shí)兩種情況下ZR-75-1細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線;
附圖6表示在有和無LSA-CM存在時(shí)兩種情況下MDAMB-231細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線;
附圖7表示在有無LSA-CM存在時(shí)兩種情況下NMNG細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線;
附圖8表示在有和無LSA-CM存在時(shí)兩種情況下從卵巢(ovaric)癌得到的人細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線;
附圖9表示在有和無LSA-CM和/或純化的P1LSA存在時(shí)的兩種情況下從卵巢癌得到的人細(xì)胞生長(zhǎng)的條形圖。
實(shí)施例1LSA細(xì)胞系的分離以無菌方式的外科手術(shù)從65歲成年婦女的腿部取出混合成脂細(xì)胞-纖維細(xì)胞型人脂肉瘤片斷。
片斷用鑿子(chisel)機(jī)械搗碎，以獲得1mm碎片，所得物質(zhì)用相當(dāng)于20μ/ml膠原酶(CLSP，Worthington，Regno Unito)，075mg/ml胰蛋白酶(1/300，Inc.Pharmaceuticals)，2%雞血清的CTC溶液處理，在37℃和不斷攪抖下在無Ca2+和Mg2+離子的Hank培養(yǎng)基(Soil)(GIBCO)和含有5%牛血清的Ham F12培養(yǎng)基(Soil)(GIBCO)中熱滅活和透折4小時(shí)，以獲得單細(xì)胞懸浮液。
細(xì)胞懸浮液以補(bǔ)充有5%牛血清(GIBCO)、青霉素(31μg/ml)、鏈霉素(50μg/ml)和二性霉素B(25μg/ml)的Ham F12(GIBCO)培養(yǎng)基稀釋。細(xì)胞以200，000細(xì)胞/皿鋪在直徑為100mm的平皿(Costar)上。
一種能在培養(yǎng)中分裂并具有特異于脂細(xì)胞特點(diǎn)的細(xì)胞克隆從培養(yǎng)基中獲得，所說克隆被稱作LSA，保藏在DSM，保藏號(hào)為ACC2029。
附圖1示出LSA系的生長(zhǎng)曲線，其中在有和無血清存在下的生長(zhǎng)曲線是明顯的。LSA系表現(xiàn)出90%的平皿鋪蓋率(platingefficiency)，在有血清存在時(shí)，其倍增時(shí)間為50-52小時(shí)，在無血清存在時(shí)，則為102小時(shí)，培養(yǎng)基每72小時(shí)換一次。
實(shí)施例2LSA系的特性表述LSA細(xì)胞的DNA內(nèi)含物通過細(xì)胞熒光計(jì)(Partec Pas Ⅱ flow-cytometer)來分析。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶解并以70%乙醇固定，用含有5μg/ml溴化乙錠、12.5μg/ml光輝霉素和15mg MgCl2于0.1M Tris緩沖液(PH 7.5)的溶液染色。在Mitotic循環(huán)各步驟中的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)用Flintoff，W.E.，Davidson，S.V.和Siminowitch，L.在“Isolation and partial Charcterization of Methotrexate-Resistent phenotype from Chinese hamster ovary cell”(Somatic cell Genet.2∶245-261 1976)一文中和Ambesi-Impiom-bato，F(xiàn).S.，Parks，L.A.M.和Coon H.G.在“Culture of hormone-dependent functional epithelial cells from rat thyroid”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77∶3455-3459，1980)一文中公開的方法獲得。
如附圖2b所示，這些值與用正常人胸腺細(xì)胞作為倍性標(biāo)準(zhǔn)的方法獲得的值相比。將胸腺細(xì)胞的G1-G0峰值定為1，在相同的條件下，LSA細(xì)胞的G1-G0峰值是1.79，這意味著DNA內(nèi)含物幾乎是四倍。如附圖2a所示，DNA內(nèi)含物/細(xì)胞也幾乎是用胸腺細(xì)胞獲得的兩倍。
在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LSA細(xì)胞群的細(xì)胞循環(huán)的各種階段的細(xì)胞分布情況示于下列表1。
表1階段細(xì)胞百分比G1-G059S27G2/M 14S階段的細(xì)胞百分比說明細(xì)胞群處于活性生長(zhǎng)階段。
染色體計(jì)數(shù)證明染色體數(shù)/細(xì)胞在80和90之間。
當(dāng)在光學(xué)顯微鏡下觀察時(shí)，LSA細(xì)胞看上去象帶有豐富(abudant)細(xì)胞質(zhì)的拉長(zhǎng)體。而在電子顯微鏡下，則發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核含有許多核仁和位于核周區(qū)的細(xì)胞器。細(xì)胞相互同源，線粒體相對(duì)豐富，細(xì)胞質(zhì)泡在數(shù)量上和大小上恒定不變。最明顯的特點(diǎn)是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在液泡區(qū)域，此區(qū)域是電子反射的并且是高脂含量帶的典型，為在電子顯微鏡下觀察而將細(xì)胞處理配制的結(jié)果則將它們除去。此外，也存在一個(gè)發(fā)育良好的高爾基體(Golgi)。為了估算脂的含量，將LSA細(xì)胞鋪到Lab-Teck(NUNC)培養(yǎng)斜面上，在半?yún)R合下(Semi-confluence)生長(zhǎng)。將細(xì)胞沖洗后，用4%多聚甲醛和在PBS(磷酸鹽水緩沖液)中15%飽和苦味酸固定6分鐘，用蒸餾水沖洗細(xì)胞2次，然后用油紅O溶液染色5分鐘，再用PBS沖洗兩次，用1%甲基胺藍(lán)染色10秒鐘。
假如細(xì)胞在5%牛血清存在下生長(zhǎng)，類脂被分散到細(xì)胞質(zhì)中，成園形的泡。在無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞中則不形成類脂，但當(dāng)用甲基黃嘌呤/desamethasone培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)和用胰島素再培養(yǎng)48小時(shí)后則被刺激生成。
實(shí)施例3以LSA(SA-CM)為條件的培養(yǎng)基對(duì)不同細(xì)胞系體外生長(zhǎng)的作用LSA細(xì)胞在盛有含5%牛血清的F12培養(yǎng)基的100mm平皿(Costar)中長(zhǎng)到80%匯合后，以PBS洗滌細(xì)胞單層，用無血清F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。24小時(shí)后，用新鮮培養(yǎng)基取代原培養(yǎng)基，該條件培養(yǎng)基每6-24小時(shí)收集一次，持續(xù)30天。細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，用錐蟲藍(lán)(Trypan Bluc)染色后，在相對(duì)照顯微鏡下觀察它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上和功能上都顯示是有生命的。
以LSA細(xì)胞為條件的培養(yǎng)基能刺激正常上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，像CHO(CCL-61)、FRTL-5(CRL-1468)和NIH-3T3(ECACC-87100803)在無血清下生長(zhǎng)24小時(shí)的情況，正如由3H-胸苷摻入試驗(yàn)所證明的(見附圖3)。與上述結(jié)果相反，以LSA細(xì)胞為條件的培養(yǎng)基，在用含有雌激素受體的腫瘤細(xì)胞體外分析時(shí)，表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞溶解活性生長(zhǎng)的抑制作用。使用的細(xì)胞是從人乳房癌獲得的MCF-7細(xì)胞(Land，H.等，Science222∶778(1980)，ECACC-86012803)，該細(xì)胞具有雌激素受體(Soule，H.O.等，Natl.CancerInst.S1，1409-1413(1973))、雄激素受體(Horowity，K.B.等，Steroids26，785-795(1975))、胰島素和triodothyronine受體(MacGrath，C.M.CancerRes.，43∶1355-1360(1983));
從人乳房癌獲得的ZK-75-1(CRL-1504)細(xì)胞，所說細(xì)胞對(duì)雌激素受體呈陽性。
從人乳房癌獲得的MDAMB-231(ATCC-HTB26)細(xì)胞，而它對(duì)雌激素受體呈陰性。
從鼠乳房上皮獲得的NMMG(Burker，R.E.等，CancerRes.，38∶3769-3773(1978)，CRL-1636)細(xì)胞，所說細(xì)胞對(duì)雌激素受體呈輕微陽性。
從患有因卵巢癌轉(zhuǎn)移引起的腹膜滲漏的婦女獲得的卵巢癌人細(xì)胞等。所說細(xì)胞系對(duì)雌激素受體呈陽性。
這里提到的細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線通過按100，000細(xì)胞/皿鋪覆在直徑為100mm盛有帶有10%牛胎血清(FCS，GIBCO)的10mlDMEM(GIBCO)培養(yǎng)基中而獲得。有2mlLSA-CM被加到每個(gè)皿中。
附圖4表示MCF-7系的生長(zhǎng)曲線，其中LSA-CM的抑制作用明顯。特別是，經(jīng)4天處理后，由于胞溶作用，移去LSA-CM仍不能重新恢復(fù)MCF-7細(xì)胞的增殖能力。
附圖5表示在有或無LSA-CM存在的兩種情況下7R-75-1系的生長(zhǎng)曲線，LSA-CM的存在引起強(qiáng)烈的生長(zhǎng)抑制作用，并無任何胞溶作用。
附圖6和7表示MDAMB-231細(xì)胞和正常上皮NMMG細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，其中明顯無由于LSA-CM引起的生長(zhǎng)抑制作用，這樣的細(xì)胞不表現(xiàn)出雌激素受體。
附圖8表明，即使培養(yǎng)24小時(shí)后，LSA-CM條件培養(yǎng)基對(duì)人卵巢癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用。
在不同細(xì)胞系中LSA-CM對(duì)3H-胸苷摻入的作用列在下表2中。
表2在不同細(xì)胞系中LSA-CM對(duì)3H-胸腺苷摻入的作用細(xì)胞系無作用激活抑制MCF 7+ZR-75-1+NMMG+FRTL-S+CHO+NTH-3T3+實(shí)施例4LSA-CM對(duì)動(dòng)物的作用挑選20只受Bittner病毒感染有明顯腫瘤塊的Balb/cfc3H鼠(CharlesRiver)，系患雌激素依賴乳房癌，由病毒本身誘導(dǎo)而致。
每天腹膜注射200μlLSA-CM15天后，80%經(jīng)治療過的鼠中觀察到腫瘤組織生長(zhǎng)被抑制和壞死。
實(shí)施例5從LSA-CM分離P1LSA蛋白質(zhì)LSA-CM培養(yǎng)基濃縮100倍，在PH7.4下對(duì)等溶磷酸鹽緩沖液滲析，然后在P6樹脂(Pharmacia)上凝膠過濾。將洗脫組分用來試驗(yàn)選擇性抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。僅一個(gè)組分顯示所說生物活性。將所說組分的一個(gè)樣品在非變性條件下于聚丙烯酰胺膠上電泳而分離，鑒別為一種約29KDa的蛋白質(zhì)，稱作P1LSA。將所說蛋白質(zhì)電洗脫，用來生產(chǎn)以下所說的多克隆抗體和用于序列分析。
該蛋白質(zhì)序列如下表3所示。
如附圖9所示，純化的P1LSA蛋白質(zhì)對(duì)人卵巢腫癌細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用。
表3P1LSA蛋白質(zhì)的氫基酸序列和相應(yīng)的編碼序列ATGACCGAGCGCCGCGTCCCCTTCTCGCTCCTGCGGGGCCCCAGC45MetThrGluArgArgValProPheSerLeuLeuArgGlyProSer15TGGGACCCCTTCCGCGACTGGTACCCGCATAGCCGCCTCTTCGAC90TrpAspProPheArgAspTrpTyrProHisSerArgLeuPheAsp30CAGGCCTTCGGGCTGCCCCGGCTGCCGGAGGAGTGGTCGCAGTGG135GlnAlaPheGlyLeuProArgLeuProGluGluTrpSerGlnTrp45TTAGGCGGCAGCAGCTGGCCAGGCTACGTGCGCCCCCTGCCCCCC180LeuGlyGlySerSerTrpProGlyTyrValArgProLeuProPro60
GCCGCCATCGAGAGCCCCGCAGTGGCCGCGCCCGCCTACAGCCGC225AlaAlaIleGluSerProAlaValAlaAlaProAlaTyrSerArg75GCGCTCAGCCGGCAACTCAGCAGCGGGGTCTCGGAGATCCGGCAC270AlaLeuSerArgGlnLeuSerSerGlyValSerGluIleArgHis90ACTGCGGACCGCTGGCGCGTGTCCCTGGATGTCAACCACTTCGCC315ThrAlaAspArgTrpArgValSerLeuAspValAsnHisPheAla105CCGGACGAGCTGACGGTCAAGACCAAGGATGGCGTGGTGGAGATC360ProAspGluLeuThrValLysThrLysAspGlyValValGluIle120ACCGGTAAGCACGAGGAGCGGCAGGACGAGCATGGCTACATCTCC405ThrGlyLysHisGluGluArgGlnAspGluHisGlyTyrIleSer135CGGTGCTTCACGCGGAAATACACGCTGCCCCCCGGTGTGGACCCC450ArgCysPheThrArgLysTyrThrLeuProProGlyValAspPro150ACCCAAGTTTCCTCCTCCCTGTCCCCTGAGGGCACACTGACCGTG495ThrGlnValSerSerSerLeuSerProGluGlyThrLeuThrVal165GAGGCCCCCATGCCCAAGCTAGCCACGCAGTCCAACGAGATCACC540GluAlaProMetProLysLeuAlaThrGlnSerAsnGluIleThr180ATCCCAGTCACCTTCGAGTCGCGGGCCCAGCTTGGGGGCCGAGAA585IleProValThrPheGluSerArgAlaGlnLeuGlyGlyArgGlu195GCTGCAAAATCCGATGAGACTGCCGCCAAGTAA618AlaAlaLysSerAspGluThrAlaAlaLys205
通過與貯存在數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比較，證明該序列除僅一個(gè)氨基酸外，與上面提到的由CarperS.W.描述的對(duì)應(yīng)的人HSp27蛋白質(zhì)相同，不同之點(diǎn)在于194位氨基酸的取代，所說氨基酸是由精氨酸取代脯氨酸。
實(shí)施例6抗-P1LSA多克隆抗體的生產(chǎn)和P1LSA蛋白質(zhì)活性的抑制將從10%聚丙烯酰胺膠上洗脫的100μgP1LSA蛋白質(zhì)溶解在1mlPBS(磷酸鹽水緩沖液)，并與1ml費(fèi)氏完全佐劑混合。每隔10天將混合物通過肌內(nèi)注射兔子，共四次。20天內(nèi)每隔一天從兔子取出30ml免疫血清。按廠商說明用MabTrapG(Pharmacia)純化免疫球蛋白(Ig)部分。
免疫沉淀和免疫印跡(immunoblotting)試驗(yàn)表明，免疫球蛋白以一種特定方式與LSA-CM來源的P1LSA蛋白質(zhì)反應(yīng)。
37℃下預(yù)培養(yǎng)帶有10μl 1mg/ml Ig溶液的100μl LSA-CM30分鐘可終止抑制腫瘤上皮細(xì)胞(MCF-7)分裂的活性，恢復(fù)到類似于未處理的對(duì)照樣品的3H-胸腺摻入和生長(zhǎng)曲線，證明以預(yù)免疫血清培養(yǎng)后LSA-CM活性未改變。
這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，按以上實(shí)施例5公開的方法分離和純化的，具有表3公開的序列的P1LSA蛋白質(zhì)實(shí)際上對(duì)抑制本文所說的上皮細(xì)胞分裂的活性起主要作用。
實(shí)施例7編碼P1LSA蛋白的核苷酸序列編碼P1LSA蛋白質(zhì)的核苷酸序列由按標(biāo)準(zhǔn)方法從LSA細(xì)胞提純的RNA poly A+，使用下列引物進(jìn)行PCR反應(yīng)來測(cè)定Oligo5'GGGAATTCTGAGCAGACGTCCAGAGECORIOligo3'CGGAATTCCGGGCTAAGGCTTTACTTGECORI該兩序列分別從5'和3'位不轉(zhuǎn)譯編碼HSp27基因的序列推測(cè)出。
擴(kuò)增產(chǎn)物在載體pGEM4Z(Promega)的EcorI位點(diǎn)被直接克隆，并用雙脫氧(dideoxy)法測(cè)序。編碼蛋白質(zhì)的完全序列示于表3。
本發(fā)明以結(jié)合其優(yōu)選方案而加以公開，但需理解，由本專業(yè)技術(shù)人員所作的修飾和改變并不背離本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種本質(zhì)上為蛋白質(zhì)的化合物，其特征在于，它能選擇性抑制雌激素敏感上皮腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞分裂和/或能在所說腫瘤細(xì)胞上施加細(xì)胞毒性作用；其分子量范圍為27到30KDa之間，含有一個(gè)從1位氨基酸到193位氨基酸基本與人HSp27(熱休克p27)蛋白質(zhì)同源的氨基酸序列；或所說化合物一種生物活性片斷。
2.一種如權(quán)利要求1的本質(zhì)上為蛋白質(zhì)的化合物，所說化合物在其羧基末端含有一個(gè)與下列氨基酸序列同源的氨基酸序列GluAlaAlaLysSerAspGluThrAlaAlaLys-NH2
3.一種如權(quán)利要求2的本質(zhì)上為蛋白質(zhì)的化合物，這種化合物含有一個(gè)基本與下列氨基酸序列同源的氨基酸序列MetThrGluArgArgValProPheSerLeuLeuArgGlyProSer 15TrpAspProPheArgAspTrpTyrProHisSerArgLeuPheAsp 30GlnAlaPheGlyLeuProArgLeuProGluGluTrpSerGlnTrp 45LeuGlyGlySerSerTrpProGlyTyrValArgProLeuProPro 60AlaAlaIleGluSerProAlaValAlaAlaProAlaTyrSerArg 75AlaLeuSerArgGlnLeuSerSerGlyValSerGluIleArgHis 90ThrAlaAspArgTrpArgValSerLeuAspValAsnHisPheAla 105ProAspGluLeuThrValLysThrLysAspGlyValValGluIle 120ThrGlyLysHisGluGluArgGlnAspGluHisGlyTyrIleSer 135ArgCysPheThrArgLysTyrThrLeuProProGlyValAspPro 150ThrGlnValSerSerSerLeuSerProGluGlyThrLouThrVal 165GluAlaProMetProLysLeuAlaThrGlnSerAsnGluIleThr 180IleProValThrPheGluSerArgAlaGlnLeuGlyGlyArgGlu 195AlaAlaLysSerAspGluThrAlaAlaLys 205.
4.如權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的本質(zhì)上為蛋白質(zhì)的化合物，它是由LSA細(xì)胞(DSM ACC.N.2029)產(chǎn)生的，該化合物優(yōu)選由所說細(xì)胞在培養(yǎng)基中分泌。
5.一種藥用組合物，優(yōu)選抗腫瘤用，包含以上任何權(quán)利要求之一的本質(zhì)上為蛋白質(zhì)的化合物或其生理上可接受的鹽。
6.如權(quán)利要求5的組合物，用來治療雌激素敏感性上皮腫瘤。
7.以上權(quán)利要求之一的一種本質(zhì)上為蛋白質(zhì)的化合物或其生理上可接受鹽的用途，用于制備治療腫瘤的組合物，優(yōu)選治療雌激素敏感性上皮腫瘤。
8.一種核酸，它含有編碼上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所說本質(zhì)上為蛋白質(zhì)的化合物的核苷酸序列。
9.如權(quán)利要求8的核酸，含有下列核苷酸序列ATGACCGAGCGCCGCGTCCCCTTCTCGCTCCTGCGGGGCCCCAGC 45TGGGACCCCTTCCGCGACTGGTACCCGCATAGCCGCCTCTTCGAC 90CAGGCCTTCGGGCTGCCCCGGCTGCCGGAGGAGTGGTCGCAGTGG 135TTAGGCGGCAGCAGCTGGCCAGGCTACGTGCGCCCCCTGCCCCCC 180GCCGCCATCGAGAGCCCCGCAGTGGCCGCGCCCGCCTACAGCCGC 225GCGCTCAGCCGGCAACTCAGCAGCGGGGTCTCGGAGATCCGGCAC 270ACTGCGGACCGCTGGCGCGTGTCCCTGGATGTCAACCACTTCGCC 315CCGGACGAGCTGACGGTCAAGACCAAGGATGGCGTGGTGGAGATC 360ACCGGTAAGCACGAGGAGCGGCACGACGAGCATCCCTACATCTCC 405CGGTGCTTCACGCGGAAATACACGCTGCCCCCCGGTGTGGACCCC 450ACCCAAGTTTCCTCCTCCCTGTCCCCTGAGGGCACACTGACCGTG 495GAGGCCCCCATGCCCAAGCTAGCCACGCAGTCCAACGAGATCACC 540ATCCCAGTCACCTTCGAGTCGCGGGCCCAGCTTGGGGGCCGAGAA 585GCTGCAAAATCCGATGAGACTGCCGCCAAGTAA 618
10.含有權(quán)利要求8或9之一所述核苷酸序列的質(zhì)粒或噬菌體型載體。
11.一種哺乳綱細(xì)胞系，能在體外分裂，并且具有與脂細(xì)胞相關(guān)表型，它在其培養(yǎng)基或條件培養(yǎng)基中產(chǎn)生至少一種權(quán)利要求1-4之一所述的，能選擇性抑制腫瘤細(xì)胞分裂的化合物。
12.如權(quán)利要求10的哺乳綱細(xì)胞系，其中所說的腫瘤細(xì)胞包括上皮腫瘤細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求12的哺乳綱細(xì)胞系，其中所說上皮腫瘤細(xì)胞源于雌激素敏感性上皮腫瘤。
14.如權(quán)利要求1-13之一的哺乳綱細(xì)胞系，能在有和無血清培養(yǎng)基兩種情況下體外分裂。
15.如權(quán)利要求11-14中之一的哺乳綱細(xì)胞系，其中所說細(xì)胞系從人脂肉瘤分離出。
16.如權(quán)利要求15的哺乳綱細(xì)胞系，其中所說細(xì)胞系從人脂肉瘤分離出。
17.如權(quán)利要求16的哺乳綱細(xì)胞系，其中所說細(xì)胞系是LSA系(DSM ACC.N.2029)。
18.一種培養(yǎng)基，以根據(jù)權(quán)利要求11-17之一所說的細(xì)胞系生長(zhǎng)為條件。
19.根據(jù)權(quán)利要求18施加條件的培養(yǎng)基，所說培養(yǎng)基含有至少一種能選擇性抑制腫瘤細(xì)胞分裂的化合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19施加條件的培養(yǎng)基，其中所說腫瘤細(xì)胞是上皮腫瘤細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求20施加條件的培養(yǎng)基，其中所說的上皮腫瘤細(xì)胞源于雌激素敏感性上皮腫瘤。
22.根據(jù)權(quán)利要求21施加條件的培養(yǎng)基，其中所說的細(xì)胞系是LSA細(xì)胞系(DSM ACC.N.2029)。
23.根據(jù)權(quán)利要求18-22中之一的條件培養(yǎng)基的用途，用來生產(chǎn)治療腫瘤的藥物組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的條件培養(yǎng)基的用途，其中所說的腫瘤是上皮腫瘤。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的條件培養(yǎng)基的用途，其中所說的上皮腫瘤是雌激素敏感性的。
26.根據(jù)權(quán)利要求18-22中的條件培養(yǎng)基的用途，用于提純、鑒別和表征至少一種能選擇性抑制腫瘤細(xì)胞分裂的化合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的條件培養(yǎng)基的用途，其中所說的細(xì)胞源于雌激素敏感性上皮腫瘤。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的條件培養(yǎng)基的用途，其中所說的細(xì)胞源于雌激素敏感性上皮腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種本質(zhì)上為蛋白質(zhì)的組合物，該組合物能選擇性抑制對(duì)雌激素敏感的腫瘤細(xì)胞的分裂和/或能在所說腫瘤細(xì)胞上施加細(xì)胞毒性作用。本發(fā)明也涉及一種從人脂內(nèi)瘤分離到的能在培養(yǎng)中分裂的細(xì)胞系(這一細(xì)胞系產(chǎn)生所說組合物)以及涉及其加以條件控制的培養(yǎng)基(有所說組合物存在其中)本發(fā)明還涉及所說產(chǎn)物在診斷和臨床上的各種應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1078494SQ9310406
公開日1993年11月17日 申請(qǐng)日期1993年3月9日 優(yōu)先權(quán)日1992年3月9日
發(fā)明者阿爾多·曼奇尼 申請(qǐng)人:國(guó)家腫瘤研究治療學(xué)院-G.派斯卡勒創(chuàng)建