專利名稱：利用白細(xì)胞介素-10誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1受體拮抗物的產(chǎn)生的制作方法
從大體上說本發(fā)明涉及通過施用有效量的白細(xì)胞介素-10而誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1受體拮抗物產(chǎn)生的方法。
本發(fā)明涉及使用白細(xì)胞介素-10(IL-10)治療與白細(xì)胞介素-1水平升高相關(guān)的疾病和狀態(tài)。具體地說，本發(fā)明涉及治療與不希望的炎性反應(yīng)，例如敗血病休克，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，相關(guān)聯(lián)的各種各樣的疾病和狀態(tài)，例如見，Gallinetal.，editors，Inflammation(RavenPress，NewYork，1988);Evansetal.，CirculatoryShock，Vol.29，pgs.279-290(1989);Waageetal.，J.Exp.Med.Vol.169，pgs.333-338(1989)等等。
在某種程度上本發(fā)明基于下列發(fā)現(xiàn)IL-10能誘導(dǎo)IL-1rd的產(chǎn)生，而IL-1rd使IL-1的生物活性受阻。本發(fā)明包括含有白細(xì)胞介素-10的藥物組合物。本發(fā)明的白細(xì)胞介素-10較好的是選自于由下列氨基酸序列定義的開放閱讀框架的一組成熟多肽MetHisSerSerAlaLeuLeuCysCysLeuValLeuLeuThrGlyValArgAlaSerProGlyGlnGlyThrGlnSerGluAsnSerCysThrHisPheProGlyAsnLeuProAsnMetLeuArgAspLeuArgAspAlaPheSerArgValLysThrPhePheGlnMetLysAspGlnLeuAspAsnLeuLeuLeuLysGluSerLeuLeuGluAspPheLys
GlyTyrLeuGlyCysGlnAlaLeuSerGluMetIleGlnPheTyrLeuGluGluValMetProGlnAlaGluAsnGlnAspProAspIleLysAlaHisValAsnSerLeuGlyGLuAsnLeuLysThrLeuArgLeuArgLeuArgArgCysHisArgPheLeuProCysGluAsnLysSerLysAlaValGluGlnValLysAsnAlaPheAsnLysLeuGlnGluLysGlyIleTyrLysAlaMetSerGluPheAspIlePheIleAsnTyrIleGluAlaTyrMetThrMetLysIleArgAsn和MetGluArgArgLeuValValThrLeuGlnCysLeuValLeuLeuTyrLeuAlaProGluCysGlyGlyThrAspGlnCysAspAsnPheProGlnMetLeuArgAspLeuArgAspAlaPheSerArgValLysThrPhePheGlnThrLysAspGluValAspAsnLeuLeuLeuLysGluSerLeuLeuGluAspPheLysGlyTyrLeuGlyCysGlnAlaLeuSerGluMetIleGlnPheTyrLeuGluGluValMetProGlnAlaGluAsnGlnAspProGluAlaLysAspHisValAsnSerLeuGlyGluAsnLeuLysThrLeuArgLeuArgLeuArgArgCysHisArgPheLeuProCysGluAsnLysSerLysAlaValGluGlnIleLysAsnAlaPheAsnLysLeuGlnGluLysGlyIleTyrLysAlaMetSerGluPheAspIlePheIleAsnTyrIleGluAlaTyrMetThrIleLysAlaArg,其中用標(biāo)準(zhǔn)的三字母簡(jiǎn)寫代表L-氨基酸，起始于N-末端。有時(shí)也將這兩種類型的IL-10分別稱作為人IL-10(或人細(xì)胞激活素合成抑制因子)以及病毒IL-10(或BCRF1);例如，Moore et al.，Science，Vol.248，1230-1234頁(yè)(1990);Vieira et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.88，1172-1176頁(yè)(1991);Fiorentino et al.，J.Exp.Med.，Vol.170，2081-2095頁(yè)(1989);Hsu et al.，Science，Vol.250，pgs.830-832(1990)。在本發(fā)明方法中使用的成熟IL-10更優(yōu)選的是選自于下列序列組
SerProGlyGlnGlyThrGlnSerGluAsnSerCysThrHisPheProGlyAsnLeuProAsnMetLeuArgAspLeuArgAspAlaPheSerArgValLysThrPhePheGlnMetLysAspGlnLeuAspAsnLeuLeuLeuLysGluSerLeuLeuGluAspPheLysGlyTyrLeuGlyCysGlnAlaLeuSerGluMetIleGlnPheTyrLeuGluGluValMetProGlnAlaGluAsnGlnAspProAspIleLysAlaHisValAsnSerLeuGlyGluAsnLeuLysThrLeuArgLeuArgLeuArgArgCysHisArgPheLeuProCysGluAsnLysSerLysAlaValGluGlnValLysAsnAlaPheAsnLysLeuGlnGluLysGlyIleTyrLysAlaMetSerGluPheAspIlePheIleAsnTyrIleGluAlaTyrMetThrMetLysIleArgAsn和ThrAspGlnCysAspAsnPheProGlnMetLeuArgAspLeuArgAspAlaPheSerArgValLysThrPhePheGlnThrLysAspGluValAspAsnLeuLeuLeuLysGluSerLeuLeuGluAspPheLysGlyTyrLeuGlyCysGlnAlaLeuSerGluMetIleGlnPheTyrLeuGluGluValMetProGlnAlaGluAsnGlnAspProGluAlaLysAspHisValAsnSerLeuGlyGluAsnLeuLysThrLeuArgLeuArgLeuArgArgCysHisArgPheLeuProCysGluAsnLysSerLysAlaValGluGlnIleLysAsnAlaPheAsnLysLeuGlnGluLysGlyIleTyrLysAlaMetSerGluPheAspIlePheIleAsnTyrIleGluAlaTyrMetThrIleLysAlaArg.


圖1是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)IL-10時(shí)使用的載體pcD(SRα)的簡(jiǎn)圖。
圖2是在細(xì)菌中表達(dá)IL-10時(shí)使用的載體TRP-C11的簡(jiǎn)圖。
圖3顯示攜帶有插入至其XhoI限制性位點(diǎn)的鼠IL-10，病毒IL-10，或人IL-10的開放閱讀框架(ORF)的pGSRG質(zhì)粒;還顯示了最終構(gòu)建體(稱為TAC-RBS)中RBS-ATG-多聚接頭區(qū)域的序列。
本發(fā)明是針對(duì)利用IL-10改善處于炎性狀態(tài)或患炎癥的患者中IL-10的毒性作用的方法。為了實(shí)施該方法本發(fā)明包括含有IL-10的藥物組合物。用于本發(fā)明中的IL-10選自于由pH5C，pH15C和pBCRF1(SRα)中的cDNA插入物定義的開放閱讀框架編碼的一組成熟多肽，相應(yīng)的質(zhì)粒已寄存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，Maryland，其保藏號(hào)分別為No.68191，68192和68193。
Ⅰ.白細(xì)胞介素-10的分析IL-10s具有幾種作為分析的依據(jù)和構(gòu)成單位的生物學(xué)活性。具體的是，IL-10s具有抑制由IFN-r，淋巴毒素，IL-2，IL-3構(gòu)成的組中至少一種細(xì)胞激活素以及T輔助細(xì)胞群中GM-CSF的合成的特性，其中的GM-CSF通過與同基因抗原遞呈細(xì)胞(APCs)和抗原接觸后，誘導(dǎo)一種或多種上述細(xì)胞激活素的合成。在該活性中，處理APCs，使之不能復(fù)制但其加工抗原的結(jié)構(gòu)仍能維持其功能。在與T細(xì)胞混合前，例如用約1500-3000R(γ或X-射線)輻射APCs便能簡(jiǎn)便地完成這一過程。
另外，在一級(jí)或，更好的是二級(jí)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中可檢測(cè)對(duì)細(xì)胞激活素的抑制作用，在這種情況下，不需要使用同基因的APCs。MLRs是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，例如，Bradley，162-166頁(yè)，Mishell等人，“SeleetedMethodsinCellularImmunology”(Freeman，SanFrancisco，1980);以及Battisto等人，Meth.inEnzymol.Vol.150，83-91頁(yè)(1987)。簡(jiǎn)單地說，將兩種類群的異基因淋巴樣細(xì)胞混合，其中的一個(gè)類群已在混合前進(jìn)行處理如通過輻射，以阻止其增殖。優(yōu)選的是，在增補(bǔ)培養(yǎng)基如補(bǔ)充了10%胎牛血清的RPMI1640中以約2×106細(xì)胞/毫升的濃度制備兩個(gè)細(xì)胞群。為了進(jìn)行對(duì)照和測(cè)試培養(yǎng)物，分析時(shí)，各將0.5ml的每一類群混合用于檢測(cè)。對(duì)于第二級(jí)MLR，用新鮮制備的，經(jīng)輻射的刺激器細(xì)胞再刺激在一級(jí)MLR中維持了7天的細(xì)胞。含有IL-10的樣品可以在混合的同時(shí)加入到測(cè)試培養(yǎng)物中，在混合后1-3天可檢測(cè)對(duì)照以及測(cè)試培養(yǎng)物中產(chǎn)生的細(xì)胞激活素。
利用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的技術(shù)獲得進(jìn)行IL-10分析的T細(xì)胞群和/或APC群，該方法在Disabato et al.，eds.，Meth.in Enzymol.，Vol.108(1984)中進(jìn)行了詳細(xì)描述。用于更好的IL-10分析的APCs是外周血單核白細(xì)胞。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以獲得這些細(xì)胞，例如由Boyum，Meth.in Enzymol.，Vol.108，88-102頁(yè)(1984);Mage，Meth.in Enzymol.，Vol.108，118-132頁(yè)(1984);Litvin et al.，Meth.in Enzgmol.，Vol.108，298-302頁(yè)(1984);Stevenson，Meth.in Enzymol.，Vol.108，242-249頁(yè)(1989);和Romain et al.，Meth.in Enzymol.，Vol.108，148-153頁(yè)(1984)描述，這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。較好的是，在IL-10檢測(cè)中使用輔助T細(xì)胞，這些細(xì)胞可由下列方法獲得，首先從外周血中分離淋巴細(xì)胞，然后利用一個(gè)通過商業(yè)途徑獲得的抗-CO4抗體，例如可從美國(guó)專利4，381，295中描述和從Ortho Pharmaceutical公司獲得的OKT4，通過例如掃描或流動(dòng)細(xì)胞檢測(cè)儀篩選輔助細(xì)胞。必要的技術(shù)已由Boyum在Scand.J.Clin.Lab.Invest.，Vol.21(增刊，97)，<p>聚(丁烯-4，4-二膦酸)鈉，其具有下列重復(fù)組成單位
聚(烯丙基雙膦酸乙基胺)，其具有下列重復(fù)組成單位
歐洲專利申請(qǐng)0321233中描述的其它膦酸聚合物，例如聚(烯丙基膦酰乙酯)，膦酸化異丁烯酸酯等以及成對(duì)的雙膦酸化聚合物均可作為AEA在此應(yīng)用，當(dāng)然，只要它們含有或通過修飾后含有上述的有機(jī)保留增強(qiáng)基團(tuán)。
基于本發(fā)明的一個(gè)方面，口用復(fù)方含有一種口用上可接受的賦形劑和一種有效劑量的實(shí)質(zhì)上水不溶性非陽(yáng)離子抗菌劑，以及具有平均分子量約為1，000～1，000，000的抗菌增強(qiáng)劑，并至少含有一個(gè)釋放增強(qiáng)基團(tuán)及一個(gè)有機(jī)保留增加基團(tuán)，該藥劑含有上述基團(tuán)，而這些基團(tuán)不含有或?qū)嵸|(zhì)上不含有水溶性合成陰離子線性聚合物，聚羧酸堿金屬鹽或銨鹽，這些鹽類的分子量約為1，000～1，000，000。
通過mRNA分析也可以測(cè)定細(xì)胞激活素的產(chǎn)生。利用如由White等人，J.Biol.Chem.，Vol.257，8569-8572頁(yè)(1982)，和Gillespie等人，U.S專利4，483，920描述的細(xì)胞質(zhì)點(diǎn)雜交法可檢測(cè)細(xì)胞激活素mRNAs。由此，這些文獻(xiàn)作為本文的參考文獻(xiàn)。其他方法包括利用純RNA的點(diǎn)吸印法，例如Chapter6，在Hames等人編著的，NucleicAcidHybridizationAPracticalApproach(IRLPress，Washington，D.C.，1985)。
將需要檢測(cè)IL-10活性的幾個(gè)樣品進(jìn)行預(yù)處理，以去除可能會(huì)干擾檢測(cè)的已預(yù)先測(cè)定的細(xì)胞激活素。例如，IL-2在某些細(xì)胞中增加IFN-γ的產(chǎn)生。因此基于該分析中使用的輔助T細(xì)胞，必須從測(cè)試樣品中除去IL-2。通過將樣品通過標(biāo)準(zhǔn)的抗細(xì)胞激活素親和柱可以很方便地完成該“去除”過程。
IL-10活性單位可用各種方法定義。優(yōu)選的是，基于IL-10具有在植物血球凝集素刺激的外周血球單核細(xì)胞中抑制IFN-γ產(chǎn)生的能力定義的單位。通常采用免疫測(cè)量法檢測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)物的IFN-γ水平。也可以根據(jù)IL-10′s增加IL-4誘導(dǎo)的MC/9細(xì)胞的增殖的能力而定義IL-10活性單位，MC/9細(xì)胞在美國(guó)專利4，559，310中描述并且可從ATCC獲得，寄存號(hào)為CRL9306。1單位/毫升的定義是在下列分析中高于IL-4水平時(shí)產(chǎn)生MC/9增殖的50%最大刺激時(shí)需要的IL-10的濃度。在標(biāo)準(zhǔn)微滴板上在每孔的50μl培養(yǎng)基中制備IL-4和IL-10的二倍或三倍稀釋液。培養(yǎng)基由RPMI1640，10%胎牛血清，50mM 2-巰基乙醇，2mM谷氨酰胺，青霉素(100U/L)和鏈霉素(100μg/L)組成。加入IL-4，即將25μl/孔的1600U/ml(終濃度為400U/ml)稀釋于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，例如20-24小時(shí)。以0.5-1.0μCi/孔濃度加入3H-胸腺嘧啶(例如50μCi/ml溶于培養(yǎng)基)，再將細(xì)胞培養(yǎng)過夜，其后收集細(xì)胞，檢測(cè)摻入的放射性活性。
Ⅱ.純化和藥物組合物當(dāng)本發(fā)明的多肽以可溶性形式表達(dá)時(shí)，例如作為酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一種分泌產(chǎn)物，可按照本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法純化該產(chǎn)物，包括以下步驟硫酸銨沉淀，離子交換層析，凝膠過濾，電泳，親和層析和/或其他;例如，“EnzymePurificationandRelatedTechniques，“MethodsinEnzymology，22233-577(1977);andScopes，R.，ProteinPurificationPrinciplesandPractice(Springer-Verlag，NewYork，1982)可作為這些純化方法的參考。另外如果本發(fā)明的多肽以非可溶性形式表達(dá)，例如以聚集體，內(nèi)含體等形式，則也可用本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法純化這些產(chǎn)物，包括通過離心從破碎的宿主細(xì)胞中分離內(nèi)含體，用離液序列高的和還原劑溶解內(nèi)含體，稀釋該溶解混合物，并且降低離液序列高的試劑和還原性試劑的濃度以便該多肽能形成生物學(xué)活性構(gòu)型。后一方案在下列文獻(xiàn)中被描述，本文參考地結(jié)合該文獻(xiàn)Winkler等人，“Biochemistry”，254041-4045(1986);Winkler等人，“Biotechnology”，3992-998(1985);Koths等人，美國(guó)專利4，569，790;以及歐洲專利申請(qǐng)86306917.5和86306353.3。
本文中使用的“有效量”是指足以降低或阻止發(fā)炎的量。對(duì)于具體的患者該有效量是依據(jù)如發(fā)炎的狀態(tài)，類型和程度，患者的總體健康，施藥方法，副作用的嚴(yán)重性等等因子而變化。一般，IL-10以含有有效量的IL-10和藥用載體的藥物組合物形式給藥。藥用載體可以是適用于將本發(fā)明的組合物釋放給患者的相容性的無(wú)毒性物質(zhì)。一般來說，這些藥物的適用于非腸道給藥的組合物也是已知的，例如，Remington′sPharmaceuticalScience，15thEd.(MackPublishingCompany，Easton，PA1980)。另外，通過可植入的或可注射的藥物釋放系統(tǒng)可以將本發(fā)明的組合物引入患者體內(nèi)，例如，Urquhartetal.，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，Vol.24，199-236頁(yè)(1984);Lewis，ed.ContvolledReleaseofPesticidesandPharmaceuticals(PlenumPress，NewYork，1981);美國(guó)專利3，773，919;美國(guó)專利3，270，960等等。
當(dāng)以非腸道給藥時(shí)，IL-10以單位劑量可注射形式(例如，溶液，懸浮液或乳液)與一種藥用載體相結(jié)合配制。這些載體的例子有正常的鹽水，林格氏液，葡萄糖溶液，和Hank′s溶液。也可以用如不易揮發(fā)的油和乙基油酸鹽這樣的非水溶性載體。一種優(yōu)選的載體是5%葡萄糖/鹽水。該載體可以含有最少量的添加物，如增加等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，例如，緩沖劑和防腐劑。用基本上不含聚合體的純化形式和濃度為約5-20μg/ml范圍的其他蛋白質(zhì)配制IL-10較好。優(yōu)選的是，以連續(xù)灌輸形式施用IL-10，以便每天釋放約50-800μg范圍的量(即約1-16μg/Kg/天)。每天的灌注速率依據(jù)對(duì)副作用檢測(cè)和血細(xì)胞數(shù)而變化。
實(shí)施例下面的實(shí)施例用于說明本發(fā)明。所選擇的載體和宿主，試劑的濃度，溫度，以及各種變量的值僅是為了舉例說明本發(fā)明的應(yīng)用，而不能認(rèn)為是其限制。
實(shí)施例1細(xì)菌宿主中人CSIF的表達(dá)從多步的化學(xué)方法合成的雙鏈DNA片段裝配合成的人CSIF基因，從而形成一種命名為TAC-RBS-hCSIF的表達(dá)載體。在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌系統(tǒng)，例如E.coliK-12菌株JM101，JM103等等(由Viera和Messing，在Gene，Vol.19，pgs.259-268(1982)中描述)中完成克隆和表達(dá)。用標(biāo)準(zhǔn)方案例如，Maniatisetal.，MolecularCloningALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1982)完成限制性核酸內(nèi)切酶消化和連接酶反應(yīng)。
對(duì)于小批量質(zhì)粒制備可用堿性方法(Maniatisetal.，上文所述)。對(duì)于大批量質(zhì)粒的制備可以用一種修改的堿性方法，其中用等量的異丙醇從澄清裂解液中沉淀核酸。在進(jìn)行氯化銫平衡密度離心前用冷2.5M乙酸銨進(jìn)行沉淀以去除RNA，并用溴化乙錠檢測(cè)。
為了進(jìn)行濾紙雜交，用Whatman 540過濾循環(huán)儀以選出克隆，然后裂解這些克隆，并通過用0.5M NaOH，1.5M NaCl;1M Tris-HCl pH8.0，1.5M NaCl連續(xù)處理(每次2分鐘)并在80℃加熱(30分鐘)而進(jìn)行固定。利用32P-標(biāo)記的(激酶處理)合成DNAs在6×SSPE，20%甲胺，0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，100mg/ml E.coli tRNA，100mg/ml考馬斯亮藍(lán)G-250(Bio-Rad)中42℃雜交6小時(shí)。(通過在800ml水中溶解174克NaCl，27.6克NaH2PO4.9H2O，以及7.4克EDTA而制備20×SSPE，用NaOH將PH調(diào)至7.4，體積調(diào)至1升，并將整個(gè)溶液用高壓蒸汽消毒鍋進(jìn)行滅菌)。將濾紙用1×SSPE，0.1%SDS洗滌兩次(15分鐘，室溫)。在進(jìn)行放射自顯影(Fuji RX膠片)照相后，用在濾紙上已染成藍(lán)色的菌落與重新生成的菌落相對(duì)照而確定陽(yáng)性菌落的位置。用Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.74，pg.5463(1977)的二脫氧方法對(duì)DNA測(cè)序。二脫氧反應(yīng)的模板是再克隆至M13mp載體中的相關(guān)區(qū)域的單鏈DNAs(例如，Messing et al.Nucleic Acids Res.，Vol.9，pg.309(1981))或者是由下列方法制備的雙鏈DNA;即用微堿性方法制備，并用0.2M NaOH變性(5分鐘，室溫)以及通過加入2倍體積乙醇從0.2M NaOH，1.43M乙酸銨沉淀得到DNA。利用應(yīng)用生物系統(tǒng)380A(AppliedBiosystcms380A)合成儀，借助于氨基磷酸酯化學(xué)過程合成DNA。按照380A合成儀指南中描述的方法進(jìn)行合成，去保護(hù)，切割和純化(7M脲PAGE，洗脫，DEAE-纖維層析)。
在50ml反應(yīng)體積中，將要克隆的合成DNAs的互補(bǔ)鏈(各400ng)混合并用多聚核苷酸激酶磷酸化。將該DNA與已用合適的限制性酶消化的1mg載體DNA相連接，在室溫下50ml體積中連接反應(yīng)進(jìn)行4-12小時(shí)。磷酸化作用，限制性酶消化，聚合酶反應(yīng)，以及連接反應(yīng)已在現(xiàn)有技術(shù)中描述(Maniatis et al.，上文所述)。通過在補(bǔ)充了氨芐青霉素，異丙基-1-硫-β-半乳糖苷(IPTG)(0.4mM)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷(X-gal)(40mg/ml)的L瓊脂上平板培養(yǎng)而篩選出LacZ+菌落(如果需要)。
通過用DNA聚合酶填充含有tacP的質(zhì)粒pDR540(Pharmacia)的單BamHI位點(diǎn)而構(gòu)建TAC-RBS載體。然后將其連接至未磷酸化的合成寡聚核苷酸(Pharmacia)上，這些寡聚核苷酸形成編碼一個(gè)同感核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS，GTAAGGAGGTTTAAC)的雙鏈片段。在連接反應(yīng)后，將該混合物磷酸化并用SstI接頭ATGAGCTCAT再次連接。然后用SstI和EcoI切割該復(fù)合物，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離出173堿基對(duì)(bp)片段，將該片段克隆至已用EcoRI-SstI限制性切割的pUC19(Pharmacia)上(如下文中描述)。最終構(gòu)建體(稱為TAC-RBS)中的RBS-ATG-多聚接頭區(qū)域的序列顯示于圖3中。
用8個(gè)步驟將合成IL-10基因裝配到pUC19中。在每一步驟中，在通過將pUC19的LacZ(α)基因保持于步驟1中插入的ATG起始密碼子框架中而進(jìn)行克隆后，檢測(cè)沒有缺失和/或插入的插入物片段。通過在含有X-gal和IPTG的L-氨芐青霉素平板上篩選藍(lán)菌落而過濾出含有缺失和/或插入的菌落。或者，在小規(guī)模質(zhì)粒DNA制備時(shí)在各步驟中利用通用的測(cè)序引物，例如從BoehringerMannheim獲得很容易地確征插入物的序列。
在步驟1中，用SstI消化TAC-RBS載體，用T4DNA聚合酶(其3′-內(nèi)核酸酶活性消化SstI裂解產(chǎn)生的3′-突出鏈從而形成平齊末端片段)處理，并在T4DNA聚合酶失活后，用EcoRI處理以形成含有TAC-RBS區(qū)域并且在ATG起始密碼子處具有平齊末端，在相反的另一末端有EcoRI裂解端的173bp堿基，最后，分離該173bpTAC-RBS片段。
在步驟2中，將步驟1中分離到的TAC-RBC片段與EcoRI/KpnI消化的pUC19質(zhì)粒以及合成的1A/B片段相混合，如下文所示，該1A/B片段在其上游末端有平齊末端并且在其下游末端有相應(yīng)于KpnI切割端的粘性末端。將該KpnI末端連接至并位于BstEⅡ位點(diǎn)的下游。連接這些片段以形成步驟2中的pUC19。
在步驟3中，將合成片段2A/B和3A/B(顯示于下文)與BstEⅡ/SmaⅠ消化的步驟2中的pUC19(在擴(kuò)增和純化后)混合并連接形成步驟3中的pUC19。應(yīng)注意，3A/B片段的下游末端含有形成SmaI平齊末端的額外堿基。在步驟4中切割這些額外堿基。所以2A/B和3A/B片段具有互補(bǔ)的9殘基單鏈末端，將它們?cè)诨旌蠒r(shí)退火，留下2A/B的上游BstEⅡ切割端以及3A/B的下游平齊端，并連接至pUC19中。
在步驟4中，用AflⅡ/XbaⅠ消化步驟3中的pUC19，擴(kuò)增，純化，再純化，與合成4A/B片段(顯示于下文)混合，并連接形成步驟4的pUC19。
在步驟5中，用XbaⅠ/SalⅠ消化步驟4的pUC19，擴(kuò)增和純化，與合成的5A/B片段(顯示于下文)混合，并且連接形成步驟5的pUC19。注意在步驟6中，5A/B片段的SalⅠ粘性末端用HpaⅠ消化除去。
在步驟6中，用HpaⅠ/PstⅠ消化步驟5的pUC19，擴(kuò)增并純化，與合成片段6A/B(顯示于下文)混合并連接以形成步驟6的pUC19。
在步驟7中，用ClaⅠ/SphⅠ消化步驟6的pUC19，擴(kuò)增并純化，與合成片段7A/B(顯示于下文)混合并連接以形成步驟7的pUC19。
在步驟8中，用MluⅠ/HindⅢ消化步驟7的pUC19，產(chǎn)擴(kuò)增和純化，與合成片段8A/B和9A/B混合并連接以形成最后構(gòu)建體。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將該最后構(gòu)建體插入至大腸桿菌K-12菌株JM101，例如可從ATCC獲得，其寄存號(hào)為33876。在培養(yǎng)后，從JM101細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，并檢測(cè)提取物稀釋的生物學(xué)活性。
AGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGG-TCGGGTCCGGTCCCGTGGGTCAGACTCTTGTCGACGTGGGTGAAGGGTCC-tAACCggtacaTTGGc片段1A/B
GtAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTG-GACGGATTGTACGAAGCTCTAGAGGCTCTACGGAAGTCGTCTCAC-AAGACTTTCTTTTTC片段2A/BCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTcTtAAGTGAAAGAAAGTTTACTTCCTAGTCGACCTGTTGAACAAgAaTTC片段3A/BGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTC-CTCAGGAACGACCTCCTGAAATTCCCAATGGACCCAACGGTTCGGAACAG-TGAGATGATCCAGTTTTAtACTCTACTAGGTCAAAATaGAtC片段4A/BCTaGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGC-GAtCTCCTCCACTACGGGGTTCGACTCTTGGTTCTGGGTCTGTAGTTCCG-GCATGTtAACgCGTACAaTTGcagct片段5A/BAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTG-TTGAGGGACCCCCTCTTGGACTTCTGGGAGTCCGACTCCGATGCCGCGAC-TCATCGATctgcaAGTAGCTAg片段6A/BCGATTTCTTCCCTGTCAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAA-TAAAGAAGGGACAGTTTTGTTCTCGTTCCGGCACCTCGTCCACTTCTT-cGCgTgcatggCGcAc片段7A/BCGCGTTTAATAATAAGCTCCAAGACAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTG-AAATTATTATTCGAGGTTCTGTTTCCGTAGATGTTTCGGTACTCA-AGTTTGAC片段8A/B
ATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGA-CTCAAACTGTAGAAGTAGTTGATGTATCTTCGGATGTACTGTTACTTCT-TACGAAACTGAATGCTTTGACTtcga片段9A/B(小寫字母指出該堿基不同于天然序列中同樣位點(diǎn)處的堿基)實(shí)施例2在COS7猴細(xì)胞中表達(dá)vIL-10利用允許經(jīng)擴(kuò)增的片段后插入到EcoRⅠ消化的pCD-(CRα)載體(圖1)中的引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增編碼vIL-10開放閱讀框架的基因。該插入片段的編碼鏈顯示如下(該開放閱讀框架以大寫字母給出)aattcATGGAGCGAAGGTTAGTGGTCACTCTGCAGTGCCTGGTG44CTGCTTTACCTGGCACCTGAGTGTGGAGGTACAGACCAATGT86GACAATTTTCCCCAAATGTTGAGGGACCTAAGAGATGCCTTC128AGTCGTGTTAAAACCTTTTTCCAGACAAAGGACGAGGTAGAT170AACCTTTTGCTCAAGGAGTCTCTGCTAGAGGACTTTAAGGGC212TACCTTGGATGCCAGGCCCTGTCAGAAATGATCCAATTCTAC254CTGGAGGAAGTCATGCCACAGGCTGAAAACCAGGACCCGGAG296GCTAAGGACCATGTCAATTCTTTGGGTGAAAATCTAAAGACC338CTACGGCTCCGCCTGCGCAGGTTCCACAGGTTCCTGCCGTGT380GAGAACAAGAGTAAAGCTGTGGAACAGATAAAAAATGCCTTT422AACAAGCTGCAGGAAAAAGGAATTTACAAAGCCATGAGTGAA464TTTGACATTTTTATTAACTACATAGAAGCATACATGACAATT506AAAGCCAGGTGAg519通過表達(dá)vIL-10和/或限制消化產(chǎn)物的電泳圖譜可以鑒別以正確方向攜帶該插入物的克隆。攜帶有vIL-10基因的這樣一種載體命名為pBCRF1(SRα)并寄存于ATCC，其寄存號(hào)為68193。在E.coliMC1061中擴(kuò)增pBCRF1(SRα)，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離，并按如下步驟用于轉(zhuǎn)染COS7猴細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天，將約1.5×108COS7猴細(xì)胞接種于含有Dulbecco改變的Eagle培養(yǎng)基(DME)的單獨(dú)的100mm平板上，該培養(yǎng)基含有5%胎牛血清(FCS)和2mM谷氨酰胺。為了完成轉(zhuǎn)染，通過用胰蛋白胨培養(yǎng)，用無(wú)血清DME洗滌2次而從培養(yǎng)皿中移走COS7細(xì)胞，并懸浮于無(wú)血清DME中，濃度為107個(gè)細(xì)胞/ml。將0.75ml試樣與20μgDNA混合并轉(zhuǎn)染至滅菌的0.4cm電擊穿小試管中。在10分鐘后，將細(xì)胞在Biorad Gene Pulser裝置中以200伏，960μF進(jìn)行脈沖。再經(jīng)10分鐘后，從小試管中移出細(xì)胞，將其加至含有5%FCS，2mM谷氨酰胺，青霉素，鏈霉素和慶大霉素的20mlDME中。將該混合物等分至四個(gè)100mm組織培養(yǎng)皿中。在37℃，5%CO2中培養(yǎng)12-24小時(shí)后，用類似的僅含1%FCS的培養(yǎng)基代替前面的培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2中繼續(xù)培養(yǎng)另外72小時(shí)，其后，收集培養(yǎng)液，分析其抑制IFN-γ合成的能力。
將10ml新鮮分離的PBLs等分試樣(約2×108個(gè)細(xì)胞/ml)與PHA(100ng/ml)一起于37℃在由(ⅰ)補(bǔ)充了5%FCS和2mM谷氨酰胺的90%DME和(ⅱ)從前面用pBCRF1(SRα)轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞得到的10%上清液組成的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。24小時(shí)后，收集細(xì)胞和上清液，分別檢測(cè)IFN-γmRNA或IFN-γ蛋白質(zhì)的存在。對(duì)照也進(jìn)行相同處理，不同的是10%上清液來自于先前用攜帶不相關(guān)cDNA插入物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS7培養(yǎng)物。相對(duì)于對(duì)照而言，vIL-10處理的樣品對(duì)IFN-γ的合成具有約50%的抑制。
實(shí)施例3在E.coli中表達(dá)vIL-10編碼下列成熟vIL-10的基因在大腸桿菌中表達(dá)。
ThrAspGlnCysAspAsnPheProGlnMetLeuArgAspLeuArgAspAlaPheSerArgValLysThrPhePheGlnThrLysAspGluValAspAsnLeuLeuLeuLysGluSerLeuLeuGluAspPheLysGlyTyrLeuGlyCysGlnAlaLeuSerGluMetIleGlnPheTyrLeuGluGluValMetProGlnAlaGluAsnGlnAspProGluAlaLysAspHisValAsnSerLeuGlyGluAsnLeuLysThrLeuArgLeuArgLeuArgArgCysHisArgPheLeuProCysGluAsnLysSerLysAlaValGluGlnIleLysAsnAlaPheAsnLysLeuGlnGluLysGlyIleTyrLysAlaMetSerGluPheAspIlePheIleAsnTyrIleGluAlaTyrMetThrIleLysAlaArg.
將pBCRF1(SRα)的cDNA插入物再克隆至M13質(zhì)粒中，通過位點(diǎn)特異性誘變將該cDNA改變兩次首先在成熟vIL-10多肽編碼區(qū)的5′-末端形成一個(gè)ClaⅠ位點(diǎn)，其次，在成熟vIL-10多肽的編碼區(qū)3′-末端形成一個(gè)BamHⅠ位點(diǎn)。經(jīng)過突變的序列很容易插入至下文中描述的TRPC11表達(dá)載體。
通過將一個(gè)合成的同感RBS片段與ClaⅠ接頭(ATGCAT)連接以及將得到的片段克隆至ClaⅠ限制的pMT11hc(在前面已將該質(zhì)粒修飾使之含有ClaⅠ位點(diǎn))而構(gòu)建得TRPC11載體。pMT11hc是一種小型(2.3Kb)高拷貝的pBR322的AMPR，TETS衍生物，它含有πVX質(zhì)粒的EcoRⅠ-HindⅢ多接頭區(qū)域(πVX由Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)。通過用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性切割，用ClaⅠ接頭(CATCGATG)填平得到的粘性末端異連接，從而重新獲得EcoRⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)并用ClaⅠ位點(diǎn)代替SmaⅠ位點(diǎn)，由此修飾了pMT11hc質(zhì)粒使之含有ClaⅠ位點(diǎn)。來自TRPC11構(gòu)建體的一個(gè)轉(zhuǎn)化體具有側(cè)面為ClaⅠ位點(diǎn)的串聯(lián)PBS序列。通過用PstⅠ消化該質(zhì)粒，用Bal31核酸酶處理，用EcoRⅠ限制性切割并在所有四種三磷酸脫氧核苷酸存在下用T4DNA聚合酶處理從而移去一個(gè)ClaⅠ位點(diǎn)和RBS序列的第二拷貝的部分序列。通過PAGE重新獲得得到的30-40bp片段并將其克隆至SmaⅠ限制性切割的pUC12中。然后將來源于pKC101(由Nichols et al.，在Methods in Enzymology，Vol.101，pg.155中描述(Academic Pness，N.Y.1983)的248bp的攜帶E.coli trpP的EcoRⅠ片段克隆至EcoRⅠ位點(diǎn)以得到整個(gè)TRPC11構(gòu)建體，顯示于圖2中。通過首先用ClaⅠ和BamHⅠ消化TRPC11，純化消化產(chǎn)物，然后在標(biāo)準(zhǔn)連接溶液中將它與含有編碼成熟BCRF1的核苷酸序列的M13的ClaⅠ-BamHⅠ片段相混合從而將TRPC11用作為vIL-10的載體。含有該插入物的TRPC11稱作為TRPC11-BCRF1，將它在E.coliK12JM101菌株中繁殖，例如，該菌株可從ATCC獲得，其保藏號(hào)為33876。
實(shí)施例4由IL-10誘導(dǎo)的IL-1受體拮抗劑利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如Figdoretal.，Blood，Vol.60，pg.46(1982);Figdoretal.，J.Immunol.Meth.，Vol.68，pg.73(1984)從500ml正常供血者的血中分離人外周血單核細(xì)胞。簡(jiǎn)單地說，通過在血成份分離器中密度離心而分離單核細(xì)胞，接著通過離心淘選將其分餾成淋巴細(xì)胞和單核白細(xì)胞。通過非特異性酯酶染色而判斷的單核白細(xì)胞制劑純度大于95%并且含有98%以上的活細(xì)胞。在Yssel′s培養(yǎng)基(Yssel et al.，Immunol.Meth.，Vol.72，pg.219)培養(yǎng)單核白細(xì)胞，該培養(yǎng)基含有補(bǔ)充了1%貯存的熱失活的人AB+血清的人血清白蛋白(HSA)。利用Limulus amebocyte裂解液分析測(cè)定該培養(yǎng)液不含內(nèi)毒素(內(nèi)毒素含量＜0.2ng/ml)。在‘Teflon’袋(Jansen MNL，St.Niklaas，Belgium)中37℃以4×108個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)單核白細(xì)胞，該‘Teflon’袋阻止這些細(xì)胞吸附。為了檢測(cè)IL-1ra的誘導(dǎo)作用，通過與脂多糖(LPS，Difco Laboratories，Detroit，ML，E.coli 0127B8)(1μg/ml)接觸24小時(shí)而失活培養(yǎng)液中的單核白細(xì)胞。然后收集上清液，檢測(cè)產(chǎn)生的IL-1β和IL-1ra。用濃度為10μg/ml的單克隆抗體19F1中和IL-10。結(jié)果列于下表中。
表培養(yǎng)液狀況IL-1β(ng/mL)IL-1ra(ng/mL)僅培養(yǎng)基(對(duì)照)0.030.40LPS40.00102.50LPS+IL-10(100U/ml)8.75149.37LPS+IL-4(100U/ml)9.25100.00LPS+抗-IL-10Mab42.5060.87上面描述的本發(fā)明的實(shí)施例是為了說明和描述的目的。而不是指本發(fā)明的全部?jī)?nèi)容或?qū)⒈景l(fā)明限制至所公開的精確形式，并且根據(jù)上面的論述顯然可以進(jìn)行修改和變化。所選擇和描述的實(shí)施例僅是為了最好地解釋本發(fā)明的原理從而能使本領(lǐng)域內(nèi)的其他技術(shù)人員在各種具體方案以及適合于所需要的特定用途而進(jìn)行的各種修改方案中最好地使用本發(fā)明。直正的意圖是本發(fā)明的范圍由本文所附的權(quán)利要求定義。
在1989年12月20日，本申請(qǐng)人在美國(guó)典型培養(yǎng)物收集中心，Rockville，MD，USA(ATCC)寄存了攜帶pH5C，PH15C和pBCRF1(SRα)的各個(gè)E.coliMC1061培養(yǎng)物，其保藏號(hào)分別為No.68191，68192和68193。這些寄存物是按照ATCC的用于專利目的的培養(yǎng)物寄存物的協(xié)議提供的條件保藏的，該協(xié)議確保美國(guó)專利和商標(biāo)委員會(huì)依據(jù)35USC122和37CFR1.14獲得這些寄存物，并且根據(jù)美國(guó)公開原則公眾也可獲得這些寄存物，并且要求這些寄存物保持存活。這些寄存菌株的可用性不能解釋為在違背政府當(dāng)局按照其專利法授予的權(quán)力的情況下特權(quán)實(shí)施該發(fā)明。
已對(duì)寄存作為某些改進(jìn)使其滿足布達(dá)佩斯公約的要求。
權(quán)利要求
1.改良患者的炎性反應(yīng)的方法，該方法包括給患者施用有效量的白細(xì)胞介素-10的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的白細(xì)胞介素-10選自于由病毒白細(xì)胞介素-10和人白細(xì)胞介素-10構(gòu)成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的炎性狀態(tài)是敗血病休克或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中IL-10按基本上不含聚合體的純化形式以及濃度為5-20μg/ml范圍的其他蛋白質(zhì)一起配制。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中IL-10通過連續(xù)灌注方式給藥，以便每天釋放出1-16μg/Kg范圍的量。
全文摘要
本發(fā)明提供治療炎性癥狀的方法，包括給患者施用有效量的白細(xì)胞介素-10。
文檔編號(hào)A61K38/20GK1081378SQ93104408
公開日1994年2月2日 申請(qǐng)日期1993年3月19日 優(yōu)先權(quán)日1992年3月20日
發(fā)明者R·迪瓦爾馬力菲特, J·迪弗賴斯 申請(qǐng)人:先靈公司