專(zhuān)利名稱(chēng)：一種含有偽狂犬病病毒突變株的疫苗的制作方法
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本發(fā)明涉及偽狂犬病病毒(pseudorabiesvirus-PRE)條件性致死突變株。PRV又稱(chēng)Aujeszky氏病病毒(Aujeszky′sdiseasevirus-ADV)。PRV是一種高度親神經(jīng)性皰疹病毒，可使家養(yǎng)和野生動(dòng)物患偽狂犬病(參閱Mettenleiter，Comp.Immu.Microbiol.Infect.Dis.14.151-163;WittmannandRziha，in[G.Wittmanned.]HerpesvirusDiseasesofCattle，HorsesandPigs，Kluwer，Boston，230-325;PensaertandKluge，in[M.B.Pensaerted.]Virusinfectionsofporcines，ElsevienSciencePublishersB.V.，Amsterdam.39-64)。豬對(duì)PRV是相對(duì)地抵抗，因此認(rèn)為它是此病毒的自然宿主。病原自然入侵門(mén)戶(hù)是鼻咽部，病毒可在鼻咽部粘膜細(xì)胞中復(fù)制。病毒感染外周神經(jīng)后可轉(zhuǎn)移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，此時(shí)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腦炎，常常致死仔豬。成年豬感染后通?？梢源婊?，但有發(fā)熱及肺炎癥狀。感覺(jué)神經(jīng)節(jié)的感染通常導(dǎo)致潛伏狀態(tài)。
抗Aujeszky氏病免疫接種的應(yīng)用可以減少由于感染動(dòng)物死亡和生長(zhǎng)抑制所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。為此，用致弱活毒疫苗和滅活病毒疫苗進(jìn)行免疫接種是有效的。一般更愿意選擇致弱活毒疫苗，這是由于其容易生產(chǎn)，價(jià)格亦比滅活病毒疫苗便宜。此外，致弱病毒活疫苗可以經(jīng)鼻內(nèi)接種，較之使用致弱病毒活疫苗或是滅活病毒疫苗經(jīng)非消化道途經(jīng)免疫能產(chǎn)生更好的保護(hù)力。
早期疫苗所使用的致弱活病毒毒株是通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)物上連續(xù)傳代所獲得的，因而具有一些嚴(yán)重的缺陷，這些疫苗是不純的，其中混有不知毒力及免疫原性的變異株，另外這些疫苗還存在著毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)。近來(lái)隨著對(duì)病毒結(jié)構(gòu)及復(fù)制分子水平方面知識(shí)的增長(zhǎng)和精細(xì)的分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，使科學(xué)家能夠設(shè)計(jì)出致弱的疫苗而不僅是依機(jī)會(huì)來(lái)得到。通過(guò)病毒遺傳學(xué)及DNA序列分析，可以識(shí)別病毒基因組中的特殊區(qū)域，這些區(qū)域中的改變能導(dǎo)致病毒致病性的減弱。利用重組DNA技術(shù)可以使這些區(qū)域改變或缺失，以得到具有確切及穩(wěn)定改變的致弱病毒。Kit及其同事首先在PRV的致弱上成功地使用了這一方案(Am.J.Vet.Res.46，1359-1367)。PRV胸苷激酶(thymidine-kinase，TK)基因的滅活可導(dǎo)致此病毒對(duì)豬的毒力大大減低(EP-A-141.458)。除了TK基因的改變，在糖蛋白基因中，如gⅠ，gⅢ和gⅩ已被導(dǎo)入缺失(Kitetal.，Am.J.Vet.Res.48，780-793;Marchiolietal.，Am.J.Vet.Res.48，1577-1583;Quintetal.，J.Gen.Virol.68，523-534;Moormannetal.，J.Gen.Virol，71，1591-1595;WO-A-(102795)導(dǎo)致了病毒力進(jìn)一步減弱，并且能從血清學(xué)上分辨出免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物(Plattetal.，Vet.Microbiol.，11，25-40;VanOirschotetal.，J.Gen.Virol.67，1179-1182;VanOirschotetal.，J.Virol.Meth，22，191-206;Eloitetal.，Vet.Rec.128，91-94)。
疫苗研究的一個(gè)新方案是把活弱毒疫苗毒株作為載體(病毒疫苗載體)使外源病原基因得到表達(dá)?；钶d體病毒所表達(dá)的抗原類(lèi)似于自然感染后的表達(dá)，將會(huì)激發(fā)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。疫苗載體可能用于目前尚無(wú)合適的疫苗或不能夠安全地、便于生產(chǎn)疫苗的那些疾病的免疫接種。
疫苗載體的研究主要集中在痘苗病毒上(MossandFlexner，Ann.Rev.Immunol.5，305-324;PicciniandPaoletti，Adv.VirusRes，34，43-64)。痘苗病毒曾廣泛使用，根除了人類(lèi)天花，表現(xiàn)了很高的效力并相當(dāng)安全。疫苗病毒有著廣泛的突主范圍及容納大段外源DNA的能力，因而已被選作疫苗載體試驗(yàn)(Hruby，Clin.Microbiol，Rev.3，153-170;Tartagliaetal.，Crit.Rev.Immunol.10，13)。如痘苗病毒一樣，其他痘病毒如浣熊痘病毒、禽痘病毒、綿羊痘病毒和豬痘病毒也已作為疫苗載體進(jìn)行研究(Tayoretal.，Vaccine6，504-508;Lodmelletal.，J.Virol.65，3400-3405;Letellieretal.，Arch.Virol.118，43-56)。
其它被用作疫苗載體的病毒還有腺病毒(Berker，BioTechniques6，6003-6020)和皰疹病毒(Shihetal.，Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.81，5867-5870;Thomsenetal.，Gene57，261-265;Lowenetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，3896-3900;Coleetal.，J.Virol.64，4930-4938;vanZijletal.，J.Virol.65，2761-2765;Kitetal.，Vaccine9，564-572)。安全有效的皰疹病毒活疫苗的獲得及容納大片段外源DNA的能力，使這些病毒成為研究疫苗載體有吸收力的選擇對(duì)象，使用PRV作為疫苗載體是很有希望的。PRV已被很好地鑒定，通過(guò)定位缺失(targeteddeletions)已研究出安全有效的活疫苗(見(jiàn)上述參考文獻(xiàn))。該病毒有廣泛的宿主范圍，但對(duì)人類(lèi)無(wú)害。將PRV作為有效的載體近來(lái)已由VanZijletal驗(yàn)證(J.Virol.65，2761-2765，WO-A-(100352)。他們指出表達(dá)豬瘟病外膜糖蛋白E1的PRV重組體既可以抗偽狂犬病又可抗豬瘟(classicalswinefever-古典豬瘟)。
疫苗最重要的特征之一是其安全性。由于常規(guī)致弱后疫苗導(dǎo)致其表型改變的精確分子變化是未知的，因此其毒力仍經(jīng)常有機(jī)會(huì)返強(qiáng)，這一類(lèi)可以通過(guò)帶確切而穩(wěn)定缺失的重組疫苗加以解決。盡管并非不可能，但有時(shí)構(gòu)建穩(wěn)定的致弱疫苗是非常困難的。在此情況下，人們只能依靠使用滅活疫苗或使用安全的疫苗載體，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)刂苽渑c測(cè)試，活的致弱缺失疫苗和疫苗載體對(duì)免疫適格(immunocompetent，即在抗原性攻擊后能發(fā)生免疫應(yīng)答的能力)宿主通常是安全的，但對(duì)免疫致?lián)p害(immunocompromized)宿主則會(huì)引起嚴(yán)重的并發(fā)癥。因?yàn)橹氯趸钜呙绾鸵呙巛d體則能夠復(fù)制，它們會(huì)在環(huán)境中散播從而可能威脅到免疫致?lián)p害宿主。另外，對(duì)目標(biāo)種使用安全的疫苗而對(duì)其他種動(dòng)物可能仍具有毒力。
與疫苗載體整合的目標(biāo)基因通常編碼具有高度免疫原性的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白包括病毒糖蛋白、融合蛋白(fusionproteins)和血凝素-神經(jīng)氨酸苷酶(Hruby，Clin.Microbiol.Rev.3，153-171)。這些蛋白通常參與病毒-細(xì)胞相互作用，決定宿主-和/或細(xì)胞-病毒的趨向性。因此，由載體病毒表達(dá)的上述基因，在理論上可以改變它的生物特性，如致病性、組織趨向性和宿主特異性，因而通過(guò)同源重組，這些改變了的生物學(xué)特性可能會(huì)由致弱的載體病毒轉(zhuǎn)為有毒力的野生型病毒。
上述種種情況要求活疫苗和疫苗載體是自身限定的，例如接種痘苗者是不會(huì)將痘苗毒傳播的。理想的是，一種疫苗將產(chǎn)生非感染性的子代，而且與相應(yīng)的野生型病毒重組后不會(huì)產(chǎn)生感染性的病毒。以下我們將闡述滿(mǎn)足這些條件的一項(xiàng)發(fā)明。
本發(fā)明提供條件致死性偽狂犬病病毒(PRV)突變株，可用于免疫預(yù)防Aujeszky氏病，也可用作安全的載體疫苗。本發(fā)明的毒株不能夠表達(dá)gp50，這是一種病毒的外膜蛋白，是病毒感染性的必要條件。通過(guò)插入一段外源寡核苷酸，或者造成缺失，或是兩種均有(置換)的方法而使gp50基因滅活，尤其是插入一段含有在三個(gè)閱讀框架中均有翻譯終止密碼子的人工合成寡核苷酸，或者含有pg50基因和gp63基因部份的PRV基因組的部分缺失，而使gp50基因滅活。該變異病毒在一株可表達(dá)病毒gp50基因的互補(bǔ)細(xì)胞系(Complementingcellline)中生長(zhǎng)，用這些細(xì)胞產(chǎn)生的子代病毒粒子在表型上是完整的，它們擁有該互補(bǔ)細(xì)胞系提供的gp50。這些表型完整的突變株病毒粒子可以在體外或體內(nèi)感染細(xì)胞、能夠復(fù)制并通過(guò)細(xì)胞間而直接擴(kuò)散。但由感染細(xì)胞釋放的子代病毒粒子是非感染性的，因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙賕p50。又因?yàn)樗鼈儾荒荛_(kāi)始一個(gè)新的感染周期，這些病毒不能夠由免疫接種動(dòng)物傳播到非接種動(dòng)物。這一限定使得依賴(lài)于這些病毒的(載體)疫苗非常安全。
繼之，本發(fā)明還涉及為制備抵抗動(dòng)物疾病的疫苗或者抗偽狂犬病疫苗，或者采用把編碼其它相關(guān)病原的抗原或部分抗原核苷酸序列整合到上述突變株以制備抗其它動(dòng)物病的疫苗載體的偽狂犬病毒gp50突變株的使用。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及到控制動(dòng)物病的一種疫苗，這種疫苗是由含有糖蛋白gp50，并在gp50基因中有一個(gè)突變的偽狂犬病病毒所組成。疫苗如作為抵抗偽狂犬病，在此突變是缺失。如作為抵抗其它動(dòng)物疾病，同此突變是插入一個(gè)包含編碼由上述其它動(dòng)物疾病作為病原抗原或部分抗原的異源核苷酸序列。偽狂犬病病毒可能通過(guò)在其基因組中包括其它突變以改變其毒力，或表達(dá)其它蛋白，例如在gp63，gⅠ，gⅢ，gⅩ，11K，胸苷激酶(TK)，核糖核苷酸還原酶(RR)，蛋白激酶或28K基因中缺失或/和插入，特別是其gⅠ和gp63基因。
本發(fā)明涉及到PRVgp50突變株，以毒株R122，R332，D560和D1200作為范例(見(jiàn)

圖1)。毒株R122和R332不能表達(dá)有作用的gp50，而毒株D560和D1200不能表達(dá)有作用的gp50或有作用的gp63，因?yàn)間p50是病毒人侵的基本條件。這些突變體生長(zhǎng)在可表達(dá)gP50的互補(bǔ)細(xì)胞系中，盡管所有的毒株都可以在非互補(bǔ)的細(xì)胞系中完成一個(gè)完整的復(fù)制周期，但因?yàn)槿鄙賕p50，這些細(xì)胞釋放出來(lái)的子代病毒粒子是非感性的。觀(guān)察到gp50突變株在非互補(bǔ)細(xì)胞系中能產(chǎn)生蝕斑的結(jié)果，表明該病毒可以由感染細(xì)胞向非感染細(xì)胞傳播。
按照deWindetal描述的方法，將一為人工合成的具有序列5′-TAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3′(SEQIDNo1)的寡核苷酸插入質(zhì)粒pN3HB的pg50基因兩個(gè)不同位點(diǎn)上，。該寡核苷酸含有一個(gè)EcoRI限制性位點(diǎn)(GAATTC)和全部三個(gè)閱讀框架的翻譯終止密碼子(J.Virol.64，4691-4696)(見(jiàn)圖1)，從而獲得了PRVR122和R332毒株。質(zhì)粒pN3HB是由質(zhì)粒pR322克隆出的PRV的HindⅢ-B片段組成的(VanZijletal.，J.Virol.65，2761-2765)。于gp50基因核苷酸位點(diǎn)366-367，以及996-997之間插入了寡核苷酸所產(chǎn)生的質(zhì)粒分別被命名為R1和322。我們使用PRV毒株Rice的gp50核苷酸序列的序數(shù)(圖2，Petrovskisetal.，J.Virol.59，216-223)，應(yīng)該注意到，PRV毒株NIA-3與Rrice毒株的gp50基因核苷酸序列在優(yōu)點(diǎn)364不同(G→A)，致使NIA-3毒株的gp50基因上具有了一個(gè)BglⅡ限制性位點(diǎn)。
病毒基因組的構(gòu)建使用重疊重組(Overlaprecombination)(VanZijletal.，J.Virol.65，2761-2765)，使用了一個(gè)誘變處理的片段(R1或322)以及三個(gè)由粘粒(cosmid)重組子c-179，c-27和c-443得到的三個(gè)重疊的亞基因組野生型PRV片段，同時(shí)含有完整病毒基因組。重疊重組是在基本上表達(dá)gp50的互補(bǔ)細(xì)胞系(G5細(xì)胞系)中完成的(Peetersetal，J.Virol.66，894-905)，獲得的病毒分別被命名為R122和R332毒株。
為得到毒株D560，我們使用了質(zhì)粒322(見(jiàn)上)以及另一個(gè)被命名為149的質(zhì)粒pN3HB衍生物(deWindetal.，J.Virol.64，4691-4696，是在pN3HB的gp63基因的核苷酸352-353之間插入了寡核苷酸(序碼依照?qǐng)D5，Petrovskisetal.，J.Virol.60，185-193)(見(jiàn)圖1)。用質(zhì)粒322的BglⅡ-EcoRI片段置換質(zhì)粒149的BglⅡ-EcoRI片段，得到新質(zhì)粒的gp50基因996位點(diǎn)以及gp63基因353位點(diǎn)之間的核苷酸序列即被SEQIDNo1序列所替換，(例如誘變寡核苷酸序列)，這一質(zhì)粒與野生型重疊片段一同被用來(lái)在G5細(xì)胞中重疊重組成新病毒，該病毒株命名為D560。
為得到D1200毒株，用限制性酶BglⅡ和EcoRI消化質(zhì)粒149，所得到的大片段，在其末端經(jīng)E.coli DNA聚合酶I Klenow片段處理后，以T4DNA連接酶環(huán)化，所得質(zhì)粒的gp50基因336位點(diǎn)與gp63基因353位點(diǎn)之間的核苷酸序列被序列AATTCTAGCCTA(SEQ ID No 2;例如誘變寡核苷酸的殘端)置換，這個(gè)質(zhì)粒與重疊野生型片段一同被用來(lái)在G5細(xì)胞中重疊重組成新病毒，該病毒命名為D1200。
gp50突變株R122和R332，gp50+gp63突變株D5600和D1200能在非互補(bǔ)SK6細(xì)胞上產(chǎn)生蝕斑。R122株和R332株在SK6細(xì)胞中產(chǎn)生的蝕斑的大小與野生型親代毒株NIA-3相似，而D560和D1200毒株在SK6細(xì)胞上所產(chǎn)生的蝕斑則較小，這表明gp63參與了PRV的復(fù)制周期。
雖然細(xì)胞間的傳遞傳播并不依賴(lài)gp50，但是并不期望gp50突變株病毒在動(dòng)物體內(nèi)明顯的復(fù)制。病毒的毒力通常是在感染的初始位點(diǎn)上復(fù)制后，繼之子代病毒粒擴(kuò)散到身體其他部位，并通過(guò)多重感染循環(huán)而大量增殖。因?yàn)間p50突變株僅僅能夠在感染的初始位點(diǎn)上復(fù)制，我們期望這些突變株沒(méi)有毒力。此外，這些突變株是否具有免疫原性是有疑問(wèn)的，因?yàn)橐延凶C據(jù)表明gp50可以在豬體內(nèi)引起保護(hù)性免疫應(yīng)答，gp50本身是具有高度免疫原性的(Marchiolietal.，J.Virol.61，3977-3982;Mukamotoetal.，Vet.Microbiol.29，109-122;Riviereetal.，J.Virol.66，3424-3434。這樣，gp50的滅活將嚴(yán)重降低gp50和gp50+gp63突變株的免疫原性。同樣我們也不期望突變株病毒會(huì)到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因?yàn)檫@既包括了病毒由感染組織向外周神經(jīng)的傳遞及繼之而來(lái)的轉(zhuǎn)移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。若病毒的貫穿突觸(trans-synaptic)傳播包括了感染性子代病毒粒子對(duì)后突觸神經(jīng)元(post-synapticneurons)的再感染(Lyckeetal.，J.Gen.Virol.65，;Cardetal.，J.Neurosci.10，1974-1994)，突變株病毒向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移將在突觸被封鎖，這將阻止病毒進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而防止它對(duì)腦部的損害。
為測(cè)定gp50突變體病毒是否能夠在動(dòng)物組織中擴(kuò)散，我們?cè)谪i鼻粘膜分離塊中用免疫組化方法研究gp50突變株R122和R332及gp50+gp63突變株D560和D1200的復(fù)制;另外，皮下或腹腔接種小鼠，測(cè)試了病毒在體內(nèi)復(fù)制和傳播的能力，結(jié)果表明所有的突變株都能夠在豬鼻粘膜中復(fù)制。
使我們感到驚奇的是經(jīng)皮下或腹腔注射，證明gp50突變株和gp50+gp63突變株對(duì)小鼠是致命的。R122毒株的毒力(以感染動(dòng)物死亡的平均時(shí)間表示)與野生型毒株NIA-3相比僅有較少地減弱;但D560和D1200毒株的毒力大大減弱了，表明了gp63參與了對(duì)小鼠的毒性作用。對(duì)感染動(dòng)物死后檢查發(fā)現(xiàn)突變株能夠在腦部復(fù)制。腹腔接種動(dòng)物器官的免疫組化測(cè)定證明病毒優(yōu)先在外周神經(jīng)中復(fù)制。在非互補(bǔ)性細(xì)胞中生長(zhǎng)的毒株R122，因缺少gp50，通過(guò)腹腔途徑接種感染是不成功的。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明gp50對(duì)初始感染是必要的。表型完整的PRVgⅡ突變株(可產(chǎn)生非感染性子代，但在非互補(bǔ)性細(xì)胞系上不能產(chǎn)生蝕斑)對(duì)小鼠是完全無(wú)害的，這一結(jié)果證明初始感染之后，病毒成功的傳播依賴(lài)于細(xì)胞間的傳遞。由gp50或gp50+gp63突變株感染動(dòng)物體再也不能分離到感染性的病毒，這一結(jié)果說(shuō)明這些突變株在活動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的子代病毒粒子是非感染性的。
同時(shí)，這些結(jié)果也顯示出gp50對(duì)初始感染是必要的，而對(duì)病毒的后期復(fù)制和傳遞是不必要的，這說(shuō)明病毒在體內(nèi)主要傳播機(jī)制是直接地細(xì)胞到細(xì)胞傳遞，這進(jìn)一步說(shuō)明病毒的貫穿突觸轉(zhuǎn)移不依賴(lài)gp50，而且不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外病毒粒子引起的后突觸神經(jīng)元的再感染。由于從接種了gp50或gp50+gp63突變株動(dòng)物中不能夠分離到感染性病毒，表明由gp50突變體在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的子代病毒粒子是非感染性的。因此這些突變株的復(fù)制僅限于感染/免疫動(dòng)物體內(nèi)。以gp50突變株為基礎(chǔ)制備抗偽狂犬病疫苗或作為重組載體病毒以表達(dá)異源基因，將會(huì)成為非常安全的疫苗，因?yàn)榇艘呙鐑H在接種動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制，并不會(huì)傳播到包括其它種在內(nèi)的其它動(dòng)物中。進(jìn)而，如果異源基因插入到載體病毒的gp50基因上與野生型病毒形成的重組子將始終只能產(chǎn)生非感染性重組子。
用gp50突變株R122接種豬，以野生型強(qiáng)毒株NIA-3攻毒后，可以獲得完全保護(hù)而不出現(xiàn)狂犬病的臨床癥狀。用gp50+gp63突變株D560和D1200接種的豬在以NIA-3攻毒后，有短時(shí)間的發(fā)熱及生長(zhǎng)遲緩，但沒(méi)有神經(jīng)癥狀出現(xiàn)。這些結(jié)果表明只能夠通過(guò)細(xì)胞間傳遞而傳播的PRV突變株仍有高度的免疫原性。另外，這些結(jié)果最先表明，盡管gp50的表達(dá)是PRV最重要的免疫原性蛋白(見(jiàn)上)但對(duì)豬有效地抗偽狂犬病并不是必需的，這一結(jié)果出人意料。
依照本發(fā)明所制備的預(yù)防和控制偽狂犬病感染的疫苗，所含PRV的病毒外膜蛋白中有g(shù)p50和一個(gè)如上所述作為一種活性成分的滅活的gp50基因。此疫苗中還有一些常規(guī)成份，如一種合適的載體，合適的穩(wěn)定劑，佐劑，溶劑，乳化劑等。疫苗的使用可采取多種方法，如皮內(nèi)注射，皮下注射，肌肉注射，靜脈注射或鼻內(nèi)接種。優(yōu)選為鼻內(nèi)接種。此疫苗還可含有其它相應(yīng)疾病的免疫原，從而制成多價(jià)疫苗。
PRVgp50突變株用做病毒載體時(shí)，除了其本身gp50基因有一個(gè)突變處，優(yōu)選在其內(nèi)部還有一個(gè)插入，此插入的遺傳信息來(lái)自其它病原，可以是病毒，如豬瘟(hogcholera或swinefever)病毒，細(xì)小病毒，傳染性胃腸炎病毒，豬流行性流產(chǎn)及呼吸道綜合癥(PEARS，或神密豬病-mysteryswinediseaseMSD，PRRS或SIRS)，豬呼吸道冠狀毒(PRCV)，豬流行性腹瀉病毒和流感病毒;也可以是細(xì)菌，如多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)，支氣管炎博德氏菌(Bordetellabronchiseptica)，胸膜肺炎放線(xiàn)菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)，豬鏈球菌(Streptococcussuits)，豬痢疾密螺旋體(Treponemahyodysenteria)，大腸桿菌(Escherichiacoli)和鉤端螺旋體(Leptospira)以及支原體如肺炎支原體(M.hyopneumoniae)和鼻支原體(M.lyorhinis)。病原核苷酸序列克隆成為PRV基因組片段，以繼之整合到PRV的基因中，這一系列方法都早為已知的，VanZijletal已描述過(guò)一個(gè)實(shí)例，見(jiàn)J.Virol，62，2191-2195。
盡管PRVgp50突變株仍能通過(guò)細(xì)胞間傳遞而傳播，但單純皰疹病毒1型(HSV-1)和牛皰疹病毒1型(BHV-1)同源基因的突變株卻不能通過(guò)細(xì)胞間傳遞而傳播(LigasandJohnson，J.Virol.62，1486-1494;Fehleretal.，J.Virol.66，831-839)。這表明PRV的gp50與HSV-1的gD及BHV-1的gIV的功能在某些方面存在差異。使用一種與PRVgp50突變株的方法相似的，通過(guò)重組DNA技術(shù)，有可能用此方法修飾HSV-1，BHV-1和其它皰疹病毒，使其能夠通過(guò)細(xì)胞間傳遞而傳播，但不產(chǎn)生傳染性子代。以此途徑可以制成許多安全的皰疹病毒(載體)疫苗，用來(lái)預(yù)防或控制多種動(dòng)物及人類(lèi)疾病。
圖示說(shuō)明如下圖1部分PRV基因組的物理圖。箭頭指出早期終止密碼子的位置，它是由連接子插入誘變導(dǎo)致的，位于質(zhì)粒pN3HB以及相關(guān)的病變突變株R122，R332，M102和M105的gp50基因和gp63基因之間(Peetersetal.，J.Virol.66，894-905;deWindetal.，J.Virol.64，4691-4696)。水平橫線(xiàn)顯示的是突變株D560和D1200缺失的位置和寬度。上方的線(xiàn)顯示PRV的BstxI-StuI片段，此片段整合到G5細(xì)胞中并持續(xù)表達(dá)gp50(Peetersetal.，J.Virol.66，894-905)。
圖2包含有豬瘟病毒(hogcholeravirus)E1基因和人細(xì)胞肥大病毒(humancytomegalovirus)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的質(zhì)粒pEVhis13HCVE1，該質(zhì)粒用于包含異源基因的PRVgp50突變株的構(gòu)建(見(jiàn)實(shí)施例6)。
圖3包含有豬瘟病毒(hogcholeravirus)E1基因和人細(xì)胞肥大病毒(humancytomegalovirus)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的質(zhì)粒pBP53E1，其中PRV基因組的一部分在缺失的gp50基因的位置，該質(zhì)粒用于包含異源基因的PRVgp50突變株的構(gòu)建(見(jiàn)實(shí)施例6)。
實(shí)施例1PRV毒株NIA-3的gp50基因的克隆及表達(dá)gp50細(xì)胞系的構(gòu)建所有的重組DNA方法均以標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)完成(Maniatisetal.，Molecularcloningaloboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)。pEVhis14質(zhì)粒是來(lái)自pSV2his(Hartman&Mullingan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，8047-8051)后者的EcoRI-BamHI片段被含人細(xì)胞肥大病毒(hCMV)直接的早期增強(qiáng)子(immediateearlyenhancer)/啟動(dòng)子的片段所取代(Bernardetal.，EMBOJ.6，133-138)，隨后為一段含有在所有三個(gè)閱讀框架的終止密碼子和多聚腺嘌呤位點(diǎn)的寡核苷酸片段。質(zhì)粒pEVhis10是pEVhis14經(jīng)過(guò)除去含hCMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的BamHI片段而得到的。PRV的gp50基因以BstXI-StuI片段(缺少gp50啟動(dòng)子)克隆到pEVhis14的EcoRV位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于hCMV啟動(dòng)了的下游，從而得到質(zhì)粒pEVhis14gp50。對(duì)于含有PRV重疊亞基因組片段的粘粒(Cosmid)重組子c-179，c-27和c-443，以及含有在pBR322衍生物的HindⅢ位點(diǎn)有PRVHindⅢ-B片段質(zhì)粒pN3HB的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)已有文獻(xiàn)闡述(vanZijletal.，J.Virol.65，2761-2765)。在pN3HB的gp50基因的兩個(gè)不同的位點(diǎn)中，通過(guò)連接插入(插入R1和322)，使得gp50的表達(dá)被滅活，也已有文獻(xiàn)描述(deWindetal.，J.Virol.64，4691-4696)。
用電穿孔法(electroporation)的方法將質(zhì)粒pEVhis 14 gp50傳染到SK-6細(xì)胞。SK-6細(xì)胞經(jīng)胰酶消化收獲，在室溫下用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗一次，以2×107細(xì)胞/毫升將其重懸浮于冰冷的PBS中。10μgpEVhis 14 gp50質(zhì)粒加入到0.5ml細(xì)胞中，該細(xì)胞在滅菌的一次性電穿孔比色杯(electroporation cuvette)，內(nèi)部電極距離0.4cm;Bio Rad Laboratories)中保持在0℃，使用BioRad GenePulsex在25μF電容器1000V放電容被放電。細(xì)胞在0℃放置15分鐘，移到盛有50ml培養(yǎng)基的75cm2燒瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。隨后轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，在100mm培氏皿中用含2.5mM組氨醇的培養(yǎng)基做數(shù)倍稀釋。每隔3-4天換一次培養(yǎng)基，直到可見(jiàn)清晰的細(xì)胞克隆(7～10天)，把單個(gè)克隆挑出來(lái)移入多孔培養(yǎng)板中生長(zhǎng)。用免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)和單克隆抗體G50N2的放射免疫沉淀試驗(yàn)測(cè)定gp50的表達(dá)，由放射免疫沉淀試驗(yàn)檢測(cè)到的一株可表達(dá)大量gp50的細(xì)胞系，命名為G5(Peetersetal.，J.Virol.66，894-905)。
實(shí)施例2突變株病毒的構(gòu)建突變株病毒R122和R332是用含有重疊野生型PRV序列，并分別在gp50基因核苷酸位點(diǎn)366-367及996-997之間含有誘變寡核苷酸5′-TAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3′(SEQIDNol)的pN3HB衍生物RI或322的HindⅢ-B片段(deWindetal.，J.Virol.64，46991-4696)的三個(gè)粘粒(Cosmid)(c-179，c-27和c-443VanZijletal.，等人敘述，J.Virol.65，2761-2765)在G5細(xì)胞中經(jīng)重疊重組而構(gòu)建(圖1)。質(zhì)粒經(jīng)過(guò)EcoRI消化(粘粒，cosmids)或HindⅢ消化(克隆RI和322)，使病毒DNA片段釋放出來(lái)，并不再與載體序列作進(jìn)一步分離。用BioRadGene-Pulser和電容擴(kuò)大器(CapacitanceExtender)分別在250V和960μF的條件下，用電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞接種于6孔板上，37℃培養(yǎng)3小時(shí)后，培養(yǎng)基換成加有2%胎牛血清和1%甲基纖維素的Earle氏最低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(Earle′sminimalessentialmedium)在37℃培養(yǎng)直到蝕斑出現(xiàn)(2-3天)。
為了得到D560毒株，質(zhì)粒149(含有在gp63基因的核苷酸位點(diǎn)352-353之間有誘變寡核苷酸的pN3HB衍生物(deWindetal.，JVirol.64，4691-4696;序數(shù)依圖5，Petrovskisetal.，J.Virol.60，185-193)的BglⅡ-EcoRI片段被質(zhì)粒322的BglⅡ-EcoRI片段(見(jiàn)圖1)取代，產(chǎn)生的質(zhì)粒，在gp50基因核苷酸位點(diǎn)996和gp63基因位點(diǎn)353之間的序列被片段TAGGCTAGAATTCTAGCCTA(SEQIDNol;誘變寡核苷酸序列)所取代，該質(zhì)粒同病毒的重疊野生型片段一起，在G5細(xì)胞中按上述方法以重疊重組法得到重組病毒。
為了得到D1200毒株，質(zhì)粒149經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶BglⅡ和EcoRI消化，生成的大片段再以E.ColiDNA多聚酶I的Klenow片段對(duì)產(chǎn)生平末端進(jìn)行處理，而后自身連接，得到的質(zhì)粒中g(shù)p50基因336位點(diǎn)和gp63基因的353位點(diǎn)之間的核酸序列被片段AATTCTAGCCTA(SEQIDNo2;例如誘變寡核苷酸的殘余部分)所取代，該質(zhì)粒再與野生型片段一起，在G5細(xì)胞中如上所述用重疊重組法得到重組病毒。
實(shí)施例3gp50和gp50+gp63突變株在豬鼻粘膜分離塊中的復(fù)制為證實(shí)這些突變株是否能在動(dòng)物組織中傳播，我們使用了豬鼻粘膜分離塊，這些分離塊表現(xiàn)為上皮細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞的天然組合，亦已證實(shí)這些分離塊的感染與活體鼻粘膜的感染極為相似(Poletal.，Res.Vet.Sci.50，45-53)。用野生型PRVNIA-3毒株，gp50連接子插入突變株R122和R332，以及gp50+gp63缺失突變株D1200和D560來(lái)感染分離塊。
感染后24小時(shí)用免抗PRV血清進(jìn)行免疫組化檢驗(yàn)(Immunohistochemicalexamination，Pol.etal.，Res.Vet.Sci.50，45-53);發(fā)現(xiàn)野生型NIA-3病毒在感染的粘膜分離塊的上皮細(xì)胞中大范圍的傳播。用gp50突變株R122和R332以及gp50+gp63突變株D1200和D560也得到類(lèi)似的結(jié)果。感染后24小時(shí)，病毒幾乎全部在上皮細(xì)胞中復(fù)制，但是經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，所有的毒株都可以感染到下層成纖維細(xì)胞。用兔抗PRV血清和單克隆抗體(G50N2，gp50特異性)的特異性免疫染色均證明gp50+gp63突變株和gp50突變株不能表達(dá)gp50。這些結(jié)果表明gp50對(duì)于病毒在豬鼻粘膜中的傳播不是必須的。
實(shí)施例4gp50和gp50+gp63突變株對(duì)小鼠的毒力a.gp50+gp63無(wú)效突變株對(duì)小鼠是致死性的。
gp50突變體能夠在組織分離塊中復(fù)制和擴(kuò)散的結(jié)果表明它們也能在機(jī)體內(nèi)復(fù)制和擴(kuò)散。之所以選擇小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，是因?yàn)樾∈髮?duì)皰疹病毒是高度敏感的，而且已廣泛的用于毒力測(cè)試及神經(jīng)傳播的模型體(FraserandRramchandran，J.Comp.Path.79，435-444;CookandStevens，Infect，Immun.7，272-288;FieldandHill，J.Gen.Virol.23，145-157;FieldandHill，J.Gen.Virol.26，145-148;Kristensonetal.，BrainRes.69，189-201;Plattetal.，Arch.Virol.63，107-114;Dixetal.，Infect.Immun.40，103-112)。在第一個(gè)試驗(yàn)中，我們使用了gp50+gp63缺失突變株D560和D1200，而不是連接子插入突變株R122或R332，從而避免了接種物存在野生型返強(qiáng)毒株。這種返強(qiáng)毒株可能是由互補(bǔ)細(xì)胞系中的病毒繁殖與病毒基因組同源重組，連接子插入突變體而得到的(Caietal.，J.Virol.62，2596-2604;Peetersetal.，J.Virol.66.894-905;Peetersetal.，J.Virol.66，3388-3392)。由于D560和D1200毒株的gp50+gp63缺失的3′端序列與互補(bǔ)性G5細(xì)胞沒(méi)有同源部分(圖1)，這些突變體在互補(bǔ)性G5細(xì)胞中復(fù)制期間產(chǎn)生野生型返強(qiáng)毒株是不可能的。
選擇5只6-8周齡的雌性BALB/C小鼠(Charles River，Suldzfeld，F(xiàn)RG)在頸部皮下注射105蝕斑形成單位的NIA-3，D560，D1200毒株及gp63突變株M105。注射N(xiāo)IA-3毒株的小鼠，發(fā)生了偽狂犬病的嚴(yán)重癥狀，諸如后肢劇烈抓搔，“洗臉”及癱瘓，并且在感染后70小時(shí)死亡。M105毒株的感染動(dòng)物則沒(méi)有廣泛性瘙癢，但呈弓背散坐(Sat apart with a crooked back)并呼吸頻率加快，動(dòng)物在接種90小時(shí)死亡。用D560和D1200毒株接種的小鼠與接種M105毒種的小鼠癥狀相似，在進(jìn)入垂死狀態(tài)前，動(dòng)物表現(xiàn)冷淡，有麻痹癥狀，有時(shí)可持續(xù)42小時(shí)，直到感染后大約130-140小時(shí)死亡(表1，試驗(yàn)1)此結(jié)果表明gp50+gp63無(wú)效突變株對(duì)小鼠仍是致死性的，但無(wú)論如何，與野生型病毒或gp63突變株病毒相比，其毒力都明顯減低了。
b.gp50+gp63無(wú)效突變株能到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)并在其中復(fù)制。
用gp63或gp50+gp63突變株感染小鼠比用NIA-3感染小鼠引起的神經(jīng)紊亂癥狀輕，用免疫組化方法檢測(cè)到感染動(dòng)物腦組織中病毒的存在。用先前描述的方法(Poletal.，Microb.Path，7，361-371)對(duì)感染鼠的腦組織及器官的冰凍切片進(jìn)行固定及免疫組化試驗(yàn)，然后抗gp50的單克隆抗體用作第一抗體，在第二次孵化時(shí)使用了結(jié)合山羊抗鼠免疫球蛋白G抗體的過(guò)氧化物酶(Peetersetal.，J.Virol.66，894-905)。
使我們感到驚訝的是，結(jié)果顯示用D1200和D560接種的小鼠腦組織切片中發(fā)現(xiàn)了大量感染的神經(jīng)原，而用NIA-3或M105感染的小鼠腦組織切片中只有很少量感染的神經(jīng)原。用免抗PRV血清進(jìn)行各種免疫染色實(shí)驗(yàn)(Poletal.，Res.Vet.Sci.50，45-53)證明接種D1200和D560的動(dòng)物腦中所出現(xiàn)的病毒都不表達(dá)gp50。從腦部中分離出病毒后在SK-6細(xì)胞中測(cè)定滴度時(shí)，很容易從接種NIA-3或M105的動(dòng)物中回收到感染的病毒，而從接種D560或D1200的動(dòng)物中不容易分離到感染的病毒(表1，實(shí)驗(yàn)1)。這些結(jié)果證明不能夠產(chǎn)生感染性病毒的gp50+gp63無(wú)效突變株仍然可以到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)并在其內(nèi)復(fù)制。
盡管gp63對(duì)病毒的生長(zhǎng)無(wú)關(guān)緊要(Petrovskisetal.，J.Virol.60，1166-1169 );但gp50+gp60突變株在互補(bǔ)性G5細(xì)胞和非補(bǔ)性SK-6細(xì)胞上產(chǎn)生的蝕斑顯然較gp50突變株產(chǎn)生的蝕斑小。另外已證明gp63與對(duì)豬的毒力有關(guān)(Kimman et al.，J.Gen.Virol.73，243-251)。由于這些發(fā)現(xiàn)表明gp50突變株比gp50+gp63突變株毒力更強(qiáng)，因此我們想檢測(cè)gp50突變株對(duì)小鼠的毒力，然而在使用gp50突變株免疫小鼠之前，我們必須確證注射物中不含野生型返強(qiáng)毒(見(jiàn)上)。用R122在G5細(xì)胞上產(chǎn)生的單個(gè)蝕斑接種SK-6細(xì)胞，制備了一批無(wú)野生型返強(qiáng)毒的表型完整的R122病毒。從接種的SK-6細(xì)胞中提取病毒DNA并轉(zhuǎn)染G5細(xì)胞單層(這樣可以大大降低PRV的種入量;Peeters et al.，J.Virol.66，894-905 )。從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中制備病毒批，在SK-6細(xì)胞上測(cè)定，滴定達(dá)到2.1×107蝕斑形成單位(pfu)/ml。這一批病毒被命名為R122+，表示此病毒是表型完整的。再用200μl(4.2×106pfu)R122+病毒原液接種SK-6細(xì)胞，制備一批缺失gp50的病毒。收獲的病毒滴度為150pfu/ml，命名為R122-，表示此病毒由非互補(bǔ)性細(xì)胞中得到。但是用抗gp50的單克服抗體進(jìn)行免疫過(guò)氧化酶染色檢測(cè)這些蝕斑(Peeters et al.，J.Virol.66，894-905 )證明gp50陰性，這一結(jié)果說(shuō)明該病毒批中不含有野生型病毒但仍有一部分感染性病毒粒子。這些病毒粒可能是來(lái)自用于制備R122-病毒批的接種物(R122+)。另一種可能是，R122+病毒粒子感染SK-6細(xì)胞時(shí)，gp50會(huì)附著在原生質(zhì)膜上，而子代病毒粒子可能會(huì)重新結(jié)合這些gp50。其它可能性還有缺少gp50的病毒粒子通過(guò)細(xì)胞攝粒作用被細(xì)胞吞噬(Campadelli-Fiume et al.，J.Virol.62，159-167 )并且偶然地避免了被降解，從而導(dǎo)致了生產(chǎn)性的感染。R122+和R122-病毒原液的物理滴度則借助于電子顯微鏡進(jìn)行測(cè)定，并以乳膠小球(直徑91nm;Serva)做為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
除了測(cè)定R122+的毒力外，我們還測(cè)定了不同毒株的毒力是否取決于感染的途徑。將5只小鼠分為一組，皮下或腹腔注射105pfu的NIA-3，M105，R122+和D1200毒株。接種R122+株的小鼠出現(xiàn)了偽狂犬病的癥狀，與NIA-3接種的動(dòng)物癥狀類(lèi)似(見(jiàn)上)。皮下接種NIA-3的動(dòng)物，在注射后大約34-40小時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)明顯癥狀，而皮下接種R122+的動(dòng)物則要在大約42小時(shí)后才出現(xiàn)癥狀。小鼠分別在注射后56小時(shí)和68小時(shí)出現(xiàn)死亡(表1，實(shí)驗(yàn)2)，這些結(jié)果表明gp50突變株R122+對(duì)小鼠毒力很強(qiáng)，而且比gp50+gp63突變株D1200或gp63突變株M105毒力強(qiáng)得多。腹腔接種NIA-3，R122+和M105株，比皮下接種的平均死亡時(shí)間長(zhǎng)10-13小時(shí)。D1200毒株，腹腔注射比皮下注射的平均死亡時(shí)間大約短25小時(shí)(表1，實(shí)驗(yàn)2)。所有測(cè)定的毒株的綜合癥和臨床癥狀與接種途徑無(wú)關(guān)。這樣，盡管接種的時(shí)間存在差異，但兩種注射途徑都導(dǎo)致了致死性的感染。用免疫組化的方法從實(shí)驗(yàn)2所用的所有動(dòng)物腦組織切片中檢測(cè)到了病毒(表1)。而且，與NIA-3，R122+或M105感染的動(dòng)物相比，用D1200接種的動(dòng)物腦組織中的病毒復(fù)制更為廣泛。
d.病毒在感染器官的外周神經(jīng)中的擇優(yōu)復(fù)制用免疫組化法檢測(cè)組織切片中病毒抗原時(shí)，只有在腹腔注射的動(dòng)物的組織切片中檢測(cè)到病毒抗原。檢測(cè)到病毒的器官有肝臟、脾臟、腎臟、腸道和腎上腺，但肺臟中則檢測(cè)不到病毒抗原。器官中的病毒感染幾乎完全局限在神經(jīng)纖維中，這一結(jié)果證明神經(jīng)組織是PRV感染和復(fù)制的優(yōu)選部位，推測(cè)病毒是通過(guò)逆軸突傳輸方法從器官到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的，與以前報(bào)道的一致(CookandStevens，Infect.Immun.7，272-288;FieldandHill，J.Gen.Virol.23，145-157;FieldandHill，J.Gen.Virol.26，145-148;McCrackenetal.，J.Gen.Virol.20，17-28;StrackandLoewy，J.Neurosci，10，2139-2147;Cardetal.，J.Neurosci，10.1974-1994。gp50無(wú)效突變株能夠有效地傳輸?shù)街袠猩窠?jīng)系統(tǒng)說(shuō)明神經(jīng)傳輸與gp50的存在無(wú)關(guān)。
從腹腔接種NIA-3和M105株的動(dòng)物組織抽提取液中可以回收到感染性病毒。正如所料，R122+或D1200接種的動(dòng)物中不能回收到感染性病毒，進(jìn)一步表明這些病毒的子代屬非感染性的。奇怪的是皮下接種NIA-3的動(dòng)物中有3/5的動(dòng)物組織抽提液中產(chǎn)生了感染性病毒(表1，實(shí)驗(yàn)2)。這意味著病毒是通過(guò)逆向運(yùn)動(dòng)從中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳到這些器官中。皮下接種M105株小鼠器官中缺乏感染性病毒，說(shuō)明病毒的傳輸可能被拖延了。
e.機(jī)體的初始感染需要gp50體外試驗(yàn)結(jié)果表明gp50對(duì)病毒的穿透是必須的，但對(duì)細(xì)胞間傳播為非必須的(Peeters et al.，J.Virol.66，894-905)，意味著在機(jī)體內(nèi)病毒的感染情況亦相同。盡管gp50在機(jī)體內(nèi)對(duì)病毒的穿透是必須的這一可能性很大，但我們必須證明在這種情況下，gp50對(duì)動(dòng)物初始感染是必要的。為證明gp50參與病毒的感染過(guò)程而使用了一批生長(zhǎng)在非互補(bǔ)性SK-6細(xì)胞上，而缺少gp50(R122-;見(jiàn)上)的R122病毒。因?yàn)?05pfu的R122+相當(dāng)于3.3×106個(gè)病毒顆粒，我們用了相同數(shù)量的R122+病毒顆粒注射小鼠。正如所料，皮下或腹腔注射R122+的小鼠全部死亡(表1，實(shí)驗(yàn)3)。然而，接種R122-的小鼠中，腹腔接種的全部存活，而皮下接種的小鼠有五分之一死亡。這些結(jié)果表明在病毒的外膜中g(shù)p50的存在對(duì)于成功地感染是必要的。
對(duì)接種R122-后死亡的動(dòng)物檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)病毒存在腦組織中，證明在接種物中仍有感染性病毒。將該接種物在非互補(bǔ)性SK-6細(xì)胞中重復(fù)滴定后，分別出現(xiàn)了9個(gè)或16個(gè)蝕斑。這些蝕斑經(jīng)過(guò)免疫組化檢驗(yàn)是由gp50突變株產(chǎn)生的。這些感染性病毒粒子的可能來(lái)源在上文中已討論過(guò)。因?yàn)榻?jīng)過(guò)腹腔注射后，PRV NIA-3毒株的LD50大約是70pfu，所以R122-注射物中存在感染性病毒粒子可能是與個(gè)別動(dòng)物產(chǎn)生致死性感染導(dǎo)致死亡有關(guān)。
f.一株對(duì)小白鼠無(wú)毒力的病毒，不能產(chǎn)生感染性子代病毒，不能經(jīng)細(xì)胞間傳遞而傳播。
在上文中我們已經(jīng)指出了PRV的gⅡ或gH無(wú)效突變株在非互補(bǔ)性細(xì)胞系中的復(fù)制，同gp50無(wú)效突變株一樣，也能產(chǎn)生非感染性子代病毒粒子(Peetersetal.，J.Virol.66，894-905;Peetersetal.，J.Virol.66，3388-3892)。但與gp50突變株相反，gⅡ和gH突變株不能在非互補(bǔ)性細(xì)胞中產(chǎn)生蝕斑。這一結(jié)果表明了gⅡ和gH對(duì)病毒在細(xì)胞間傳遞是必須的。為證實(shí)細(xì)胞間傳遞是否對(duì)病毒在機(jī)體內(nèi)的成功傳播是必不可少的，我們采用表型完整的PRVgⅡ無(wú)效突變株B14S(Peetersetal.，
J.Virol.66，894-905 )接種小鼠。用105pfu的B145病毒腹腔或皮下接種小鼠后，任何動(dòng)物都不產(chǎn)生偽狂犬病的癥狀(表1，實(shí)驗(yàn)3)，結(jié)果說(shuō)明，不能產(chǎn)生感染性子代和不能通過(guò)細(xì)胞間傳遞的病毒對(duì)小鼠是無(wú)毒的。
實(shí)施例5gp50突變株和gp50+gp63突變株對(duì)豬的毒力與免疫原性為檢測(cè)突變毒株的毒力和免疫原性，用毒株R122+，D560和D1200株接種豬。野生型M209毒株和gp63突變株M102(圖1)(Kimman et al.，J.Gen.Virol.73，243-251 )則作對(duì)照，然后以PRV強(qiáng)毒NIA-3毒株攻毒測(cè)定免疫力。
每5只4-6周齡豬為一組(荷蘭中心獸醫(yī)研究所，蘭德拉斯SPF豬)，每只滴鼻接種105pfu的病毒，方法是在呼吸過(guò)程中向鼻腔內(nèi)緩慢滴入0.5ml病毒懸液。免疫4周后，用105pfu的PRV強(qiáng)毒NIA-3毒株滴鼻攻毒。每天兩次觀(guān)察豬臨床癥狀，每日測(cè)量肛門(mén)溫度。一周稱(chēng)重3次，記錄每只豬的生長(zhǎng)停滯的天數(shù)，發(fā)熱以及神經(jīng)癥狀。以攻毒之日起直到動(dòng)物重新開(kāi)始增重所需的天數(shù)定為生長(zhǎng)停滯期。肛門(mén)溫度超過(guò)40℃為發(fā)熱。出現(xiàn)搔癢、共濟(jì)失調(diào)、癱瘓、顫抖和抽搐即為神經(jīng)癥狀。
用野生型M209毒株接種豬發(fā)生了偽狂犬病的典型癥狀如發(fā)熱、食欲減退、生長(zhǎng)遲緩以及諸如共濟(jì)失調(diào)和癱瘓這樣的神經(jīng)癥狀(表2)。R122+和M102突變株引起短期的發(fā)熱和生長(zhǎng)遲緩，但不表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀。D560和D1200突變株既不引起任何神經(jīng)癥狀也不引起發(fā)熱和生長(zhǎng)遲緩。這些結(jié)表明gp50+gp63突變株D560與D1200對(duì)豬完全無(wú)毒，而gp50突變株R122+及gp63突變株M102較之野生型PRV毒性已大大減低。
用R122+和M102毒株免疫的豬在用NIA-3攻毒后，不表現(xiàn)發(fā)熱或生長(zhǎng)遲緩，也不出現(xiàn)臨床癥狀(表3)。用D560和D1200毒株免疫的豬有短時(shí)期的發(fā)熱和生長(zhǎng)遲緩，雖有的動(dòng)物出現(xiàn)有幾天反應(yīng)遲緩且有兩只豬出現(xiàn)嘔吐，但沒(méi)有神經(jīng)癥狀。未免疫對(duì)照組的豬則出現(xiàn)嚴(yán)重的偽狂犬病癥狀，發(fā)熱、生長(zhǎng)遲緩期相當(dāng)長(zhǎng)，并有兩只豬死亡(表3)。這些結(jié)果說(shuō)明，用gp50突變株R122+和gp63突變株M102免疫的豬可以完全得到保護(hù)，不出現(xiàn)偽狂犬病臨床癥狀，而用gp50+gp63突變株D560和D1200免疫的豬則可部分地得到保護(hù)。
表2 不同的PRV毒株對(duì)豬的免疫試驗(yàn)￥免疫毒種發(fā)熱*生長(zhǎng)遲緩*臨床癥狀M209(n=3)5.3±0.68.3±7.3++M102(n=4)#2.4±1.5 2.4±2.2 -R122+(n=5) 3.8±1.6 0.8±1.8 -D560(n=5)00-D1200(n=5)00-￥試驗(yàn)期間沒(méi)有豬死亡＊平均天數(shù)(±S.D.)＃一頭豬死亡，可能是采集血樣后的創(chuàng)傷引起的。
++出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，諸如共濟(jì)失調(diào)，抽搐和癱瘓。
表3免疫豬用NIA-3攻毒后的保護(hù)免疫毒株死亡發(fā)熱*生長(zhǎng)遲緩*臨床癥狀-(n=6)26.8±0.510.3±7.1++M102(n=4)000-R122+(n=5) 0 0 0 -D560(n=5)02.6±1.34.6±6.5+/-D1200(n=5)03.6±1.11.4±3.1+/-
＊平均天數(shù)(+S.D.)++出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，諸如共調(diào)失調(diào)，抽搐和癱瘓+/-表示反應(yīng)遲鈍(有時(shí)嘔吐，見(jiàn)文)以上例子表明PRV和gp50對(duì)病毒的感染(穿透)是必須的，但對(duì)細(xì)胞間的傳遞則不然。表型完整的gp50突變株和gp50+gp63突變株可以在接種動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制與傳播。但是，從感染細(xì)胞釋放的子代病毒屬非感染性的，因此接種動(dòng)物亦不能釋放感染性的病毒。這一特性加之PRV的廣泛宿主范圍以及容納大量外源DNA的能力，使得PRV的gp50突變株相當(dāng)適合于制備安全的(載體)疫苗，防制偽狂犬病和其他動(dòng)物疾病。
實(shí)施例6構(gòu)建表達(dá)豬瘟病毒(HogCholeraVirus)外膜糖蛋白E1的gp50缺失突變體為試驗(yàn)gp50缺失突變體能否作為表達(dá)異源基因的載體，在hCMV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下，采用含有豬瘟病毒(HogCholeraVirus，HChV＝古典豬瘟，classicalswinefever)E1基因的DNA片段代替PRV毒株NIA-3的gp50基因。
一個(gè)ScaI-DraI片段(ScaI位于gX基因的位點(diǎn)317-322之間，核苷酸序號(hào)同Reaetal.，J.Virol.54，21-29;DraI位于gp63和gI基因之間的位點(diǎn)1181-1186，核苷酸序號(hào)同Petrovskisetal.，J.Virol.60，185-193)位于PRV的Us區(qū)域，該片段被克隆到質(zhì)粒pUc19M的NdeI位點(diǎn)的平頭端(Clontech)。采用體外定點(diǎn)誘變(Transformerkit，Clontech)，單一的限制酶識(shí)別位點(diǎn)即被恰好確定在gp50基因之前和gp50基因之后。通過(guò)采用誘變引物5′-AGGTTCCCATACACTAGTCCGCCAGCGCCATGC-3′(SEQIDNo3;SEQUENCETYPEnucleotide，SEQUENCELENGTH33，STRANDNESSsingle，SOURCEsynthetic)和5′-CCCGGTCCGTAGCCTAGGCAGTACCGGCGTCG-3′(SEQIDNo4;SEQUENCETYPEnucleotide，SEQUENCELENGTH32，STRANDNESS∶single，SOURCE∶synthetic)，為限制酶SpeI(ACTAGT)和AvrⅡ(CCTAGG)的識(shí)別序列被分別確定在位點(diǎn)-17至-12和1210至1215上(gp50基因的核苷酸序列號(hào)同Petrovskisetal.，J.Virol.59，216-223)。gp50基因經(jīng)帶有SpeI和AvrⅡ的質(zhì)粒DNA的消化而缺失，并被一合成的SpeI-AvrⅡDNA片段取代，該合成的DNA片段包含限制酶EcoRI，EcoRV和HindⅢ的識(shí)別序列(該合成的DNA片段是通過(guò)同摩爾量序列分別為5′-CTAGTGAATTCGATATCAAGCTTC-3′(SEQIDNo∶5，SEQUENCETYPE∶nucleotide，SEQUENCELENGTH∶24，STRANDNESS∶single，SOURCE∶synthetic)和5′-CTAGGAAGCTTGATATCGAATTCA-3′(SEQIDNo∶6;SEQUENCETYPE∶nucleotide，SEQUENCELENGTH∶24，STRANDNESS∶single，SOURCE∶synthetic)的兩個(gè)單螺旋寡核苷酸的退火而得到的)。而后，一個(gè)包含gp50缺失的NcoI-PstI片段(NcoI位于gX基因的位點(diǎn)883-888之間，核苷酸序列號(hào)見(jiàn)Reaetal.，J.Virol.54，21-29;PstI位于pg63基因的位點(diǎn)883-888之間，核苷酸序列號(hào)見(jiàn)Petrovskisetal.，J.Virol.60，185-193被克隆到經(jīng)NcoI和PstI消化的質(zhì)粒pGEM5Zf(+)(Promega)中。所得的質(zhì)粒被命名為pBP53。
HChV的El基因源于HChV毒株Brescia的cDNA克隆(Moormannetal.，Virology177，184-198)。該基因作為一個(gè)DsaI-EcoRV片段(DsaI部位以E.coliDNA聚合酶I的Klenow片段填充，核苷酸2337-3804，根據(jù)Moormannetal.，Virology177，184-198 的核苷酸序列號(hào))克隆到質(zhì)粒pEVhis13的EcoRI部位(以E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段填充)和EcoRV部位之間。所說(shuō)的質(zhì)粒源自質(zhì)粒pSV2his(Hartman and Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，8047-8051 )，該質(zhì)粒包含hCMV啟動(dòng)子，啟動(dòng)子后接ATG起始編碼子，一特定限制位點(diǎn)數(shù)和在三個(gè)閱讀框架內(nèi)的轉(zhuǎn)譯終止編碼(Peeters et al.，J.Virol.66，894-905;同時(shí)參見(jiàn)實(shí)施例1。在得到的質(zhì)粒中，E1基因與pEVhis 13的起始啟動(dòng)子框架式融合。該質(zhì)粒被命名為pEVhis 13HCE1(見(jiàn)圖2)。在質(zhì)粒pEVhis13HCVE1被HpaI和PstI消化以后，一個(gè)含有hCMV啟動(dòng)子，E1基因和一個(gè)轉(zhuǎn)譯編碼子的片段被分離出來(lái)。該HpaI-PstI片段經(jīng)T4DNA聚合酶處理得到一平頭端，繼而克隆到pBP53的EcoRV部位上。E1基因的轉(zhuǎn)錄定向與pBP53的gX和gp63基因的相似，以此定向插入片段的質(zhì)粒被分離出來(lái)，并被命名為pBP53E1(圖3)。
為檢驗(yàn)E1基因是否克服正確，在G5細(xì)胞中檢測(cè)了E1的瞬間表達(dá)(transientexpression)。采用lipofectin(GIBCOBRL)將質(zhì)粒pBP53E1或pEVhis13HCVE1對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。2天后，單層細(xì)胞被固定且通過(guò)采用對(duì)HChV的糖蛋白特異的辣過(guò)氧化酶(horseradishperoxidase)-綴合單克隆抗體3和4的免疫株對(duì)E1的表達(dá)進(jìn)行了檢驗(yàn)(Wensvoort，J.Gen.Virol.70，2685-2876)。由pBP53E1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)E1的表達(dá)是明顯可見(jiàn)的，其染色能力較pEVhisF13HCVE1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的更強(qiáng)一些。這些結(jié)果表明，在PRV序列之中，就pBP53E1而言，E1被有效地表達(dá)了。
質(zhì)粒pBP53E1與PvuⅡ和PstⅠ被消化，并與PRV毒株NIA-3的病毒DNA一起在G5細(xì)胞中采用lipotectin共轉(zhuǎn)染。2天后，當(dāng)蝕斑明顯可見(jiàn)時(shí)，單層細(xì)胞固定，并采用上述的瞬時(shí)表達(dá)檢驗(yàn)法對(duì)此進(jìn)行染色。被染色的蝕斑的存在表明借助于同源重組E1基因已被轉(zhuǎn)移至病毒基因組，且E1基因被重組病毒表達(dá)。為分離出重組病毒，重復(fù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)并分離到400個(gè)獨(dú)立的蝕斑。為鑒別表達(dá)了E1的重組子，部分分離物被轉(zhuǎn)移至含有SK-6細(xì)胞的微量滴定板中。培養(yǎng)2天后，蝕斑可見(jiàn)，受感染的單層細(xì)胞固定，并通過(guò)免疫染色來(lái)檢驗(yàn)E1的表達(dá)。最后，表達(dá)了E1的重組病毒為從初始分離物中純化出來(lái)的蝕斑，該分離物在SK-6細(xì)胞上產(chǎn)生染色的蝕斑。
可見(jiàn)，表達(dá)了HChV的E1的PRV重組疫苗株能夠在豬以HChV攻毒-接種之后使之避免古典豬瘟(classicalswinefever)(VanZijletal.，J.Virol.65，2761-2765)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，上述的非-傳遞E1-表達(dá)gp50缺失突變株能夠?qū)е路乐构诺湄i瘟的免疫應(yīng)答。
權(quán)利要求
1.皰疹病毒突變株的應(yīng)用，該株僅能通過(guò)病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞間傳遞的方式進(jìn)行擴(kuò)散，并產(chǎn)生非感染性子代病毒粒子以制備抵抗人或動(dòng)物疾病的疫苗。
2.一種偽狂犬病病毒，gp50突變株在制備抵抗動(dòng)物疾病的疫苗中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述的應(yīng)用是制備一種抗Aujeszky氏病疫苗的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中經(jīng)過(guò)將編碼一種來(lái)自于另一種病原體的抗原或部分抗原的核苷酸序列整合入所述的突變株來(lái)制備一種抵抗人或動(dòng)物疾病的載體疫苗。
5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中經(jīng)過(guò)將編碼有來(lái)自另一種病原體的抗原或部分抗原的至少一個(gè)基因整合入所述的突變株來(lái)制備抵抗動(dòng)物除Aujeszky氏病以外疾病的疫苗。
6.一種預(yù)防和/或控制動(dòng)物疾病的疫苗，它包含有糖蛋白gp50的偽狂犬病病毒并具有其gp50基因中的一個(gè)突變。
7.如權(quán)利要求6所述的用于預(yù)防和/或控制Aujeszky氏病的疫苗，其中所述的突變?yōu)橐蝗笔А?br> 8.如權(quán)利要求6所述的其中預(yù)防和/或控制至少一種動(dòng)物疾病的疫苗，其中所述的突變?yōu)橐粋€(gè)包含編碼有對(duì)應(yīng)所述動(dòng)物疾病抗原的異源基因的插入。
9.如權(quán)利要求6至8之一所述的疫苗，其中偽狂犬病病毒另外在其另一個(gè)基因上還有至少一個(gè)突變，如gp63基因或gI基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種預(yù)防和控制動(dòng)物疾病的疫苗，其中具有糖蛋白gp50和gp50突變基因的一株偽狂犬病病毒。該疫苗適用于偽狂犬病(Aujeszky′sdisease或Pseudorabies)，或當(dāng)它是插入編碼某種動(dòng)物病抗原的同源基因突變株，可用于防止上述相應(yīng)的動(dòng)物病。此株偽狂犬病病毒可在其一個(gè)其它基因，如gp63或gI基因中，至少可再增加一個(gè)突變。此疫苗不會(huì)由免疫動(dòng)物傳播到非免疫動(dòng)物。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1086143SQ9310800
公開(kāi)日1994年5月4日 申請(qǐng)日期1993年7月9日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月9日
發(fā)明者伯納德斯·彼得勒斯·休伯特斯皮特斯, 簡(jiǎn)·瑪麗亞·安東尼, 厄斯波, 阿諾德·倫納德·約瑟夫吉爾肯斯, 羅伯特斯·雅各布斯·瑪麗亞穆?tīng)柭?申請(qǐng)人:阿克佐公司