一種5基因缺失偽狂犬病重組病毒活疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種5基因缺失偽狂犬病重組病毒活疫苗及其制備方法，屬于獸用生 物制品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬?。≒seudor油ies，PR;又名Aujeszky'Sdisease,AD)是由偽狂犬病毒 (Pseudor油iesvirus,PRV)引起的一種急性傳染病，可感染多種家畜、伴侶動(dòng)物及野生動(dòng) 物。豬是感染后可W存活的唯一物種，也是膽存宿主。感染豬主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀、流誕、 呼吸困難、母豬繁殖障礙、仔豬高死亡率等，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] PRV是瘤疹病毒科、a瘤疹病毒亞科、水痘病毒屬的成員，與其同屬的還有I型牛 瘤疹病毒度HV-1)、馬瘤疹病毒巧HV)W及水痘帶狀瘤疹病毒（VSV)。PRV基因組為線性雙 股DNA，約145肺，由長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)扣L)和短獨(dú)特區(qū)扣巧及US兩側(cè)的末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)燈時(shí)與內(nèi) 部重復(fù)（IR)組成，可編碼70-100種蛋白質(zhì)，成熟的病毒粒子約有50種蛋白。在上述基因 產(chǎn)物中，化區(qū)段中的gC、TK及US區(qū)段中的PK、gG、gl、姐、1化和28K為病毒增殖的非必需 成份，一般認(rèn)為，TK、gC、姐、PK和CP(衣殼蛋白）等與PRV毒力相關(guān)。另外，瘤疹病毒基因 組中，UL49. 5編碼的囊膜蛋白gN能抑制TAP介導(dǎo)的多膚轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在病毒感染的細(xì)胞 內(nèi)阻斷MHCI類復(fù)合體的裝配，從而下調(diào)MHCI類分子在細(xì)胞表面的表達(dá)，使得病毒有可能 逃避宿主CD8叮細(xì)胞的識(shí)別，并在宿主鼻腔及上呼吸道上皮細(xì)胞中復(fù)制，引起化脈性反應(yīng)或 組織潰爛，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌二次感染及嚴(yán)重的肺炎。最新研究表明（ShafiqulIetal，2014; HuiyougW，etal，2012) ,BHV-I病毒UL49. 5胞質(zhì)尾缺失和胞外域30~40aa部分缺失能增 強(qiáng)病毒侵染宿主的能力，誘導(dǎo)更強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，在疫苗研制方面更具優(yōu)勢(shì)。 目前尚未見(jiàn)偽狂犬病毒在運(yùn)方面有相關(guān)的研究報(bào)道。
[0004] 疫苗免疫接種是防制偽狂犬病的主要策略。偽狂犬疫苗主要分為=種：一是常 規(guī)疫苗，即滅活疫苗和弱毒活疫苗，如目前應(yīng)用較多的Bartha-KGl株活疫苗；二是基因缺 失疫苗，即通過(guò)分子生物學(xué)方法，人工缺失某些基因，使其毒力減弱的同時(shí)又保留其免疫原 性。目前構(gòu)建的偽狂犬病毒基因工程疫苗大多為TK、gl、姐、gG基因的單基因缺失或多基 因缺失突變株。PRV作為基因工程載體具備相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)=(I)PRV不感染人，具有很好的安全 性?，F(xiàn)有的活疫苗株Bartha-Kei或'783'等在世界上已應(yīng)用了幾十年，未發(fā)生重大的安 全事故。（2)基因組容量大：在PRV長(zhǎng)達(dá)145肺的基因組中，約一半基因被認(rèn)為是非必需的， 如gI、姐、gM、TK、PK、gC和加TPase等，在運(yùn)些區(qū)域可先后或同時(shí)插入和表達(dá)多種外源基因 而不顯著影響其繁殖及免疫原性。（3)生產(chǎn)原材料來(lái)源方便，生產(chǎn)成本低：PRV疫苗可W接 種SPF雞胚成纖維細(xì)胞及PK15、ST等傳代細(xì)胞生產(chǎn)，原材料充足，生產(chǎn)工藝成熟，且PRV病 毒滴度很容易達(dá)到免疫要求，大大降低了生產(chǎn)成本。（4)免疫期長(zhǎng)：PRVW細(xì)胞免疫為主，病 毒可W較長(zhǎng)時(shí)間感染，外源基因可W在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)。（5)宿主范圍廣，多種家畜、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物 (如狐和貂）、伴侶動(dòng)物及野生動(dòng)物均可感染PRV，可研制針對(duì)不同動(dòng)物的活載體疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]本發(fā)明提供一種缺失姐、gI、US9、化49. 5、TK等5基因的偽狂犬病毒，用于制備偽 狂犬病活疫苗，預(yù)防偽狂犬病。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案
[0007] 1. -種偽狂犬病重組病毒活疫苗，其特征在于該活疫苗主要含有偽狂犬病毒 巧RV/姐/gl/US9/A化49. 5/TK株病毒，該毒株已于2015年11月11日送交北京市朝陽(yáng) 區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中屯、保藏，保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 11500。
[0008] 2.如權(quán)利要求1所述的一種偽狂犬病重組病毒活疫苗，其特征在于該活疫苗含有 的偽狂犬病毒巧RV/姐/gl/US9 /A化49. 5/TK株病毒是同時(shí)缺失了姐基因、gl基因、 US9基因、TK基因和部分化49. 5基因的重組偽狂犬病毒株。
[0009] 3 -種5基因缺失偽狂犬病重組病毒活疫苗的制備方法，其特征在于所述的重組 偽狂犬病毒活疫苗是，將偽狂犬病毒巧RV/姐/gl/US9 /A化49. 5/TK株接種長(zhǎng)滿單層的 雞胚成纖維細(xì)胞（CE巧，培養(yǎng)后，收獲病毒培養(yǎng)物，加適宜穩(wěn)定劑，經(jīng)冷凍真空干燥制成疫 苗。
[0010] 4. 一種5基因缺失偽狂犬病重組病毒活疫苗的制備方法，其特征在于所述的培養(yǎng) 偽狂犬病毒5基因缺失株病毒巧RV/姐/gl/US9 /A化49. 5/TK株傳代細(xì)胞是ST細(xì)胞/ 或PK15細(xì)胞/或適合該病毒生長(zhǎng)的傳代細(xì)胞，培養(yǎng)后，收獲病毒培養(yǎng)物，加適宜穩(wěn)定劑，經(jīng) 冷凍真空干燥制成疫苗。
【具體實(shí)施方式】
[0011] -、生產(chǎn)用病毒株的構(gòu)建 陽(yáng)01引 1.載體
[0013] PMD-18T載體，用于克隆測(cè)序及轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公 司。含有GFP基因的載體pU-EGFP和含有RFP基因的載體pU-ERFP，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。 4] 2.引物設(shè)計(jì)
[0015] 根據(jù)GenBank上發(fā)表的PRV序列設(shè)計(jì)合成W下引物：
[0016] (1)擴(kuò)增gl基因左同源臂的引物：
[0017] US6F :5, -GACTTAAGGATCTCCGACCCGCAGGTGG-3'（序列 1)
[0018] US6R :5, -GACTTAAGGGAGCCGGGTCACGTCGCGCG-3'（序列 2)
[0019] 似擴(kuò)增US9基因右同源臂的引物：
[0020] US2F :5, -GACTAGTATGGGGGTGACGGCCATCAC-3,（序列 3)
[0021] US2R :5, -GACTAGTCGGAGAGATCCTGCCGTCTAGG-3'（序列 4)
[0022] (3)擴(kuò)增GFP基因的引物：
[0023] EGFP-F :5, -GGTATACGGATCCAAGGAGATATAACA-3'（序列 5)
[0024] EGFP-R :5' -GACTAGTGAGCTCTTAAAGCTCATCAT-3'（序列 6)
[0025] (4)擴(kuò)增US9基因的引物：
[0026] PUS9-F :5' -AGAAACCGGAAGTGACGAATGG-3'（序列 7)
[0027] PUS9-R :5, -AGGAGCACCTGGTCGCAGAG-3'（序列 8)
[0028] (5)擴(kuò)增化49. 5基因的引物（擴(kuò)增含37-40aa基因片段）：
[0029] PUL50F:5, -GCCTGCAAGATGTAGCCGGAGA-3'（序列 9)
[0030] PUL50R:5, -TGGCGAGCGAGTGGGGTC-3'（序列 10) 陽(yáng)0川 （6)擴(kuò)增缺失A37-40aa基因的化49. 5部分基因的引物（引入AflII酶切位點(diǎn)， 用于化49. 5基因的連接）：
[0032] rPUL50F2 :5, -TAAGCTTGCCTGCAAGATGTAGCCGGAGA-3'（序列 11)
[0033] rPUL50R2 :5, -ACTTAAGTTAGGCGTAACCCAGGGCgAC-3,（序列 12)
[0034] (7)擴(kuò)增化49. 5基因的引物（擴(kuò)增缺失了CT的化49. 5部分基因片段）：
[0035] 巧UL49F:5, -TACTAGTAGATCGATCCGCACGCGC-3,（序列 13)
[0036] 巧UL49R:5, -AGAATTCGCAGCGTGGACACGAAG-3'（序列 14)
[0037] 巧UL49F2 :5' -ACTTMGATCGATCCGCACGCGC-3'(引入AflII酶切位點(diǎn)，用于UL49. 5 基因的連接）（序列15)
[00測(cè) 做擴(kuò)增化49. 5基因左同源臂的引物：
[0039] UL50F:5, -TAAGCTTGCCTGCAAGATGTAGCCG-3'（序列 16)
[0040] UL50R:5, -ACTTAAGTTAGGCGTAACCCAG-3'（序列 17) 陽(yáng)OW (9)擴(kuò)增化49. 5基因右同源臂的引物：
[0042] UL48F: 5，-TACTAGTAGATCGATCCGCACGCGCCCG-3 '（序列 18)
[0043] UL48R:5, -AGAATTCGCAGCGTGGACACGAA-3'（序列 19) W44] (10)擴(kuò)增TK基因左同源臂的引物：
[0045] UL24F :5, -GGTATACCCGTGGTCGTCACGCCCATGAA-3'（序列 20)
[0046] UL24R :5, -GGTATACATGCGCATCCCGGCGCGCTTC-3'（序列 21)
[0047](11)擴(kuò)增TK基因右同源臂的引物：
[0048] UL22F :5, -GACTAGTATGCCCGCGTCGTCCGTGCGC-3,（序列 22)
[0049] UL22R :5, -GACTAGTGCGGTACGCCTCGGCGACGGT-3,（序列 23)
[0050] (12)擴(kuò)增RFP基因的引物：
[0051] RFP-F :5, -GGTATACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'（序列 24)
[0052] RFP-R :5, -GACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3'（序列 25)
[0053] 3.含GFP標(biāo)記的偽狂犬缺失病毒（rPRV/姐/gl/US9 /GFP+)的構(gòu)建
[0054] (1)轉(zhuǎn)移載體PMD-US6-GFP-US2 的構(gòu)建
[00對(duì)隊(duì)本發(fā)明人由我國(guó)山西省太原市自行分離到的PRV做株）基因組為模板，采用引 物US6F/R和US2F/R分別擴(kuò)增姐、gl、US9缺失的同源重組左同源臂和右同源臂；WpU-EGFP 為模板，用引物EGFP-F/EGFP-R擴(kuò)增GFP基因。擴(kuò)增目的片段分別連接PMD-18T載體，構(gòu)建 相應(yīng)的重組質(zhì)粒。W訊n/Aflll雙酶切左臂，WSpel/EcoRI雙酶切右臂，回收相應(yīng)片段后 依次與pMD-GFP質(zhì)粒相應(yīng)酶切后的片段連接，獲得轉(zhuǎn)移載體PMD-US6-GFP-US2。
[0056] 似同源重組 W57] 將轉(zhuǎn)移載體PMD-US6-GFP-US2與PRV(SX株）親本株共轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen公司）說(shuō)明書（見(jiàn)附件1)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn) 染24小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變及巧光蛋白表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解后盲傳兩代，仍有綠色巧 光表達(dá)，初步判斷重組病毒捶救成功。 陽(yáng)〇5引 （3)重組病毒的蝕斑純化
[0059] 將初步獲得的重組病毒接種已長(zhǎng)成良好細(xì)胞單層的PK15細(xì)胞6孔細(xì)胞板，吸附1 小時(shí)后，棄去吸附液，鋪上1 %的低烙點(diǎn)瓊脂糖，繼續(xù)培養(yǎng)。接種48小時(shí)后在巧光顯微鏡下 觀察綠色巧光，挑選單個(gè)巧光蝕斑于ImlDMEM營(yíng)養(yǎng)液中，凍融1次后，如此進(jìn)行蝕斑純化 3~4次，將獲得的重組病毒命名為巧RV/姐/gl/US9 /GFP+。 柳6〇] (4)重組病毒巧RV/姐/gl/US9 /GFP+的鑒定
[0061] 采用姐、gI、US9和GFP基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未擴(kuò)增出姐、 gl和US9片段，擴(kuò)增出GFP