專利名稱：從原料中提取紫杉醇的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從原料中提取和純化紫杉醇和類紫杉醇(taxoid)的方法和設(shè)備。該方法和設(shè)備之特征在于用臨界或接近臨界的流體從漿果紫杉針葉和其它部分提取和純化的紫杉醇。
用有機溶劑提取植物原料，微生物和海洋微生物得到許多顯示抗腫瘤活性的化合物已被證實。將這些化合物作為化學(xué)治療和抗HIV劑進行研究已經(jīng)受到其低天然豐度和不利的常規(guī)提取技術(shù)的阻礙。這種化合物的一個例子為紫杉醇(NSC125973)，一種由西部短葉紫杉衍生的二萜植物產(chǎn)品。現(xiàn)在臨床試驗中該藥對晚期卵巢癌和許多其它癌癥顯示出驚人的30-40％的響應(yīng)率。但是這種藥供應(yīng)不足。
目前，用有機溶劑從粉碎的短葉紫杉樹皮中提取紫杉醇有三個主要步驟，另有四個主要步驟進行色譜純化。該提取方法由粉碎的樹皮開始，將樹皮用甲醇在50-55℃滲濾三次。然后用甲醇濃縮提取液。接著將濃縮的甲醇提取液分配在二氯甲烷和水之間。將含紫杉醇的二氯甲烷餾分濃縮。將二氯甲烷濃縮液溶解在50/50丙酮己烷中，過濾混合物除去不溶物。該有機提取方法產(chǎn)生淡黃色漿狀物，其中固體含量約為粉碎樹皮的1.3％。
常規(guī)純化包括四個主要步驟進行。首先，將從提取方法中得到的丙酮己烷混合物在Florisil柱上用70/30己烷丙酮混合物進行色譜分離，得到含紫杉醇的餾分。然后將紫杉醇餾分濃縮至干。該步驟可重復(fù)進行多達(dá)九次。第二，將紫杉醇濃縮物在甲醇和水的混合物中結(jié)晶然后在丙酮和己烷的混合物中重結(jié)晶，得到純度85-95％紫杉醇。第三，將紫杉醇在裝有2.5％異丙醇或2.5％正-丁醇的二氯甲烷硅膠上進行色譜分離，得到純度為約98％的紫杉醇。第四，將紫杉醇溶解在丙酮中，溶液過濾，并將紫杉醇在丙酮∶己烷的混合物中重結(jié)晶。
這種有機相提取和色譜純化方　產(chǎn)生純度為99％的紫杉醇，約為粉碎樹皮的0.014％。通過這種技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇具有以下缺陷(i)提取和純化過程耗時；(ii)在苛刻環(huán)境下的長滯留時間；和(iii)總產(chǎn)率低。短葉紫杉樹皮通常是從成年樹(100-200年)獲得，收獲這種樹皮是困難和昂貴的，而且其供應(yīng)量有限。因此這種樹有滅種的危險。正在進行大量研究以尋找其它生產(chǎn)途徑和原材料來源。一些其它生產(chǎn)途徑包括從最相近的類紫杉醇，10-脫乙?；鶟{果赤霉素III進行全合成和半合成。其它原料包括裝飾紫杉針葉，嫩枝，新芽和植物細(xì)胞培養(yǎng)物。除了尚未完全實現(xiàn)的全合成(可能很難商業(yè)化)外，這些技術(shù)都需要從生物質(zhì)源中提取和純化類紫杉醇。
裝飾紫杉針葉可能成為非常有吸引力的原料資源。這種針葉中含有大量的類紫杉醇，而且為在苗圃和農(nóng)場容易繁殖的再生源。
但是，這種針葉存在著附加處理問題。這種針葉中含有大量的可被有機溶劑提取的蠟和非極性成分。一些非極性蠟可用己烷溶劑預(yù)洗除去。但是一些相近于類紫杉醇的組分在用二氯甲烷和甲醇混合物的主要常規(guī)溶劑提取中會與紫杉醇一起被提取出來，用有機溶劑從這種針葉中提取的總量為35-42％(與樹皮的25％比較)。然而其中相當(dāng)大的百分含量不是紫杉醇而是被一起提取出來的雜質(zhì)。最初的針葉中還含有大量的水(約60％)。
因此用針葉提取和純化紫杉醇的方法變得比前述用樹皮的方法更復(fù)雜，更浪費時間。
本發(fā)明涉及從含有類紫杉醇和蠟及其它組分的原料中提取和純化紫杉醇和類紫杉醇的方法和設(shè)備。本發(fā)明特別適用從漿果紫杉針葉中提取類紫杉醇，如紫杉醇。實施方案的特征在于臨界和接近臨界流體。
這里所用術(shù)語“臨界流體”意指于臨界壓力和臨界溫度的流體或大于臨界壓力和臨界溫度的流體。超臨界流體意指在大于臨界壓力和臨界溫度的流體，因此術(shù)語“臨界流體”為術(shù)語“超臨界流體”的上位概念。術(shù)語“接近臨界流體”意指接近于但不是在臨界壓力和/臨界溫度的流體；特別是在和大于臨界壓力但是在臨界溫度之下的流體。接近臨界流體用來說明具有密度類似于臨界流體的流體。為了方便，用“CoNC流體”表示臨界或接近臨界流體。
本發(fā)明一個實施方案的特征在于從含有類紫杉醇的原料中提取類紫杉醇的方法。該方法特別適用于那些含有在用常規(guī)溶劑提取技術(shù)時與類紫杉醇一起被提取出來的蠟和其它組分的原料。該方法包括將原料經(jīng)過脫蠟的步驟。脫蠟條件包括將原料經(jīng)過第一流體，這種第一流體為非極性CoNC流體。將蠟溶解在第一流體中以形成富蠟提取物和脫蠟原料。該方法進一步包括從脫蠟原料中分離類紫杉醇的步驟，即將脫蠟原料經(jīng)過第二流體以形成紫杉醇類提取物和剩余原料。第二流體是CoNC流體和極性共溶劑的混合物。將富蠟提取物和紫杉醇類提取物經(jīng)過色譜法以形成類紫杉醇和一個或多個洗脫液。
這里所用術(shù)語“非極性”意指偶極矩為0.0-0.1德拜的物質(zhì)。術(shù)語“極性”意指偶極矩約為0.1-1.7德拜的物質(zhì)。
優(yōu)選地，將洗脫液減壓以分離共洗脫的類紫杉醇。減壓從CoNC流體中將共洗脫的類紫杉醇沉淀。將用減壓分離CoNC流體得到的類紫杉醇用色譜技術(shù)純化以形成純化的類紫杉醇。
優(yōu)選地，將減壓后的第一和第二流體通過提取物冷卻器以形成基本上沒有類紫杉醇的CoNC流體，然后再循環(huán)，并除去廢物。
術(shù)語“基本上沒有類紫杉醇”意指與該方法步驟的起始原料比較只有很少的類紫杉醇。
色譜裝置包括一個或多個色譜柱，將通過第二流體期間吸附在第一柱上的類紫杉醇用相對極性的有機溶劑混合物(己烷∶正-丙醇∶甲醇三個梯度)或第三流體洗脫。第三流體由CoNC流體和不同于第二流體類型或濃度的共溶劑組成。將含有大量類紫杉醇的餾分再經(jīng)過附加柱進行色譜分離。將含有非類紫杉醇或少量類紫杉醇的餾分作為廢物處理或通過附加色譜方法作為洗脫液進行再處理和回收。而含有少量紫杉醇、并且不是廢物的餾份則經(jīng)過第四流體。第四流體由CoNC流體和極性共溶劑組成。第四流體的壓力和/或溫度比第三流體高或低以除去非類紫杉醇溶質(zhì)。因此調(diào)節(jié)第四流體的壓力和溫度并通過第一色譜柱再循環(huán)。
將含有類紫杉醇的餾分再經(jīng)過色譜柱然后用包括有機溶劑混合物的相對非極性流動相或第五流體洗脫。第五流體由CoNC流體和非極性共溶劑組成。適宜的有機溶劑混合物包括甲醇和乙腈的混合物。收集含有純化紫杉醇和相近的類紫杉醇的餾分。將不含類紫杉醇或含少量類紫杉醇的流動相作為廢物或再處理和再循環(huán)。將沒有類紫杉醇的流體/溶劑混合物用改變混合物的壓力和溫度進行處理以使雜質(zhì)從溶液中析出產(chǎn)生適于再循環(huán)的CoNC流體/混合共溶劑。
優(yōu)選地，CoNC流體選自二氧化碳；一氧化二氮；烷類，如丙烷；烯類，如乙烯；和氟碳化合物，如氯二氟甲烷。這些化合物在常溫和常壓下為氣體。但是在低溫和大氣壓以上時，這些化合物能形成CoNC流體。
優(yōu)選地，極性共溶劑選自甲醇，乙醇，丁醇，丙醇，二氯甲烷和丙酮的極性溶劑。
本方法的實施方案是提取含有紫杉醇，三尖杉林堿，漿果赤霉素III，10-脫乙?；鶟{果赤霉素III，脫乙?；仙即己兔撘阴；?7-表紫杉醇及其衍生物和前體的理想方案。本發(fā)明的實施方案適用于從再生原料如針葉中分離和提取紫杉醇和類紫杉醇組合物。
任意地，首先將針葉干燥除去水分并且處理擴大原料的有效表面積。典型的擴大表面積的方法包括粉碎或研磨。
本發(fā)明一個實施方案的特征在于從含有類紫杉醇和蠟及其它組分的原料中提取類紫杉醇的設(shè)備。該設(shè)備包括一個用于承裝原料，第一流體和第二流體的腔體。該設(shè)備還包括一個與上述腔體連接的第一流體源。第一流體包括CoNC流體。第一流體源能將第一流體送入上述腔體中以使原料經(jīng)過脫蠟條件。第一流體溶解原料中的蠟中而產(chǎn)生含蠟提取物和脫蠟原料。該設(shè)備還包括第二流體源。第二流體是流體和極性共溶劑的混合物。第二CoNC流體源與上述腔體連接。第二流體源能將第二流體送入上述腔體而形成紫杉醇類提取物和廢料。為了接收富蠟提取物和腔體中的類紫杉醇提取物，將上述腔體與色譜裝置連接以生成洗脫液和濃縮的類紫杉醇。
優(yōu)選地，色譜裝置包括一個或多個色譜柱。優(yōu)選地，將色譜柱與減壓裝置連接以降低洗脫液的壓力。經(jīng)過減壓可使與洗脫劑共洗脫的類紫杉醇釋放出來并可被進一步處理。
優(yōu)選地，將通過減壓裝置產(chǎn)生的類紫杉醇純化以得到純化的類紫杉醇。
優(yōu)選地，為了從減壓裝置中回收洗脫液將減壓裝置與提取物冷卻器連接。用冷卻從洗脫液中除去雜質(zhì)后可再循環(huán)洗脫液。
優(yōu)選地，通過與色譜裝置連接的管道和泵將除去類紫杉醇和廢料之后的第一和第二流體再循環(huán)。
本設(shè)備的一個實施方案的特征在于與紫杉醇純化裝置的一個或多個色譜柱及第一或第二流體源連接的管道。該管道用于接收流經(jīng)色譜柱到類紫杉醇洗脫液的第二流體。該設(shè)備還包括這種裝置，即將的第二流體從該管道作為類紫杉醇洗脫液送到第二個色譜柱，以分離類紫杉醇和產(chǎn)生沒有類紫杉醇的CoNC流體。
優(yōu)選地，將沒有類紫杉醇的CoNC流體減壓使雜質(zhì)從溶液中析出以產(chǎn)生適宜再循環(huán)的第二流體。
優(yōu)選地，該設(shè)備適用于接收二氧化碳；烷類，如丙烷；烯類，如乙烯；氟碳化合物，如氯二氟甲烷；和作為CoNC流體的一氧化二氮。優(yōu)選地，該設(shè)備適用于接收選自甲醇，乙醇，丙醇，丁醇，二氯甲烷和丙酮的極性溶劑。
本發(fā)明設(shè)備是適用于分離含有紫杉醇，漿果赤霉素III，10-脫乙?；鶟{果霉素III，三尖杉林堿，脫乙?；仙即己兔撘阴；?7-表紫杉醇理想設(shè)備。
本發(fā)明的實施方案能用含有20.9％甲醇的超臨界二氧化碳(在40℃和1，274帕)僅用21分鐘從裝飾紫杉針葉中提取0.048wt.％的紫杉醇(可獲紫杉醇的99+％)。這種紫杉醇的回收是驚人的和意想不到的。滯留時間短是非常重要的，因為它將顯著影響工廠的資金投入和生產(chǎn)成本。
本發(fā)明實施方案的特征在于通過改進滲透作用和溶解作用后的快速提取。與常規(guī)方法比較，該方法改進了生產(chǎn)能力和可測量性。該方法特征在于總效率高和方法步驟少。根據(jù)本發(fā)明制作提取液的特征在于使用最少的有機溶劑和改進了產(chǎn)品質(zhì)量。
本發(fā)明方法和設(shè)備可以增加對用于研究目的和臨床試驗的類紫杉醇的供應(yīng)。優(yōu)選原料包括針葉。本發(fā)明方法和設(shè)備是在存在有一般僅在針葉中所含雜質(zhì)存在下提取類紫杉醇。而且，本發(fā)明方法和設(shè)備適用從除紫杉針葉外的其它原料中提取紫杉醇。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將從以下的


和詳細(xì)描述中體現(xiàn)。
圖1為體現(xiàn)本發(fā)明特征的臨界流體提取和色譜設(shè)備的示意圖。
圖2為體現(xiàn)本發(fā)明特征的臨界流體提取和色譜設(shè)備的示意圖，包括再循環(huán)試劑，超臨界流體和共溶劑。
圖3是在228和280nm時從針葉樣品中得到的提取物的色譜圖。
圖4a和b為用本發(fā)明方法收集的餾分的色譜圖。
下面將詳細(xì)描述用于從漿果紫杉針葉中提取紫杉醇的本發(fā)明的方法和設(shè)備。這里所用紫杉包括各種漿果紫杉和短葉紫杉，及其它紫杉屬植物。
本發(fā)明特征在于使用CoNC流體作為溶劑。CoNC流體由在常溫下為氣體如二氧化碳和一氧化二氮的某些物質(zhì)組成。當(dāng)這些氣體被壓縮使條件接近或在其臨界壓力和溫度之上時，這種氣體顯示了高的溶解能力。
CoNC流體在表現(xiàn)出類液體密度的同時又表現(xiàn)出氣體的擴散性和粘滯性。由于其密度強烈依賴于溫度和壓力，CoNC流體表現(xiàn)出寬范圍溶解力。溫度和壓力的改變可以使溶解力變化一個或更多量級。CoNC流體進一步表現(xiàn)出超低表面張力，而且更容易滲透于微孔材料中。
具有本發(fā)明特征的，即從原料包括針葉中用CoNC流體提取類紫杉醇的設(shè)備(用數(shù)字11表示的)如圖1所示。設(shè)備11由四個主要部分組成提取器13；CoNC流體傳送裝置(用數(shù)字15表示)；色譜純化裝置(用數(shù)字17表示)；減壓裝置(用數(shù)字19表示)。
提取器13詳見圖1A。提取器13有一個倉20，該倉包含一個用于承裝原料的腔體21。原料最好被碾壓或研磨成細(xì)料。腔體21有一個入口23用于接受流體和一個出口25用于排出流體。CoNC流體從與入口23相連的提取器分流器27排出。閥門27a控制流經(jīng)分流器27的CoNC流體的流動。
提取器13裝有用于保持恒溫的溫控裝置(未畫)和裝料口(未畫)。這種提取器可用已知的Isco SFX2-10提取器。
腔體21的入口23與CoNC流體傳送裝置15相連。CoNC流體傳送裝置15由下列主要部分組成CoNC流體罐29，共溶劑罐31和注入泵33。注入泵33通過輸送管35連通腔體21的入口23。兩個閥門35a和35b控制輸送管35的流量。注入泵33用于接收來自共溶劑罐31的共溶劑和來自CoNC流體罐29的CoNC流體。注入泵33通過管道37與臨界流體罐29相連。閥門37a控制管道37內(nèi)CoNC流體的流量。
注入泵33通過兩個管道45和47與共溶劑罐31相連。管道45直接與注入泵33和共溶劑泵49相連。到注入泵33的共溶劑的流量由閥門45a控制。管道45內(nèi)的壓力由壓力計51監(jiān)測。
管道47直接與共溶劑泵49和共溶劑罐31相連。用共溶劑泵49從管道47抽入共溶劑，再從管道45壓出。通過管道47進入共溶劑泵49的共溶劑流量用閥門47a控制。
提取器出口25與色譜純化裝置17相連。色譜純化裝置17由兩個主要部分組成HPLC柱61和過濾器63。過濾器63是一個5微米過濾器，通過輸出管道65與出口25相連。通過管道65從提取器流出的CoNC流體經(jīng)過濾器67過濾。CoNC流體經(jīng)管道67進入HPLC柱61。HPLC柱61是正常相HPLC柱。
CoNC流體經(jīng)HPLC柱61至減壓裝置19。CoNC流體通過管道71流出HPLC柱61。輸出管道71內(nèi)的壓力由壓力計73監(jiān)測并由減壓閥71a控制。
減壓后的CoNC流體進入收集罐77。收集罐77包含一個固體或液體截留相，如50∶55二氯甲烷和甲醇的混合物。收集罐77存儲保留在CoNC流體中的紫杉醇，以及所有不蒸發(fā)的共溶劑。CoNC流體通過排氣口83排出。
操作中，干燥和碾碎或磨碎的原料，如碾碎或磨碎的漿果紫杉針葉，被放入提取器13的腔體21中。首先向原料中通入第一流體，如CoNC二氧化碳。第一CoNC流體是相對非極性的。將蠟和其它成分的原料溶解于CoNC流體，并通過腔體21的出口25和管道65排出。將留在CoNC流體中原料中的蠟和其它非類紫杉醇成分收集在收集罐77中并棄去。CoNC流體通過排氣口83排出。
接著，通過合并極性共溶劑，如甲醇，乙醇，或丙酮，和CoNC流體形成第二流體。注入泵33收到第二流體并通過管道35注入提取器腔體21。第二流體從原料中除去紫杉醇和其它類紫杉醇。帶有類紫杉醇的第二流體從腔體21通過出口25被排到色譜裝置17的HPLC柱61。HPLC柱61從第二CoNC流體中除去紫杉醇和其它類紫杉醇，如10-脫乙酰基漿果赤霉素III。
在第二流體中共同洗脫的類紫杉醇和其它雜質(zhì)被收集在收集罐77中。第二CoNC流體和共溶劑被減壓閥71a減壓，使類紫杉醇和其它雜質(zhì)離開溶液。CoNC流體通過排氣口83從收集罐77排出。
體現(xiàn)本發(fā)明特征的設(shè)備，其特征在于CoNC流體和共溶劑再循環(huán)，如圖2所示。類紫杉醇提取設(shè)備，用數(shù)字111表示，由下列主要部分組成提取裝置113；CoNC流體裝置(用數(shù)字115表示)；色譜裝置(用數(shù)字117表示)；減壓裝置(用數(shù)字119表示)。
提取腔113具有與圖1所示提取腔13相似的特性。即提取腔113有一個具有入口和出口(未畫)的內(nèi)部腔體(未畫)。提取裝置的腔體具有存放含類紫杉醇原料的能力。原料最好用干燥和研磨裝置(未畫)來干燥和減小顆粒。
提取裝置113通過與腔體(未畫)相連的管道135接受CoNC流體。由閥門135a控制通過管道135的流量。管道135與預(yù)熱器137相連。預(yù)熱器137調(diào)節(jié)CoNC流體和共溶劑混合物的溫度。預(yù)熱器137通過管道141與靜態(tài)混合器139相連。靜態(tài)混合器139將CoNC流體和共溶劑混合成均勻混合物以形成第二CoNC流體。
靜態(tài)混合器通過管道145與循環(huán)泵143相連，并通過管道149與共溶劑補充泵147相連。共溶劑補充泵147與含共溶劑容器(未畫)相連。共溶劑泵147具有將共溶劑注入管道141的能力，用以調(diào)節(jié)送入提取裝置113的CoNC流體內(nèi)共溶劑的濃度。
循環(huán)泵143通過管道153與過冷卻器151相連。過冷卻器151用于冷卻CoNC流體和CoNC流體/共溶劑混合物以調(diào)節(jié)溫度。過冷卻器151通過管道159a，159b和159c與CoNC流體儲藏罐155和存放由CoNC流體/共溶劑混合物組成的第二CoNC流體的儲藏罐157相連。
提取器113腔體的出口(未畫)與色譜裝置117相連。色譜裝置117由下列主要部分組成第一吸附柱161和第二吸附柱163。第一吸附柱161通過管道165與提取裝置113的腔體的出口(未畫)相連。閥門165a控制管道165內(nèi)第二CoNC流體的流量。
第一吸附柱161用于保存從原料中提取的紫杉醇，漿果赤霉素III，10-脫乙?；鶟{果赤霉素III，三尖杉林堿和其它感興趣的提取的類紫杉醇。第一吸附柱161通過分流器167與CoNC流體和CoNC流體/共溶劑混合物源相連。分流器167與CoNC流體儲藏罐155和CoNC流體/共溶劑混合物儲藏罐157相連。閥門167a控制流過管道167的流量。分流器167允許CoNC流體和CoNC流體/共溶劑混合物洗脫第一吸附柱161吸附的類紫杉醇。
第一吸附柱161通過管道169與第二吸附柱163相連。閥門169a控制管道169內(nèi)CoNC流體或CoNC流體/共溶劑混合物的流動。第二HPLC柱163與減壓裝置119相連。減壓裝置119的管道171接受來自第二吸附柱163的流體。流經(jīng)管道171流體的流量由閥門171a控制。管道171輸送洗脫后的紫杉醇和CoNC流體/共溶劑到減壓閥171b，紫杉醇加熱器173和紫杉醇分離器175。紫杉醇加熱器173稀釋第一流體和第二流體，使紫杉醇從紫杉醇分離器175內(nèi)的溶液中分離出來。
通過管道177從紫杉醇分離器175中移出紫杉醇。閥門177a控制通過管道177流體的流量。超臨界流體和超臨界流體/共溶劑混合物通過排放管179從紫杉醇分離器175移出。
管線179與提取劑冷卻器181相連。提取劑冷卻器181使CoNC流體和CoNC流體/共溶劑混合物的密度再次增加。
提取劑冷卻器181通過管道183a，183b和183c與第一CoNC流體儲藏罐155和第二CoNC流體/共溶劑混合物儲藏罐157相連。第一流體儲藏罐155存放CoNC流體。第二流體儲藏罐157存放CoNC流體和共溶劑組成的第二流體。閥門183a和183b控制管道183A，183B和183C內(nèi)流體的流動。
從柱161洗脫出的10-脫乙?；鶟{果赤霉素III帶有一定的CoNC流體/共溶劑混合物。管道169通過漿果赤霉素分流器191與減壓裝置119相連。閥門191a控制流經(jīng)漿果赤霉素分流器191流體的流量。從第一吸附柱161洗脫的10-脫乙?；鶟{果赤霉素III被導(dǎo)入漿果赤霉素分流器191。
漿果赤霉素分流器191與減壓閥193，漿果赤霉素加熱器195和漿果赤霉素分離器197相連。減壓閥193降低CoNC流體/共溶劑混合物的壓力。漿果赤霉素加熱器195稀釋CoNC流體和CoNC流體/共溶劑混合物。低壓和中溫的結(jié)合使10-脫乙?；鶟{果赤霉素III從漿果赤霉素分離器197內(nèi)的溶液中釋放出來。
10-脫乙?；鶟{果赤霉素III通過管道199從漿果赤霉素分離器197排出。閥門199a控制從漿果赤霉素分離器197流出的10-脫乙?；鶟{果赤霉素III的流動。
漿果赤霉素分離器197通過管道201與提取劑冷卻器181，第一流體儲藏罐155和第二流體儲藏罐157相連。管道201與管道179相連使CoNC流體和CoNC流體/共溶劑混合物被再循環(huán)。
第一吸附柱161通過第二分流器211與減壓裝置119相連。閥門211a控制流經(jīng)管道211的CoNC流體和CoNC流體/共溶劑混合物的流動。管道211與減壓閥213，提取劑加熱器215，廢物分離器217和分流器219相連。分流器219與管道171相連。分流器219接收來自第二吸附柱163的超臨界流體和超臨界流體/共溶劑混合物，形成再循環(huán)。閥門219a控制管道219內(nèi)的流動。
管道211收到來自第一HPLC柱161和分流器219的基本不含類紫杉醇的流體和CoNC流體/共溶劑混合物。減壓閥213降低流過管道211的CoNC流體和CoNC流體/共溶劑混合物的壓力。提取劑加熱器215加熱流過管道211的CoNC流體和CoNC流體/共溶劑混合物。減壓和加熱使廢料從廢物分離器217內(nèi)的溶液中分離。
廢料通過管道221從廢物分離器217排出。閥門221a控制流經(jīng)管道221的廢料的流動。
廢物分離器217通過管道221與提取劑冷卻器181，第一流體儲藏罐155和第二流體儲藏罐157相連。管道221與管道179相連，將CoNC流體和CoNC流體/共溶劑混合物運送到提取劑冷卻器181。提取劑冷卻器181濃縮該流體以便再循環(huán)。
損失的CoNC流體由CoNC流體補充泵225補充。CoNC流體補充泵225通過管道227a，b和c與第一流體儲藏罐155和第二流體儲藏罐157相連。CoNC流體補充泵225與CoNC流體源(未畫)相連。
操作中使用超臨界流體二氧化碳，干原料被研磨并被輸送到提取器113的提取腔。優(yōu)選干原料為漿果紫杉針葉。原料用第一流體脫蠟。第一流體為密度為0.8g/mL的臨界流體二氧化碳。在約1000psi(壓力)下從第一流體儲藏罐155抽出二氧化碳飽和液體，稍微冷卻以避免泵壓時出現(xiàn)空窩現(xiàn)象。循環(huán)泵143給第一流體加壓至提取壓力3000psi并使其通過靜態(tài)混合器139和預(yù)加熱器137，使二氧化碳達(dá)到提取溫度40℃。非極性二氧化碳從原料中提取非極性蠟和一些類紫杉醇。
含蠟提取劑流過第一吸附柱161，該柱留下紫杉醇。通過反向調(diào)壓器213使二氧化碳流過閥門211a。經(jīng)此過程，二氧化碳的壓力降至1100psi，溫度也相應(yīng)的下降。
第一流體在提取劑加熱器215中重新加熱至約40℃。在此條件下，超臨界二氧化碳的密度只有約0.2g/mL，使得攜帶的蠟幾乎沒有溶解性，因而留在廢物回收分離器217中。然后，純化后的二氧化碳流到提取劑冷卻器181液化，并回到第一CoNC儲藏罐155。
接著對脫蠟原料用第二流體進行紫杉醇提取/吸收。第二流體包含超臨界二氧化碳和極性共溶劑如丙酮的混合物。第二流體用循環(huán)泵143從第二儲藏罐157抽出。向液流中加入一些共溶劑以補充上述循環(huán)過程中的損失。該混合液流經(jīng)過靜態(tài)混合器139以保證均勻性，再經(jīng)過預(yù)熱器137進入提取腔113。提取條件與脫蠟步驟所用條件基本相同。
含有紫杉醇，類紫杉醇和雜質(zhì)的提取劑被泵抽至第一吸附柱161，在此紫杉醇和相似化合物分別被吸收。
接下來，將提取腔113從管路下線，檢修，卸料或重新裝料。用第三流體將紫杉醇從第一吸附柱161洗脫。第三流體由二氧化碳和共溶劑組成。第三流體中極性溶劑的濃度比在第二流體混合物中有所增加。液流離開第一吸附柱直接通過閥門211a直到紫杉醇/三尖杉林堿帶開始洗脫，在此液流被導(dǎo)流，通過閥門169a到第二吸附柱163。第二吸附柱163吸收紫杉醇，三尖杉林堿，類紫杉醇和其它雜質(zhì)。因為超臨界流體/共溶劑混合物也具有使?jié){果赤霉素從硅膠柱解吸附能力，所以洗脫劑被導(dǎo)向通過閥門191到另一減壓環(huán)路，在此，漿果赤霉素在漿果赤霉素分離器197中被回收?；厥盏臐{果赤霉素會含有在該提取步驟已經(jīng)通過硅膠柱的其它物質(zhì)，因此在使用之前需要進一步純化。
漿果赤霉素回收之后，臨界流體/共溶劑混合物經(jīng)過提取劑冷卻器181到達(dá)CoNC流體/共溶劑儲藏罐157進行再循環(huán)。
無類紫杉醇液流離開吸收柱161和163被導(dǎo)向通過閥門219a，接著經(jīng)過減壓去掉雜質(zhì)。然后，溶劑流經(jīng)過提取劑冷卻器181和CoNC流體/共溶劑儲藏罐157進行再循環(huán)。
接著，用第四流體將紫杉醇從第二吸附柱163洗脫。第四流體由CoNC流體和極性共溶劑組成。共溶劑的濃度比第二流體中的低。因此，第四流體比第二流體極性小。通過紫杉醇分離器175降壓回收類紫杉醇。CoNC流體/共溶劑混合物重被引入提取劑冷卻器181進行再循環(huán)。回收的紫杉醇中將含有一定量的共溶劑，可以通過蒸發(fā)，濃縮和再循環(huán)除去。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到第一，第二，第三和第四流體可有相同或相似的CoNC流體組分，或可有不同的CoNC流體組分并在分開的回路中操作。類似的，第二，第三和第四流體可有相同或相似的共溶劑成分，或可有不同的共溶劑成分但在分開的回路中操作。該方法和設(shè)備可延用到包含更多流體的附加色譜過程。實施例A.概述所用HPLC級有機溶劑有來自Baker的乙腈，氯仿，己烷和二氯甲烷，來自EM Science的丙酮。還用了純甲苯(Mallinckrodt)，對茴香醛(Sigma)，對羥基苯甲酸丁酯(Sigma)和無水乙醇(Baker)。所用臨界流體溶劑為來自Associated Gas Products，Everett，MA的CP級(98％+)二氧化碳(CO2)，一氧化二氮N2O)，丙烷(C3H8)和氟利昂-22或氯二氟甲烷(CHClF2)。
所用的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)是來自National Cancer Insitute的漿果赤霉素III(lot#330753)，三尖杉林堿(lot#318735)和紫杉醇(lot#s125973和125973-L/24)和來自顧問Dr.David G.I.Kingston，Virginia Polytechnic Institute and State University，Blacksburg，VA的10-脫乙?；仙即?lot#GS-6S-170-4)，10-脫乙酰基-7-表紫杉醇(lot#GS-6S-170-3)和7-表紫杉醇(lot#GS-6S-172-1)。lot#125973-L/24紫杉醇因含有雜質(zhì)而未被用作標(biāo)準(zhǔn)。純標(biāo)準(zhǔn)溶液在甲醇中制備。混合標(biāo)準(zhǔn)被用于評價用不同流動相和常液梯度模式產(chǎn)生的共洗脫和干擾峰。還使用了來自NCI的相對純的紫杉醇-三尖杉林堿切邊(side cut)(lot#624955-1/13/0)。
所用原料為來自Renkema Farms，Zelenka Nursery，Grand Haven，MI的新伐12″徑粗的紫杉(Taxus media)“Hicksii”。手工采下針葉并在60℃爐中烘烤過夜；干葉重量一般約為原來的40％。用Janke &Kunkel 20000rpm粉碎機將干針葉粉碎成碎末(70目)。對紫杉衍生物(Taxenes)的HPLC分析由計算機控制的三元梯度系統(tǒng)(Model 2350泵/Model2360控制器及Model V4變波長探測器，Isco，Lincoln，NE)和Rheodyne Model 7125注射器進行。15cm，5μm Phenyl柱和Phenyl保護柱(Rainin，Woburn，MA)一起使用。三元系統(tǒng)用作梯度系統(tǒng)，其中A＝60％甲醇，B＝40％甲醇/40％乙腈，C＝100％甲醇。流速為1.0mL/min，波長為228nm。該梯度使各標(biāo)準(zhǔn)之間極好的分開，并且在距溶劑前鋒到達(dá)很遠(yuǎn)的地方就移出了漿果赤霉素III，從而可對某些樣口定量化。還使用了常液流動相，流速為1.0mL/min，含有55％甲醇12％乙腈，并在228nm進行探測。我們的HPLC分析技術(shù)依據(jù)NCI和Polyscience，Inc.(Bio-Eng23.8％紫杉醇和44.3％三尖杉林堿對NCI23.8％紫杉醇和43.6％三尖杉林堿)的紫杉醇/三尖杉林堿分析被證實為可靠的。
所用其它分析和制備儀器有單光束UV/VIS光譜儀(Hitachi，Model100-10)，帶Friedrichs冷凝器和Whatman纖維套管(VWR)的Soxhlet提取器，微旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(Buchler Instrument，Model 4214-000)和帶二苯基和硅膠盤的薄層色譜系統(tǒng)。該薄層色譜系統(tǒng)對類紫杉醇明顯不如HPLC靈敏，因此很少使用。
紫杉醇分析的常用方法包括用有機溶劑提取，二氯甲烷分配和在苯基柱上用乙腈-甲醇-水流動相測定。雖然這些系統(tǒng)對從樹皮樣品提取工作良好，但針葉樣品含有在反相系統(tǒng)中與紫杉醇共洗脫的化合物。用甲烷提取，二氯甲烷分配和小柱清洗的分析方法已發(fā)展成定量分析共洗脫化合物對吸收(光譜)數(shù)據(jù)在228nm和280nm的紫杉醇純度的影響。
對于在漿果紫杉針葉和樹皮中測定紫杉醇的方法已有一些發(fā)表。本實施例的特征在于采用簡化提取技術(shù)，用小硅膠柱清洗，最后用228nm和280nm的吸收數(shù)據(jù)作定量分析的方法。該方法成功之處在于正確判定共洗脫雜質(zhì)，而以前發(fā)表的方法則無法確定之。
該HPLC系統(tǒng)由ISCO三元梯度儀(Lincoln，NE)組成，它包括一個進行常規(guī)分析的ISCO V4探測器，一個在228nm和280nm同時進行定量分析的ISCO S500探測器和一個用于產(chǎn)生三維譜掃描的SpectraPhysicsSpectra Focus Model SFl01-0122探測器。小硅膠柱(01-00 SPICECartridges)從Rainin Instrument Company，Woburn，MA獲得。用于柱色譜的硅膠為EMScience提供的Cat.No.10180-3 Silica Gel 40，70-230目。
紫杉樹枝樣品在60℃干燥16-20小時。從樹枝上弄下針葉，放入Waring攪拌機粉碎，然后通過70目篩。未通過篩子的原料重新粉碎直到90％的樣品通過。
將200mg粉碎后的樣品裝入40mL的小瓶。加入30mL甲醇并用磁性攪拌器攪拌過夜。提取液通過#40 Whatman濾紙進入裝有15mL水和10mL二氯甲烷的250mL分液漏斗。提取容器用30mL二氯甲烷洗滌，洗滌液過濾后進入分液漏斗。
甲醇-水相用三體積二氯甲烷(每次50mL)提取，然后將提取液倒入250mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(長頸)瓶中。根據(jù)需要可再加入水或甲醇以保證該相分離。提取持續(xù)進行直至收集總體積為200mL。蒸發(fā)提取液至看上去干燥。殘留的痕量水先用20mL丙酮接著用25mL己烷除去，再提取至干燥，然后將樣品重新溶于8mL二氯甲烷。
將提取液的二氯甲烷溶液緩慢通過小硅膠柱，然后用另外4mL二氯甲烷洗滌。這次洗滌除去蠟和非極性物質(zhì)；在接近小柱頂部的綠色譜帶得到紫杉醇。將洗脫劑改為4％丙酮的二氯甲烷，當(dāng)綠色帶開始移出小柱時停止洗脫。洗脫劑再改為20％丙酮的二氯甲烷，用這種溶劑分兩次(每次10mL)將含紫杉醇綠色帶從小柱上洗脫。提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥，剩余物溶解于2.00mL甲醇中。
HPLC柱是Rainin 80-D15-C5 Microsorb5微米，具有1.5cm苯基保護柱的4.6mm×15.0cm苯基固定相柱。流動相是12％乙腈和55％甲醇，其余部分是水。流速是1.0mL/min。0.05mg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇在甲醇中制備。標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇和樣品紫杉醇注射體積均為10微升。峰高在228nm和280nm以雙道方式測量，并用下列公式計算紫杉醇紫杉醇 其中C＝濃度，mg/mLH＝228nm道峰高PF＝從公式2(見下文)A(280)/A(228)吸收率計算的紫杉醇峰純度因子紫杉針葉和樹皮提取液的制備用經(jīng)典有機相提取以及超臨界流體提取。在我們實驗室采用在苯基柱上用反相HPLC進行分析，在228nm進行單波長檢測，產(chǎn)生的紫杉醇中干生物質(zhì)的含量在0.04-0.05％范圍內(nèi)。然后將部分提取液送National Cancer Institute，F(xiàn)rederick，Maryland進行鑒定分析。他們用帶發(fā)光二極管陣列探測器的HPLC儀分析，結(jié)果表明在針葉樣品中含有在280nm大量吸收的物質(zhì)。樹皮樣品，紫杉醇參照混合物中的所有化合物以及純紫杉醇沒有表現(xiàn)出有這種共洗脫化合物。這一雜質(zhì)的發(fā)現(xiàn)促使我們試圖將其分離，因為基于它的譜特性，而使它在紫杉醇峰中的存在可得到補償。
由于在反相系統(tǒng)中干擾化合物和紫杉醇共洗脫，因此我們用正相系統(tǒng)進行分離。將27g紫杉樹“Hicksii”針葉樣品用甲醇-甲苯提取并在22mm×250mm硅膠柱上色譜分離。進行快速分離，用50％丙酮的二氯甲烷將紫杉醇部分從柱上洗脫。將提取液蒸發(fā)至干，重新溶解于9％丙酮的二氯甲烷中，再置于第二個22mm×250mm的硅膠柱上，該柱已被用9％丙酮的二氯甲烷平衡。丙酮梯度開始緩慢變化，在270nm用光譜儀監(jiān)視丙酮濃度。
隨著丙酮的濃度從9％逐漸遞增至15％收取到13份200mL樣品。#4樣品在紫杉醇保留時間區(qū)的峰形與在針葉樣品色譜掃描圖(圖3a和3b)280nm處看到的峰形完全吻合。這些干涉峰的譜掃描表現(xiàn)出一些通性。各干涉峰的最大吸收值非常接近于280nm，最小吸收值接近于235nm，A(280)/A(228)的響應(yīng)率約為3.5。
#5樣品表現(xiàn)的吸收形狀與#4樣品相似，只是前者的量僅為后者的38％。#6，#7和#8樣品在同樣色譜形狀上表現(xiàn)為質(zhì)量減少。#8樣品基本上沒質(zhì)量。紫杉醇在#9樣品中的第一表現(xiàn)是其具有一個只有少量三尖杉林堿的大(面積)峰。#10具有紫杉醇和三尖杉林堿大峰。這些紫杉醇樣品的譜掃描圖與純紫杉醇的相同，A(280)/A(228)的比值約為0.05。
還建立了用于計算紫杉醇峰的PF(純度因子)的聯(lián)立公式其中A(280)＝AT(280)＋AU(280)A(228)＝AT(228)＋AU(228)
A(280)＝在280nm的總吸收AT(280)＝由于紫杉醇而在280nm的吸收AU(280)＝由于未知成分而在280nm的吸收其中K1＝AU(280)/AU(228)＝3.50(計算值)K2＝AT(280)/AT(228)＝0.05(計算值)K3＝A(280)/A(228)則PF=AT(228)A(228)=K1-K3K1-K2]]>將我們的測量值代入K2和K1得到下式PF＝1.0145－0.29×A(280)/A(228)(2)上式用于校正實驗結(jié)果。大多數(shù)樣品給出的吸收率約為0.35，因而純度因子為0.91。因此，用反相HPLC在苯基柱上通過測量在228nm的吸收測得的裝飾紫杉和紫杉樹“Hicksii”的針葉中紫杉醇的含量為0.050％，對應(yīng)于干生物質(zhì)重量基礎(chǔ)應(yīng)修正為0.046％。其它人員在用苯基柱分析紫杉醇時應(yīng)注意他們的紫杉醇峰可能隱含干涉峰，因此，除了在280nm處進行監(jiān)視之外，還要通過對紫杉醇峰進行譜掃描和/或在280nm監(jiān)視來檢查干涉峰。實施例1有機相提取在臨界流體提取和純化實驗的同時，使用一些有機相提取技術(shù)是為了比較。這些技術(shù)通常包括己烷洗滌，甲醇(M)/二氯甲烷(MC)提取，三至四步二氯甲烷-水相分配，然后蒸發(fā)至干并重新溶解于甲醇。HPLC分析之前用小硅膠柱(1cm)清除雜質(zhì)。
首先，用己烷沖洗干粉末，除去非極性蠟。使用兩道工序Soxhlet提取和在室溫下用攪拌棒在過量己烷中混合，后者被稱為Snader技術(shù)。該工序所用時間為8至24小時。
將己烷提取液干燥，重新溶解于己烷，過濾，用己烷丙酮洗脫劑在小硅膠柱上清洗。將己烷沖洗過的針葉干燥并用50/50M/MC混合物提取。這一采用Soxhlet技術(shù)的提取進行3小時，然后放置12-15小時；采用Snader技術(shù)，樣品允許旋轉(zhuǎn)過夜。粗M/MC提取液被蒸發(fā)至干并再溶解于MC。將等分的樣品和蒸餾水混合，然后在分液漏斗分配。
將MC相漏入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，用MC重新提取水相(可多達(dá)三次)。用少量甲醇破壞因Snader提取形成的水/MC乳液。MC部分用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法干燥并配衡。干MC提取物重新溶解于甲醇用以HPLC分析。這些實驗的結(jié)果以紫杉醇與初始干生物質(zhì)的重量百分比和純度與干提取物的重量百分比表示，列于表1。
表1 紫杉針葉中紫杉醇的有機相提取
實施例2臨界流體相提取早期實驗表明針葉中水的存在阻礙了臨界流體提取。因此，全部隨后的實驗均在干燥，碾碎的漿果紫杉針葉上進行以最大限度地減小質(zhì)量傳輸障礙和增大暴露表面積。第二系列實驗的結(jié)果表明，正如所預(yù)料的，臨界流體提取受溶劑極性控制。在這一系列中，樣品順序地用增加了極性的臨界流體溶劑提取。這些實驗全部在3000psi和60℃下進行，結(jié)果列于表2。
表2 臨界流體提取的極性作用
上面表2中，紫杉醇的百分比基于原始干樣品質(zhì)量，純度百分比基于提取物質(zhì)量。實施例3進行一些實驗以確定和改進氟利昂-22，氯二氟甲烷(CHClF2)結(jié)果。例如，TAXC-7的實驗僅用20分鐘便由10樣品體積的氟利昂-22完成。進行一些實驗以估計體積流通量和滯留時間對提取效率的影響。還有一些實驗用以確定極非極性蠟是否抑制紫杉醇到臨界流體相的質(zhì)量傳導(dǎo)。這些實驗證明用100樣品體積臨界流體完全足以從一個樣品中提取全部紫杉醇，極性蠟確實阻礙紫杉醇的質(zhì)量傳導(dǎo)。結(jié)果，隨后實驗均用至少100倍樣品體積的臨界流體溶劑，對或用己烷沖洗或用超臨界流體二氧化碳(SCF CO2)提取了的針葉進行。SCF CO2，由于其在試驗條件下的非極性和密度，其行為非常象己烷，從針葉提取極性蠟約為7％，并且無紫杉醇。
為了替換作為臭氧耗盡物的氟利昂-22，SFC CO2的極性被添加的甲醇改善。溫度，壓力和共溶劑條件的選擇基于氟利昂-22在3000psi和60℃下的Hildebrand溶解系數(shù)。這些實驗的結(jié)果列于表3。
表3 用SCF CO2/21MOL％甲醇提取紫杉醇
基于殘余物的有機相提取/HPLC分析，用這些實驗提取出可得性紫杉醇的約99+％。實施例4壓力和溫度的影響對壓力，溫度和甲醇濃度靈敏性的實驗結(jié)果列于表4。
表4 用SCF CO2/甲醇提取紫杉醇
列于表4的實驗中殘余物的SCF提取物和有機相提取物的平均紫杉醇含量為0.0468±0.0022；在TAXC-25和26的殘余物中未發(fā)現(xiàn)紫杉醇。TAXC-29和30最接近氟利昂結(jié)果(列于表2中的TAXC-7)。實施例5臨界流體提取和純化(CXP)不使用極性改變劑，用氟利昂-22確定HPLC硅膠柱(Water′sMicroporasil)是否能將紫杉醇從臨界流體相中有選擇的分離。這些實驗結(jié)果列于表5。
表5 用HPLC反壓柱對臨界流體提取和紫杉醇純化的影響
每個實驗的初餾物在50∶50M∶MC溶劑井中收集。每種情況下，在初餾物中收集不到紫杉醇但收集大量物質(zhì)。例如，從TAXC-34的初餾物中收集到原始干樣品質(zhì)量的12.1％，用TAXC-34F表示。表5中的TAXC-34C指的是選擇性地分散在HPLC硅膠柱上的材料(樣品質(zhì)量的2.3％)。該物質(zhì)，實驗完成后用甲醇從柱上洗脫，用反相HPLC色譜測定其含有0.626％紫杉醇。在臨界流體處理的樣品TAXC-34R中紫杉醇的殘余濃度用有機相提取和反相HPLC色譜分析確定為0.0324％。因此，樣品TAXC-34的紫杉醇總含量為0.0470％，其中31.1％為純化因子13(0.626/0.047)所致。表5中的數(shù)據(jù)說明最優(yōu)結(jié)果是TAXC-32C用2000psig反壓得到的，即用35的純化因子回收到34.9％的紫杉醇。實施例6用超臨界CO2/極性共溶劑的CXP為替換氟利昂-22，要評價一些帶SCF CO2的共溶劑系統(tǒng)。甲醇不在是所選共溶劑因為它比紫杉醇在硅膠柱上的吸收更具有優(yōu)勢。這一點在小硅膠柱實驗和以后在HPLC硅膠柱實驗中得到證實。評價的共溶劑有甲醇，二氯甲烷，丙酮，丁醇和乙醇，在SCF CO2中均為10摩爾％，在3000psig和60℃下；所有實驗使用反壓2000psig。在用甲醇和乙醇作共溶劑的實驗的初餾物中發(fā)現(xiàn)大量紫杉醇，用丁醇的結(jié)果不明確。
用二氯甲烷和丙酮作共溶劑(10摩爾％)進行的實驗初餾物中未發(fā)現(xiàn)紫杉醇。約一半紫杉醇(0.0242％)以純化因子16在以二氯甲烷為共溶劑的硅膠柱實驗(TAXC-36C)中得到。SCF CO2/丙酮實驗(TAXC-37C)從硅膠柱產(chǎn)生少量紫杉醇(0.0147％，以純化因子15)。實施例7用梯度色譜的CXP通過從置于HPLC柱頂部的原料色譜洗脫進一步改進純化因子。因為HPLC柱的歷史和滯留行為是未知的，我們選擇一種梯度方式，即從低極性到中極性。這些實驗結(jié)果列于表7。
表7 共溶劑濃度和壓力對紫杉醇臨界流體提取和純化的影響
從硅膠柱上回收的％紫杉醇由總紫杉醇(七個實驗，TAXC-34至40的平均值0.047±0.0025％)與生物質(zhì)殘余物中的紫杉醇之差決定；在初餾物中未見紫杉醇。TAXC-41C是在1.0ml/min流量和60分鐘內(nèi)用己烷∶二氯甲烷∶甲醇梯度色譜洗脫的。首先在228nm吸收將25個餾分收集在配衡容器中；收集容器在色譜掃描中的每個峰谷被更換。將這些餾分蒸發(fā)至干并稱重以確定提取重量。為在反相苯基柱上進行常規(guī)HPLC分析將這些餾分重新溶解于適量甲醇中。假定的“紫杉醇帶”的色譜圖表明這一餾分主要是由紫杉醇和三尖杉林堿組成。相鄰色帶的分析表明約95％的紫杉醇已從假定的“紫杉醇帶”中洗脫。由于只有少量物質(zhì)被回收，因此還不能確定紫杉醇的純度；然而純度估計約為17％，純化因子近似于360。
表7中的TAXC-43C由于其臨界流體提取，有選擇的附著和色譜洗脫條件而不同于TAXC-41C。對于TAXC-43C，一種非己烷洗滌的樣品(TAXC-42)首先用100倍樣品體積SCF CO2在2000psig和40℃下提取以除去蠟和其它非極性成分。該提取物，占樣品干質(zhì)量的6.6％，不含紫杉醇。用含有10摩爾％丙酮的TAXC-43的SCF CO2提取從TAXC-42得到的殘余物。提取過程在2000psig和41℃下進行以使商業(yè)部門的資本和操作費用最省。另外，該系統(tǒng)的運行應(yīng)盡可能接近常液以使臨界流體再壓縮費用最省。
附著的紫杉醇和其它雜質(zhì)用己烷∶正丙醇∶甲醇從硅膠柱上色譜洗脫，使用三元梯度法是為了增加餾分的溶解能力。在此過程中，只有7個餾分示于圖4a。將這些餾分收集于配衡容器，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥，再溶解于甲醇并分析。餾分#5(假定的“紫杉醇帶”)的HPLC色譜圖示于圖4b。該掃描圖表明紫杉醇帶主要含有紫杉醇和三尖杉林堿。對于餾分#5，其純化因子約為130，基于HPLC分析的純度百分比為6.2％，重量為4.0毫克。
TAXC-45C和TAXC-47C以與TAXC-43C相同方式進行；三個過程均采用SCF CO2洗滌處理。對于TAXC-45C，由于含有18摩爾％丙酮的SCF CO2極性強得使紫杉醇遍布整個柱，而使紫杉醇沒有以尖峰形式被從柱上色譜出來。這可以在獨立的小硅膠柱實驗中確定。對于TAXC-47C，高濃度二氯甲烷(21摩爾％)的SCF CO2對滯留紫杉醇在HPLC柱頂部是有效的，但沒有用21摩爾％甲醇共溶劑從原生物質(zhì)中提取紫杉醇有效。這里描述的臨界流體提取和色譜純化方法表現(xiàn)出對紫杉醇比對三尖杉林堿更具有選擇性。在TAXC-43C的餾分#5中紫杉醇對三尖杉林堿的濃度比為2.22(參見圖4b)，而在針葉中這一比值的測量結(jié)果為1.08。對于TAXC-45C和TAXC-47C，所得的相似的T/C比值分別為2.04和2.08。
從SCF CO2洗滌樣品的提取物和從TAXC-43，45和47的初餾物中進行提取的實驗表明10-脫乙酰基漿果赤霉素III和漿果赤霉素可以從一些極性可溶物質(zhì)和紫杉醇中有效地提取。我們還發(fā)現(xiàn)在試驗條件下漿果赤霉素極易溶解于含極性共溶劑的SCF CO2，而且在高極性條件下(大于20％丙酮，有利于用臨界流體進行提取和純化的條件)漿果赤霉素可以被有選擇地吸附在硅膠柱上。
權(quán)利要求
1.一種從含有類紫杉醇的原料中提取類紫杉醇的方法，包括以下步驟a)將所說原料經(jīng)過第一流體對原料進行脫蠟，第一流體由臨界或接近臨界流體組成，所說的蠟溶解于第一流體形成富蠟提取液和脫蠟原料；b)將所說脫蠟原料經(jīng)過第二流體，該流體含有臨界或接近臨界流體和極性共溶劑，形成類紫杉醇提取劑和廢料；c)用色譜法將類紫杉醇從所說類紫杉醇提取液的雜質(zhì)中分離，產(chǎn)生類紫杉醇和洗脫液。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所說色譜法包含至少一個柱。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所說色譜法包含第一柱和第二柱，所說第一柱包括一個用于保留類紫杉醇的正相硅膠吸附柱，所說第二柱包括用于分離或純化類紫杉醇的反相吸附柱。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所說富蠟提取液由所說第一柱接收，所說第一柱留有在臨界或接近臨界流體/共溶劑混合物中洗脫的類紫杉醇。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所說類紫杉醇提取液由所說第一柱接收，所說第一柱留有類紫杉醇，并洗脫放出所說類紫杉醇到臨界或接近臨界流體/共溶劑混合物中形成第一類紫杉醇洗脫液，對所說第一類紫杉醇洗脫液減壓生成類紫杉醇和臨界或接近臨界流體/共溶劑混合物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所說留在所說第一柱上的類紫杉醇是用第三流體從柱上洗脫的，并形成第二洗脫液，所說第三流體包括臨界或接近臨界流體和極性共溶劑的混合物，所說極性共溶劑的極性比所說第二流體強。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所說第二洗脫液進入所說第二柱，所說第二柱留有類紫杉醇和放出臨界或接近臨界流體和共溶劑的混合物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所說留在所說第二柱上的類紫杉醇用第四流體洗脫，形成類紫杉醇洗脫液，所說第四流體包括臨界或接近臨界流體和極性共溶劑的混合物，所說共溶劑的濃度小于所說第二流體的濃度。
9.權(quán)利要求8的方法，將其中所說類紫杉醇洗脫液減壓生成類紫杉醇和基本無類紫杉醇的臨界或接近臨界流體與共溶劑的混合物。
10.權(quán)利要求5，7或9的方法，在除去類紫杉醇后將所說臨界流體和共溶劑的混合物再循環(huán)。
11.權(quán)利要求3的方法，其中所說臨界流體或接近臨界流體和共溶劑被再循環(huán)直至將類紫杉醇從所說第一柱上洗脫出來隨后使其進入第二柱，所說類紫杉醇是用第二柱吸附，產(chǎn)生基本上沒有類紫杉醇的臨界流體或接近臨界流體/共溶劑混合物。
12.權(quán)利要求11的方法，將其中所說沒有類紫杉醇的臨界流體或接近臨界流體/共溶劑混合物減壓使雜質(zhì)從溶劑中除去產(chǎn)生基本上沒有類紫杉醇的臨界流體或接近臨界流體/共溶劑混合物。
13.權(quán)利要求5的方法，其中所說類紫杉醇漿果赤霉素III和10-脫乙酰基漿果赤霉素III是從第一柱洗脫出來的。
14.權(quán)利要求5的方法，其中所說用減壓產(chǎn)生的純化的類紫杉醇是漿果赤霉素III和10-脫乙酰基漿果赤霉素III。
15.權(quán)利要求9的方法，其中所說用減壓產(chǎn)生的類紫杉醇是紫杉醇和三尖杉林堿。
16.權(quán)利要求5，7或9的方法，將其中所說的臨界流體或接近臨界流體和共溶劑混合物通過提取冷卻器形成純化的臨界流體或接近臨界流體和共溶劑混合物，然后將其再循環(huán)。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所說共溶劑是選自甲醇，乙醇，丁醇，丙醇，二氯甲烷和丙酮的極性溶劑。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所說超臨界流體是由一種或多種選自二氧化碳，氟化烴和一氧化二氮的氣體組成的。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所說類紫杉醇選自紫杉醇，三尖杉林堿，漿果赤霉素III和10-脫乙酰基漿果赤霉素III，脫乙?；仙即?，和脫乙?；?7-表紫杉醇中的一種或多種。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所說原料包括針葉。
21.權(quán)利要求12的方法，其中所說類紫杉醇是從第二柱上用臨界或接近臨界流體和極性共溶劑的混合物洗脫生成富類紫杉醇提取液，將所說富類紫杉醇提取液減壓和加熱，使所說類紫杉醇從所說洗脫液中分離。
22.一種從含蠟和其它成分的原料中分離類紫杉醇的設(shè)備，包括a)一個用于接受原料，臨界或接近臨界流體和共溶劑的腔體；b)一個與所說腔體相連的臨界或接近臨界流體的源，為的是將所說臨界或接近臨界流體直接送入所說腔體并將所說原料經(jīng)過脫蠟條件以形成富蠟提取液和脫蠟原料；c)蠟提取液接收裝置與所說提取腔相連，為的是接收所說富蠟提取液；以及d)與所說腔體相連的臨界或接近臨界流體和極性共溶劑源，為的是將所說臨界或接近臨界流體和極性共溶劑直接送入所說腔體并將所說原料經(jīng)過提取條件以形成紫杉醇提取液和廢料；e)與所說提取腔相連的類紫杉醇純化裝置，為的是接收所說蠟提取液和類紫杉醇提取液，并用色譜法分離生成類紫杉醇和洗脫液。
23.權(quán)利要求22的設(shè)備，其中所說蠟提取液接收裝置與漿果赤霉素純化裝置相連以便從所說富蠟提取液中分離漿果赤霉素，進而生成漿果赤霉素和無紫杉醇的臨界或接近臨界流體。
24.權(quán)利要求22的設(shè)備，其中所說類紫杉醇純化裝置包括第一硅膠吸附柱和第二反相柱。
25.權(quán)利要求24的設(shè)備，其中所說類紫杉醇從所說第二反相柱洗脫，形成富類紫杉醇洗脫液，將所說洗脫液減壓加熱以生成類紫杉醇和基本無類紫杉醇的臨界或接近臨界流體/共溶劑混合物。
26.權(quán)利要求22的設(shè)備，將其中所說富蠟提取液和洗脫液減壓和加熱，形成廢料和臨界或接近臨界流體，臨界或接近臨界流體/共溶劑混合物用于再循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于從含有類紫杉醇的原料中分離類紫杉醇的方法和設(shè)備。該方法和設(shè)備用臨界或接近臨界流體將裝飾紫杉針葉中的類紫杉醇與蠟和其它成分分離。
文檔編號A61P35/00GK1121347SQ94191805
公開日1996年4月24日 申請日期1994年3月10日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月12日
發(fā)明者特瑞沃P·卡斯特 申請人:阿菲歐斯公司