專利名稱：用于感染或炎癥病灶位點(diǎn)造影的標(biāo)記趨化肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及趨化肽和它們?cè)跈z測(cè)個(gè)體中感染和炎癥位點(diǎn)及治療組織損傷中的應(yīng)用。
相關(guān)技術(shù)的描述對(duì)各種形式的組織損傷應(yīng)答而發(fā)生炎癥。這種組織損傷可以是由微生物侵入、自身免疫過程、組織或器官同種移植排斥、或諸如熱、冷、放射能量、電或化學(xué)刺激、或機(jī)械創(chuàng)傷的傷害性外部影響造成的。無(wú)論其原因和軀體位點(diǎn)，隨后的炎癥反應(yīng)是很相似的，由一系列復(fù)雜的功能和細(xì)胞調(diào)節(jié)組成，包括微循環(huán)、液體運(yùn)動(dòng)的變化、及炎癥細(xì)胞(白細(xì)胞)的流入和激活。這種應(yīng)答方式構(gòu)成了宿主抗感染的固有防衛(wèi)機(jī)制的重要部分，雖然這帶來(lái)了由炎癥過程自身造成進(jìn)一步組織損傷的“代價(jià)”，但它最終促進(jìn)了隨后的修復(fù)過程。
當(dāng)微生物感染時(shí)或受到某種形式的組織損傷后，會(huì)合成可溶性化學(xué)物質(zhì)，它們引發(fā)炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括一系列復(fù)雜的過程。炎癥位點(diǎn)血流增加，并因毛細(xì)血管通透性增加，有液體從血液滲出。在受傷位點(diǎn)的這種液體滲出包括正常時(shí)離開毛細(xì)血管速度相當(dāng)慢的血漿蛋白。通過被動(dòng)或主動(dòng)過程，白細(xì)胞也通過毛細(xì)血管進(jìn)入炎癥位點(diǎn)。炎癥細(xì)胞滲出物起始主要由多形核(PMN)白細(xì)胞(也稱為中性白細(xì)胞或粒細(xì)胞)組成。隨后，在炎癥浸潤(rùn)物中可見單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞。
感染和炎癥位點(diǎn)的鑒別和鑒定對(duì)人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)中的診斷很重要。在早期局部感染時(shí)，常常需要搜尋個(gè)體中的“隱藏的炎癥位點(diǎn)”，其臨床癥狀無(wú)特異性，只是發(fā)熱和體重減輕。與此相似，在患自身免疫疾病如類風(fēng)濕性器節(jié)炎的病人中，或在排斥組織或器官同種移植物的受體中，確定炎癥位點(diǎn)、限定其范圍、及在治療開始后監(jiān)視其變化的能力對(duì)有效的臨床醫(yī)護(hù)都很重要。
因而，已付出很大努力并開發(fā)了許多技術(shù)以確定炎癥位點(diǎn)并估計(jì)炎癥過程的程度，這一點(diǎn)就不足為奇了。這些技術(shù)包括傳統(tǒng)X-射線技術(shù)、CAT掃描、和各種放射核掃描。(Sutton，A Textbookof Radiology and Imaging，3rd Ed.，Churchill Livingston(1980)；Maysey et al，Clinical Nuclear Medicine Ed.，W.B.Sanders(1983))。已使用的放射核掃描技術(shù)的例子包括1.67Ga(鎵)，注射后其與漿蛋白結(jié)合并趨于定位在慢性炎癥位點(diǎn)；
2.111In(銦)標(biāo)記的粒細(xì)胞，當(dāng)重新注入宿主時(shí)，其在炎癥位點(diǎn)累積；3.放射標(biāo)記的螯合物，其進(jìn)入細(xì)胞外液中然后在液體聚積點(diǎn)累積；和4.鉈掃描或所謂的首過放射核素血管造影，以估測(cè)血流增加的面積。
傳統(tǒng)的核醫(yī)學(xué)技術(shù)使用下列放射性藥物用于感染炎癥造影67Ga檸檬酸鹽，111In標(biāo)記白細(xì)胞，99mTc標(biāo)記的白細(xì)胞，和111In標(biāo)記的人多克隆IgG。雖然這些試劑中每種在特定情況下可產(chǎn)生有用的結(jié)果，但仍有相當(dāng)大的待改進(jìn)之處。
67Ga檸檬酸鹽在機(jī)制上可與111In-IgG(Mw150KD)一起歸類為標(biāo)記蛋白，因?yàn)殪o脈注射后67Ga檸檬酸鹽立即轉(zhuǎn)而與血漿中的循環(huán)運(yùn)鐵蛋白(MW100KD)和乳鐵蛋白(MW～100KD)螯合。用標(biāo)記蛋白進(jìn)行炎癥造影是其在炎癥位點(diǎn)的積累率和從正常組織清除的速率不同所造成的(Juweid，M.，et al.，Eur.J.Nucl，Med，19159-165(1992))。由于從正常組織優(yōu)先洗出和血液清除的原因，用這些試劑進(jìn)行損傷檢測(cè)的最佳時(shí)間一般是注射后≥24小時(shí)。
Thakur等人廣泛分析和討論了基于中性白細(xì)胞體外標(biāo)記的方法(Sem.Nucl.Med.14107-117(1984))。在此方法中，個(gè)體的中性白細(xì)胞用γ發(fā)射性放射核素(選擇111In核素)標(biāo)記。這樣標(biāo)記的中性白細(xì)胞可用于體內(nèi)動(dòng)力學(xué)研究和炎癥病灶的造影。這一技術(shù)的一個(gè)缺點(diǎn)是在體外標(biāo)記前需要取出并分離中性白細(xì)胞。
白細(xì)胞產(chǎn)生許多介質(zhì)控制炎癥反應(yīng)的范圍和持續(xù)時(shí)間，并在其表面帶有許多受體，可與這些化學(xué)介質(zhì)和存在于炎癥液中的其他蛋白結(jié)合并反應(yīng)。這種受體一介質(zhì)相互作用對(duì)控制炎癥位點(diǎn)白細(xì)胞功能很重要。炎癥介質(zhì)中有趨化因子(也稱為化學(xué)引誘物)，其具有誘導(dǎo)PMN和巨噬細(xì)胞定向遷移和活化的能力(綜述和討論見Roitt等等，Immunology，Gower Medical Pub.，London(1985))。
111In標(biāo)記的白細(xì)胞已是很成功的造影劑，但需要較長(zhǎng)的準(zhǔn)備時(shí)間和血液操作。研究時(shí)間還要進(jìn)一步延長(zhǎng)，因?yàn)榉派錁?biāo)記細(xì)胞注射后需要數(shù)小時(shí)去定位，因?yàn)樗鼈儽仨毾葘ふ亿吇盘?hào)，然后遷移到炎癥位點(diǎn)。另外，劑量測(cè)定法方面的考慮限制了可施用的放射活性量，常導(dǎo)致造影質(zhì)量差。雖然可使用劑量高得多的99mTc標(biāo)記白細(xì)胞，但放射活性在非靶標(biāo)器官中的積累限制了其普遍實(shí)用性。
通過發(fā)展低分子量放射藥物可顯著降低從注射到損傷檢測(cè)間的時(shí)間，這種放射藥物與循環(huán)炎癥細(xì)胞以及已存在于炎癥位點(diǎn)的細(xì)胞結(jié)合。具有這些特征的候選分子包括IL-8(Baggiolini，M.等，J.Clin.Invest.84(4)1045-1049(1989))，血小板因子-4(Deuel，T.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1)4584-4587(1981)和肽N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(For-MLF)(MW437)(Showell，H.J.等，J.Fxper，Med.1431154-1169(1976)；Schiffmann，E.等，Proe.Natl Acad.Sci.USA 721059-1062(1975)；Williams，L.T.等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 741204-1208(1977))。
For-MLF是一種細(xì)菌產(chǎn)物，它通過與白血細(xì)胞膜上高親和力受體結(jié)合而引發(fā)白細(xì)胞趨化性(Williams，L.T.等，Proc.Nat.Acad.Sci USA 741204-1208(1977)；Showell，H.J.等，J.Exper.Med.1431154-1169(1976)；Schiffmann，E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 721059-1062(1975))。這些受體既存在于多形核細(xì)胞上也存在于單核吞噬細(xì)胞上。雖然許多體外結(jié)構(gòu)-活性研究已證明這些小的N-甲酰-甲硫氨酰肽的許多合成類似物結(jié)合中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，與此天然肽相比親和力相等或更強(qiáng)(Niedel.J.等，J.Biol.Chem.2557063-7066(1980)；O’Flaherty，J.J.等，J.Immunol.1201326-1332(1978)；Rot，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847967-7971(1987)；Iqbal，M.等，F(xiàn)EBS 165171-174(1984))，但體內(nèi)生物分布和生物活性研究相當(dāng)有限。因?yàn)榱＜?xì)胞與化學(xué)引誘物梯度應(yīng)答；隨著額外的受體被表達(dá)，受體的親和力下降，直到細(xì)胞到達(dá)炎癥位點(diǎn)，在那里化學(xué)引誘物的濃度最高(Snyderman，R.等，RevInfect.Dis.9S 562-S569(1987)；Fletcher，M.P.，J.Immunol.128941-948(1988)；Niedel，J.，等，J.Biol.Chem.10700-710(1979))。由于For-MLF(MW 437)非常小，其分子結(jié)構(gòu)易于掌握以設(shè)計(jì)最佳的造影劑。
許多種類的的細(xì)菌可產(chǎn)生一類或多類趨化分子，可以是小肽、較大的蛋白，也可以是脂質(zhì)(Klein，I.，ImmunologyThe Science ofSelf-Nonself Discrimination，Wiley Interscience，New York(1982))。例如，已知大腸桿菌產(chǎn)生強(qiáng)趨化分子，這些分子含有帶封閉氨基的異源性小肽作為其活性成分。已合成了這種肽并顯示為多形核白細(xì)胞的強(qiáng)化學(xué)引誘物。這些趨化肽中最熟知的是For-MLE和一些相關(guān)的四肽(Schiffman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 721059-1062(1975)；Schiffman等，美國(guó)專利4,427,660(1984))。這些肽的結(jié)構(gòu)功能研究揭示在靶細(xì)胞表面存在立體特異性受體(Becker，E.L.Am.J.Pathol.85385-394(1976))；然后用放射標(biāo)記甲酰肽作為配體檢測(cè)這種受體(Williams等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 741204-1208(1977))。
隨后，合成了結(jié)構(gòu)為N-甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys的趨化肽，并顯示與人中性白細(xì)胞上的受體結(jié)合力強(qiáng)，該肽可在Tyr殘基上用125I以高比放射活性標(biāo)記(Niedel等，J.Biol.Chem.25410700-10706(1979))。
細(xì)菌細(xì)胞也可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，例如通過激活宿主補(bǔ)體系統(tǒng)的成分，造成局部產(chǎn)生趨化分子，C5a和C5b67。一旦宿主中發(fā)生了免疫應(yīng)答，IgG抗體分子也可作為趨化因子，因?yàn)楸患せ畹腡淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的分子可以作為趨化因子。基于炎癥細(xì)胞類型上存在的適當(dāng)受體，不同的趨化分子對(duì)各種多形核細(xì)胞(如，嗜中性白細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞)、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞具有選擇性。
趨化肽是許多結(jié)構(gòu)-活性研究的焦點(diǎn)，以確定分子負(fù)責(zé)受體結(jié)合和激活的特異特征(Deuel，T.F.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1)4584-4587(1981)；O’Flaherty，J.T.等，J.Immunol.1201326-1332(1978)；Rot，A等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA847967-7971(1987)；Iqbal，M.，等，F(xiàn)EBS 165171-174(1984))。這些研究大部分集中在For-MLF序列中天然氨基酸的取代；但已有關(guān)于受體結(jié)合和激活EC50值小于或等于天然肽的加長(zhǎng)肽和高負(fù)電肽的報(bào)道(Fischman，A.J，J.Nucl.Med.32483-491(1991)；Toniolo，C.等，Biochem，23698-704(1984))?？偟目磥?lái)，這些結(jié)構(gòu)-活性研究的結(jié)果得出雖然N-末端的修飾對(duì)受體結(jié)合和激活有很大的不利影響，但在C-末端的修飾影響很小(Spisani，S.等，Inflammation 10363-369(1986))。另外，受體結(jié)合與生物活性高度相關(guān)(Deuel.T.F等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78(1)4584-4587(1981)；Schiffmann，E.等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 721059-1062(1975))?；谶@些資料，已有人提出了一種受體-肽復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型，其中只有N-末端的4個(gè)氨基酸與受體相作用(Freer，R.J.，等，Biochem.21257-263(1982))。
已證明在C-末端修飾的合成For-MLF類似物與中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞結(jié)合，與天然肽相比親和力相等或較高(Deuel，T.F.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1)4584-4587(1981)；Schiffmann，E.，等，Proc.Natl Acad Sci.USA 721059-1062(1975)；Niedel.J.等，J.Biol.Chem.2557063-7066(1980))。這樣在C-末端包含標(biāo)記片移使含得制備了保留受體結(jié)合特性的放射標(biāo)記類似物。
這種感染造影的方法比現(xiàn)用的放射藥物有幾個(gè)理論上的優(yōu)勢(shì)。這些小分子與循環(huán)粒細(xì)胞以及已存在于炎癥位點(diǎn)的白細(xì)胞結(jié)合的能力，可顯著減少?gòu)淖⑸涞綋p傷檢測(cè)之間的間隔時(shí)間。這種肽的分子量小(＜1000D)，使得與標(biāo)記蛋白和白細(xì)胞相比能更快地?cái)U(kuò)散到感染和炎癥區(qū)域。另外，粒細(xì)胞的就地放射標(biāo)記避免了細(xì)胞功能的改變(傳統(tǒng)標(biāo)記方法常如此)和血液操作(其對(duì)工作人員和病人的固有危險(xiǎn))。
Zoghbi等人(J.Nuc.Med.2232(1981))用運(yùn)鐵蛋白與肽偶聯(lián)用111In標(biāo)記For-MLF，并提示該試劑在選擇性標(biāo)記人中性白細(xì)胞上是肯定的。雖然此方法提供了解決標(biāo)記特異性問題的一種潛在方案，但它沒有提出一種克服從個(gè)體采取細(xì)胞、體外處理它們、然后重輸回個(gè)體這一復(fù)雜狀況的方案。
有一篇報(bào)導(dǎo)描述了在兔中直接注入125I標(biāo)記的N-甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys體內(nèi)定位無(wú)菌膿腫的嘗試(Jiang等，Nucl.Med.21110-113(1982))。雖然達(dá)到了有效標(biāo)記率(膿腫與肌肉之比)，但使用該試劑會(huì)導(dǎo)致暫時(shí)性中性白細(xì)胞減少，然后返彈性中性白細(xì)胞增多。作者承認(rèn)需要進(jìn)一步開發(fā)以避免中性白細(xì)胞減少/中性白細(xì)胞增多的付作用并使該方法可用于臨床。另外，125I不能很好地造影，而且該文獻(xiàn)也沒有披露或提示較好的造影同位素，如123I、111In或99mTc。
Morgen等人在美國(guó)專利4,986,979中公開了一種提高炎癥組織位點(diǎn)上標(biāo)記物集累量的方法。該方法利用了白細(xì)胞激活時(shí)表面抗原標(biāo)志的正調(diào)節(jié)。描述了一種利用含親和標(biāo)記物的趨化肽和與白細(xì)胞結(jié)合的放射核素的造影方法，以及這種提高的造影應(yīng)用。這些作者沒有公開合成拮抗劑的任何合成方法，或公開這種拮抗劑可用于避免中性白細(xì)胞減少反應(yīng)。
雖然上述技術(shù)可能提供了有用的信息，它們?nèi)钥赡茉斐刹豢山邮艿母哳l假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，需要過多的操作和加工，或伴有不可接受的付作用。因此，本領(lǐng)域中一直公認(rèn)需要一種更直接、更靈敏、更特異的檢測(cè)和定位感染或炎癥位點(diǎn)的方法，特別是可連續(xù)進(jìn)行以測(cè)評(píng)治療的時(shí)間響應(yīng)的技術(shù)。
發(fā)明簡(jiǎn)述基于可檢測(cè)標(biāo)記的趨化肽全身性注射到動(dòng)物體內(nèi)后在局部感染位點(diǎn)積累這一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明涉及一種基本非侵入性的感染或炎癥位點(diǎn)造影方法。
更具體地講，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)個(gè)體中感染或炎癥位點(diǎn)的方法，其包括a.給予該個(gè)體診斷有效量的可檢測(cè)標(biāo)記的趨化肽X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中X為氨基保護(hù)基，Y為氨基酸殘基，Z為間隔序列，n為0或1，和W為下式結(jié)構(gòu)的標(biāo)記或連接取代基-[K]v-M1其中K為中間功能團(tuán)，v為0或1，及M1是診斷學(xué)上可檢測(cè)的標(biāo)記物；及其中趨化肽在感染或炎癥位點(diǎn)顯著積累，而在無(wú)感染或炎癥的位點(diǎn)不顯著積累；和b.檢測(cè)該趨化肽。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)個(gè)體中感染或炎癥位點(diǎn)的方法，其包括a.給予該個(gè)體診斷有效量的可檢測(cè)標(biāo)記的趨化肽X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中
X為氨基保護(hù)基，Y為 其中，R1為芐基，烷基或-CH2-CH2-R2-CH3，和R2為-S- 或-O-Z為間隔序列，n為0或1，和W為下式結(jié)構(gòu)的標(biāo)記或連接取代基-[K]v-M1其中K為中間功能團(tuán)v為0或1M1是診斷學(xué)上可檢測(cè)的標(biāo)記物；及其中趨化肽在感染或炎癥位點(diǎn)顯著積累，而在無(wú)感染或炎癥的位點(diǎn)不顯著積累；和b.檢測(cè)該趨化肽。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種可檢測(cè)標(biāo)記的趨化肽X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中
X為下式結(jié)構(gòu)的氨基保護(hù)基 其中R3選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4為氧或硫Y為氨基酸殘基，Z為選自1-6個(gè)碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的間隔序列，其中R6為氨基酸殘基，m為大于或等于1的整數(shù)，n為0或1，及W是下式結(jié)構(gòu)的標(biāo)記或連接取代基-[K]v-M1其中K為DTPA、EDTA或HYNIC，v為1，及M1是111In或99mTc；且其中趨化肽在感染或炎癥位點(diǎn)顯著積累，而在無(wú)感染或炎癥的位點(diǎn)不顯著積累。
本發(fā)明范圍內(nèi)還包括含有這種趨化肽的治療組合物，盡管對(duì)這種組合物來(lái)說(shuō)并不總是要求包含可檢測(cè)片段。更具體地講，本發(fā)明涉及含有下式趨化肽的治療組合物X-Y-Leu-Phe-[Z]n-[T]α其中X為下式結(jié)構(gòu)的氨基保護(hù)基
其中R3選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4為氧或硫Y為氨基酸殘基，Z為選自1-6個(gè)碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的間隔序列，其中R6為氨基酸殘基，m為大于或等于1的整數(shù)，n為0或1，T是治療劑，α為0或1；其中趨化肽在感染或炎癥位點(diǎn)顯著積累，而在無(wú)感染或炎癥的位點(diǎn)不顯著積累。
本發(fā)明從而涉及一種檢測(cè)個(gè)體中感染或炎癥位點(diǎn)的體內(nèi)方法。該方法包括給予該個(gè)體可檢測(cè)標(biāo)記的趨化肽，這種肽在感染或炎癥位點(diǎn)顯著積累但不在無(wú)感染或無(wú)炎癥位點(diǎn)積累。
本發(fā)明還包括其上已連有適當(dāng)?shù)尿戏肿踊蚩蓹z測(cè)標(biāo)記物的各種趨化肽。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是表示4種與DTPA偶聯(lián)的趨化肽與人中性白細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果的圖。該試驗(yàn)是一種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)，其中[3H]For-MLF被遞增濃度的未標(biāo)記肽所置換。
圖2是表示4種與DTPA偶聯(lián)的趨化肽刺激人中性白細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物試驗(yàn)結(jié)果的圖。該試驗(yàn)中包括MLF用于比較。
圖3趨化肽類似物刺激的超氧化物產(chǎn)生。人多形核細(xì)胞僅與HBSS或與所示濃度的肽37℃保溫10分鐘，然后測(cè)定高鐵細(xì)胞色素的還原。
超氧化物最大產(chǎn)量的百分?jǐn)?shù)＝E/M×100其中E是在所示濃度肽存在下所產(chǎn)生的超氧化物的量，M是這種肽所產(chǎn)生的超氧化物的最大量。
For-NleLFK-HYNICHP1；For-MLFK-HYNICHP2；For-MLFNH(CH2)6NH-HYNICHP3；For-MLF-(D)K-HYNICHP4.
圖4趨化肽類似物對(duì)For-ML[3H]F與人多形核細(xì)胞結(jié)合的作用。完整的人多形核細(xì)胞(8×105)與培養(yǎng)緩沖液或所示濃度的肽在15 nM For-ML[3H]F存在下24℃保溫45分鐘，然后測(cè)定特異性For-ML[3H]F結(jié)合。
最大For-ML[3H]F結(jié)合的百分?jǐn)?shù)＝E/C×100其中E是所示濃度的未標(biāo)記肽存在下的特異性cpm，C是只有緩沖液存在下For-ML[3H]F的特異性cpm。For-NleLFK-HYNICHP1；For-MLFK-HYNICHP2；For-MLFNH(CH2)6NH-HYNICHP3；For-MLF-(D)K-HYNICHP4.
圖5肽濃度對(duì)放射化學(xué)產(chǎn)率(％)和比活性(mCi/Mole)的影響。顯示了對(duì)于For-MLF-(D)K-HYNIC的數(shù)據(jù)。用所有受試肽得到了相似的結(jié)果。
圖6大腸桿菌感染的大鼠中99mTc標(biāo)記肽的靶標(biāo)-本底比(T/B)。感染肌肉中％ID/g除以對(duì)側(cè)正常肌肉中的相應(yīng)值計(jì)算得到數(shù)據(jù)。均在注射前24小時(shí)建立感染。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是5-6只動(dòng)物的均值±均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。
圖7注射99mTc-標(biāo)記趨化肽類似物后，大腸桿菌股部感染兔的代表性γ照相圖象。該圖象是在注射大約1mCi的99mTc-標(biāo)記HP2 17小時(shí)后得到的，在注射前24小時(shí)產(chǎn)生感染。
圖8注射99mTc-標(biāo)記HP2 17小時(shí)后大腸桿菌股部感染的兔中的生物分布。數(shù)據(jù)用平均百分注射劑量/g組織表示。誤差棒是指SEM。注射99mTc-標(biāo)記HP2前24小時(shí)產(chǎn)生感染。
圖9大腸桿菌感染的兔中注射99mTc標(biāo)記HP4 17小時(shí)后的靶標(biāo)-本底比(T/B)。感染肌肉或膿中％ID/g除以對(duì)側(cè)正常肌肉中的相應(yīng)值計(jì)算得到數(shù)據(jù)。均在注射前24小時(shí)建立感染。對(duì)于感染肌肉，數(shù)據(jù)中包括6只動(dòng)物的28個(gè)標(biāo)本。對(duì)于膿，數(shù)據(jù)中包括6只動(dòng)物的6個(gè)標(biāo)本。
圖10表示了4個(gè)HP3制劑注射后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)上血液、肺、肝、脾、腎和消化道中百分注射劑量/克。
圖11這是下文實(shí)施例85中試驗(yàn)方法的流程示意圖。在-15和-5分鐘及注射后0.25、0.5、1、3、5、10和20分鐘采取用于血液學(xué)測(cè)定的血樣。
圖12ForNle LFNleYK-DTPA對(duì)猴外周白血細(xì)胞水平的影響?？偟耐庵馨籽?xì)胞計(jì)數(shù)以基線水平的百分?jǐn)?shù)表示。使用4個(gè)劑量的肽(ng/kg)。P注射肽；V注射載體。
圖13注射99mTc-標(biāo)記的For-Met-Leu-Phe-NH-(CH2)6-NH-HYNIC 3和12小時(shí)后股部感染的雌性Rhesus猴的γ照相圖象。所有的圖象均對(duì)最亮的照片(pixel)標(biāo)準(zhǔn)化。
圖1499mTc-HP和111In標(biāo)記的白細(xì)胞共同注射后6和18小時(shí)大腸桿菌股部深處感染兔的γ照相圖象。99mTc圖像對(duì)99mTc窗中的111In光子矯正。所有的圖像都對(duì)早期99mTc-HP圖像中的總計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。注射前24小時(shí)建立感染。
圖15注射后3、6和18小時(shí)閃爍照相的ROI分析所得99mTc-HP和111In-白血細(xì)胞的靶標(biāo)-本底比。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是6只動(dòng)物的均值±SEM。所有動(dòng)物均在注射放射示蹤劑之前24小時(shí)被感染。
圖16注射后18小時(shí)在切出的組織標(biāo)本上通過直接放射活性測(cè)定法測(cè)得的99mTc-HP和111In-白血細(xì)胞的靶標(biāo)-本底比。小圈代表99mTc-HP的所有值(6只動(dòng)物的30個(gè)標(biāo)本)，大圈表示均值±SEM。小方塊代表111In-白血細(xì)胞的所有值(6只動(dòng)物的30標(biāo)個(gè))，大方塊表示均值±SEM。所有動(dòng)物均在注射前24小時(shí)感染。
圖17注射后18小時(shí)在切出的組織標(biāo)本上通過直接放射活性測(cè)定法測(cè)得的99mTc-HP和111In-白血細(xì)胞的膿與正常肌肉之比。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是6只動(dòng)物的均值±SEM。所有動(dòng)物均在注射前24小時(shí)感染。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述“炎癥”和“炎癥位點(diǎn)”用于指?jìng)€(gè)體中由于組織損傷(無(wú)論其原因或病因)所發(fā)生的狀況和其位置。這種組織損傷可以是由微生物侵入、自體免疫過程、組織或器官同種移植排斥、或傷害性外部影響因素如熱、冷、放射能量、電或化學(xué)刺激、或機(jī)械創(chuàng)傷所造成的。無(wú)論其起因和身體位點(diǎn)，隨后的炎癥反應(yīng)是相當(dāng)相似的。由一系列復(fù)雜的功能和細(xì)胞調(diào)節(jié)所組成，包括微循環(huán)、液體運(yùn)動(dòng)的改變以及炎癥細(xì)胞(白細(xì)胞)的流出和激活。
“感染”一詞指細(xì)菌、病毒、真菌、原生動(dòng)物和其他微生物的侵入。
“個(gè)體”一詞包括動(dòng)物如哺乳動(dòng)物，尤其是人。
“激動(dòng)劑”一詞這里指與一種受體結(jié)合并刺激該受體功能的趨化肽。
“拮抗劑”一詞這里指阻止對(duì)受體刺激的趨化肽。作為拮抗劑的趨化肽對(duì)細(xì)胞受體具有親和力，并通過與之結(jié)合阻止細(xì)胞的應(yīng)答。
“診斷有效”一詞用于描述劑量，是指所給予的可檢測(cè)標(biāo)記趨化肽的量足以使得能夠檢測(cè)感染或炎癥位點(diǎn)，即高于背景信號(hào)。
一般說(shuō)來(lái)，可檢測(cè)標(biāo)記趨化肽的診斷劑量將根據(jù)如患者年齡、狀態(tài)、性別和患病程度、禁忌癥和其他變量而變化，將由有關(guān)醫(yī)生來(lái)調(diào)節(jié)。劑量可在約0.01微克/公斤到約2000微克/公斤之間變化，優(yōu)選為約0.1微克/公斤到1000微克/公斤。
“末端修飾的趨化肽”一詞是指包括擔(dān)不限于具有以下通式結(jié)構(gòu)的分子X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中X為氨基保護(hù)基，Y為氨基酸殘基，Z為間隔序列，n為0或1，和W為標(biāo)記或連接取代基。
在上述通式結(jié)構(gòu)中，X是氨基保護(hù)基，即保護(hù)氨基的基團(tuán)，可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可用于此目的的許多基團(tuán)中的任何一個(gè)。下述流程圖說(shuō)明幾種向趨化肽上加入氨基保護(hù)基的有用的合成路線。Met-Leu-Phe的N-末端衍生化 a.1.RNCO，Et3N，DMF；2H3O+b.1.ROCOCl，Et3N，DMF；2H3O+c.1.RCOCl，Et3N，DMF；2H3O+d.1.RSO2Cl.Et3N，DMF；2H3O+e.鹽酸1，1-吡唑-1-甲酰胺Et3N，DMF；2H3O+f.RNCS，Et3N，DMF；2H3O+g.1.(RO)2POCl.Et3N，DMF；2H3O+h.2，5-二甲氧基四氫呋喃NaOAc，AcOH一般而言，但考慮趨化肽(CP)上的氨基保護(hù)基即N-末端保護(hù)基時(shí)，將此片段看作一個(gè)單一的單元更準(zhǔn)確，而不是看作一個(gè)被“隔離基團(tuán)”與CP分隔開的“龐大”的基團(tuán)。保護(hù)基團(tuán)的這兩個(gè)部分可能都與受體通過立體、靜電和疏水作用而作用。因此保護(hù)基的組成作為一個(gè)整體將最終決定CP的活性。這一概念例如被以下事實(shí)所支持，觀察到氨基甲酸正丁基酯保護(hù)的CP比相應(yīng)的正丁基脲保護(hù)的CP活性低近10倍。這兩個(gè)保護(hù)基具有相同的脂肪側(cè)鏈，但是鍵角、旋轉(zhuǎn)度和靜電特征不同。
當(dāng)將CP的N一保護(hù)從氨基甲酸酯(尿烷)換成脲時(shí)，N-末端的整體形狀可能就會(huì)改變，脲的鍵角不同，旋轉(zhuǎn)自由度明顯小(羰基-N鍵比羰基-O鍵旋轉(zhuǎn)度小)。這些因素可能對(duì)CP-受體的總體匹配性有些影響。
引入脲將改變CP N-末端的靜電特征。這些靜電差異可導(dǎo)致受體中氫鍵作用的改變。
脲的整體大小與氨基甲酸酯的大小沒有明顯區(qū)別。但可能存在的例外是脲的受阻旋轉(zhuǎn)可能將其鎖定到一種特異的構(gòu)象，這種構(gòu)象對(duì)其與受體的匹配有顯著影響。這更多的涉及形態(tài)而不是整體大小。
也許在CP N-末端裝配脲保護(hù)基的最合理的原因是脲在較寬范圍的條件下比氨基甲酸酯更穩(wěn)定。因此其在高酸性條件下的穩(wěn)定性允許在C-末端連接片段上進(jìn)行更寬范圍的化學(xué)轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明范圍內(nèi)還包括其他相關(guān)的氨基保護(hù)基，如含有雜原子的脲-硫脲、磺酰胺、膦酰胺、胍和磺酰脲。
文獻(xiàn)中公開了許多其他氨基保護(hù)基，如叔丁氧羰基、乙?；⑵S氧羰基、甲酰基、硫代甲酰基、氰基脒和甲氧羰基。
用異丁氧羰基和烷基(C3-C6支鏈和環(huán)狀)氨基甲酰基保護(hù)氨基末端也可產(chǎn)生有效的趨化肽(它們可以是激動(dòng)劑或拮抗劑)。
以下列出了適用于趨化肽的一些氨基保護(hù)基。這些保護(hù)基的合成方法參見“Protecting Groups In Organic synthesis”JohnWiley&SonsNew York，1981；第6章。
a.氨基甲酸酯氨基甲酸環(huán)丙基甲基酯氨基甲酸1-甲基-1-環(huán)丙基甲基酯氨基甲酸二異丙基甲基酯氨基甲酸2-甲硫基乙基酯氨基甲酸1，1-二甲基丙炔基酯氨基甲酸叔戊基酯氨基甲酸環(huán)戊基酯氨基甲酸環(huán)己基酯氨基甲酸9-芴基甲基酯氨基甲酸1-金剛烷基酯氨基甲酸1，1-二甲基-2-2-三氯乙基酯氨基甲酸2，2，2-三氯乙基酯氨基甲酸1-甲基-1-苯乙基酯氨基甲酸2，4-二氨芐基酯b.羧酰胺及其相應(yīng)的硫代羧酰胺噻吩甲酰胺金剛烷基甲酰胺4-溴丁?；柞０啡夤鸹柞０窡燉；柞０穋.脲、其相應(yīng)的硫脲和氰基胍衍生物芐基脲2，4-二氟苯基脲
1-萘基脲苯基脲二苯基脲丙基脲雜合脲d.磺酰胺苯磺酰胺二甲氧苯磺酰胺甲苯磺酰胺芐磺酰胺三氟甲磺酰胺e.膦酰胺苯膦酰胺二甲氧苯膦酰胺甲苯膦酰胺芐膦酰胺三氟甲膦酰胺在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，X是 其中R3選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4是硫?qū)僭?，?yōu)選氧或硫。
當(dāng)R3是烷基時(shí)，優(yōu)選1-6個(gè)碳原子的烷基，更優(yōu)選3-6個(gè)碳原子的烷基，即甲基、乙基、丙基、丁基、戊基及己基或其異構(gòu)體，如異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、新戊基、2-乙基丁基等。最優(yōu)選異丁基和叔丁基。
當(dāng)R3是鏈烯基時(shí)，優(yōu)選2-6個(gè)碳原子的鏈烯基，更優(yōu)選2-4個(gè)碳原子的鏈烯基，即乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基及己烯基或其異構(gòu)體，如異丙烯基、異丁烯基、仲丁烯基、叔丁烯基、新戊烯基、2-乙基丁烯基等。
當(dāng)R3是炔基時(shí)，優(yōu)選2-6個(gè)碳原子的炔基，更優(yōu)選2-4個(gè)碳原子的炔基，即乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基及己炔基或其異構(gòu)體，如異丙炔基、異丁炔基、仲丁炔基、叔丁炔基、新戊炔基、2-乙基丁炔基等。
當(dāng)R3是烷氧基時(shí)，優(yōu)選1-6個(gè)碳原子的烷氧基，更優(yōu)選3-6個(gè)碳原子的烷氧基，即甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基及己氧基或其異構(gòu)體。
當(dāng)R3是芳烷氧基時(shí)，優(yōu)選芐氧基，即Φ-CH2-O-，其中苯基(Φ)可被取代或不取代。
當(dāng)R3是氨基時(shí)，優(yōu)選-N(H)R5，其中R5選自氫、烷基、環(huán)烷基和芳基。
當(dāng)R5是烷基時(shí)，優(yōu)選1-4個(gè)碳原子的烷基，更優(yōu)選3-4個(gè)碳原子的烷基，即甲基、乙基、丙基、丁基或其異構(gòu)體，如異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基。
當(dāng)R5是環(huán)烷基或芳基時(shí)，優(yōu)選環(huán)戊基、環(huán)己基、金剛烷基、苯基或聯(lián)苯基，更優(yōu)選環(huán)己基或苯基，其可以被取代或不取代。
在上述通式中Y是氨基酸殘基，可以是可用于該目的的任何這種殘基。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，Y是 其中R1是芐基、烷基或-CH2-CH2-R2-CH3，及R2為-S-， 或-O-當(dāng)R1是烷基時(shí)，優(yōu)選1-6個(gè)碳原子的烷基，即甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基或其異構(gòu)體，如異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、新戊基、2-乙基丁基等。R1是烷基時(shí)更優(yōu)選3-4個(gè)碳原子的烷基。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，Y是4-氨基四氫吡喃-4-羧酸(Thp)。用Thp產(chǎn)生的類似物是對(duì)人中性白細(xì)胞的化學(xué)引誘劑，但不刺激超氧化物的產(chǎn)生。合成并測(cè)試的肽是甲?；?Thp-Leu-Phe-OMe。
在上述通式中Z是任何有用長(zhǎng)度的間隔序列。根據(jù)n是0或1，它可以存在也可以不存在。當(dāng)n是1時(shí)，Z存在并優(yōu)選為脂肪二胺或[R6]m，其中R6是氨基酸殘基。m是大于或等于1的整數(shù)，優(yōu)選1-3的整數(shù)。Z還可以是脂肪二胺和[R6]m的結(jié)合。
當(dāng)Z是脂肪二胺時(shí)，優(yōu)選1-6個(gè)碳原子的脂肪二胺，如甲二胺、乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺和己二胺。當(dāng)Z是脂肪二胺時(shí)，更優(yōu)選4-6個(gè)碳原子的脂肪二胺，如丁二胺(也稱cadaverine)、戊二胺(也稱putrescine，以下稱為Pu)和己二胺。
當(dāng)Z為[R6]m時(shí)，根據(jù)m的值不同，可有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。當(dāng)存在兩個(gè)或多個(gè)殘基時(shí)，它們可相同或不同。組成間隔序列的氨基酸可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何氨基酸，可以是必須的或非必須的。例如，R6可為下列氨基酸之一或其組合精氨酸、谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸。在實(shí)施本發(fā)明中用作間隔序列的優(yōu)選氨基酸殘基是下列氨基酸或其組合正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
如上所述，W是標(biāo)記或連接取代基。W代表用于對(duì)本發(fā)明的實(shí)施中所用趨化肽進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記的片段?！翱蓹z測(cè)標(biāo)記”一詞指在趨化肽上連接上診斷學(xué)上可檢測(cè)的標(biāo)記物。
本領(lǐng)域中已知許多不同的標(biāo)記物和標(biāo)記方法。可用于本發(fā)明的標(biāo)記物類別的實(shí)例包括放射性同位素、順磁性同位素、和可通過正電子發(fā)射體層成象(PET)造影的化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了可與本發(fā)明趨化肽結(jié)合的其他適宜標(biāo)記物，或利用常規(guī)試驗(yàn)?zāi)軌虼_定這種標(biāo)記物。而且，這些標(biāo)記物與趨化肽的結(jié)合可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)進(jìn)行。
對(duì)進(jìn)行體內(nèi)診斷造影，可利用的檢測(cè)儀器類型是選擇給定放射核素的主要因素。所選擇的放射核素必須具有可被給定類型的儀器檢測(cè)的衰變類型。一般講，用于診斷造影的任何常規(guī)顯影方法都可用于本發(fā)明。
選擇體內(nèi)診斷放射核素的另一重要因素是其半衰期要足夠長(zhǎng)使得靶組織達(dá)最大吸收時(shí)仍可被檢測(cè)，但又要足夠短使宿主的有害幅射達(dá)到最小。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，用于體內(nèi)造影的放射核素不發(fā)射顆粒，但產(chǎn)生大量的140-200KeV范圍的光子，這容易被常規(guī)的γ照相機(jī)檢測(cè)。
為了進(jìn)行體內(nèi)診斷，放射核素可直接與起化肽連接，或通過一中間功能團(tuán)間接連接。常用于將金屬離子放射同位素與趨化肽連接的中間功能團(tuán)是螯合劑，二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)(Hnatowich，D.J.，Int.J.Appl.Radiat.Isot.，33327-332，(1982))和乙二胺四乙酸(EDTA)。用于連接Tc與肽的其他常用螯合基團(tuán)包括(1)二肪配體，(2)官能化cyclams，(3)N2S2配件，和(4)N3S配件。
或者，可將反應(yīng)活性硫醇通過(5)亞氨基硫雜戊環(huán)與賴氨酸殘基結(jié)合，或可將硫醇?xì)埢煤粋€(gè)或多個(gè)Cys殘基的氨基酸序列與肽結(jié)合 可與趨化肽結(jié)合的金屬離子的實(shí)例為99mTc、123I、131I、97Ru、67Cu、67Ga、125I、68Ga、72As、89Zr和201Tl。優(yōu)選99mTc和111In。
111In標(biāo)記的趨化肽是用于大鼠中感染病灶位點(diǎn)外部造影的有效試劑(Fischman，A.J.，J.Nucl.Med.32483-491(1991))。但肽的生物半衰期短，降低了111In(t1/267.9h)造影的實(shí)用性。由于其物理半衰期短、比活性高、造影性能極佳、造價(jià)低及有廣泛供應(yīng)，99mTc是標(biāo)記趨化肽的理想放射核素。雖然已有許多技術(shù)用于99mTc標(biāo)記，但肼基煙酰胺基團(tuán)(HYNIC)的效果尤其肯定。肼基煙酸的活性琥珀酰亞胺酯(SHNH)已成功地用于衍生蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基的ε-氨基。這些結(jié)合物與具有Tc(V)氧代核的簡(jiǎn)單配合物如99mTc-葡庚酸鹽一起保溫就可造成定量標(biāo)記(Abrams，M.J.等，J.Nucl.Med.312022-2028(1990))。
用99mTc對(duì)大分子的標(biāo)記方法可分成三大類直接標(biāo)記、雙功能團(tuán)螯合物、和預(yù)成螯合物?，F(xiàn)今優(yōu)選的利用HYNIC(SHNH)接頭的標(biāo)記方法是利用輔助配體，例如高锝酸根離子在螯合前體存在下還原以形成易變的99mTc-前體配合物(這里稱為“輔助配體”)，后者再與雙官能修飾CP的金屬結(jié)合基團(tuán)反應(yīng)形成99mTc-CP結(jié)合物。如上所述，99mTc-葡庚糖酸鹽輔助配體可用于已用SHNH基團(tuán)修飾的蛋白的放射標(biāo)記(Schwartz，D.A.，等，Bioconjugate Chem.2333-336(1991))。但這要求60分鐘保溫及比活性大于25mCi/mg，以使放射標(biāo)記率大于90％。多羥基氨基酸t(yī)ricine可用作99mTc標(biāo)記SHNH修飾的多肽和蛋白的更有效和易得的標(biāo)記前體。
Tricine，即三(羥甲基)甲基甘氨酸，和其類似物可與氯化亞錫還原劑一起配制成PH6-8的水溶液，以自發(fā)形成99mTc前體。在ITLC-SG條上進(jìn)行“Tc-tricine”輔助配體的形成分析，與99mTc-葡庚糖酸鹽的分析相似，用鹽水在原點(diǎn)進(jìn)行TcSn膠體定量，用甲基乙基酮在溶劑前沿進(jìn)行高锝酸根的定量。在與99mTc-葡庚糖酸鹽的相似條件下，“Tc-tricine”溶液(36mg/ml前體，50μg/ml氯化亞錫，PH6.0)在室溫?cái)?shù)分鐘內(nèi)放射標(biāo)記SHNH修飾的IgG達(dá)90％以上。另外，與Tc-葡庚糖酸鹽相比，“Tc-tricine”溶液可以大于150mCi/mg蛋白的比活性達(dá)到＞90％的IgG-SHNH放射標(biāo)記。在SHNH修飾的小分子如CP的標(biāo)記中，應(yīng)用高比活性的定量放射標(biāo)記更加重要。
可按以下總步驟標(biāo)記HYNIC修飾的肽拌攪下向新制備的Sn/tricine溶液(72mg/ml tricine，PH7.0-7.2，100μg/ml SnCl2·2H2O)中加入等體積的發(fā)生劑洗出的99mTcO4-(30mCi/ml)。用1×8cm的ITLC-SG檢測(cè)條測(cè)定99mTc-tricine的產(chǎn)生，用鹽水或甲基乙基酮洗脫劑分別測(cè)定膠體或高锝酸根。將99mTc-tricine立即加入肽溶液中。通過將1mg肽溶解在600μL乙酸并加入400μL微酸性水，靜量30分鐘使腙脫保護(hù)，用PH5.2乙酸緩沖液將肽按1∶10稀釋，可制得1mg/ml的肽溶液，如iboc MLF-HYNIC腙。通過100μL99mTc-tricine與15μL溶液混合制備99mTc-肽結(jié)合物。保溫1小時(shí)后，用1×8cmITLC-SG檢測(cè)條以25％w/w NaCl溶液作為洗脫劑測(cè)定99mTc-肽的生成百分率，其中99mTc-肽留在原點(diǎn)，而所有其他成分被洗脫至溶劑前沿。
適合的趨化肽的實(shí)例包括但不限于N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-DTPA
N-For-Met-Leu-Phe-Pu-DTPAN-For-Nle-Leu-Phe-Lys-DTPAN-For-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPAN-For-Met-Leu-Phe-Lys-DTPAN-For-Met-Leu-Phe-D-Lys(NH2)-DTPAN-Ac-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPAN-芐氧羰基-Met-Leu-Phe-甲酯IBOC-L-甲硫氨酰(亞砜)-L-Leu-L-Phe-L-賴氨酰胺IBOC-正亮氨酰-L-Leu-L-Phe-L-賴氨酰胺N-For-L-甲硫氨酰(亞砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-LysN-For-L-甲硫氨酰(砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-LysN-異丁基脲-Met-Leu-Phe-羧酸異丁氧羰基-Met-Leu-Phe-N-DTPA-LysN-For-(D)-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物t-BOC-Nle-Leu-Phe-Lys溶劑化物N-For-甲硫氨酰-亞砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-For-甲硫氨酰-砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-氨基甲酰-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-三甲基乙?；?Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物異丁氧羰基-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Nε-DTPA-Lys異丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH-BOC異丙基脲-Met-Leu-Phe-正丙基二胺-Asp-SHNH HBr異丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-Asp-SHNH HBr
異丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH HBrN-苯基脲-Met-Leu-Phe異丙基脲-Met-Leu-Phe-丙二胺-SHNHN-正丁基硫脲-Met-Leu-PheN-正丁基脲-Phe-Leu-Phe-Leu-PheN-異丙基脲-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-COOHiBOC-Met-Leu-Phe-COOHiBOC-Met-Leu-Phe[酰氨基(丙基酰氨基)羧基[(丙基)羧基)]-(酰氨基丙醇SPNH)酯N-異丁基脲-Met-Leu-Phe-羧酸N-正丙基脲-Met-Leu-PheN-叔丁基脲-Met-Leu-PheN-正丁基脲-Met-Leu-PheiBOC-Met-Leu-Phe-(酰氨基乙氧基乙基[3-酰氨基]-6-丙烯醛腙)-吡啶N-iBOC-Met-Leu-Phe-SPNH-硫代酯N-異丙基脲-Met-Leu-PheN-iBOC-Met-Leu-Phe-丙二胺-SPNH環(huán)己基脲-Met-Leu-Phe-COOHN-正丁基氨基甲酸-Met-Leu-Phe-甲酯N-iBOC-Met-Leu-Phe-甲酯N-甲基氨基甲酸-Met-Leu-Phe-甲酯N-金剛烷基脲-Met-Leu-PheN-肉桂?；?Met-Leu-Phe
對(duì)甲苯基脲-Met-Leu-Phe間甲苯基脲-Met-Leu-PheN-肉桂?；?Phe-Leu-Phe-Leu-Phe。
除確定和鑒定病灶性感染和炎癥位點(diǎn)外，本發(fā)明的方法可用于監(jiān)視個(gè)體中的炎癥過程。例如，通過測(cè)量炎癥位點(diǎn)大小或數(shù)目的增大或減小，可能確定旨在改善感染或炎癥過程的其他起因的、或針對(duì)炎癥過程自身的具體治療方案是否有效。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明用于診斷該位點(diǎn)炎癥的特異根本原因。在此方法中，首先給予懷疑有炎癥點(diǎn)的個(gè)體以診斷有效量的趨化肽(如前所述)，然后進(jìn)行放射照相造影，以確定該位點(diǎn)的存在和其位置。
用于實(shí)施本發(fā)明的趨化肽可為激動(dòng)劑或拮抗劑。在某些情況下，根據(jù)其所用濃度所給予的肽可是這兩者。
肽iBOC-MLFK和iBOC-MLFK-DTPA拮抗ForMLF刺激的中性白細(xì)胞釋放自由基，以及被激活的中性白細(xì)胞體內(nèi)與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。用111In接頭DTPA對(duì)C-末端的修飾仍保留了拮抗活性。這些肽不表現(xiàn)任何激動(dòng)活性。
通過比較激動(dòng)肽甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-正亮氨酰-酷氨酰-賴氨酸-DTPA(For-Nle FNle YK-DTPA)和拮抗肽iBoc-MLFK-DTPA進(jìn)行體內(nèi)造影研究。111In標(biāo)的肽迅速定位在感染位點(diǎn)。γ照相圖象和組織生物分布都證實(shí)了這種定位。這兩種肽的主要區(qū)別在于激動(dòng)肽定位于諸如肺、脾和骨髓的區(qū)域中、指示細(xì)胞活化和著邊，而拮抗肽卻并非如此。激動(dòng)肽引起白血細(xì)胞計(jì)數(shù)的暫時(shí)性下降(中性白細(xì)胞減少)，而拮抗肽沒有顯著影響。這些結(jié)果是激動(dòng)劑-拮抗劑的合理結(jié)果。激動(dòng)肽顯示在5小時(shí)內(nèi)靶標(biāo)-本底比一直增加，而拮抗肽在1小時(shí)時(shí)最有效。這提示較高的結(jié)合親和力(如與激動(dòng)肽)可造成靶標(biāo)-本底比提高，并在治療學(xué)上有利。這些結(jié)果很有用，還因?yàn)橐郧安磺宄卓箘┦欠衲茱@示造影能力。這種能力對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員不是顯而易見的，因?yàn)榻Y(jié)合和造影有可能要求借助激動(dòng)劑來(lái)激活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)并非如此。
拮抗肽t-Boc-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe抑制中性白細(xì)胞介導(dǎo)的溶酶體酶釋放。另外，其他的尿烷N-末端封閉基團(tuán)并不能將肽轉(zhuǎn)化為拮抗劑，反而轉(zhuǎn)化為激動(dòng)劑(甲氧羰基和芐氧羰基)。N-末端iBoc保護(hù)基也適于拮抗肽，在C-末端賴氨酸處被DTPA修飾的iBoc肽保持適當(dāng)?shù)纳锘钚浴?br> 本發(fā)明通過顯示拮抗劑iBoc-MLFK抑制與疾病相關(guān)的中性白細(xì)胞與內(nèi)皮粘附和釋放自由基的功能發(fā)展了本領(lǐng)域。該肽還在體內(nèi)定位患病位點(diǎn)。另外，它在發(fā)揮這些作用時(shí)并不改變白血細(xì)胞的數(shù)目。這些結(jié)果與粘附反應(yīng)封閉性拮抗肽和其他潛在拮抗劑的應(yīng)用相一致，即作為感染/炎癥疾病的治療和診斷劑。
肽骨架的修飾用其他化合物替代上述通式結(jié)構(gòu)中的一個(gè)Leu或Phe殘基也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
a.亮氨酸用二丙基甘氨酸(Dpg)替代亮氨酸殘基，生成的類似物是對(duì)人中性白細(xì)胞的化學(xué)引誘物。所制備并測(cè)試的肽是甲酰-Met-Dpg-Phe-OH。
用1-氨基環(huán)己烷羧酸(Acc6)替代亮氨酸殘基，生成的類似物是兔中性白細(xì)胞中溶菌酶釋放的強(qiáng)誘導(dǎo)劑。所合成并測(cè)試的肽是甲酰-Met-Acc6-Phe-OH。
b.苯丙氨酸用z-脫氫苯丙氨酸替代苯丙氨酸殘基，生成的類似物刺激兔中性白細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物。所合成并測(cè)試的化合物是甲酰-Met-Leu-z-Phe-OMe。
以下列出了制備用于骨架修飾的替代氨基酸的參考文獻(xiàn)a)4-氨基四氫硫代吡喃-4-羧酸(替代甲硫氨酸)公開于Torrini等，Indian Journal of Peptide Protoin Research 38495-504(1991)；b)二丙基甘氨酸和1-氨基環(huán)己烷羧酸(替代亮氨酸)公開于Dentino等，The Journal of Biological Chemistry 2818460-18468(1991)；c)z-脫氫苯丙氨酸(替代苯丙氨酸)用Chauhan等，Tetrahedron 442359-2366(1985)中描述的方法制備；d)2-氨基二氫茚酮-2-羧酸(替代苯丙氨酸)公開于Gavuzzo等，Indian Journal of Peptide Protein Research 37268-276(1991)；和e)苯胺基甘氨酸(替代苯丙氨酸)按Krahs等，EuropeanJournal of Medicinal Chemistry 2719-26(1992)中描述的方法制備。
在本發(fā)明的另一方案中，趨化肽可被“治療學(xué)結(jié)合”并用于輸送治療劑至感染或炎癥位點(diǎn)。“治療學(xué)結(jié)合”一詞指趨化肽與治療劑結(jié)合。以此方式使用的治療劑針對(duì)炎癥的根本病因，如感染生物或腫瘤，或針對(duì)炎癥過程自身的成分。用于治療炎癥的藥劑實(shí)例有甾類和非甾類抗炎藥。許多非甾類抗炎藥抑制前列腺素的合成。
可用于按本發(fā)明方法與趨化肽偶聯(lián)的其他治療劑有藥物、放射性同位素、植物血凝素、毒素、和抗微生物藥。服用的治療劑量是治療有效的量，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定。該劑量還取決于受體的年齡、健康和體重、共同治療(如果有的話)的種類、治療頻率、目標(biāo)效應(yīng)的性質(zhì)，如抗炎效應(yīng)或抗菌效應(yīng)。
植物血凝素是常源自植物的與碳水化合物結(jié)合的蛋白質(zhì)。許多植物血凝素還能使細(xì)胞凝集并刺激-些淋巴細(xì)胞。蓖麻蛋白是已用于治療學(xué)的一種毒性植物血凝素，通過將負(fù)責(zé)毒性的α-鏈與抗體分子結(jié)合，以達(dá)到位點(diǎn)特異性運(yùn)送毒性效應(yīng)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，蓖麻蛋白α-鏈與趨化肽結(jié)合。
毒素是由植物、動(dòng)物和微生物產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，在足夠劑量下可能是致命的。白喉毒素是由白喉棒狀桿菌產(chǎn)生的一種蛋白，由可分離的α-和β-亞單位組成。該毒性成分可與趨化肽結(jié)合，用于向感染或炎癥反應(yīng)位點(diǎn)上特異性輸送。
為治療目的可與趨化肽結(jié)合的按本發(fā)明方法使用的放射性同位素的例子有125I、131I、90Y、67Cu、217Bi、211At、212Pb、47Sc、186Re、188Re、105Rh、153Sm和109Pd。
可用于實(shí)施本發(fā)明的抗微生物藥是能抑制感染性微生物如細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲的物質(zhì)(Goodman，A.G.等，1985，同上)，可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何這種物質(zhì)。
能與按本發(fā)明方法使用的趨化肽或特異抗體偶聯(lián)的其他治療劑也是已知的，或本領(lǐng)域技術(shù)人員易于確定。
用于胃腸外給藥的造影趨化肽的或治療學(xué)上結(jié)合的趨化肽的制劑，包括無(wú)菌水或非水溶液、懸液和乳液。非水溶劑的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、可注射有機(jī)酯如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸液(包括鹽水和緩沖液)，包括氯化鈉、Ringer葡萄糖、葡萄糖加氯化鈉、乳酸化Ringer液、或固定油的胃腸外載體。靜脈內(nèi)載體包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、電解質(zhì)補(bǔ)充物，如基于Ringer葡萄糖的那些，等等。還可以存在防腐劑和其他添加劑，如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體?？傮w上，見Remington’s Pharmaceutical Science，16th ed.，Mac Eds.1980.
本發(fā)明的造影趨化肽或治療學(xué)上結(jié)合的趨化肽的制劑，可用能達(dá)到其預(yù)期目的的任何方法給藥。例如，可經(jīng)胃腸外給藥，包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮或頰內(nèi)途徑?？梢蕴娲鼗蛲瑫r(shí)使用口服給藥。用于造影的可檢測(cè)標(biāo)記趨化肽的優(yōu)選給藥途徑是靜脈途徑。該趨化肽可一次全部給藥，或逐漸灌注(優(yōu)選靜脈內(nèi))，使用蠕動(dòng)工具以完成該逐漸灌注。
本發(fā)明可用于檢測(cè)軀體廣泛部位的感染或炎癥，包括但不限于肌肉、血管壁、腹部、骨盆、骨、關(guān)節(jié)或肺。
本發(fā)明可用于診斷任何數(shù)量的微生物感染，或診斷由這種感染或由創(chuàng)傷、自體免疫過程或腫瘤引起的炎癥。
本發(fā)明還可用作提高感染或炎癥治療的效力和其響應(yīng)的工具。
以上公開內(nèi)容一般性地描述了本發(fā)明。參照以下具體實(shí)施例可獲得更全面的理解，本文提供這些實(shí)施例只用于說(shuō)明目的，而無(wú)意于限制本發(fā)明，除非特別說(shuō)明。
實(shí)施例1試驗(yàn)性細(xì)菌感染的病灶點(diǎn)造影用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)固相方法合成了趨化肽N-甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.152149-2154(1963))；Stewart，J.M.，和Young，J.D.，Solid PhasePaptide Synthesis，W.H.Freeman&Company，San Francisco，CA(1969))。利用環(huán)形酸酐，用DTPA修飾C-末端賴氨酸的ε-氨基。原肽和DTPA衍生物的EC50幾乎相同，約為10-9M，表明用DTPA衍生化不影響肽的生物活性。(所有受試肽都得到了類似結(jié)果)。這一結(jié)果是非常令人驚異的，因?yàn)槿藗冾A(yù)期引入高負(fù)電DTPA基團(tuán)將會(huì)明顯改變這種小肽的性質(zhì)。這種肽易于用111In放射標(biāo)記。六只Sprague-Dawley大鼠通過在左側(cè)股部注射108活大腸桿菌進(jìn)行試驗(yàn)感染。感染后24小時(shí)注射約100μCi的標(biāo)記肽(5-10μg)。連續(xù)的γ照相圖象表明1小時(shí)時(shí)放射活性的分布在感染位點(diǎn)發(fā)生峰積(靶標(biāo)-本底比約為4.0)。2小時(shí)時(shí)，活性水平的強(qiáng)度已下降，24小時(shí)時(shí)幾乎分辨不出損傷部位。
這些結(jié)果確立了這種新試劑在感染動(dòng)物模型中對(duì)炎癥位點(diǎn)造影的實(shí)用性。
實(shí)施例2白細(xì)胞結(jié)合的生物分布和趨化肽的生物活性白細(xì)胞結(jié)合通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)測(cè)試4種與DTPA偶聯(lián)的趨化肽與人中性白細(xì)胞的結(jié)合，其中〔3H〕For-MLF被遞增濃度的未標(biāo)記肽所置換(Babior，B.M.等，J.Clin.Invest.52741(1973))。結(jié)果示于圖1中。試驗(yàn)中包括3種未DTPA衍生化的肽作為對(duì)比。
產(chǎn)生SOD試驗(yàn)4種與DTPA偶聯(lián)的趨化肽刺激人中性白細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物(Pike，M.C.等，Methods in Enzymol.162236(1988))。這些結(jié)果示于圖2中。為比較目的，試驗(yàn)中還包括MLF。
體內(nèi)中性白細(xì)胞減少以大于標(biāo)準(zhǔn)造影劑量大約10倍的劑量，將兩種DTPA偶聯(lián)趨化肽給予大鼠。在注射前5分鐘和注射后1，2，5，10，15和30分鐘(通過尾靜脈)采集外周血。在所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，沒有顯著誘發(fā)中性白細(xì)胞減少。
實(shí)施例3-5下列實(shí)施例3-5說(shuō)明異丁氧羰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-N-二亞乙基三胺五乙酰-賴氨酸(iBoc-MLFK-DTPA)是定位于體內(nèi)感染病灶點(diǎn)的ForMLF激活中性白細(xì)胞的拮抗劑。發(fā)生定位而不改變白血細(xì)胞數(shù)量。
實(shí)施例3分離的人中性白細(xì)胞(2.5×105)與1μMiBoc-MLFK-DTPA預(yù)培養(yǎng)10分鐘，然后在2.8μM氨基苯二酰肼(luminol)存在下用10nM For MLF刺激，氨基苯二酰肼作為自由基依賴性化學(xué)發(fā)光的增敏劑。在這些試驗(yàn)條件下反應(yīng)被完全抑制。隨后的研究表明這些抑制是劑量依賴性的，IC50為0.2μM。
實(shí)施例4在病灶性感染的兔模型中比較了肽拮抗劑iBoc-MLFK-DTPA與肽激動(dòng)劑甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-正亮氨酰-酪氨酰-賴氨酸-DTPA(ForNleLFNleYK-DTPA)。在每只兔(2-3kg)的后肢用大腸桿菌誘發(fā)病灶性感染，其步驟見實(shí)施例100B。24小時(shí)后，一組兔(n＝3)接受拮抗肽iBoc-MLFK-DTPA，而第二組接受激動(dòng)肽For Nle LFNle-YK-DTPA。這些肽均用111In放射標(biāo)記達(dá)比活性為約400μCi/μg肽。每只兔用氯氨酮-Xylazine麻醉，并經(jīng)邊緣耳靜脈注射100μCi或0.25μg肽。在5，15，30和60分鐘時(shí)測(cè)定下列參數(shù)白細(xì)胞數(shù)、整體圖像，及在60分鐘時(shí)處死動(dòng)物以確定組織生物分布。激動(dòng)肽誘發(fā)暫性白細(xì)胞數(shù)降低，而拮抗肽沒有。在注射激動(dòng)劑或拮抗劑10分鐘時(shí)就可檢測(cè)到病灶性感染位點(diǎn)。生物分布顯示與拮抗肽相比，激動(dòng)肽較多聚積在脾和肝中。兩種肽都迅速在腎中積累。拮抗劑的血濃度略高些，這可能提示這種肽的生物半衰期較長(zhǎng)。感染肌肉比率范圍為4∶1到7∶1，表明在感染肌肉部位顯著的吸收。激動(dòng)肽的靶-本底比在5小時(shí)內(nèi)升高，而拮抗肽比率在1小時(shí)時(shí)最高。以上表明拮抗性趨化肽能夠迅速定位于病灶性感染位點(diǎn)，從而具有感染或炎癥位點(diǎn)診斷造影的實(shí)用性。另外，這些資料提示拮抗肽在涉及這種特異受體的疾病治療中的潛在用途。
實(shí)施例5在中性白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附試驗(yàn)中測(cè)評(píng)未偶聯(lián)的肽iBoc-MLFK。在此試驗(yàn)中，用5-羧基熒光素二乙酸鹽標(biāo)記的中性白細(xì)胞(5×105)加至含匯合的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的48孔板上。以10μM的濃度加入iBoc-MLFK肽，10分鐘后用30μM ForMLF刺激中性白細(xì)胞。溫育25分鐘后洗去未結(jié)合的中性白細(xì)胞，測(cè)定粘附百分比。這種肽在此濃度下抑制粘附達(dá)66％。隨后測(cè)試了0.1-3.0μM間的濃度。這種肽劑量依賴性地抑制中性白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，IC50約為14μM。對(duì)粘附的抑制將減少白細(xì)胞如中性白細(xì)胞向患病點(diǎn)的侵潤(rùn)，從而限制與炎癥有關(guān)的組織損害。這些資料提供了支持用肽拮抗劑治療活化白細(xì)胞有關(guān)疾病的進(jìn)一步證據(jù)。
實(shí)施例6-98用本發(fā)明范圍內(nèi)的其他趨化肽重復(fù)實(shí)施例5的步驟。結(jié)果示于表I中。在此表中，MPO是髓超氧化物酶試驗(yàn)，“-”指在30μM時(shí)無(wú)作用，“+”指在30μM時(shí)有陽(yáng)性作用，“N.T.”指未測(cè)定。
表I細(xì)胞生物活性數(shù)據(jù)

表I(續(xù))細(xì)胞生物活性數(shù)據(jù)

溶解度問題表I(續(xù))細(xì)胞生物活性數(shù)據(jù)

表I(續(xù))細(xì)胞生物活性數(shù)據(jù)

溶解度問題表I(續(xù))細(xì)胞生物活性數(shù)據(jù)

表I(續(xù))細(xì)胞生物活性數(shù)據(jù)

表I(續(xù))細(xì)胞生物活性數(shù)據(jù)

實(shí)施例99在以下實(shí)施例中，按常規(guī)液相方法(Bodansky，M.和Bodansky，A.，1984，“The Practice of Peptide Synthesis”，SpringerVerlag，New York)合成了Met-Leu-Phe鹽酸鹽。異氰酸酯有供應(yīng)時(shí)從Aldrich獲得。沒有供應(yīng)的異氰酸酯通過適宜的胺與從Aldrich獲得的triphos(二(2-聯(lián)苯基膦基乙基)苯基膦)的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)而制得。所有的1HNMR譜在Bruker 30 MHz儀上在DMSOd6中測(cè)得，并相對(duì)TMS內(nèi)標(biāo)報(bào)告。
游離氨基肽與適當(dāng)?shù)漠惽杷狨シ磻?yīng)易于制得良好收率的N-末端脲保護(hù)的肽。以下描述N-正丁基-N’-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸-脲的合成舉例。將1.0g Met-Leu-Phe鹽酸鹽(2.2mMol)懸浮在10ml無(wú)水DMF中，并加入2.2當(dāng)量(0.70ml，5.0mMol)無(wú)水三乙胺，然后加入1.25當(dāng)量(0.31ml，2.8m Mol)異氰酸正丁酯。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物16小時(shí)，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去DMF。將殘余物溶解在1ml甲醇中，快速攪拌下加入15ml 1NHCl。過濾生成的白色固體(0.81g，71％)，用水洗，真空干燥過夜。FABMS；C25H40N4O5S，測(cè)定值509(M＋1)。
1H NMR(MeOH，d6)δ8.12(d，J＝8Hz.，1H)，8.01(d，J＝8Hz.，1H)，7.21(m，5H)，4.62(m，1H)，4.30(m，1H)，4.25(m，1H)，3.17(m，4H)，2.45(t，J＝7Hz，2H)，1.95(m，1H)，1.77(m，2H)，1.40(m，6H)，92(m，9H)。
實(shí)施例100該實(shí)施例證明99mTc標(biāo)記的趨化肽類似物是用于感染病灶點(diǎn)外部造影的有效試劑。
合成了4種肼基煙酰胺(HYNIC)衍生化的趨化肽類似物，F(xiàn)or-Nle LFK-HYNIC(HP1)，F(xiàn)or-MLFK-HYNIC(HP2)、For-MLFNH(CH2)6NH-HYNIC(HP3)和For-MLF-(D)K-HYNIC(HP4)，并評(píng)價(jià)其體外生物活性和受體結(jié)合。
材料和方法肽合成和鑒定按Fischman，A.J.，J.Nucl.Med.32483-491(1991)中所述的標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)(Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.152149-2154(1963)；Stewart，J.M.，和Youg.J.D.，Solid Phase PeptideSynthesis，W.H.Freeman&Company，San Francisco，CA(1969))合成并純化了N-甲酰(For)-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-賴氨酸-NH2，N-For-甲硫氨酸-亮氨酰一苯丙氨酰-賴氨酸，N-For-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-二氨基己基酰胺，和N-For-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-D-賴氨酸-NH2。所有試劑均為從商業(yè)渠道得到的最高級(jí)別。如以下對(duì)HP3所描述的方法，對(duì)這些化合物進(jìn)行煙酰肼偶聯(lián)。
向186mg N-For-Met-Leu-Phe-二氨基己基酰胺中加入2ml二甲基甲酰胺(DMF)和60μl二異丙基乙基胺，然后加入1ml DMF中的154mg琥珀酰亞胺基-6-t-Boc-肼基吡啶-3-羧酸(Abrams，M.J.，等，J.Nucl.Med.312022-2028(1990)。混合物變黃，肽在短時(shí)間內(nèi)溶解。2小時(shí)后向反應(yīng)混合物中加入乙醚-石油醚，并棄去上層。向油狀殘條物中加入水使得形成固體。用5％碳酸氫鈉、水和乙酸乙酯洗滌固體，得重183mg的產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物與含0.1ml對(duì)甲苯酚的5ml三氟乙酸(TFA)一起于20℃攪拌15分鐘，除去t-Boc保護(hù)基。用TFA處理時(shí)間延長(zhǎng)則形成的付產(chǎn)物增加。經(jīng)旋轉(zhuǎn)器發(fā)除去TFA，向殘余物中加入乙醚使脫保護(hù)肽沉淀。在2.5×50cm Whatman ODS-3柱上用0.1％TFA中乙腈梯度洗膜進(jìn)行反相HPLC純化產(chǎn)物。合并含主成分的流份，除去溶劑產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物。用UV和質(zhì)譜以及氨基酸分析來(lái)鑒定肽。
細(xì)胞制備在3％葡聚糖(Pharmacia，Nutley，NJ)中沉降，然后經(jīng)Lymphoprep(Organon Teknika，Durham，NC)梯度離心分離人外周血多形核白細(xì)胞(PMN)。用Wright染色標(biāo)本的光學(xué)顯微鏡法估測(cè)，細(xì)胞制劑含有＞95％PMN。
For-MLF受體結(jié)合試驗(yàn)N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(For-MLF)、N-甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(For-NleLF)和N-甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙酰-正亮氨酰-酪氨酰-賴氨酸(For-Nle LF Nle YK)從Sigma(St.Louls，MO)獲得。For-ML[3H]F(60 Ci/mmol)從Hew England Nuclear(Boston，MA)獲得。以總體積0.15ml及在各種濃度的衍生化肽和15nM ForML[3H]F(Deuel，T.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1)4584-4587(1981)；Fischman，A.J.等，J.Nucl.Med.32483-491(1991)；Pike M.C.，等，Methods Enzymol.162236-245(1988))存在和不存在下，8×105分離的人PMN(從健康自愿者獲得)在含1.7mMKH2PO4、8.0mM Na2HPO4、0.117M NaCl、0.15mM CaCl2、0.5mM MgCl2和1.0mM PMSF PH7.4的磷酸鹽緩沖的鹽水(培養(yǎng)緩沖液)中于24℃45培養(yǎng)分鐘。培養(yǎng)后將細(xì)胞濾至玻璃纖維盤(Whatman GF/C；Whatman，Inc.，Clifton，NJ)上，然后用20ml冰冷培養(yǎng)緩沖液洗滌。將此濾膜置于含10ml Safety-Solve(Research Products International Corp.，Mt.Prospect，IC)的閃爍管中，并用液體閃爍光度法測(cè)定放射活性。特異結(jié)合定義為總結(jié)合減去非特異性結(jié)合。非特異結(jié)合是在10μM未標(biāo)記For-MLF存在下殘余結(jié)合的放射活性量。非特異性結(jié)合為總結(jié)合的約10％。
為了確定99mTc放射標(biāo)記對(duì)結(jié)合親合力的影響，以0.15ml總體積在各種濃度的For-Nle LF Nle YK或相應(yīng)的未標(biāo)記肽和固定量的99mTc標(biāo)記肽存在或不存在下，將分離的人PMN(2×106細(xì)胞)在HBS/BSA中于40℃培養(yǎng)60分鐘。培養(yǎng)后，混合好的等份(0.1ml)細(xì)胞懸液在0.4ml微量離心管中用0.2ml HBSS/BSA∶Lymphoprep(1∶1)覆蓋，并于15000rpm將內(nèi)容物離心4分鐘(Microfhge E，Beckman，Columbia，MD)。在液氮中冷凍各管并分離細(xì)胞層。通過γ計(jì)數(shù)測(cè)定放射活性。非特異性結(jié)合是在5μM未標(biāo)記For-NleLFNleYK或相應(yīng)的未標(biāo)記肽存在下的殘余結(jié)合放射活性。非特異結(jié)合為總結(jié)合的約10％。
超氧化物產(chǎn)生的試驗(yàn)佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和細(xì)胞松馳素B從Sigma(St，Louis，MO)獲得。通過用消光系數(shù)29.5/mmol/L/cm監(jiān)視高鐵細(xì)胞色素C的超氧化物歧化酶可抑制性還原來(lái)測(cè)定超氧化物的釋放。簡(jiǎn)言之，分離的人中性白細(xì)胞用Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)(GIBCO，Grand Island，NY)培養(yǎng)。在10μM細(xì)胞松馳素B+/-超氧化物歧化酶(50μg/ml)存在下，只用HBSS或含有l(wèi)nM到1μM遞增濃度的肽(HP1，HP2，HP3，HP4，F(xiàn)or-NleLF，F(xiàn)or-MLF或For-NleLFNleYK)時(shí)于37℃培養(yǎng)10分鐘。用分光光度法測(cè)定高鋏細(xì)胞色素C的還原。
HYNIC衍生的趨化肽的99mTc標(biāo)記99mTc高锝酸鹽(99Mo/99mTc發(fā)生劑和葡庚糖酸亞錫(Glucoscan)從New England Nuclear(Boston，MA)獲得。99mTc-葡庚糖酸鹽用于提供放射標(biāo)記肼基煙酰胺結(jié)合肽所必需的Tc(V)氧代。向此冷干試劑盒中加入約2.5ml 0.9％NaCl中的99mTc高锝酸鹽。最終放射活性濃度為5-10mCi/ml，產(chǎn)物的放化純度通過即時(shí)薄層硅膠層析(ITLC-sg)來(lái)測(cè)定，用丙酮和0.9％NaCl作為流動(dòng)相溶劑。
使用下列步驟用99mTc放射標(biāo)記趨化肽。將約0.2mg肽溶于50μl二甲基亞砜中；用0.1M PH5.2的乙酸鹽稀釋至終濃度0.1mg/ml。將0.5ml肽溶液置于一清潔的玻璃瓶中，加入0.5ml99mTc-葡庚糖酸鹽。將此混合物快速渦旋，室溫下靜置1小時(shí)。在三種溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行ITLC-sg測(cè)定放化純度丙酮，0.9NaCl和丙酮∶水(9∶1)。
還用兩種系統(tǒng)進(jìn)行反相HPLC分析了99mTc標(biāo)記的肽類似物。系統(tǒng)A使用Beckman C18反相柱(5μ，4.5×46mm，Beckman，Columbia，MD)，洗脫條件溶劑A50mH乙酸鹽中5％乙腈，PH5.2；溶劑B50mM乙酸鹽中50％乙腈，PH5.2；梯度20分鐘內(nèi)由0％B到100％B；流速2mL/分。系統(tǒng)B使用VydacC18反相柱)300A，5μ，4.5mm×25cm，Vydac)，洗脫條件溶劑A水中0.1％三氟乙酸；溶劑B丙酮中0.1％三氟乙酸；梯度10分鐘內(nèi)由0％B到100％B；流速2mL/分。用Milton-Roy/LDC流過式分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)紫外吸收，用Beckman170(Backman，Columbia MD)監(jiān)測(cè)放射活性。用一種雙通道積分儀(Waters Model 746 Data Module，Waters，Marlboro，M4)記錄并分析了來(lái)自兩種檢測(cè)器的輸出信號(hào)。
比活性的最大化為了避免與藥理劑量趨化肽類似物相關(guān)的中性白細(xì)胞減少，將99mTc標(biāo)記趨化肽的比活性最大化，以使99mTc的造影劑量即最終所服用的肽明顯低于已知的活化EC50濃度(～20nM)。
在前次洗出后5小時(shí)洗脫99mTc發(fā)生劑以使99mTc的比例減至最小而保持99mTc洗出液＞300mCi。用發(fā)生劑動(dòng)力學(xué)方程結(jié)合所用99Mo/99mTc發(fā)生劑的已知?dú)v史計(jì)算Tc的質(zhì)量和99Tc與99mTc的相對(duì)比例。如上所述制備99mTc-葡庚糖酸鹽(Tc-GH)。將180μg趨化肽(MW720)溶解在50μl DMSO中，用0.1M乙酸鹽緩沖液(PH5.2)稀釋至終濃度100μg/ml。肽溶液等份用乙酸鹽緩沖液進(jìn)行系列稀釋，得到2-80μg/ml范圍的濃度。將0.5ml99mTc-GH加入等體積的肽/乙酸鹽緩沖液中開始肽標(biāo)記。快速渦旋此溶液，室溫下保溫1小時(shí)。用三種獨(dú)立溶劑系統(tǒng)進(jìn)行ITLC-sg測(cè)定肽標(biāo)記的程度丙酮，0.9％NaCl，和丙酮∶水(9∶1)。用下述關(guān)系計(jì)算放射標(biāo)記肽的比活性(％RCY×存在的mCi)/(肽的μMol數(shù)×100)。
體內(nèi)研究在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行了三種研究A)為了確定放射標(biāo)記肽類似物在健康動(dòng)物中的體內(nèi)分布，對(duì)每種類似物進(jìn)行了生物分布研究；B)為了測(cè)定放射標(biāo)記肽類似物定位于炎癥病灶位點(diǎn)的能力，在大腸桿菌感染的大鼠中進(jìn)行了組織放射活性測(cè)定；及C)為評(píng)價(jià)放射標(biāo)記肽的感染造影特性，對(duì)大腸桿感染的兔進(jìn)行了γ照相。
A.正常大鼠中的生物分布給由24只重約150g的正常雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Breeding Laboratories，Burlington MA)組成的各組動(dòng)物注射約5μCi每種99mTc標(biāo)記的肽，在5，30，60和120分鐘時(shí)測(cè)定生物分布(同一時(shí)間點(diǎn)上在6只動(dòng)物中測(cè)評(píng)每種肽)。將血液、心臟、肺、肝、、脾、胃、腎、胃腸道、骨骼肌、睪丸和骨標(biāo)本稱重，并用一種井型γ計(jì)數(shù)器(LKB model#1282，Wallac Oy，芬蘭)測(cè)定放射活性。為了校正放射衰變，所注射劑量的等份樣品也同時(shí)計(jì)數(shù)。結(jié)果以每克中所注射劑量的百分?jǐn)?shù)表示。
B.對(duì)感染大鼠的研究一種大腸桿菌的單一臨床分離物用于產(chǎn)生病灶性感染。細(xì)菌在胰胨大豆瓊脂板上37℃培養(yǎng)過夜，單一菌落用無(wú)菌0.9％NaCl稀釋以產(chǎn)生含約2×109細(xì)菌/ml的渾濁懸液。重約150g的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Breeding Laboratories，Burlington MA)用氯氨酮麻醉，并在其左后股部肌肉注射0.1ml含約2×108細(xì)菌的懸液。
接種細(xì)菌24小時(shí)后，給經(jīng)注射股部腫大的動(dòng)物通過側(cè)尾靜脈注射約5μCi(3pMol)的99mTc標(biāo)記肽。注射后30和120分鐘，將5只動(dòng)物的各組斷頸處死。如上所述取組織標(biāo)本，測(cè)定放射活性并計(jì)算結(jié)果。
C.感染兔的造影為了確定使用放射標(biāo)記趨化肽在對(duì)這些試劑的中性白細(xì)胞減少效應(yīng)敏感的動(dòng)物中進(jìn)行感染定位的可行性，在大腸桿菌病灶性感染的兔中進(jìn)行了造影研究。重2-3kg的6只雄性新西蘭白兔用氯氨酮和xylazine(15.0和1.5mg/kg)麻醉，并且在后股肌肉中注射1.0ml約2×109大腸桿菌的懸液。接種后24小時(shí)，給經(jīng)注射股部腫大的兔通過側(cè)耳靜脈注射600-1000μCi HPLC純化的99mTc標(biāo)記HP2(比活性＞10000mCi/μMol，如上所述經(jīng)HPLC與未標(biāo)記肽分離)。用氯氨酮和xylazine(15.0和1.5mg/kg)麻醉動(dòng)物，并在注射后0到3小時(shí)和16-17小時(shí)用大視野γ照相機(jī)(TechnicareOmega 500，Solon，Ohio)獲取系列閃爍圖象，所述照相機(jī)裝有高分辨平行孔準(zhǔn)直儀并與專用計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)(Technicare 560，Solon，Ohio)。在預(yù)置的5分鐘/視域(View)內(nèi)記錄圖象，集中15％的窗以包括99mTc的140KeV光峰。為了表征標(biāo)記肽的定位，進(jìn)行有義區(qū)(region-of-interest，ROI)分析，以時(shí)間的函數(shù)比較感染股與對(duì)側(cè)正常股的肌肉。
在獲得最后的圖象以后，注射過量戊巴比妥處死動(dòng)物，將血液、心臟、肺、肝、脾、腎、胃、腸、丸、骨、骨髓、正常骨骼肌、感染骨骼肌和膿標(biāo)本稱重，并按如上所述測(cè)定放射活性。為了校正放射衰變，所注射劑量的等份也同時(shí)計(jì)數(shù)。結(jié)果以每克中所注射劑量的百分?jǐn)?shù)表示。為了測(cè)定循環(huán)中與細(xì)胞結(jié)合的活性量，離心血液并分離細(xì)胞和血液。用0.9％NaCl清洗細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞和上清中的殘余活性。為了測(cè)定在感染位點(diǎn)與細(xì)胞結(jié)合的活性量。用0.9％NaCl洗膿兩次，測(cè)定細(xì)胞中和可溶部分中的殘留放射活性。
統(tǒng)計(jì)方法通過利用線性模型的方差分析(ANOVA)評(píng)價(jià)造影和生物分布研究的結(jié)果，其中器官和時(shí)間作為分類變量；％ID/g或％ID/器官＝器官＋時(shí)間＋器官×?xí)r間。用Duncan的新復(fù)極差法(Duncan，D.B.，Biometrics 111-42(1955))進(jìn)行post-hoc肽濃度比較。每個(gè)F值的第一個(gè)下標(biāo)是第一分類變量的自由度數(shù)(n－1)、第二個(gè)分類變量的自由度數(shù)(m－1)、或其交互作用的自由度數(shù)(n－1)×(m－1)。第二個(gè)下標(biāo)是剩余自由度的數(shù)目(觀察總數(shù)－n×m)。所有結(jié)果以均值±SEM表示。
結(jié)果肽合成均以良好收率和純度制備了4種HYNIC衍生化的趨化肽類似物。紫外分析顯示所有4種肽在268nm和315nm處有最大吸收，這是HYNIC基團(tuán)的特征。質(zhì)譜和氨基酸分析結(jié)果與預(yù)期偶聯(lián)肽產(chǎn)物一致。
趨化肽類似物的生物活性超氧化物產(chǎn)生試驗(yàn)的結(jié)果于示圖3中。表II中給出了產(chǎn)生50％最大響應(yīng)的肽濃度(EC50)。肽HP2，HP3和HP4具有與For-MLF相同的效力(100nM)或更高的效力。HP1的效力至少低一個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，對(duì)產(chǎn)生超氧化物的效力順序是HP2＞HP3＞HP4＞＞HP1。
表II趨化肽類似物的超氧化物產(chǎn)生和結(jié)合EC50肽 超氧化物 結(jié)合親產(chǎn)生和力nM nMHP1 500 40HP212 0.18HP340 0.12HP460 0.35For-MLF 100 20For-NleLF 320 300For-NleLFNleYK100 1定義為所產(chǎn)生超氧化物陰離子(O2-)的最大量的肽效力，所有受試肽都相似，在2.07-3.80mol O2-/106細(xì)胞/10分鐘范圍內(nèi)。所有肽的效力均低于佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)(一種PMN氧化性爆發(fā)的無(wú)關(guān)激活劑)效力，它在0.1μM濃度時(shí)產(chǎn)生22.9nmol O2-/106細(xì)胞/10分鐘的響應(yīng)。
趨化肽類似物與化學(xué)引誘物受體的結(jié)合圖4顯示HYNIC衍生化趨化肽類似物抑制For-ML[3H]F與完整人PMN的結(jié)合，其效力水平與對(duì)產(chǎn)生超氧化物陰離子的效力水平相似。表II中給出了對(duì)For-ML[3H]F與人PMN結(jié)合產(chǎn)生50％抑制所需要的肽濃度(EC50)。肽HP2，HP3和HP4的EC50值與六肽For-MeLFNleYK的相似。雖然HP1與化學(xué)引誘物受體的親和力比此系列中其他HYNLC衍生化肽的低約100倍，但僅低于For-MLF的效力1倍。三肽For-NleLF的效力比六肽和For-MLF低100倍以上。因此，與化學(xué)引誘物受體的親和力順序?yàn)镠P3＞HP2＞HP4＞＞HP1。99mTc-HP2的EC50＜10nM。
為了確定99mTc標(biāo)記對(duì)受體結(jié)合的影響，用上文描述的試驗(yàn)條件測(cè)定未標(biāo)記HYNIC-肽置換99mTc標(biāo)記肽的能力。這些試驗(yàn)的結(jié)果證明取代50％99mTc肽與中性白細(xì)胞的結(jié)合所要求的未標(biāo)記肽濃度比用For-ML[3H]F作為示蹤劑時(shí)大大約10倍。如果放射標(biāo)記物中每個(gè)Tc-葡庚糖酸鹽含有一個(gè)以上肽單位并且結(jié)合是協(xié)作性的，則這種結(jié)合親和力的提高可得到解釋。
用99mTc放射標(biāo)記在用于監(jiān)測(cè)放射標(biāo)記的溶劑系統(tǒng)中，99mTc標(biāo)記肽和99mTc-葡庚糖酸鹽在即時(shí)薄層層析-硅膠條上的Rf值為0.9％NaCl-99mTc-肽＝0.0，99mTc-葡庚糖酸鹽＝1.0；丙酮-99mTc-肽＝1.0，99mTc-葡庚糖酸鹽＝0.0；丙酮∶水(9∶1)-99mTc-肽＝1.0，99mTc-葡庚糖酸鹽＝0.0。與僅用丙酮時(shí)相比，第三種系統(tǒng)峰尾最小，得到99mTc-肽的窄帶。所有99mTc-肽制備物的ITLC證明保溫1小時(shí)后90％以上的放射活性與肽相連。用HPLC系統(tǒng)A分析標(biāo)記肽，顯示99mTc-葡庚糖酸鹽、99mTc-HP1、99mTc-HP2、99mTc-HP3和99mTc-HP4的主要放射性峰的保留時(shí)間分別為0.3-0.5、14.37、11.25、15.11、和12.96分鐘。比活性的最大化99Mo/99mTc發(fā)生劑洗脫得總活性456mCi。Tc總量為3.4mMol，99Tc與99mTc之比為1.53∶1，計(jì)算99mTc的比活為134000mCi/μmol。如上所述制備99mTc-葡庚糖酸鹽(Tc-GH)；制備時(shí)最終放射濃度＞150mCi/ml。用丙酮和0.9％NaCl進(jìn)行即時(shí)薄層層析測(cè)得99mTc-GH的放化純度為＞95％。
趨化肽激動(dòng)劑類似物的藥理效力要求高比活放射標(biāo)記，以減少存在于注射液中的肽的絕對(duì)量。理想的情況是不需要純化即可達(dá)到這種比活水平。圖5綜合了肽濃度對(duì)標(biāo)記產(chǎn)率的影響。從這些數(shù)據(jù)可清楚地看出反應(yīng)混合物的最終肽濃度對(duì)放化產(chǎn)率有顯著影響；肽濃度低于10μg/ml時(shí)得到的標(biāo)記產(chǎn)率差。當(dāng)結(jié)果相對(duì)于反應(yīng)混合物中肽-Tc摩爾比表示時(shí)，顯然當(dāng)該比率升高時(shí)，放化產(chǎn)率(％)升高而比活下降。
用此方法可能達(dá)到＞10,000mCi/mol的比活，但放化產(chǎn)率降至顯著低于10μg/ml的肽濃度。當(dāng)肽濃度＜10μg/ml時(shí)需要純化步驟除去來(lái)結(jié)合的99mTc?？捎梅聪郤ep-Paks去除未反應(yīng)的99mTc葡庚糖酸鹽和99mTcO4-。經(jīng)HPLC(用系統(tǒng)B)除去未反應(yīng)肽可使比活性進(jìn)一步提高。因?yàn)橄鄳?yīng)于99mTc-肽、未標(biāo)記肽和99mTc-葡庚糖酸鹽的峰在此HPLC系統(tǒng)中分辨良好，可分離無(wú)載體放射標(biāo)記肽。在此情形下，放射標(biāo)記肽的比活僅受99mTc發(fā)生劑洗脫液比活的限制。99mTc趨化肽在正常大鼠中的生物分布4種99mTc標(biāo)記趨化肽類似物的生物分布示于表III中。在所有體內(nèi)試驗(yàn)中，所有動(dòng)物耐受了放射標(biāo)記趨化肽類似物的靜脈給藥，而無(wú)明顯的不良影響。除腎、胃和胃腸道以外，所有肽的組織濃度隨時(shí)間而下降。
表III99mTc標(biāo)記的趨化肽類似物的生物分布％L.D./g(均值±SEM)器官時(shí)間 HP1 HP2 HP3 HP4(分)血液51.17±0.070 1.18±0.056 1.01±0.056 0.78±0.04630 0.82±0.019 0.67±0.036 0.55±0.017 0.48±0.05260 0.67±0.016 0.57±0.033 0.47±0.035 0.36±0.012120 0.52±0.010 0.48±0.015 0.39±0.015 0.31±0.010心 50.75±0.045 0.50±0.019 0.72±0.089 0.42±0.02730 0.50±0.010 0.32±0.016 0.27±0.021 0.22±0.02460 0.40±0.012 0.28±0.018 0.29±0.026 0.20±0.013120 0.37±0.028 0.26±0.013 0.25±0.024 0.16±0.012肺 51.54±0.122 0.85±0.043 10.65±1.473 1.11±0.09930 0.63±0.043 0.78±0.032 8.45±0.818 0.61±0.07160 0.64±0.039 0.46±0.030 5.10±0.449 0.49±0.026120 0.46±0.026 0.50±0.025 2.44±0.435 0.37±0.027肝 50.76±0.056 0.99±0.023 5.72±0.467 0.74±0.09130 0.53±0.012 0.62±0.019 4.81±0.205 0.52±0.02260 0.45±0.012 0.50±0.022 4.60±0.101 0.51±0.010120 0.43±0.016 0.58±0.026 4.75±0.175 0.46±0.016脾 50.34±0.014 0.35±0.023 2.27±0.281 0.35±0.04130 0.30±0.012 0.39±0.045 2.28±0.231 0.27±0.01760 0.26±0.006 0.25±0.013 3.11±0.191 0.32±0.017120 0.25±0.007 0.29±0.020 3.01±0.220 0.27±0.009
表III(續(xù))器官時(shí)間 HP1 HP2HP3 HP4(分)腎 5 3.08±0.092 3.30±0.1731.90±0.199 3.67±0.436305.13±0.282 4.82±0.2461.68±0.064 5.22±0.139605.16±0.115 4.36±0.2131.63±0.057 5.36±0.178120 5.68±0.143 4.17±0.1211.60±0.030 4.74±0.201胃 5 0.17±0.024 0.10±0.0040.38±0.053 0.19±0.011300.12±0.012 0.15±0.0100.56±0.029 0.09±0.023600.15±0.013 0.10±0.0050.51±0.034 0.15±0.017120 0.16±0.015 0.11±0.0110.39±0.008 0.15±0.012胃腸道 5 0.20±0.013 0.25±0.0120.33±0.038 0.16±0.005300.32±0.026 0.64±0.0740.64±0.046 0.32±0.039600.23±0.020 0.64±0.0890.70±0.050 0.39±0.030120 0.32±0.028 0.72±0.0550.81±0.047 0.41±0.035睪為5 0.15±0.010 0.12±0.0080.12±0.011 0.19±0.006300.14±0.005 0.11±0.0030.11±0.006 0.14±0.015600.13±0.005 0.10±0.0060.11±0.004 0.13±0.008120 0.14±0.003 0.10±0.0030.10±0.005 0.11±0.004肌肉5 0.32±0.013 0.25±0.0200.23±0.015 0.27±0.017300.22±0.004 0.17±0.0180.10±0.005 0.17±0.013600.19±0.008 0.14±0.0160.12±0.012 0.15±0.009120 0.20±0.012 0.15±0.0140.10±0.007 0.12±0.006骨 5 0.55±0.026 0.39±0.0110.39±0.023 0.37±0.038300.41±0.009 0.32±0.0130.26±0.017 0.37±0.019600.33±0.007 0.30±0.0200.28±0.023 0.34±0.009120 0.32±0.011 0.28±0.0120.24±0.017 0.28±0.009
在血液中，方差分析顯示肽(F3，70＝56.79，p＜0.0001)和時(shí)間(F3，70＝252.01，p＜0.0001)的顯著性主要影響；但肽與時(shí)間的交互作用不顯著。血中肽濃度的順序?yàn)镠P1＞HP2＞HP3＞HP4(p＜0.01)。在心組織中，方差分析顯示肽(F3，64＝44.36，p＜0.0001)和時(shí)間(F3，64＝98.06，p＜0.0001)的顯著性主要影響，及顯著的肽與時(shí)間交互作用(F9，64＝36.9，p＜0.001)。在肺中，方差分析顯示肽(F3,6570＝183.25，p＜0.0001)和時(shí)間(F3，65＝24.56，p＜0.0001)的顯著性主要影響，及顯著的肽與時(shí)間交互作用(F9，13.80，p＜0.0001)。肽濃度的順序?yàn)镠P3＞＞HP1＝HP4＝HP2(p＜0.01)。在肝中，方差分析顯示肽(F3，65＝1000,00，p＜0.0001)和時(shí)間(F3，65＝12.80，p＜0.0001)的顯著性主要影響；但肽與時(shí)間的交互作用不顯著。在肝中，肽濃度的順序?yàn)镠P3＞＞HP1＝HP4＞HP2(p＜0.01)。在脾中，方差分析顯示肽(F，633＝431.00，p＜0.0001)的顯著性主要影響，及顯著的肽與時(shí)間的交互作用(F9，63＝4.64，p＜0.0001)。在此器官中，時(shí)間的主要影響不顯著。肽濃度的順序?yàn)镠P3＞＞HP2＝HP4＝HP1(p＜0.01)。在腎中，方差分析顯示肽(F3，69＝291.58，p＜0.0001)和時(shí)間(F3，69＝40.14，p＜0.0001)的顯著性主要影響，及顯著性肽與時(shí)間的交互作用(F9，69＝10.94，p＜0.0001)。肽濃度的順序是HP4＝HP1＞HP2＞HP3(p＜0.01)。在胃中，方差分析顯示肽(F3，53＝202.98，p＜0.0001)和時(shí)間(F3，53＝5.56，p＜0.005)的顯著性主要影響，及顯著的肽與時(shí)間的交互作用(F9，53＝5.56，p＜0.0001)。肽濃度的順序是HP3＞HP4＝HP2(p＜0.01)。在胃腸道中，方差分析顯示肽(F3，62＝66.30，p＜0.0001)和時(shí)間(F3，62＝36.32，p＜0.0001)的顯著性主要影響，及顯著的肽與時(shí)間交互作用(F9，67＝477，p＜0.001)。肽濃度的順序?yàn)镠P4＝HP1＞HP3＝HP2(p＜0.01)。在骨骼肌中，方差分析顯示肽(F3，59＝48.70，p＜0.0001)和時(shí)間(F3，59＝97.69，p＜0.0001)的顯著主要影響；但肽與時(shí)間交互作用不顯著。肽濃度的順序?yàn)镠P1＞HP2＝HP4＞HP3(p＜0.01)。在骨中，方差分析顯示肽(F3，68＝30.15，p＜0.0001)和時(shí)間(F3，68＝52.84，p＜0.0001)的顯著性主要影響，及顯著的肽與時(shí)間交互作用(F3，68＝5.15，p＜0.0001)。肽濃度的順序?yàn)镠P1＞HP4＝HP2＝HP3(p＜0.01)。99mTc趨化肽在感染大鼠肌肉中的定位99mTc標(biāo)記肽類似物在正常和感染股部肌肉中的組織濃度(％ID/g)示于表IV中。
表IV99mTc標(biāo)記的趨化肽在正常和感染的大鼠肌肉中的組織濃度(％ID/克組織±SEM)時(shí)間 肽組織 (分) HP1 HP2 HP3 HP4正常 30 0.16±0.009 0.11±0.003 0.05±0.009 0.13±0.007120 0.10±0.006 0.07±0.004 0.05±0.005 0.13±01025感染 30 0.39±0.013 0.28±0.013 0.11±0.007 0.42±0.049120 0.21±0.008 0.16±0.007 0.10±0.004 0.32±0.019
方差分析顯示肽(F3，25＝56.51，p＜0.0001)和時(shí)間(F3，25＝59.45，p＜0.0001)的顯著性主要影響，及顯著的肽與時(shí)間交互作用(F3，25＝6.74，p＜0.005)。在正常肌肉中，HP1(p＜0.01)和HP2(p＜0.05)的濃度隨著時(shí)間降低，而HP3和HP4的濃度保持不變。在注射后30分鐘，正常肌肉中HP1的濃度大于(p＜0.01)其他肽，HP2的濃度大于(p＜0.01)其他肽，HP2的濃度大于(p＜0.01)HP3。在120分鐘時(shí)，正常組織中HP4的濃度大于(p＜0.01)HP2和HP3；HP1的濃度大于(p＜0.01)HP3。
在感染的肌肉中，HP1(p＜0.01)、HP2(p＜0.01)和HP4(p＜0.05)的濃度隨時(shí)間降低，HP3的濃度(其在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)的積累水平都是最低的)保持不變。在注射后30分鐘，HP1和HP4的濃度大于(p＜0.01)HP2和HP3的濃度；HP2的濃度大于(p＜0.01)HP3。在120分鐘時(shí)，HP4的濃度大于(p＜0.01)HP1、HP2和HP3；HP1的濃度大于(p＜0.01)HP3。
靶標(biāo)-本底比(T/B)(每克感染肌肉的％ID/每克正常肌肉的％ID)示于圖6中。方差分析顯示肽的顯著性主要影響(F3，22＝5.87，p＜0.005)。但時(shí)間的主要影響和肽與時(shí)間交互作用無(wú)顯著性。HP4的T/B比顯著大于HP2(p＜0.05)，HP1(p＜0.01)、和HP3(p＜0.01)。因此，證明在注射后的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，HP4不但在感染組織中絕對(duì)濃度最高，而且T/B比也最高。相反，HP3在感染組織中絕對(duì)濃度最低，而且T/B比最低。兔中感染病灶位點(diǎn)的造影在兔體內(nèi)，注射后立即在肺、肝和脾中檢測(cè)到高水平的99mTc-HP4。肺活性隨時(shí)間降低，注射后1-3小時(shí)在感染股中觀察到放射活性的病灶集累。注射后4小時(shí)，T/B比為約4∶1。注射后16小時(shí)(圖7)，整體損傷的平均T/B比增至10∶1，病灶區(qū)＞20∶1。另外在隨后(＞4小時(shí))的時(shí)間點(diǎn)注意到一些腸部積累。注射后16小時(shí)，測(cè)得與細(xì)胞結(jié)合的殘余循環(huán)放射活性百分比為約25％。相反，對(duì)膿的分級(jí)分離表明約90％的放射活性與白細(xì)胞結(jié)合。
通過直接組織計(jì)數(shù)測(cè)得，注射后17小時(shí)的組織濃度(％ID/g)綜合在圖8中。最高濃度為脾＞肺＞肝＝腎(p＜0.01)。T/B比率(每克感染肌肉或膿的％ID/每克對(duì)側(cè)正常肌肉的％ID)示于圖9中。膿和感染肌肉的平均T/B比率分別為25.78∶1(最大48.54∶1，最小8.84∶1)和14.17∶1(最大25.64∶1，最小4.78∶1)。
討論以上表明用99mTc-葡庚顥酸鹽作為Tc-(V)氧代核來(lái)源，HYNIC衍生化趨化肽類似物容易以高活性被99mTc標(biāo)記。而且，99mTc標(biāo)記肽是用于股深部感染的試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭懈腥静≡铧c(diǎn)外部造影的有效試劑。
合成的4種HYNIC肽中，三種(HP2，HP3和HP4)與受體結(jié)合的EC50與六肽For-NleLFNleYK的相似，而HP1為For-MLF的約2倍。所有HYNlC偶聯(lián)肽與For-MLF相比，與化學(xué)引誘物受體的親和力增強(qiáng)。受體結(jié)合效力的順序?yàn)镠P3＞HP2＞HP4＞For-NleLFNleYK＞For-MLF＞HP1＞For-NleLF。用Nle代替For-MLF中的Met造成受體結(jié)合親和力下降10-15倍。但在C-末端進(jìn)一步用-Lys-HYNlC衍生化使受體結(jié)合增強(qiáng)。
HP2、HP3和HP4的產(chǎn)超氧化物EC50比六肽和For-MLF提高2-8倍。For-NleLF顯示比For-MLF的效力低3倍。與HP1較For-NleLF對(duì)受體結(jié)合提高的效應(yīng)不同，與For-MLF和For-NleLFNle YK相比，它的產(chǎn)超氧化物EC50值提高了5倍。
當(dāng)按照所建議的肽受體相互作用模型解釋時(shí)，這些資料提示在第4個(gè)氨基酸殘基上的HYNlC衍生化造成構(gòu)象紊亂，從而影響受體結(jié)合和超氧化物的產(chǎn)生。最令人驚異的發(fā)現(xiàn)是在2位Nle取代Met的效應(yīng)，它造成受體結(jié)合EC50比For-MLF提高15倍以上，比六肽提高300倍，而活化的EC50提高10倍以上。這一結(jié)果特別重要，因?yàn)橐郧皥?bào)道的趨化肽類似物中這一取代的影響很小。4位由D-Lys取代L-Lys造成受體結(jié)合EC50提高2倍、活化EC50提高5倍也支持這一假說(shuō)。在這一位置用1，6-二氨基己烷代替L-Lys只造成結(jié)合EC50的微小增加和活化EC50的3-4倍升高。用99mTc標(biāo)記HYNIC偶聯(lián)的肽造成親和力明顯提高。99mTc-HYNIC-肽結(jié)合分析試驗(yàn)的結(jié)果證明置換99mTc肽與中性白細(xì)胞結(jié)合的50％所需要的未標(biāo)記肽濃度比使用For ML[3H]F作為示蹤劑時(shí)的高大約210倍。如果放射標(biāo)記物中每個(gè)Tc-葡庚糖酸鹽含有一個(gè)以上肽單位并且結(jié)合有協(xié)同性，則可解釋這種結(jié)合親和力的提高。據(jù)報(bào)導(dǎo)四聚趨化肽類似物中也有類似的結(jié)合增強(qiáng)作用(Krau，J.L.，等，Biochem.Biophys.Res.Comm.124945-949(1984))。這些結(jié)果還證明C-末端對(duì)于衍生化的堅(jiān)定性。
這些觀察提示，除作為極好的感染造影放射藥物，HYNIC肽還可作為進(jìn)一步闡明伴有For-MLF與其受體結(jié)合的分子作用的模型化合物。
在獲得HYNIC衍生化趨化肽類似物的最大比活性時(shí)，主要集中在放射核素源中的操作上，即99Mo/99mTc放射核素發(fā)生劑的洗出。獲得高比活性99mTcO4-的一個(gè)潛在問題是長(zhǎng)壽99Tc(基態(tài)，t1/2～105年)的建立。因?yàn)?9Tc是87％的99Mo衰變和100％99mTc蛻變的結(jié)果而直接產(chǎn)生的，總是存在一定量的載體在標(biāo)記反應(yīng)中參與競(jìng)爭(zhēng)。比活性＞10000mCi/μmol的99mTc標(biāo)記趨化肽類似物易于制備，但需要用Sep-Pak分離標(biāo)記肽與其他99mTc種類。如果除優(yōu)化99mTc源以外還優(yōu)化了放射標(biāo)記肽的層析純化條件，則可達(dá)到更高的比活性。在HPLC系統(tǒng)中，相應(yīng)于99mTc標(biāo)記肽、未標(biāo)記肽和99mTc葡庚糖酸鹽的峰分辨良好，可分離無(wú)載體放射標(biāo)記肽。在這些情形下，放射標(biāo)記肽的比活僅限于99mTc發(fā)生劑的比活。因此，基于99mTc的理論比活，99mTc標(biāo)記HYNIC衍生化的趨化肽類似物的最大比活為約500,000mCi/μmol。雖然按常規(guī)方法達(dá)到這一比活水平是不可能的，但制備具有與用于標(biāo)記的99mTc-葡庚糖酸鹽相似比活的放射標(biāo)記肽應(yīng)該是可能的。因?yàn)榛诔Ｒ?guī)方法可以制得比活＞10,000mCi/μMol的99mTc-葡庚糖酸鹽，如果應(yīng)用HPLC純化，這一比活水平的肽是可能的。
因?yàn)镠YNIC葡庚糖酸鹽配體只能占領(lǐng)锝配位區(qū)的兩個(gè)點(diǎn)，標(biāo)記產(chǎn)物很可能含有另外的基團(tuán)。據(jù)信葡庚簋酸鹽作為“共同配體”而發(fā)揮這種作用。由于趨化肽的分子量小，用于锝標(biāo)記的共同配體可能對(duì)這些分子的生物分布產(chǎn)生重要影響。為了評(píng)價(jià)這些可能性，測(cè)定了用不同的共同配體-葡糖二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘露糖和葡糖胺-標(biāo)記的99mTc標(biāo)記HP2和HP3的生物分布。以不同配體放射標(biāo)記的步驟與使用葡庚糖酸鹽的方法相同。HPLC分析放射標(biāo)記肽，均顯示等一峰。
圖10顯示了注射后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)這4種HP3制劑在血、肺、肝、脾、腎和胃腸道中的注射劑量百分?jǐn)?shù)/克。雖然在大部分組織中檢測(cè)到了生物分布的小差異，最顯著的差異見于肺(葡糖二酸鹽，葡庚糖酸鹽＞甘露醇＞＞葡糖胺)；肝(葡糖二酸鹽，葡庚糖酸鹽，甘露醇＞＞葡糖胺)；腎(甘露醇＞葡糖二酸鹽，葡庚糖酸鹽，葡糖胺)；脾(葡糖二酸鹽＞＞葡庚糖酸鹽，甘露醇＞＞葡糖胺)；及胃腸道中(葡糖二酸鹽，葡糖胺＞＞葡庚糖酸鹽＞＞甘露醇)。用HP2得到了相似結(jié)果。
已有幾種用放射標(biāo)記趨化肽進(jìn)行感染造影的努力(Fischman，A.J.，J.Nucl.Med.32483-491(1991)；McAfee，J.G.等，Semin.Nucl.Med.1483-106(1984)；Thakur，M.L.等，Semin，Nucl.Med.14107-117(1984)，Zogbhi，S.S.，等，J.Nucl.Med.22P32(1981))。但進(jìn)行這些研究時(shí)存在的放射標(biāo)記方法產(chǎn)生低比活的試劑，造影需要藥理量的肽。已顯示這些肽劑量在兔中產(chǎn)生嚴(yán)重的暫時(shí)性中性白細(xì)胞減少癥(O’Flaherty，J.T.等，J.Immunol.1181586-1589(1977))。利用本發(fā)明的標(biāo)記技術(shù)，可完全消除這些潛在的不利影響。在兔這種對(duì)趨化肽的中性白細(xì)胞減少效應(yīng)高度敏感的物種中，HPLC純化的99mTc HP4在注射后1小時(shí)內(nèi)定位于大腸桿菌感染的病灶位點(diǎn)，并在15小時(shí)達(dá)到最大T/B比。
HYNIC放射標(biāo)記方法提供了一種制備極高比活99mTc標(biāo)記肽和蛋白的獨(dú)特而有效的工具。
達(dá)到這樣的高比活后，應(yīng)該可以在顯著低于中性白細(xì)胞減少反應(yīng)EC50的肽濃度下進(jìn)行造影試驗(yàn)。例如利用SEP-PAK純化肽(～10,000mCi/μmol)，注射20mCi的試量，其含約2nMol肽。對(duì)于70kg的對(duì)象而言，這代表注射劑量低于30pMol/kg?；赗hesus猴中的研究，這一肽量遠(yuǎn)低于誘發(fā)顯著中性白細(xì)胞減少的劑量。利用HPLC純化物，安全系數(shù)應(yīng)提高約10倍。
實(shí)施例101本實(shí)施例證明放射標(biāo)記的激動(dòng)趨化肽類似物可作為猴中炎癥位點(diǎn)造影的有效試劑。利用高比活的放射標(biāo)記可避免這些試劑的中性白細(xì)胞減少效應(yīng)。
在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中測(cè)評(píng)了趨化肽類似物的體內(nèi)生物活性、生物分布和炎癥造影特性。在正常Rhesus猴中測(cè)定了劑量依賴性中性白細(xì)胞減少反應(yīng)。99mTc標(biāo)記的肼基煙酰胺(HYNIC)衍生化趨化肽類似物用于在猴中研究生物分布和炎癥造影。
在正常動(dòng)物中的研究表明肽在動(dòng)物中誘發(fā)明顯的劑量依賴性中性白細(xì)胞減少。注射后幾乎立即發(fā)生中性白細(xì)胞數(shù)減少，然后迅速返回基線。檢測(cè)到了對(duì)區(qū)別WBC計(jì)數(shù)、血壓、脈頻、或呼吸頻率的顯著影響。在最低測(cè)試肽劑量下，中性白細(xì)胞的減少很小。以良好的收率和純度制備了HYNIC衍生化肽，生物活性與原肽相似，以20000mCi/μmol的比活方便地標(biāo)記。當(dāng)將約0.5mCi(＜2.0ng/kg)的放射標(biāo)記肽注入帶有無(wú)菌炎癥病灶點(diǎn)的猴中時(shí)，觀察到其生物分布模式與放射標(biāo)記WBC相似，未檢測(cè)到中性白細(xì)胞減少。注射后3小時(shí)時(shí)，炎癥位點(diǎn)很明顯，T/B比為約3∶1。材料N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰(For-MLF)、N-甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-正亮氨酰-酪氨酰-賴氨酸(ForNleLFNleYK)、佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和細(xì)胞松馳素B得自Sigma(St.Louis.Mo)。ForML[3H]F(60Ci/mmol)和99mTc(99Mo/99mTc-發(fā)生劑)得自NeW England Nuclear-(Boston，MA)。Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)得自GIBCO(Grand Island，NY)。肽合成和鑒定如以前的描述(Fischman，A.J.等，J.Nucl.Med.32483-491(1991)，用標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)(Merrifield，R.B.JAm.Chem.Soc.152149-2154(1963)；Stewart，J.M等，Solid Phase PeptideSynthesis，W.H.Freeman&Company，San Francisco，CA(1969))，合成并純化了N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-賴氨酸和N-甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-正亮氨酰-酪氨酰-賴氨酰-DTPA。煙?；[衍生化趨化肽類似物N-甲酰-met-leu-phe-lys-HYNIC按如下方法制備。
將含60μl二異丙基乙基胺的1.0ml二甲基甲酰胺(DMF)中的琥珀酰亞胺基-6-t-Boc-肼基吡啶-3-羧酸(154mg，mMol)，加至2ml DMF中的N-For-Mer-Leu-Phe-Lys(186mg，mMol)中。肽迅速溶解，2小時(shí)后加入乙醚-石油醚。棄去上層，向殘余物中加水形成固體。用5％碳酸氫鈉、水和乙酸乙酯洗滌該固體。得183mg粗產(chǎn)品。將粗產(chǎn)品與5ml含0.1ml對(duì)甲苯酚的三氟乙酸(TFA)于20℃攪拌15分鐘，除去保護(hù)基。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去TFA，加入乙醚沉淀脫保護(hù)的肽。在2.5×50cm WhatmanODS-3柱上用乙腈對(duì)0.1％TFA的梯度洗脫，反相HPLC純化產(chǎn)物。合并含主成分的流份，除去溶劑得目標(biāo)產(chǎn)物。
用TLC、HPLC、UV光度法、質(zhì)譜法和氨基酸分析測(cè)定終產(chǎn)物的化學(xué)純度。如Pike，M.C.和Snyderman，R.，MethodsEnzymol，162236-245(1988)；Pike，M.C.等，Blood 67909-913(1986)；和Fischman，A.J.等，J.Nucl.Med.32483-491(1991)中描述的方法，測(cè)定與人PMN上化學(xué)引誘物受體結(jié)合的EC50和產(chǎn)超氧化物的EC50。99mTc放射標(biāo)記為了避免施用藥理劑量趨化肽類似物帶來(lái)的中性白細(xì)胞減少效應(yīng)，在產(chǎn)生最大比活的條件下用99mTcyt放射標(biāo)記HYNIC衍生物。通過獲得高比活造影劑量的99mTc，肽的注射量大大低于EC50(～20nM)。
在前一次洗出后5小時(shí)對(duì)99Mo/99mTc發(fā)生劑洗出，以產(chǎn)生約500mCi的總活性。按Lamson等人J.Nucl.Med.7639-641(1975)的方法計(jì)算Tc的量和99Tc與99mTc的相對(duì)比例。在典型的洗出中，Tc的總量為約3nMol，99Tc與99mTc比為約1.5∶1，99mTc的比活性＞100,000mCi/μmol。從葡庚糖酸亞錫(Glucoscan，DuPont)制備99mTc-葡庚糖酸鹽(Tc-GH)，以提供用于放射標(biāo)記肼基煙酰胺偶聯(lián)肽的Tc(V)氧代(Pike，M.C.等人，Blood 67909-913(1986))。將約2.5ml鹽水中的99mTc-高锝酸根加入冷干試劑盒中，在制備時(shí)的放射活性終濃度為150mCi/ml。以丙酮和鹽水作為流動(dòng)相溶劑通過即時(shí)薄層硅酸層析(ITLC-sg)測(cè)得產(chǎn)物的放化純度大于95％。
將約180μg趨化肽For-Met-Leu-Phe-NH-(CH2)6-NH-HYNIC(MW720)溶解在50μl DMSO中，用PH5.2的0.1N乙酸鹽緩沖液稀釋至終濃度為10μg/ml。將1.5ml肽溶液置于一干凈玻璃小瓶中，再加入0.5ml99mTc-葡庚糖酸鹽?？焖贉u旋混合物，室溫靜置1小時(shí)。以三種獨(dú)立的溶劑系統(tǒng)通過ITLC-sg監(jiān)視肽標(biāo)記的程度丙酮、鹽水和丙酮∶水(9∶1)。在一C18柱(5μ，4.5×46mm，Beckman，Columbia，MD)上的線性梯度洗脫進(jìn)行反相HPLC純化99mTc標(biāo)記的肽。洗脫條件為溶劑A-50mM乙酸鹽中5％乙腈，PH5.2；溶劑B-50mM乙酸鹽中50％乙腈，PH5.2；梯度20分鐘內(nèi)0％到100％B；流速2mL/分。用下述關(guān)系計(jì)算放射標(biāo)記肽的比活(回收百分率×存在的mCi)/(肽的mMol數(shù)×100)。動(dòng)物模型以4種劑量的溶于0.2ml無(wú)熱原鹽水中的ForNleLFNleYK-DTPA(10000；1000；100和10ng/kg)在每只重10kg的4只雄性Rhesus猴中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用所有4種肽劑量處理每只動(dòng)物，每個(gè)劑量水平間休息期為一周。用氯氨酮/xylazine麻醉動(dòng)物，80分鐘內(nèi)采集一系列0.5ml靜脈血樣。每個(gè)試驗(yàn)包括4次注射載體、肽、肽、載體。在第一次注射前15和5分鐘和注射后0.25、0.5、1、3、5、10和20分鐘抽取基線血樣。收集20分鐘的血樣后馬上進(jìn)行下次注射。在整個(gè)試驗(yàn)過程中監(jiān)視血壓、脈博、和呼吸頻率。測(cè)定每一樣品中白血細(xì)胞計(jì)數(shù)(CBC)、區(qū)別白血細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅血細(xì)胞計(jì)數(shù)、和疊積細(xì)胞體積。另外，監(jiān)視動(dòng)物的活動(dòng)和表情、攝食和體重。該試驗(yàn)方法的圖解式概要示于圖11中。
兩只重約10kg的成年雌性Rhesus猴用于造影試驗(yàn)。因?yàn)檫@些動(dòng)物以前已用于其他放射藥物的造影試驗(yàn)，它們?cè)谡T導(dǎo)麻醉當(dāng)中已在右后股部經(jīng)受了許多次肌肉注射。這些注射造成顯著程度的無(wú)菌炎癥。造影在輕度氨氨酮麻醉下(5.5mg/kg)，通過一腿靜脈給動(dòng)物注射約0.5mCi99mTc標(biāo)記肽(＜2.0ng/kg)。在注射放射標(biāo)記肽后5分鐘、30分鐘、1小時(shí)和19小時(shí)，用氯氨酮/xylaxine(15.0和1.5mg/kg)麻醉動(dòng)物，用大提野γ照相機(jī)獲取全身閃爍照相圖象，所述照相機(jī)裝有平行孔高分辨低能準(zhǔn)直儀，并與專用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)聯(lián)機(jī)(Technicare Gemini 700，Technicare 560，Solon，OH)。所有的圖象是15％的窗集中在140KeV的99mTc光峰條件下以10cm/分的掃描速度獲得的。注射前5分鐘和注射后1、3，5和15分鐘采集0.5ml血樣，測(cè)定CBC。
拉近有義區(qū)(ROI)整個(gè)動(dòng)物、心血池、肺、肝、脾、腎、腸、骨、正常肌肉和發(fā)炎肌肉；計(jì)算計(jì)數(shù)密度(CPM/片)。結(jié)果以組織-血池比、注射劑量百分?jǐn)?shù)/克(％ID/g)和靶標(biāo)-本底比(致炎股/對(duì)側(cè)股之比)表示。統(tǒng)計(jì)方法按Duncan的新復(fù)極差法(Duncan，D.B.，Biometrics 111-42(1955))進(jìn)行方差分析，統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)造影研究的結(jié)果。
結(jié)果制備的HNIC衍生化肽有極好的收率和化學(xué)純度。終產(chǎn)物在TLC和HYPLC上顯示單一帶(峰)。紫外分析顯示在268和315nm處有最大吸收。質(zhì)譜給出m/z671的峰。氨基酸分析與預(yù)期產(chǎn)物一(Met-1.00，Leu-1.00，Phe-0.97，Lys-1.00)。HPLC純化后放射標(biāo)記肽的比活性＞20000mCi/μmol。與人PMN上化學(xué)引誘物受體結(jié)合及超氧化物產(chǎn)生的體外分析，得出EC50分別為2.0和20nM。
圖12顯示For NleLFNleYK-DTPA在猴中誘發(fā)明顯的劑量依賴性中性白細(xì)胞減少反應(yīng)。在兩個(gè)最高肽劑量(10000和1000ng/kg)下，注射后白細(xì)胞計(jì)數(shù)幾乎馬上降至對(duì)照的約40％，在第二次注射肽時(shí)返回到對(duì)照的60-80％。第二次注射肽以后，白細(xì)胞計(jì)數(shù)降至對(duì)照的40-50％。在最高劑量下，在第二次注射載體時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)返回到對(duì)照的80％，在研究結(jié)束時(shí)(第一次注射載體后80分鐘)達(dá)到對(duì)照的90％。在1000ng/kg劑量下，第二次注射載體時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)返回到對(duì)照的90％，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)返回到基線。在100ng/kg劑量下，白細(xì)胞計(jì)數(shù)在注射后幾乎立即降至對(duì)照的約70％，在第二次注射肽時(shí)回到基線。在第二次注射載體時(shí)白細(xì)胞水平返回到基線。在最低肽劑量下(10ng/kg)，白細(xì)胞減少程度小，每次注射肽后3分鐘內(nèi)返回基線。
在注射任何劑量的肽以后沒有動(dòng)物顯出明顯的病態(tài)。檢測(cè)對(duì)區(qū)別WBC計(jì)數(shù)、血壓、脈頻、或呼吸頻率的顯著影響。
圖13表示注射約1.0mCi99mTc標(biāo)記肽后3小時(shí)和15小時(shí)猴的代表性正前位(Ant)和正后位(Post)圖象在較早的圖象中，在肺、肝、脾和骨中有高放射性濃度，與同白細(xì)胞的結(jié)合相一致。高水平放射活性還集中在腎和膀胱中。在肌肉和胃腸道中檢測(cè)到較低的濃度。另外，在此時(shí)炎癥位點(diǎn)已清楚可辨(T/B～3∶1)。在此肽劑量下對(duì)WBC水平?jīng)]有顯著影響。
在較晚的造影時(shí)間下，肺活性下降，但在其他器官中的放射活性分布還保持相對(duì)恒定。注射后15小時(shí)，放射活性在炎癥位點(diǎn)的集累明顯減少。在其他動(dòng)物中在兩個(gè)造影時(shí)間下也觀察到了相似的生物分布模式。討論本實(shí)施例證實(shí)如在兔中一樣(O’Flaherty，J.T.等，J.Immunol.1181586-1589(1977))，激動(dòng)趨化肽在猴中誘發(fā)顯著性暫時(shí)中性白細(xì)胞減少。但在低于10ng/kg肽劑量下，此效應(yīng)不明顯。如通過肺活性隨時(shí)間降低而注意到的那樣，在開始時(shí)可能發(fā)生少量的中性白細(xì)胞激活。當(dāng)向帶有輕度無(wú)菌炎癥損傷的猴注入標(biāo)記的HYNIC衍生化趨化肽時(shí)，生物分布模式與放射標(biāo)記白細(xì)胞的分布嚴(yán)格平行，注射后三小時(shí)易檢測(cè)到炎癥病灶，靶標(biāo)-本底比為約3∶1。以很高的比活(＞20,000mCi/μmol)放射標(biāo)記，放射藥物造影劑量中肽的總量可降至中性白細(xì)胞減少的閾值；比活為20,000mCi/μmol時(shí)，在10kg動(dòng)物中注射0.5mCi相當(dāng)于肽劑量小于2ng/kg。假設(shè)血液體積為體重的8％、血細(xì)胞比容為50％，該肽劑量相當(dāng)于起始循環(huán)濃度為60pM，這低于受體激活的EC502個(gè)數(shù)量級(jí)。正如所料，這一肽劑量對(duì)外周白細(xì)胞水平?jīng)]有影響。
本實(shí)施例證實(shí)放射標(biāo)記趨化肽類似物是對(duì)中性白細(xì)胞減少效應(yīng)敏感的動(dòng)物中炎癥造影的有效試劑。當(dāng)在兔中研究這些肽的感染造影特征時(shí)得到了相似的結(jié)果(Babich，J.W.等，(送交出版))。
雖然在注射后3小時(shí)無(wú)菌感染位點(diǎn)是很明顯的，但在注射后12小時(shí)靶標(biāo)-本底比大大降低。這明顯不同于帶有大腸桿菌感染病灶位點(diǎn)的兔中的結(jié)果，后者為注射后3小時(shí)T/B比為約3∶1，在12小時(shí)時(shí)增至20∶1。這種差異的可能解釋包括損傷強(qiáng)度的差異和細(xì)菌感染和無(wú)菌炎癥的差別。如果進(jìn)一步研究證實(shí)損傷動(dòng)力學(xué)中的這種差異，可大大提高這些試劑的實(shí)用性，因?yàn)榭赡軈^(qū)別感染和無(wú)菌炎癥。實(shí)施例102本實(shí)施例中，對(duì)99mTc-標(biāo)記激動(dòng)趨化肽的感染定位特征與傳統(tǒng)的111In標(biāo)記白細(xì)胞在急性細(xì)菌感染動(dòng)物模型中進(jìn)行比較和對(duì)比。選擇兔是因?yàn)橐阎鼈儗?duì)趨化肽的中性白細(xì)胞減少效應(yīng)敏感。
在大腸桿菌感染的兔中比較了99mTc標(biāo)記的甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-賴氨酰-肼煙酰胺(99mTc-HP)與111In標(biāo)白細(xì)胞(111In-WBC)的生物分布和感染造影特性。給6只動(dòng)物的各組注射1mCi99mTc-HP＋0.05mCi111In-WBC，在注射后3-6小時(shí)和18小時(shí)進(jìn)行系列閃爍照相。在獲得最后的圖象后，處死動(dòng)物并測(cè)定生物分布。
在所有造影時(shí)間，99mTc-HP和111In-WBC的生物分布相似，用兩種放射藥物都清楚顯現(xiàn)了感染位點(diǎn)。注射后3、6和18小時(shí)的靶標(biāo)(感染肌肉)與本底(對(duì)側(cè)正常肌肉)之比(T/B)分別為對(duì)99mTc-HP3.38±0.46，3.80±0.37及10.875±1.44；對(duì)111In-WBC1.71±0.04，1.81±0.26，及3.79±0.83。T/B的平均比率(99mTc-HP與111In-WBC之比)為2.99±1.88，沒有小于1的值。從直接組織采樣計(jì)算的T/B，99mTc-HP的顯著高于111In-WBC的(33.6∶1對(duì)8.1∶1，p＜0.01)。這些差異主要是由于99mTc-HP在感染肌肉中絕對(duì)積累增加(0.102％I.D./g對(duì)0.021％ID./g，p＜0.01)，而不是由于在正常骨骼肌中的積累差異。
這些結(jié)果提示很可能由于在感染位點(diǎn)絕對(duì)積累增高的結(jié)果，99mTc-HP產(chǎn)生的靶標(biāo)-本底比大于或等于111In-WBC所能達(dá)到的。
材料和方法所有無(wú)機(jī)鹽來(lái)自Fisher Scientific Co.。ITLC-硅膠層析條得自Gelman Laboratories(Ann Arbor，MI)。111In-喔星得自Amersham Inc.(Arling ton Heights，IL)。葡庚糖酸亞錫試劑盒(Glucoscan)和99Mo/99mTc發(fā)生劑得自杜邦放射藥物分部(Billerica，MA)。所有其他試劑是可從商業(yè)途徑得到的最高級(jí)別的。肽合成用標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)合成并純化N-For-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-賴氨酸。按Babich，J.W.等人在J.Nucl.Med.33910(1990)中描述的方法制備該肽與煙酰肼的偶聯(lián)物N-For-Met-Leu-Phe-(N-ε-HYNIC)Lys(HP)。在一2.5×50cm Whatman OBS-3柱上用0.1％TFA中乙腈梯度洗脫，經(jīng)反相HPLC純化產(chǎn)物。合并含主成分的流份，除去溶劑得到目標(biāo)產(chǎn)物。用UV、質(zhì)譜和氨基酸分析鑒定此肽。HYNIC衍生化趨化肽的99mTc標(biāo)記99mTc-葡庚糖酸鹽用于提供放射標(biāo)記肼基煙酰胺(Abrams，M.J.等，J.Nucl.Med.312022-2028(1990))結(jié)合肽所必需的Tc(V)氧代。向此冷干試劑盒中加入約2.5ml 0.9％NaCl中的99mTc高锝酸鹽。最終放射活性濃度為100mCi/ml，產(chǎn)物的放化純度通過即時(shí)薄層硅酸層析(ITLC-sg)來(lái)測(cè)定，用丙酮和0.9％NaCl作為流動(dòng)相溶劑。
使用下列步驟用99mTc放射標(biāo)記趨化肽。將5μl 1mg/ml肽溶液轉(zhuǎn)至一清潔的玻璃瓶中。向此肽溶液中加入500μl PH5.2的0.1M乙酸鹽緩沖液，再加入500μl99mTc-葡庚糖酸鹽。將此混合物快速渦旋，室溫下靜置1小時(shí)。用C18反相柱(300，5μ，45mm×25cm，Vydac)和下列洗脫條件下的HPLC測(cè)定放化純度溶劑A水中0.1％三氟乙酸；溶劑B乙腈中0.1％三氟乙酸；梯度10分鐘內(nèi)由0％B到100％B；流速2ml/分。用Milton-Roy/LDC(Boca Raton，F(xiàn)L)流過式分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)紫外吸收，用Beckman 170(Backman，Columbia MD)監(jiān)測(cè)放射活性。用一種雙通道積分儀(Waters Model 746 Data Module，Waters，Marlboro M4)記錄并分析了來(lái)自兩種檢測(cè)器的輸出信號(hào)。
用如上所述用HPLC系統(tǒng)分離99mTc-HP和未標(biāo)記HP，制備99mTc-HP注射溶液。溫和加熱肽溶液并在N2流下干燥。將殘余物溶解在等滲注射用鹽水中。HPLC分析注射液樣品。111In標(biāo)記的白細(xì)胞從按如下所述進(jìn)行了感染的供體兔采血，50ml肝素化全血用hetastarch(Hespan，DuPont，Wilmington，DE)1∶1稀釋。按McAfee.J.G.等在J.Nucl.Med.211059-1068 (1980)和McAfee.J.G等人在Semin.Nucl.Med.1483-106(1984)中描述的方法制備111In標(biāo)記白細(xì)胞，但做如下改變。沉降兔血液45分鐘分離富白細(xì)胞血漿(LRP)。將LRP以450×g離心5分鐘，將WBC層重懸于10ml鹽水中，靜置60分鐘。吸出上清液，將細(xì)胞重懸于5ml鹽水中。攪拌下滴加500μCi111In-喔星，將混合物于37℃保溫60分鐘，間歇攪拌。沉降細(xì)胞，將沉積物重懸于貧血小板血漿(PPP)中，450×g離心5分鐘，重懸于注射用PPP中。從標(biāo)記介質(zhì)中分離并用PPP洗一次后，以仍保持與細(xì)胞結(jié)合的活性占開始加入細(xì)胞層的111In-喔星活性的百分比計(jì)算細(xì)胞標(biāo)記效率。感染模型在所有研究中使用重2.2-3.0kg的雄性新西蘭大白兔。來(lái)自單一臨床分離物的大腸桿菌在胰胨大豆瓊脂板上生長(zhǎng)過夜，單個(gè)菌落用無(wú)菌標(biāo)準(zhǔn)鹽水稀釋以產(chǎn)生約1×1011菌體/0.5ml(用分光光度計(jì)測(cè)定)的渾濁懸液。將0.5ml細(xì)菌懸液接種物注入兔左股肌肉深部。
接種后24小時(shí)，給因感染股部腫大的兔通過邊緣耳靜脈注射放射藥物。給六只動(dòng)物注射1mCi99mTc-HP(＞5000mCi/μMol)和0.05mCi111In標(biāo)記白細(xì)胞的混合物。造影注射放射試劑后3、6和18小時(shí)，用氯氨酮/xylazine(15.0和1.5mg/kg)麻醉動(dòng)物，用裝有平行孔中等能量準(zhǔn)直儀并與專用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)聯(lián)機(jī)的大視野γ照相機(jī)(Technicare Gemini 700，Technicare 560，Solon，Ohio)進(jìn)行正前位整體閃爍照相。用雙光子模式，15％窗集中在140KeV光峰(99mTc)和247KeV光峰(111In)，同時(shí)獲得111In和99mTc圖象。注射后3和6小時(shí)，以預(yù)置時(shí)間5分鐘/視域獲得2套圖象。注射后18小時(shí)，每視域的造影時(shí)間延長(zhǎng)至10分鐘。將有義區(qū)(ROI)拉向感染區(qū)和對(duì)側(cè)正常肌肉(本底)。結(jié)果以靶標(biāo)-本底比表示(感染股/對(duì)側(cè)股)。直接組織采樣法獲得最后的圖象后，注射過量戊巴比妥鈉處死動(dòng)物，測(cè)定生物分布。將血液、心、肺、肝、脾、腎、腎上腺、胃、胃腸道、睪丸、骨、骨髓、正常肌肉、感染肌肉和膿標(biāo)本稱重，并用井型γ計(jì)數(shù)器(LKB modle#1282，Wallac Oy，芬蘭)測(cè)定放射活性。為了校正放射衰變并能計(jì)算每個(gè)器官中以占所給劑量的份數(shù)表示的放射活性濃度，對(duì)注射劑量的等份同時(shí)計(jì)數(shù)。結(jié)果以每克中注射劑量的百分?jǐn)?shù)(％I.D./g)、感染與正常肌肉之比和膿與正常肌肉之比表示。
為了確定循環(huán)和感染位點(diǎn)上放射活性的性質(zhì)，將血液和膿樣品在Lymphoprep中梯度離心分級(jí)分離。血漿在一G-100柱(1.0×25cm)上用PH7.4 PBS洗脫進(jìn)一步分級(jí)分離。用111In-IgG、111In-F(ab’)2、125I-人白蛋白及99mTc-DTPA在此柱上做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Phantom研究進(jìn)行Phantom研究是為了計(jì)算111In的174KeV光子在99mTc窗中的交叉量和99mTc的140KeV光子在111In窗中的交叉量。簡(jiǎn)言之，給動(dòng)物注射時(shí)，作為注射物的111In和99mTc樣品以相同的比率與250ml鹽水在標(biāo)準(zhǔn)輸液袋中充分混合。將Phantom置于離造影臺(tái)5cm處，并在兩個(gè)窗中獲得圖像。從拉至每個(gè)袋周圍的有義區(qū)(ROI)中計(jì)算交叉因子并用于校正99mTc和111In圖象。統(tǒng)計(jì)方法按Duncan的新復(fù)極差法(Duncan，D.B.，Biometrics.111-42(1955))進(jìn)行方差分析(ANOVA)，評(píng)價(jià)造影和生物分布研究的結(jié)果。對(duì)于造影數(shù)據(jù)，使用線性模型的雙因素方差分析，其中“注射后時(shí)間”和“放射藥物”(99mTc-HP或111In-WBC)是分類變量，T/B＝時(shí)間＋放射藥物＋時(shí)間×放射藥物。對(duì)于生物分布數(shù)據(jù)，使用線性模型雙因素方差分析，其中器官和放射藥物是分類變量％I.D./g＝器官＋放射藥物＋器官×放射藥物。另外，用線性回歸法比較了111In-WBC和99mTc-HP的靶標(biāo)-本底比。所有結(jié)果以均值±SEM表示。
結(jié)果肽合成制備肼基煙酰胺衍生化趨化肽的收率和純度良好。UV分析顯示在268和315nm處有最大吸收。質(zhì)譜和氨基酸分析(Met-1.00，Leu-1.00，Phe-0.97，Lys-1.00)與預(yù)期偶聯(lián)肽產(chǎn)物一致。放射藥物ITLC和HPLC分析證明保溫1小時(shí)后大于90％的放射活性與肽結(jié)合。未純化99mTc-HP的比活經(jīng)計(jì)算大于3000mCi/μMol。利用上文描述的純化步驟，比活性提高到＞10,000mCi/μMol。
用于這些試驗(yàn)的111In-白細(xì)胞標(biāo)記方法造成純化前標(biāo)記效率約為70％，最終放化純度＞95％。Phantom研究Phantom研究表明注射放射藥物后3小時(shí)，在99mTc窗中檢測(cè)到的光子5％歸因于111In。注射后18小時(shí)，在99mTc窗中檢測(cè)到的光子17％歸因于111In。在這兩個(gè)造影時(shí)間下，在111In窗中檢測(cè)到的光子2％歸因于99mTc。所有造影數(shù)據(jù)均對(duì)這些掠奪(pillover)效應(yīng)做了校正。造影圖14顯示共同注射99mTc-HP和111In-WBC后6和18小時(shí)，有代表性的交叉校正的兔正前位造影圖象。在這兩個(gè)造影時(shí)間點(diǎn)，兩種放射藥物的總體生物分布幾乎相同。在肺、肝、脾和腎中檢到兩種試劑濃度都高。而在肌肉和胃腸道中兩種示蹤劑的濃度都低。
從造影數(shù)據(jù)可明顯看出，注射后6和18小時(shí)兩點(diǎn)上99mTc-HP以顯著程度定位于感染位點(diǎn)。兩種試劑的T/B比隨時(shí)間顯著增加(p＜0.01)。在兩個(gè)造影時(shí)間點(diǎn)上，99mTc-HP的T/B比顯著大于(p＜0.01)111In-WBC的。兩種放射藥物的靶標(biāo)-本底比列于圖15中。注射后6小時(shí)，99mTc-HP的T/B與111In-WBC注射后18小時(shí)的相當(dāng)。兩種T/B值(99mTc-HP與111In-WBC之比)的平均比率為2.99±1.88，沒有低于1的值。直接組織采樣注射后18小時(shí)，用直接組織放射活性測(cè)定法測(cè)定的99mTc-HP和111In-標(biāo)記WBC(％I.D./g)的生物分布示于表V中。
表V99mTc和111In-WBC在兔體內(nèi)的生物分布(％I.D./g，均值±SEM)器官99mTc-HP111In-WBC’s血 0.037/±0.003 0.127±0.0290.043±0.005 0.024±0.004肺 0.192±0.037 0.120±0.007肝 0.207±0.013 0.148±0.020脾 0.601±0.025 2.080±0.237腎 0.136±0.021 0.086±0.016腎上腺 0.103±0.018 0.139±0.026胃 0.050±0.008 0.013±0.003胃腸道 0.047±0.005 0.018±0.004睪丸0.018±0.001 0.028±0.003肌肉0.003±0.001 0.004±0.001骨髓0.159±0.013 0.358±0.107骨 0.033±0.004 0.039±0.007感染肌肉0.101±0.008 0.024±0.002膿 0.188±0.034 0.035±0.008在此時(shí)，在幾種組織中發(fā)現(xiàn)這兩種示蹤劑濃度的顯著性差異。99mTc-HP在感染肌肉(p＜0.01)、膿(p＜0.01)、心臟(p＜0.05)、肝(p＜0.05)、胃(p＜0.01)和胃腸道(p＜0.01)中積累較多。而發(fā)現(xiàn)111In-WBC在血液(p＜0.05)、脾(p＜0.01)和睪丸(p＜0.01)中有較高水平。在正常骨骼肌、骨、骨髓、肺、腎上腺或腎中沒有顯著差異。
血液的分級(jí)分離結(jié)果顯示在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，只有25％的循環(huán)99mTc放射活性與白細(xì)胞結(jié)合，而85％以上的111In放射活性與白細(xì)胞結(jié)合。兩種放射粒素與紅血細(xì)胞的結(jié)合均很小(＜2％)。相反，膿的分級(jí)分離證明對(duì)99mTc和111In兩種者都有約90％的放射活性與WBC結(jié)合。血漿柱層析表明未與WBC結(jié)合的95％以上99mTc放射活性以150000的表現(xiàn)子分量(IgG部分)被洗脫；在游離肽洗脫位置上沒有檢測(cè)到放射活性。柱上放射活性大于90％。
圖16顯示在注射后18小時(shí)切下的組織樣品上以直接放射活性測(cè)定法測(cè)得的，99mTc-HP和111In-WBC的感染肌肉與正常肌肉之比的圖。99mTc-HP的感染肌肉與正常肌肉平均比率顯著高于111In-WBC的(33.0∶1對(duì)8.1∶1，p＜0.01)。這一差異是由于99mTc-HP(0.102％I.D./g)與111In-WBC(0.024％I.D./g)相比在感染肌肉中絕對(duì)積累的增加造成的，而不定由在正常骨骼肌中的積累差所致(99mTc-HP和111In-WBC分別為0.003％I.D./g對(duì)0.004％I.D./g)。線性回歸沒有顯示99mTc-HP和111In-WBC積累間顯著相關(guān)(r2＝0.076)。
注射后18小時(shí)以直接放射活性測(cè)定法測(cè)得的、膿與對(duì)側(cè)正常肌肉的比率綜合在圖17中。膿與正常肌肉平均比率，對(duì)99mTc-HP為61.8±11.05，而對(duì)111In-WBC為9.32±2.50(p＜0.01)。99mTc-HP(0.188±0.034％I.D./g)與111In-WBC(0.035±0.008％I.D./g)相比在膿中積累較多，這是99mTc-HP的T/B較高的主要原因。
討論本實(shí)施例證明對(duì)兔中細(xì)菌感染造影，99mTc標(biāo)記趨化肽比111In-WBC優(yōu)越。99mTc標(biāo)記趨化肽在感染肌肉和膿中的絕對(duì)積累水平(％I.D./g)比111In-WBC的高。另外，99mTc-HP的靶標(biāo)-本底比在所有造影時(shí)間點(diǎn)都較大。99mTc-HP注射后6小時(shí)的T/B比與111In-WBC注射后18小時(shí)的相當(dāng)，這表明99mTc-標(biāo)記趨化肽提供了一種用于感染造影的迅速的替代方法。因?yàn)樵谡＜∪庵械姆e累不顯著，99mTc-HP比111In-WBC的T/B比提高主要是由于99mTc-HP在感染位點(diǎn)的濃度更高。
在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了全面描述后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可用許多等價(jià)參數(shù)、濃度和條件實(shí)施本發(fā)明，而不脫離本發(fā)明的精神，也不需要過多的試驗(yàn)。
雖然已結(jié)合其具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到它還可以進(jìn)一步變化。本申請(qǐng)意在包括總體上采用了本發(fā)明的原則而且包含了在與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中已知或常規(guī)實(shí)施的可應(yīng)用于如下所附權(quán)利要求范圍內(nèi)列出的以上必要特征的本公開內(nèi)容以外內(nèi)容的本發(fā)明任何變化、應(yīng)用或改寫。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)個(gè)體中感染或炎癥位點(diǎn)的方法，其包括a.給予該個(gè)體診斷有效量的可檢測(cè)標(biāo)記的趨化肽X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中X為氨基保護(hù)基，Y為氨基酸殘基，Z為間隔序列，n為0或1，和W為下式結(jié)構(gòu)的標(biāo)記或連接取代基-[K]v-M1其中K為中間功能團(tuán)，v為0或1，M1是診斷學(xué)上可檢測(cè)的標(biāo)記；及其中趨化肽在感染或炎癥位點(diǎn)顯著積累，而在無(wú)感染或炎癥的位點(diǎn)不顯著積累；和b.檢測(cè)該趨化肽。
2.一種檢測(cè)個(gè)體中感染或炎癥位點(diǎn)的方法，其包括a.給予該個(gè)體診斷有效量的可檢測(cè)標(biāo)記的趨化肽X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中X為氨基保護(hù)基，Y為 其中，R1為芐基，烷基或-CH2-CH2-R2-CH3，和R2為 或-O-Z為間隔序列，n為0或1，和W為下式結(jié)構(gòu)的標(biāo)記或連接取代基-[K]v-M1其中K為中間功能團(tuán)，v為0或1，M1是診斷學(xué)上可檢測(cè)的標(biāo)記；及其中趨化肽在感染或炎癥位點(diǎn)顯著積累，而在無(wú)感染或炎癥的位點(diǎn)不顯著積累；和b.檢測(cè)該趨化肽。
3.權(quán)利要求1的方法，其中X是選自氨基甲酸酯、羧酰胺、硫代羧酰胺、脲、硫脲和它們相應(yīng)的氰基胍衍生物、磺酰胺和膦酰胺的氨基保護(hù)基。
4.權(quán)利要求1的方法，其中X是 其中R3選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4是硫?qū)僭印?br> 5.權(quán)利要求4的方法，其中R4是氧或硫。
6.權(quán)利要求2的方法，其中R1是-CH2-CH2-R2-CH3。
7.權(quán)利要求6的方法，其中可檢測(cè)標(biāo)記的趨化肽是X-Met-Leu-Phe-[Z]n-W。
8.權(quán)利要求7的方法，其中甲硫氨酸殘基被4-氨基四氫硫代吡喃-4-羧酸取代。
9.權(quán)利要求7的方法，其中亮氨酸殘基被二丙基甘氨酸取代。
10.權(quán)利要求7的方法，其中亮氨酸殘基被1-氨基環(huán)己基羧酸取代。
11.權(quán)利要求7的方法，其中苯丙氨酸殘基被z-脫氫苯丙羧酸取代。
12.權(quán)利要求7的方法，其中苯丙氨酸殘基被2-氨基茚酮-2-羧酸取代。
13.權(quán)利要求7的方法，其中苯丙氨酸殘基被苯胺基丙氨酸取代。
14.權(quán)利要求1的方法，其中n是1，Z是[R6]m，其中R6是氨基酸殘基，m是大于或等于1的整數(shù)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中m為1，R6選自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
16.權(quán)利要求14的方法，其中m等于或大于2，每個(gè)R6獨(dú)立地選自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
17.權(quán)利要求1的方法，其中可檢測(cè)標(biāo)記的趨化肽選自下組N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-DTPAN-For-Met-Leu-Phe-Pu-DTPAN-For-Nle-Leu-Phe-Lys-DTPAN-For-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPAN-For-Met-Leu-Phe-Lys-DTPAN-For-Met-Leu-Phe-D-Lys(NH2)-DTPAN-Ac-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPAN-芐氧羰基-Met-Leu-Phe-甲酯IBOC-L-甲硫氨酰(亞砜)-L-Leu-L-Phe-L-賴氨酰胺IBOC-正亮氨酰-L-Leu-L-Phe-L-賴氨酰胺N-For-L-甲硫氨酰(亞砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-LysN-For-L-甲硫氨酰(砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-LysN-異丁基脲-Met-Leu-Phe-羧酸異丁氧羰基-Met-Leu-Phe-N-DTPA-LysN-For-(D)-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物t-BOC-Nle-Leu-Phe-Lys溶劑化物N-For-甲硫氨酰-亞砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-For-甲硫氨酰-砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-氨基甲酰-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-三甲基乙?；?Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物異丁氧羰基-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Nε-DTPA-Lys異丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH-BOC異丙基脲-Met-Leu-Phe-正丙基二胺-Asp-SHNH HBr異丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-Asp-SHNH HBr異丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH HBrN-苯基脲-Met-Leu-Phe異丙基脲-Met-Leu-Phe-丙二胺-SHNHN-正丁基硫脲-Met-Leu-PheN-正丁基脲-Phe-Leu-Phe-Leu-PheN-異丙基脲-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-COOHiBOC-Met-Leu-Phe-COOHiBOC-Met-Leu-Phe[酰氨基(丙基酰氨基)羧基[(丙基)羧基)]-(酰氨基丙醇SPNH)酯N-異丁基脲-Met-Leu-Phe-羧酸N-正丙基脲-Met-Leu-PheN-叔丁基脲-Met-Leu-PheN-正丁基脲-Met-Leu-PheiBOC-Met-Leu-Phe-(酰氨基乙氧基乙基[3-酰氨基]-6-丙烯醛腙)-吡啶N-iBOC-Met-Leu-Phe-SPNH-硫代酯N-異丙基脲-Met-Leu-PheN-iBOC-Met-Leu-Phe-丙二胺-SPNH環(huán)己基脲-Met-Leu-Phe-COOHN-正丁基氨基甲酸-Met-Leu-Phe-甲酯N-iBOC-Met-Leu-Phe-甲酯N-甲基氨基甲酸-Met-Leu-Phe-甲酯N-金剛烷基脲-Met-Leu-PheN-肉桂?；?Met-Leu-Phe對(duì)甲苯基脲-Met-Leu-Phe間甲苯基脲-Met-Leu-PheN-肉桂酰基-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe。
18.權(quán)利要求1的方法，其中M1包括放射性同位素。
19.權(quán)利要求18的方法，其中M1是111In或99mTc。
20.權(quán)利要求1的方法，其中M1包括順磁性同位素或可通過PET造影的化合物。
21.權(quán)利要求18的方法，其中經(jīng)胃腸外給藥。
22.權(quán)利要求20的方法，其中經(jīng)胃腸外給藥。
23.權(quán)利要求21的方法，其中胃腸外給藥途徑包括真皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈注射。
24.權(quán)利要求22的方法，其中胃腸外給藥途徑包括真皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈注射。
25.權(quán)利要求23的方法，其中給藥方法是逐漸灌注。
26.權(quán)利要求24的方法，其中給藥方法是逐漸灌注。
27.權(quán)利要求25的方法，其中逐漸灌注是利用蠕動(dòng)工具通過靜脈途徑進(jìn)行。
28.權(quán)利要求26的方法，其中逐漸灌注是利用蠕動(dòng)工具通過靜脈途徑進(jìn)行。
29.權(quán)利要求29的方法，其中個(gè)體是人。
30.權(quán)利要求1的方法，其中v是1，K是DTPA、EDTA或HYNIC。
31.權(quán)利要求30的方法，其中M1包括放射性同位素。
32.權(quán)利要求31的方法，其中M1是111In或99mTc。
33.權(quán)利要求30的方法，其中M1包括順磁性同位素或可通過PET造影的化合物。
34.權(quán)利要求30的方法，其中K是HYNIC。
35.權(quán)利要求34的方法，其中W還包括L，其中L是輔助配體。
36.權(quán)利要求35的方法，其中輔助配體包括葡庚糖酸鹽、tricine或另一個(gè)肽單元。
37.權(quán)利要求36的方法，其中另一個(gè)肽單元是X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W，其中W是下式結(jié)構(gòu)的標(biāo)記或連接取代基。-[K]v-M1，其中K是HYNIC，v是1，M1是診斷學(xué)上可檢測(cè)的標(biāo)記物。
38.一種檢測(cè)個(gè)體中感染或炎癥位點(diǎn)的方法，其包括a..給予所述個(gè)體診斷有效量的下式可檢測(cè)標(biāo)記的趨化肽X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中X為下式結(jié)構(gòu)的氨基保護(hù)基 其中R3選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4為氧或硫Y為Met、Phe或Nle，Z為選自1-6個(gè)碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的間隔序列，其中R6為氨基酸殘基，m為1-3的整數(shù)，n為0或1，及W是下式結(jié)構(gòu)的標(biāo)記或連接取代基-[K]v-M1其中K為DTPA、EDTA或HYNIC，v為1，及M1是111In或99mTc；且其中趨化肽在感染或炎癥位點(diǎn)顯著積累，而在無(wú)感染或炎癥的位點(diǎn)不顯著積累；和b.檢測(cè)所述趨化肽。
39.權(quán)利要求38的方法，其中Y是Met。
40.權(quán)利要求39的方法，其中甲硫氨酸殘基被4-氨基四氫硫代吡喃-4-羧酸取代。
41.權(quán)利要求39的方法，其中亮氨酸殘基被二丙基甘氨酸取代。
42.權(quán)利要求39的方法，其中亮氨酸殘基被1-氨基環(huán)己基羧酸取代。
43.權(quán)利要求39的方法，其中苯丙氨酸殘基被z-脫氫苯丙羧酸取代。
44.權(quán)利要求39的方法，其中苯丙氨酸殘基被2-氨基茚酮-2-羧酸取代。
45.權(quán)利要求39的方法，其中苯丙胺酸殘基被苯胺基丙氨酸取代。
46.權(quán)利要求38的方法，其中n是1，Z是[R6]m。
47.權(quán)利要求46的方法，其中m為1，R6選自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
48.權(quán)利要求46的方法，其中m為2，每個(gè)R6獨(dú)立地選自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
49.權(quán)利要求46的方法，其中m為3，每個(gè)R6獨(dú)立地選自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
50.權(quán)利要求49的方法，其中K是HYNIC。
51.權(quán)利要求50的方法，其中W還包括L，其中L是輔助配體。
52.權(quán)利要求51的方法，其中輔助配體包括葡庚糖酸鹽、tricine或另一個(gè)肽單元。
53.權(quán)利要求52的方法，其中另一個(gè)肽單元是X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W，其中W是下式結(jié)構(gòu)的標(biāo)記或連接取代基。-[K]v-M1，其中K是HYNIC，v是1，M1是診斷學(xué)上可檢測(cè)的標(biāo)記物。
54.權(quán)利要求38的方法，其中經(jīng)胃腸外給藥。
55.權(quán)利要求54的方法，其中胃腸外給藥途徑包括真皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈注射。
56.權(quán)利要求55的方法，其中給藥方法是逐漸灌注。
57.權(quán)利要求56的方法，其中逐漸灌注是利用蠕動(dòng)工具通過靜脈途徑進(jìn)行。
58.權(quán)利要求38的方法，其中個(gè)體是人。
59.一種可檢測(cè)標(biāo)記的趨化肽X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中X為下式結(jié)構(gòu)的氨基保護(hù)基 其中R3選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4為氧或硫Y為氨基酸殘基，Z為選自1-6個(gè)碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的間隔序列，其中R6為氨基酸殘基，m為大于或等于1的整數(shù)，n為0或1，及W是下式結(jié)構(gòu)的標(biāo)記或連接取代基-[K]v-M1其中K為DTPA、EDTA或HYNIC，v為1，及M1是111In或99mTc；且其中該趨化肽在感染或炎癥位點(diǎn)顯著積累，而在無(wú)感染或炎癥的位點(diǎn)不顯著積累。
60.權(quán)利要求59的肽，其中Y是Met、Phe或Nle。
61.權(quán)利要求60的方法，其中K是HYNIC。
62.權(quán)利要求61的方法，其中W還包括L，其中L是輔助配體。
63.權(quán)利要求62的方法，其中輔助配體包括葡庚糖酸鹽、tricine或另一個(gè)肽單元。
64.權(quán)利要求63的方法，其中另一個(gè)肽單元是X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W，其中W是下式結(jié)構(gòu)的標(biāo)記或連接取代基。-[K]v-M1，其中K是HYNIC，v是1，M1是診斷學(xué)上可檢測(cè)的標(biāo)記物。
65.一種適于胃腸外給藥的權(quán)利要求59趨化肽的藥物制劑。
66.選自下組的趨化肽N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-DTPA，N-For-Met-Leu-Phe-Pu-DTPA，N-For-Nle-Leu-Phe-Lys-DTPA，N-For-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPA，N-For-Met-Leu-Phe-Lys-DTPA，N-For-Met-Leu-Phe-D-Lys(NH2)-DTPA，N-Ac-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPA，IBOC-L-甲硫氨酰(亞砜)-L-Leu-L-Phe-L-賴氨酰胺，IBOC-正亮氨酰-L-Leu-L-Phe-L-賴氨酰胺，N-For-L-甲硫氨酰(亞砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-Lys，N-For-L-甲硫氨酰(砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-Lys，N-異丁基脲-Met-leu-Phe-羧酸，異丁氧羰基-Met-Leu-Phe-N-DTPA-Lys，N-For-(D)-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物，t-BOC-Nle-Leu-Phe-Lys溶劑化物，N-For-甲硫氨酰-亞砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物，N-For-甲硫氨酰-砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物，N-氨基甲酰-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物，N-三甲基乙酰基-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物，異丁氧羰基-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物，N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Nε-DTPA-Lys，N-金剛烷基脲-Met-Leu-PheN-肉桂?；?Met-Leu-Phe對(duì)甲苯基脲-Met-Leu-Phe間甲苯基脲-Met-Leu-PheN-肉桂?；?Phe-Leu-Phe-Leu-Phe其中所述趨化肽用診斷學(xué)上可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記，而且所述趨化肽能夠在個(gè)體的感染或炎癥位點(diǎn)積累，而在無(wú)感染或炎癥的所述位點(diǎn)不顯著積累。
67.權(quán)利要求66的方法，其中可檢測(cè)標(biāo)記物是放射性同位素。
68.權(quán)利要求67的方法，其中放射性同位素是111In或99mTc。
69.權(quán)利要求66的方法，其中可檢測(cè)標(biāo)記物是順磁性同位素或可通過PET造影的化合物。
70.含有下式趨化肽的治療組合物X-Y-Leu-Phe-[Z]n-[T]α其中X為下式結(jié)構(gòu)的氨基保護(hù)基 其中R3選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4為氧或硫Y為氨基酸殘基，Z為選自1-6個(gè)碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的間隔序列，其中R6為氨基酸殘基，m為大于或等于1的整數(shù)，n為0或1，T是治療劑，α為0或1；其中趨化肽在感染或炎癥位點(diǎn)顯著積累，而在無(wú)感染或炎癥的位點(diǎn)不顯著積累。
71.權(quán)利要求70的治療組合物，其中α為1，T選自藥物、植物血凝素、毒素、抗微生物和下式結(jié)構(gòu)的片段-[K]v-[M2]μ其中K為中間功能團(tuán)，v為0或1M2是治療性放射同位素，及μ是0或1
72.權(quán)利要求71的治療組合物，其中v為0。
73.權(quán)利要求72的治療組合物，其中M2選自125I、131I、90Y、67Cu、217Bi、211At、212Pb、47Sc、186Re、188Re、105Rh、153Sm和109Pd。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)個(gè)體中感染或炎癥位點(diǎn)的方法和治療這種感染或炎癥的方法，其中給予該個(gè)體診斷或治療有效量的、在感染或炎癥位點(diǎn)顯著積累的、可檢測(cè)標(biāo)記和治療學(xué)上偶聯(lián)的趨化肽，所述趨化肽具有通式X-Y-Leu-Phe-[Z]
文檔編號(hào)A61K38/06GK1141002SQ94194352
公開日1997年1月22日 申請(qǐng)日期1994年10月24日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月22日
發(fā)明者A·J·菲什曼, H·F·所羅門, C·K·德里安, G·J·布里杰, J·D·希金斯, S·K·拉森, P·E·赫南德茲, R·H·魯賓, H·W·斯特拉斯, A·J·福瑟洛, D·J·克龍, D·里爾辛格 申請(qǐng)人:綜合醫(yī)院有限公司, 奧瑟藥物有限公司, 約翰遜·馬思公司