專利名稱：2，4二磺酰苯基丁基硝酮，它的鹽類及它們作為藥物的應(yīng)用的制作方法
發(fā)明的背景本發(fā)明涉及一種特殊的硝酮化合物及其鹽類，以及它們作為藥用硝酮自由基捕獲劑的有利應(yīng)用。
背景資料α-苯基叔丁基硝酮(
)或“PBN”)在70年代被確認(rèn)是有用的分析試劑，連同電子自旋共振(“ESR”)一起，幫助檢測自由基。PBN會與某些自由基反應(yīng)，產(chǎn)生能發(fā)生特征ESR譜的化學(xué)物種，從而有可能確定自由基是否存在。
在70年代后期和80年代初，醫(yī)學(xué)界開始關(guān)注自由基在諸如心力衰竭、中風(fēng)等疾病中所起的作用。越來越多地在體外試驗中使用PBN以提供在這些情形中自由基存在的證據(jù)。后來還在試驗動物體內(nèi)使用，仍是作為分析助劑，目的是在模擬的局部缺血期間觀察自由基。
在80年代中期，當(dāng)嚴(yán)重的外傷性局部缺血動物試驗表明PBN處理過的動物似乎比對照樣存活率更高時，第一次暗示了PBN可能有治療作用。
在1991年5月2日公布了PCT專利申請WO-91-05552。該專利申請與現(xiàn)在頒發(fā)的美國專利5,825,032和5,036,097部分相應(yīng)，它提到了PBN和由以下化學(xué)式定義的一組PBN衍生物
其中X是苯基或
，其中的R是H、
，或Z；或
，n是從1到5的整數(shù)；或者X是
，Y是叔丁基或羥基化或乙?；氖宥』蛉〈谋交?。提議用這些化合物作為藥物制劑治療中風(fēng)后遺癥和據(jù)報道與自由基損傷有關(guān)的其它病癥。
在1992年提交了涉及PBN和有關(guān)的化合物及它們的醫(yī)學(xué)應(yīng)用的第二份PCT專利申請。該申請以先前的美國專利申請716,952(1991年6月18日提交)為基礎(chǔ)，1992年12月23日作為WO92/22290公布。這份1992年的出版物提供了極其廣泛和一般的內(nèi)容，首先，它試圖敘述盡可能多的與自由基有關(guān)的疾病癥狀。僅舉幾個例子來說，它包括從中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥(包括中風(fēng)、衰老、偏頭痛等)、外周器官疾病(包括動脈粥樣硬化、褥瘡、創(chuàng)傷和肌肉用力過度)，到紫外線曝曬。其次，它試圖列出盡可能多的潛在的自旋捕獲劑。
除了各式各樣的非PBN物質(zhì)之外，該申請還將可能有用的PBN化合物大大擴(kuò)展，包括了PBN和化學(xué)式如下的它的衍生物
其中X是苯基、咪唑基、吩噻嗪基或
，n＝1-5，優(yōu)選1-3；R2是各自獨立的(分子內(nèi)可以不同)鹵素、烷基、烷氧基、烯基、烯氧基、OH、NH2、NHZ、NZ2、NO、
-SO3H、-OSO3H、SH、-S(烷基)、-S(烯基)和鹵代烷基，尤其是-CF3；A＝0或S；Z是一個C1至C6的直鏈或支鏈的烷基或環(huán)烷基；Y是可以在一個或多個位置上羥基化或乙酰化的叔丁基；苯基或以下化學(xué)式的基團(tuán)
PBN在當(dāng)時被認(rèn)為是最優(yōu)選的化合物，據(jù)說它對正常的或未受損傷的細(xì)胞沒有可測量出的影響，而且還提到一些衍生物也有用，包括羥基衍生物，尤其是2-、3-或4-羥基苯基叔丁基硝酮和苯基(一、二或三羥基)叔丁基硝酮；PBN酯，尤其是釋放出2-、3-或4-羥基苯基叔丁基硝酮的酯，例如乙酰氧基衍生物；2-、3-或4-羧基苯基叔丁基硝酮；苯基羥丁基硝酮；烷氧基衍生物，尤其是釋放出2-、3-或4-羥基苯基叔丁基硝酮的烷氧基衍生物，例如PBN的2-、3-或4-甲氧基苯基衍生物，乙酰胺衍生物，尤其是釋放出2-、3-或4-氨基苯基叔丁基硝酮的乙酰胺衍生物；二苯基硝酮(PPN)及類似的二苯基硝酮衍生物；N-叔丁基-α-(4-硝基苯基)硝酮；和N-叔丁基-α-(2-磺苯基)硝酮。
發(fā)明的說明現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，一種特殊的PBN衍生物及其鹽具有出乎意料的優(yōu)越的藥理性質(zhì)。雖然這種衍生物2，4-二磺酰PBN屬于在前述WO92/022290中一般性提到的很廣泛的一類物質(zhì)的范圍，但是它沒有被具體地公開。也沒有預(yù)示它的有利的性質(zhì)。
本發(fā)明化合物帶有兩個磺酸基，預(yù)期會顯示出改進(jìn)的水溶解性，但是因為其疏油特性，所以穿越血/腦屏障的傳輸能力預(yù)期較差。然而，當(dāng)制成本發(fā)明化合物并在體內(nèi)試驗時，它出乎意料地顯示出功效比PBN增高。功效的這種增高與效力比PBN高一道發(fā)生。與功效和效力的顯著增高正好相反，與PBN相比，毒性則大大減小。這些結(jié)果是出乎意料的。
這些結(jié)果是出乎意料的，因為在關(guān)于結(jié)構(gòu)/活性關(guān)系的一般文獻(xiàn)中，在特別限定的各類化合物中治療效力通常與毒性一起變化。因此，大多數(shù)相關(guān)化合物保持它們的治療效力與毒性之比不變。相反，本發(fā)明化合物與這一預(yù)期的關(guān)系偏高，與緊密相關(guān)的類似物相比，它的效力增高而毒性減小。
因此，本發(fā)明的一個方面是提供了PBN一二磺?；衔?
及其可藥用的鹽。
在第二方面，本發(fā)明提供了以這種化合物或其鹽作為活性組分的可以非腸道(例如靜脈內(nèi))和口服用藥的藥物組合物。
在第三方面，本發(fā)明提供了一種治療患有與中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性氧化性損傷有關(guān)的病癥的患者(例如中風(fēng)患者)的方法，其中包括以非腸道用藥(例如靜脈內(nèi))的方式施用以本發(fā)明化合物或其鹽為基礎(chǔ)的藥物組合物。
在第四方面，本發(fā)明提供了一種治療方法，用于治療患有以中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到長期的低度氧化性應(yīng)力和中樞神經(jīng)系統(tǒng)機能逐漸喪失為特征的病癥的患者。在此方法中，以非腸道(例如靜脈內(nèi))或者最好是口服用藥的方式服用以本發(fā)明化合物或其鹽為基礎(chǔ)的藥物組合物。
在第五方面，本發(fā)明提供了一種減小或改善患者因癌癥治療產(chǎn)生的氧化性損傷造成的副作用的方法。在此方法中，以非腸道方式(例如靜脈內(nèi))或口服方式服用以本發(fā)明化合物或其鹽為基礎(chǔ)的藥物組合物。
發(fā)明的詳細(xì)描敘這一詳細(xì)描敘安排成以下部分附圖簡介.
化合物和鹽.
化合物制備.
藥物組合物.
治療的病癥和治療方案。
實施例附圖簡介此說明書涉及以下附圖，其中

圖1是用來制備化合物的反應(yīng)示意流程圖。
圖2(A、B和C)和3(A、B、C和D)是兩組圖，它們說明了動物體內(nèi)熱調(diào)節(jié)能力的不良變化與先有技術(shù)的硝酮自由基捕獲劑劑量水平的關(guān)系，以及與此相反，使用本發(fā)明化合物時沒有這種不良變化。
圖4(A、B、C和D)是一組四個圖，它顯示了本發(fā)明化合物與緊密相關(guān)的先有技術(shù)硝酮化合物相比，在治療逐漸神經(jīng)變性癥狀(例如阿爾茨海默氏病)方面的優(yōu)越性，這由它們干擾溶液中β-淀粉樣蛋白對關(guān)鍵酶的失活作用的相對能力得到說明。
圖5說明了本發(fā)明化合物在減小鼠內(nèi)大腦中動脈閉塞后觀察到的最終梗塞體積方面的效力。
圖6(A、B和C)的三個圖說明了本發(fā)明化合物減小高劑量抗癌藥物在動物中的副作用的能力。
化合物和鹽本發(fā)明的化合物是2，4-二磺酰基α-苯基叔丁基硝酮。在本文中還非正式地稱為“2，4-二磺酰PBN”或“PBN2，4-二磺酸鹽”。它在低pH條件下以酸的形式成為固體或存在于溶液中
在較高的pH下則以離解的鹽的形式存在，這可用下式表示
或作為
其中X是藥學(xué)上可接受的陽離子。此陽離子最常見的是一價陽離子，例如鈉、鉀或銨，但是也可以是多價陽離子與藥學(xué)上可接受的一價陰離子相結(jié)合，例如鈣與氯、溴、碘、氫氧根、硝酸根、磺酸根、乙酸根、酒石酸根、草酸根、丁二酸根、棕櫚酸或類似的陰離子；鎂與這些陰離子；鋅與這些陰離子等。本文在用結(jié)構(gòu)式表示多價陽離子與一價陰離子的這些組合時，一價陰離子用“Y”表示。
在這些物質(zhì)中，以游離酸和簡單的鈉、鉀或銨鹽最為優(yōu)選，鈣和鎂鹽也是優(yōu)選的，但稍差。
化合物制備如圖1中詳述和實施例1中所說明的，本發(fā)明化合物可以用一種兩步反應(yīng)順序制備。在第一步中，用合適的催化劑(例如活化的鋅/乙酸催化劑或鋁/汞齊催化劑)將市售的硝酸叔丁酯(2-甲基-2-硝基丙烷)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的正羥胺。此反應(yīng)可以在液體反應(yīng)介質(zhì)中，例如在鋅催化劑的情形于醇/水混合物中或者在鋁汞齊催化劑的情形于醚/水混合物中，在約15至100℃的溫度下進(jìn)行0.5至12小時，尤其是2到6小時。
在第二步中，使剛制得的羥胺與4-甲酰-1，3-苯二磺酸反應(yīng)，通常使用略微過量的胺。此反應(yīng)可以類似的溫度條件下進(jìn)行，一般在10到24小時內(nèi)完成。
這樣形成的產(chǎn)物是游離酸，其特征是分子量為89g/mole。它是白色粉末，加熱時分解。它在水中的溶解度大于1g/ml，D2O中的1H NMR譜為8.048ppm(dd，8.4，1.7Hz)；8.836ppm(d，8.4Hz)；8.839ppm(d，1.7Hz)；8.774ppm(s)。
通過將游離酸在水介質(zhì)中與兩當(dāng)量的合適的堿(例如鉀鹽用KOH)混合，容易制得各種鹽。
藥物組合物本發(fā)明化合物(包括它的鹽)可以配制成適合口服或非腸道(例如靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射)用藥的藥物組合物。
口服用藥的組合物可以采用溶液、或懸浮液、粉末、片劑、膠囊等形式。在這些組合物中，PBN2，4-二磺酸酯或其鹽常為少量組分(0.1％至例如50％重量)，其余的是各種賦形劑或載體及有助于形成所要劑量形式的加工助劑。液體形式可以包括合適的水基或非水賦形劑以及緩沖劑、懸浮分散劑、著色劑、矯味劑等。
固體形式可以包括例如任何以下組分或性質(zhì)類似的化合物粘合劑，例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖；崩解劑，例如藻酸，羥基乙酸淀粉鈉或玉米淀粉；潤滑劑，如硬脂酸鎂；助流劑，如膠體二氧化硅；甜味劑，如蔗糖或糖精；矯味劑，例如薄荷、糖水楊酸甲酯或桔子香料。
在可注射的組合物的情形，它們通常以可注射的滅菌的鹽水或磷酸鹽緩沖的鹽水或其它工藝上已知的可注射的載體為基礎(chǔ)?；钚韵跬话阋彩巧倭拷M分，常常占0.05-10％重量左右，其余的是可注射的載體及類似物質(zhì)。
可治療的病癥及治療方案用2，4-二磺酰PBN治療的病癥一般分成三類。第一類包括與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的某一區(qū)域急性強烈氧化性損傷有關(guān)的病癥。這些病癥的實例包括中風(fēng)、與中風(fēng)有關(guān)的癥狀、震蕩和蛛網(wǎng)膜下出血。在這種情形，以一種設(shè)計成使藥物盡可能快而直接地進(jìn)入患者血流中的方式施用本發(fā)明化合物。這常常是指靜脈注射。
治療這些病癥所用的靜脈注射劑量是從約0.1mg/kg/小時到至少10mg/kg/小時，全都注射約1到120小時，尤其是24到96小時。也可以預(yù)先快速濃注約10至500mg以便達(dá)到適當(dāng)?shù)姆€(wěn)態(tài)水平。
雖然優(yōu)選靜脈內(nèi)用藥，但也可以使用其它形式的非腸道用藥，例如肌內(nèi)注射。在這種情形，采用類似的劑量水平。2，4-二磺酰PBN的一個出乎意料和關(guān)鍵性的優(yōu)點是它能夠以比PBN本身高得多的劑量用藥。如實施例中所示，對于2，4-二磺酰PBN或其鹽，已證實可以采用最高達(dá)1000mg/kg/小時和更高的劑量，或是從10到2500mg/kg/的靜脈快速濃注劑量，而PBN本身在這樣的劑量下會致死或急性中毒。對于2，4-二磺酰PBN，在這樣的高劑量水平下劑量/向應(yīng)曲線存在著出乎意料的正的持續(xù)期，清楚地表明了在中風(fēng)或其它損傷后立即施用強力的重劑量，在很多情形對于恢復(fù)起到了主要的正面效果。
對2，4-二磺酰PBN治療作出有利反應(yīng)的第二類病癥是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到長期低度的氧化性應(yīng)力和中樞神經(jīng)系統(tǒng)機能逐漸喪失為特征的病癥。這些病癥包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)、多發(fā)梗塞性癡呆、視網(wǎng)膜病等。這些病癥都以機能的逐漸喪失為特征。2，4-二磺酰-PBN或其鹽在口服或非腸道用藥(例如靜脈內(nèi))時，可以減慢并且可能逆轉(zhuǎn)這種機能喪失。如果希望非腸道用藥(例如靜脈內(nèi)用藥)，一般使用與急性病癥時相似的劑量，但是在劑量范圍的較低一端。
在這些情形，治療方案可能延續(xù)很多月或年，因此從患者方便和耐受性考慮以口服用藥為佳。在口服用藥時，每天口服1到3次，每次需要約0.02至50mg/kg，優(yōu)選劑量為約0.04至5.0mg/kg。
當(dāng)然，可以把2，4-二磺酰PBN作為唯一的活性藥劑服用或也可以將它與其它藥劑結(jié)合服用。這就導(dǎo)致本發(fā)明化合物的第三種應(yīng)用。
對2，4-二磺酰PBN的治療有反應(yīng)的第三類病癥是由于癌癥(腫瘤疾病)治療產(chǎn)生氧化性損傷而對患者造成的副作用。產(chǎn)生氧化性損傷(因此產(chǎn)生副作用)的治療包括輻射(例如γ輻射)治療和用造成氧化性損傷的化學(xué)治療藥劑進(jìn)行治療。這些藥劑的實例包括抗生素，例如道諾霉素、鹽酸阿霉素和爭光霉素；甲基芐肼；氮芥，例如異環(huán)磷酰胺、苯丙氨酸氮芥和苯丁酸氮芥；烷基化試劑；抗代謝物；激素和拮抗劑。
服用2，4-二磺酰PBN對于減小患者在這些治療期間的不適感有效。此外，服用本發(fā)明化合物可以提高患者耐受這些治療的能力。治療中的副作用常常迫使治療中斷或妨礙在這些治療中按最佳的高劑量或快頻率用藥。在某些情形這些副作用具有破壞性的危害，會導(dǎo)致心力衰竭和其它的主要機能喪失。在動物試驗中曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明化合物可以改進(jìn)患者對這些抗腫瘤病治療的耐受性。
在這種治療中，可以在進(jìn)行輻射或化學(xué)治療之前、之中或之后服用本發(fā)明化合物。可以采用非腸道或口服用藥，或者采用能使2，4-二磺酰PBN進(jìn)入患者血流中的任何其它方法。
已觀察到正面的劑量-響應(yīng)關(guān)系。就這點而言，并且考慮到副反應(yīng)的嚴(yán)重性和提供最大可能的保護(hù)或改善作用的好處，在某些情形下可能最好是服用大量的2，4-二磺酰PBN，例如前面對于急性強烈氧化性CNS損傷癥狀提到的那些。在另一些情形，可能使用較低的劑量，例如對于漸進(jìn)性神經(jīng)元疾病治療所提到的那些。
以下是典型的用藥方案的實例在單一療法中(只用鹽酸阿霉素)，兩種典型的劑量組合是每平方米面積10-600mg化合物I加上每平方米表面積60mg鹽酸阿霉素，鹽酸阿霉素每7天或21天用藥?；衔颕可以在鹽酸阿霉素之前最多60分鐘、同時、或之后(例如幾小時后或次日)用藥。兒科的劑量通常兩種藥物均低。為治療耐多次劑量的腫瘤，可以使用更高的劑量。
實施例實施例12，4-二磺酰苯基-N-叔丁基硝酮(后繼實施例中化合物“I”)的合成。這一優(yōu)選的合成方法是以R.H.Hinton和E.G.Janzen的工作(J.Org.Chem.572646-2651，1992)為基礎(chǔ)的。如圖1所示，它包括一種醛與一種羥胺的縮合。該羥胺是不穩(wěn)定的，在使用的當(dāng)天用活化的鋅催化劑新制得。合成方法如下必要的化學(xué)藥品1.95％乙醇2.2-甲基-2-硝基丙烷3.鋅粉
4.冰乙酸5.乙醚6.飽和的氯化鈉溶液7.無水硫酸鎂固體8.4-甲酰-1，3-苯磺酸(MW 310.21g/mole)，二鈉鹽，水合物9.甲醇10.二氯甲烷步驟A.N-叔丁基羥胺的制備1.一只500ml三頸園底燒瓶裝有磁攪子、溫度計接口、溫度計和加液漏斗。
2.將95％乙醇(350ml)加到燒瓶中，在冰浴中冷卻到10℃。
3.一次加入2-甲基-2-硝基丙烷(6.18g，0.060摩爾)和鋅粉(5.89g，0.090mole)。
4.將冰乙酸(10.8g，0.180mole)加到加液漏斗中，在激烈攪拌下逐滴加入，加入的速度應(yīng)保持溫度低于15℃。
5.撤除冰浴，在室溫下攪拌混合物3小時。
6.從混合物中脫除溶劑，留下叔丁基羥胺、乙酸鋅和水。
7.加入二氯甲烷(50ml)，混合物經(jīng)布氏漏斗過濾。
8.留在濾紙上的乙酸鋅濾餅用2×25ml二氯甲烷洗。
9.在分液漏斗中分出濾液中的水，有機層用硫酸鎂干燥。
10.通過溝紋濾紙過濾，除掉硫酸鎂，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫除二氯甲烷。
11.產(chǎn)物(100％產(chǎn)率＝5.34g)為粘性液體，將它溶在甲醇(50ml)中用于部分B。
B.2，4-二磺酰苯基-N-叔丁基硝基酮的制備1.一只250ml三頸園底燒瓶裝有攪棒、氣體分散管、加液漏斗和用循環(huán)冰水冷卻的Friedrich冷凝器。
2.向燒瓶中加入200ml甲醇、4-甲酰-1，3-苯二磺酸(9.31g，30mmol)和N-叔丁基羥胺(部分A的25ml甲醇溶液，理論值30mmol)。
3.用加熱套將反應(yīng)物加熱回流，同時在攪拌下鼓入氮氣。
4.將混合物回流2小時。
5.加入部分A中的剩余的羥胺。
6.繼續(xù)在鼓入氮氣下回流至少18小時，但不超過24小時。
7.將熱的反應(yīng)混合物在布氏漏斗上過濾，固體用熱的甲醇洗。
8.用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫除甲醇，得到黃色粘性油狀物。
9.加入熱的1∶1的乙醇∶丙酮(200ml)，將混合物加熱使油溶解。
10.將溶液冷卻使卻產(chǎn)物結(jié)晶。
11.在布氏漏斗上收集產(chǎn)物，真空干燥過夜。
12.反應(yīng)通常得到產(chǎn)率為75％的白色粉末狀化合物I。
實施例22，4-二磺酰苯基-N-叔丁基硝酮(化合物I)的另一種合成方法。這是一種較早發(fā)展的方法，用于制備在本說明書實施例中報道的幾個實驗中使用的化合物樣品。此實施例的產(chǎn)物在各方面均與實施例1的相同。這一合成方法如下必要的化學(xué)藥品1.鋁箔，切成5cm寬的條狀，卷成直徑約1cm的園筒。
2.氯化汞(II)(9.68g在476ml水中)3.乙醇4.乙醚(6L)5.純水6.2-甲基-2-硝基丙烷7.氫氧化鈉，2M(80g在1L水中)8.硫酸鎂，無水固體9.4-甲酰-1，3-苯磺酸(MW 310，21g/mol*)步驟A.N-叔丁基羥胺的制備1.將鋁箔園筒在HgCl2溶液中浸15-30分鐘，然后浸入乙醇中，再浸入乙醚中，隨后置于含500ml乙醚和21.4ml水的5L燒瓶中。
2.燒瓶裝上250ml的壓力平衡滴液漏斗、機械攪拌器、氮氣入口和用循環(huán)冰水冷卻的Friedrich冷凝器。
3.將混合物攪拌10分鐘。
4.用滴液漏斗加2-甲基-2-硝基丙烷(71.68g，75.5ml)，加入的速度應(yīng)保持激烈回流。
注意加料必須在少于20分鐘內(nèi)完成，否則產(chǎn)率會顯著下降。
5.在加料的同時加入500ml一份的乙醚。這樣作是為了保持產(chǎn)物濃度盡可能高，而又不形成凝膠。最多可加入2L乙醚，而對產(chǎn)率無不利影響。
6.一旦加完2-甲基-2-硝基丙烷，將反應(yīng)物再攪拌30分鐘。
7.將所形成的灰色懸浮液分三批抽氣過濾，除掉鋁鹽。
8.每塊濾餅均用1L乙醚洗。
9.合并的醚層用300ml 2M NaOH洗，然后干燥(MgSO4)，減壓濃縮成軟的白色固體。
10.該固體剛好在室溫之上熔化，但可以進(jìn)一步在真空烘箱中干燥(不超過幾分鐘)，留下38至45g固體。
11.此固體可以原樣使用，或者用戊烷重結(jié)晶。
12.分子量為89g/mol。
B.2，4-二磺酰苯基-N-叔丁基硝酮的制備1.在一只250ml的燒瓶上裝上攪拌和用循環(huán)冰水冷卻的Friedrich冷凝器。
2.向燒瓶內(nèi)裝入71.8ml甲醇、14.5g 4-甲酰-1，3-苯二磺酸(46.7mole，1當(dāng)量)和5.0g N-叔丁基羥胺(56.2mmole，1.2當(dāng)量)。
3.將混合物回流過夜。
4.將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到園底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。
5.將固體殘余物與乙醚一起搗碎，倒掉乙醚(黃色)。
6.重復(fù)步驟5。
7.產(chǎn)物(“化合物I”)自甲醇中結(jié)晶，隨后進(jìn)行熱甲醇過濾以便除掉不溶性沉淀，自甲醇中重結(jié)晶兩次。
實施例3進(jìn)行一系列實驗，以便在體內(nèi)比較2，4-二磺酰PBN(“化合物I”)、PBN和兩種一磺酰PBN化合物作為防止在大腦局部缺血和再灌注損傷后神經(jīng)元損失的藥劑的功效。試驗步驟是W.Cao、J.M.Carney、A.Duchon、R.A.Floyd和M.Chevion在“Oxygen free radical involvement in ischemia andreperfusion injury to brain”，Neuroscience Letters.88(1988)233一文中報道的步驟。在此實驗中，對于每組6只的各組沙土鼠以單劑量的方式腹膜內(nèi)施用試驗化合物，30分鐘后將雙側(cè)頸動脈閉塞5分鐘。在一個100μm的區(qū)域內(nèi)測定神經(jīng)元核的密度。展示兩種對照樣，一種不接受試驗化合物，另一種不接受試驗化合物而且無大腦局部缺血。如表1所示，本發(fā)明化合物與先有技術(shù)化合物相比顯示了出乎意料的優(yōu)點。首先，可以看出在低劑量(例如3.2mg/kg)時化合物I在防止神經(jīng)元損失方面效力高2-3倍。在高劑量時可以看出化合物I能完全保護(hù)神經(jīng)元免遭損失，因為試驗的大腦的神經(jīng)元密度與未局部缺血的對照樣相同。在這樣的高劑量下先有技術(shù)化合物或是有毒，或是保護(hù)程度低得多。這些結(jié)果表明，化合物I與PBN和兩種緊密相關(guān)的類似物相比，其保護(hù)神經(jīng)元的效力明顯增高，同時毒性比PBN出乎意料地減少。
表1神經(jīng)元核/100微米區(qū)域PBN 2- 3- 化合物磺基 磺基 I無局部缺血的對照樣4.21 4.21 4.21 4.21(.43)(.43)(.43) (.43)局部缺血的對照樣 0.58 0.58 0.58 0.58(.28)(.28)(.28) (.28)3.2mg/kg 0.43 0.73 0.35 1.43(.18)(.34)(.21) (.31)10mg/kg 1.13 0.68 0.81 2.57(.39)(.31)(.40) (.25)32mg/kg 1.83 0.73 1.63 3.53(.21)(.31)(.35) (.41)50mg/kg 3.11 1.01 1.63 4.11(.29)(.61)(.35) (.43)100mg/kg 3.68 0.93 1.93 4.18(.71)(.53)(.39) (.49)320mg/kg 3.78 1.11 1.78 4.23(.43)(.41)(.40) (.39)1000mg/kg 有毒 0.98 1.58 4.11(.43)(.38) (.41)3200mg/kg 有毒 --4.18
實施例4進(jìn)行一系列實驗，比較化合物I與PBN和兩種磺酸鹽類似物在局部缺血后治療中的效果。采用實施例1中所述的通用方法，但是試驗化合物是在5分鐘局部缺血后再灌注的30分鐘后以單劑量的方式腹膜內(nèi)用藥。結(jié)果總結(jié)在表2。表2表明，本發(fā)明化合物仍然是在低劑量時更有效，在高劑量時效力強而毒性小。同樣，毒性妨礙了先有技術(shù)化合物達(dá)到本發(fā)明化合物能提供極其有效的治療時的高劑量。
表2神經(jīng)元核/100微米區(qū)域PBN 2- 3- 化合物磺基磺基I無局部缺血對照樣 4.18 4.184.18 4.18(.59)(.59) (.59) (.59)局部缺血對照樣 0.85 0.850.85 0.85(.19)(.19) (.19) (.19)32mg/kg1.09未測出 未測出1.83(.31) (.41)50mg/kg1.85 0.680.73 2.73(.49)(.31) (.34) (.39)100mg/kg 2.11 0.781.09 3.41(.51)(.23) (.48) (.37)320mg/kg 2.25 0.810.93 3.55(.43)(.31) (.48)1000mg/kg 有毒未測出 未測出3.68(.39)實施例5采用實施例1中所述的通用試驗方法對化合物I和PBN進(jìn)行比較，確定在沙土鼠5分鐘局部缺血后開始重新灌注的60分鐘之后靜脈內(nèi)注射用藥時它們防止神經(jīng)元損失的相對效力。結(jié)果總結(jié)在表3，它表明化合物I在大腦損傷后臨床治療的情形治療效果大得多。
表3N＝6每組 mg/kg單劑量0.0 0.51.0 10鹽水，無局部缺血 4.11 - - -(.28)鹽水，局部缺血 0.93 - - -(.17)PBN- 0.83 1.071.23(.23) (.29) (.31)化合物 I - 1.25 1.752.43(.19) (.28) (.31)PBN或化合物I對于大腦無損傷的對照沙土鼠的神經(jīng)元密度均無影響。
實施例6大腦損傷可以表現(xiàn)為行為變化。在此實驗中，試驗幼年的成體沙土鼠(3-4月)，以便確定它們在經(jīng)歷實施例1中所述的局部缺血之后24小時完成一個8分路迷宮試驗的能力。與未局部缺血的動物相比，在未治療時它們犯的錯誤要多得多，對某些試驗動物施用PBN和化合物I。如表4中詳細(xì)列出的，用高劑量的化合物I治療過的沙土鼠的犯錯誤水平與未局部缺血的動物很難區(qū)分。PBN的效力較差。這說明化合物I能防止幼年沙土鼠在5分鐘局部缺血后在8分路迷宮試驗中的局部缺血后(24小時后)暫時性/空間短期記憶喪失。
表4N＝6(每組) mg/kg/hr 24小時0.01.032 50 100對照4.1 - - -(.38)局部缺血后37.6- - -(4.85)PBN -29.8 18.19 6.23 5.83(7.27) (5.83) (.71) (.49)化合物 I-14.63 7.19 4.28 4.11(3.81) (.81) (.29) (.19)
實施例7測定了本發(fā)明化合物減小局部缺血后梗塞體積的能力。如表5所示，觀察到雖然PBN和化合物I在低劑量時都有效，但在高劑量時化合物I給出最佳保護(hù)作用，而PBN有毒性。表5列出了在C57BL/6J小鼠大腦中動脈閉塞后60分鐘靜脈內(nèi)施用試驗化合物并繼續(xù)24小時時觀察到的閉塞體積。
表5梗塞體積 mm3后治療 0.01.0 10 100(mg/kg/hr)對照樣，無局部缺血 0 - - -鹽水，局部缺血 23 - - -(2)PBN - 17.713.8 毒性(2.8) (2.3)化合物 I - 16.812.7 8.3(1.7) (3.93) (.71)實施例8在此研究中，比較了化合物I和PBN在老年沙土鼠(18-24月，n＝12/組)經(jīng)受10分鐘局部缺血之前30分鐘用藥時，防止沙土鼠致死的能力(存活率％)。如表6所示，化合物I在所有劑量水平上都更優(yōu)越，并且在高劑量時達(dá)到完全保護(hù)，而PBN只是部分有效。
表6預(yù)處理0.01032100320(mg/kg)鹽水 11 - - - -PBN - 425075 92化合物 I - 5075100100實施例9與工藝上已知的化合物PBN相比，本發(fā)明化合物的一個重要優(yōu)點是它的毒性顯著減小。如表7中詳細(xì)列出的，根據(jù)改變單次腹膜內(nèi)施用的硝酮劑量的大小確定C57BL/6L小鼠中的急性致死率。PBN在560mg/kg劑量時表現(xiàn)出明顯的毒性?；衔颕在將近20倍大的劑量下仍未顯示毒性。
表7mg/kg存活率％ 320 560 1000 3000 10000n＝20只鼠PBN100 25 00 0化合物 I 100 100 100 100100實施例10對于硝酮自由基捕獲劑，已發(fā)現(xiàn)的另一個體內(nèi)全身性不良作用是體溫降低。這一毒性會產(chǎn)生嚴(yán)重的健康后果，并且會使其它病癥的診斷復(fù)雜化。如圖2和圖4所示，本發(fā)明化合物以高達(dá)1000mg/kg的劑量對小鼠和沙土鼠施用時測量不出有體溫下降。相反，先有技術(shù)的化合物PBN在劑量僅為500mg/kg時使體溫降低最多達(dá)8℃。
實施例11試驗本發(fā)明的化合物，以便通過試驗它在一種模型中對阿爾茨海默氏病(“AD”)的效力，確定它在治療以長期對中樞神經(jīng)系統(tǒng)施以低度氧化性應(yīng)力和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能逐漸喪失為特征的病癥的效力。這一模型有以下基礎(chǔ)近來的研究證實，在老年個體的腦中存在與年齡有關(guān)的蛋白質(zhì)氧化增加和酶活性喪失。自老年個體的成纖維細(xì)胞和不同年齡個體的紅血球進(jìn)行的組織培養(yǎng)都表明，蛋白質(zhì)羰基含量(蛋白質(zhì)氧化的量度)指數(shù)增加而標(biāo)記酶的活性減小。在個體的壽命范圍內(nèi)腦蛋白的氧化逐漸增加。
反常的淀粉樣蛋白前體肽的形成和代謝在AD中的作用也在許多不同的模型中研究過。在使用胚胎海馬神經(jīng)元和神經(jīng)元/神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)物進(jìn)行的體外試驗中已經(jīng)證實，βAP 1-40在長期的共培育中產(chǎn)生細(xì)胞毒性。當(dāng)把這種肽注入鼠腦中時，產(chǎn)生了損害。所指出的這種βAP的某些分解片段也有神經(jīng)毒性[例如βAP(25-35)]。這種神經(jīng)毒性似乎是通過谷氨酸受體和非谷氨酸受體兩種機構(gòu)傳遞的。對于神經(jīng)元培養(yǎng)物的共焦顯微鏡研究證實了與βAP(1-40)接觸會造成氧化應(yīng)力[二氯熒光黃和增多的細(xì)胞內(nèi)游離鈣Fura-2]。
業(yè)已證實，βAP片段可以直接使組織提取物和培育的海馬神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)中的谷氨酰胺合成酶(GS)及肌酸激酶(CK)失活(見圖4中A和B)。圖4中的A和B表示了由AP(25-35)造成的與劑量有關(guān)的谷氨酰胺合成酶與肌酸激酶的失活。制備了得自沙土鼠新皮層的細(xì)胞溶質(zhì)級分并測定酶的活性。在鑒定以前將樣品在不同濃度的肽存在下培育10分鐘。實心符號代表天然存在的25-35片段的影響。園圈表明逆順序(32-25)對酶活性無影響?？招娜潜砻?，與25-35的影響相比，混亂的氨基酸順序?qū)τ诿富钚砸矝]有影響。每個點都是5個觀察值的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。衍生的βAP和自由基的其它細(xì)胞源是AD被引發(fā)和傳播的一個重要的決定因素。
如圖4中的C和D所證實的，化合物I和PBN均顯示出保護(hù)GS和CK免受βAP片段影響的能力。圖4的C和D表示了細(xì)胞溶質(zhì)級分與βAP25-35(0.4mg/ml)及不同濃度的PBN(園圈)或化合物I(實心園圈)一起共培育時的保護(hù)作用。每個點都是3個觀察值的平均結(jié)果(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。如由C和D可見，化合物I實現(xiàn)了完全保護(hù)，事實上甚至能使氧化的作用逆轉(zhuǎn)。相反，PBN的效力相當(dāng)有限，因為它在基本上不完全保護(hù)的水平上漸近地變平。
實施例12進(jìn)行實驗以便進(jìn)一步證實本發(fā)明化合物在防止由中風(fēng)造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷方面的效能。鼠病灶性局部缺血結(jié)果進(jìn)行一對研究以便確定化合物I在鼠病灶性局部缺血模型中的功效。在此模型中，對Sprague Dawley鼠(200-300g)進(jìn)行永久性大腦中動脈閉塞術(shù)(MCAO)以引發(fā)病灶性中風(fēng)。在永久性閉塞后施用化合物I，先在腹膜內(nèi)(i.p.)快速濃注，然后在其余時間里靜脈內(nèi)(i.v.)連續(xù)輸注，直到中風(fēng)后經(jīng)過24小時。所用的化合物I的劑量或是100mg/kg，i.p.，隨后4.2mg/kg/小時，i.v.；或者10mg/kg，i.p.，隨后0.42mg/kg/小時，i.v.。
在中風(fēng)3天后將鼠宰殺，使用三苯基四唑鎓染色技術(shù)對組織進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)加工，用圖象分析法定量測定梗塞體積和細(xì)胞壞死總面積。這些實驗的結(jié)果以圖形方式示于圖5，它表明化合物I在兩項研究中都提供了約70％的明顯的保護(hù)作用。與文獻(xiàn)結(jié)果的比較Cao和Phillis近來報道了關(guān)于非本發(fā)明化合物PBN的類似數(shù)據(jù)(BrainResearch 664267-272，1994)。在它們的研究中，對鼠進(jìn)行永久性大腦中動脈閉塞術(shù)(MCAO)和頸總動脈閉塞術(shù)。在中風(fēng)后的不同時間腹膜內(nèi)施用100mg/kg的PBN。中風(fēng)2天后將鼠宰殺，用三苯基四唑鎓染色法定量測定梗塞體積。
當(dāng)在中風(fēng)后的0.5、5、17、29和41小時或在中風(fēng)后的5、17、29和41小時施用PBN時，梗塞體積均減小約50％。為達(dá)到50％的保護(hù)作用而施用的PBN累積劑量最少為達(dá)到70％保護(hù)作用所需的化合物I數(shù)量的4倍。因此，化合物I在鼠的MCAO病灶式局部缺血模型中能提供比PBN優(yōu)越得多的保護(hù)作用。
實施例13在此實施例中對本發(fā)明化合物(化合物I)進(jìn)行鑒定，以確定它在改善抗癌治療氧化引起的副作用方面的能力。鹽酸阿霉素研究鹽酸阿霉素是廣泛應(yīng)用的抗癌藥。已知它很有效，但也知道它的引起氧化性損傷的傾向有嚴(yán)重的副作用。這些副作用包括在高劑量時造成嚴(yán)重的心臟損傷。這些副作用常常限制了這種藥劑的使用，或者限制了能夠使用的劑量水平低于為達(dá)到最大的抗腫瘤疾病效果所要求的水平。
進(jìn)行實驗以便證實本發(fā)明化合物在減小諸如鹽酸阿霉素抗癌藥的副作用方面有效，并且使動物能耐受較高劑量的鹽酸阿霉素。
用C57BL/6J和DBA/2J雄性小鼠(35-40g)試驗鹽酸阿霉素的急性致死作用和通過預(yù)先服用化合物I防止急性致死。在施用鹽酸阿霉素之前30分鐘對小鼠注射鹽水或化合物I。全都采用腹膜內(nèi)注射。鹽酸阿霉素的急性致死量是從10到30mg/kg。在這些試驗中鹽酸阿霉素的LD50在兩種品系的小鼠中均為25mg/kg。在不進(jìn)行鹽酸阿霉素治療時，劑量高達(dá)300mg/kg的化合物I對兩個品系的小鼠的存活沒有影響。
用30和100mg/kg的化合物I進(jìn)行預(yù)處理，在鹽酸阿霉素致死率-劑量效果曲線中產(chǎn)生與劑量有關(guān)的偏移。圖6表示了用DBA/2J小鼠得到的結(jié)果。劑量為100mg/kg的化合物I產(chǎn)生朝右的5倍移動(向減小致死率的方向)。因此，化合物I與鹽酸阿霉素相組合使最大耐受劑量顯著增加。這些較高的劑量是在能有效地殺死抗多種藥物的腫瘤的范圍內(nèi)。對照試驗用PBN預(yù)處理造成鹽酸阿霉素劑量-效應(yīng)曲線的輕微右移。雖然化合物I在與鹽酸阿霉素組合時其劑量可增加到300mg/kg，但對于PBN此組合有一上限。劑量為100mg/kg的PBN產(chǎn)生輕微的鎮(zhèn)靜作用，300mg/kg產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)靜作用和某些兼帶的毒性(10-20％致死率)?；衔颕鹽酸阿霉素在化合物I的劑量高達(dá)300mg/kg時不產(chǎn)生任何兼帶的毒性。
實施例14安全性試驗檢驗化合物I和PBN在雄性Sprague Dawley鼠(200-300g)中的急性毒性。對每組6只的各組鼠腹膜內(nèi)施用1000mg/kg的化合物。3天后鑒定致死率。化合物I的致死率為零，而PBN使此試驗中使用的6只鼠中的5只死亡。這些數(shù)據(jù)證實了沙土鼠試驗中化合物I比PBN安全性高的數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1. 2，4-二磺酰α-苯基叔丁基硝酮。
2.一種化學(xué)式如下的化合物
3.化學(xué)式如下的一種可藥用的鹽
4.化學(xué)式如下的權(quán)利要求3的鹽
其中X選自Na、K、NH4、Ca、Mg、CaY和MgY，Y是可藥用的一價陰離子。
5.一種藥物組合物，其中在可藥用的非腸道注射的載體中含有權(quán)利要求1的化合物。
6.一種藥物組合物，其中在可藥用的非腸道注射的載體中含有權(quán)利要求2的化合物。
7.一種藥物組合物，其中在可藥用的非腸道注射的載體中含有權(quán)利要求3的鹽。
8.一種藥物組合物，其中在可藥用的非腸道注射的載體中含有權(quán)利要求4的鹽。
9.一種藥物組合物，其中在可藥用的口服載體中含有權(quán)利要求1的化合物。
10.一種藥物組合物，其中在可藥用的口服載體中含有權(quán)利要求2的化合物。
11.一種藥物組合物，其中在可藥用的口服載體中含有權(quán)利要求3的鹽。
12.一種藥用組合物，其中在可藥用的口服載體中含有權(quán)利要求4的鹽。
13.一種治療中風(fēng)患者的方法，其中包括對患者非腸道施用至少約為0.2mg/kg/小時的治療中風(fēng)有效數(shù)量的權(quán)利要求5、6、7或8的藥物組合物。
14.一種權(quán)利要求13的方法，其中的組合物以靜脈內(nèi)方式用藥。
15.一種治療中風(fēng)患者的方法，其中包括使患者口服對治療中風(fēng)有效數(shù)量的權(quán)利要求9、10、11或12的藥物組合物。
16.一種治療漸進(jìn)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)機能喪失癥患者的方法，其中包括對患者非腸道施用對治療漸進(jìn)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)機能喪失有效數(shù)量的權(quán)利要求5、6、7或8的藥物組合物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中的組合物以靜脈內(nèi)方式用藥。
18.一種治療漸進(jìn)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)機能喪失癥患者的方法，其中包括使患者口服至少約為0.1mg/kg/天的對治療漸進(jìn)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)機能喪失有效數(shù)量的權(quán)利要求9、10、11或12的藥物化合物。
19.一種改善患者因抗腫瘤病治療產(chǎn)生的氧化性損傷而造成的副作用的方法，該方法包括使患者口服對改善副作用有效數(shù)量的權(quán)利要求9、10、11或12的藥物組合物。
20.一種改善患者因抗腫瘤病治療產(chǎn)生的氧化性損傷而造成的副作用的方法，該方法包括對患者非腸道施用對改善副作用有效數(shù)量的權(quán)利要求5、6、7或8的藥物組合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中組合物以靜脈內(nèi)方式用藥。
全文摘要
公開了2，4-二磺酰α-苯基叔丁基硝酮及其可藥用鹽。這些物質(zhì)可作為口服或非腸道(例如靜脈內(nèi))用藥的藥劑使用，用于患有例如中風(fēng)時發(fā)生的急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化或表現(xiàn)為漸進(jìn)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)機能喪失的中樞神經(jīng)系統(tǒng)逐漸氧化的患者。這些物質(zhì)也用于改善由抗腫瘤病治療造成的氧化性損傷副作用。
文檔編號A61P25/28GK1156447SQ94194993
公開日1997年8月6日 申請日期1994年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月23日
發(fā)明者J·M·卡尼 申請人:俄克拉荷馬醫(yī)學(xué)研究基金會, 肯塔基大學(xué)研究基金會