專(zhuān)利名稱(chēng)：淡水魚(yú)類(lèi)暴發(fā)性傳染病二聯(lián)疫苗的制備及免疫方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水生動(dòng)物疫苗的制備及免疫方法，特別涉及養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)暴發(fā)性傳染病(即細(xì)菌出血性敗血病)疫苗的制備和免疫方法。
1989年以來(lái)，我國(guó)接連發(fā)生前所未有的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)暴發(fā)性傳染病。發(fā)病范圍波及全國(guó)20多個(gè)省、市，罹病魚(yú)的品種有鰱魚(yú)、鳙魚(yú)、鯽魚(yú)、(包括白鯽、異育銀鯽和本地鯽魚(yú))、鳊魚(yú)、鯪魚(yú)、銀鲴、草魚(yú)、鯉魚(yú)以及各種野雜魚(yú)，甚至還有泥鰍、河蚌等。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，1990年遭此病致死的數(shù)量，湖北省高達(dá)500多萬(wàn)公斤，京津地區(qū)80多萬(wàn)公斤，上海市、江蘇省200多萬(wàn)公斤，浙江省100多萬(wàn)公斤，全國(guó)損失金額約11億元。
研究該病和相關(guān)病害的主要背景技術(shù)文件如下中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)1、分類(lèi)號(hào)A61K03578，公告號(hào)CN1071336A，申請(qǐng)?zhí)?1109470.9，申請(qǐng)日期91.10.10申請(qǐng)人中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，項(xiàng)目名稱(chēng)廣譜性防治魚(yú)、蝦、貝、蟹暴發(fā)病藥物的制作、施用方法。該專(zhuān)利提供了一種廣譜性防治魚(yú)、蝦、貝、蟹暴發(fā)病藥物的制作、施用方法。該藥的核心部分約七種中草藥，可以制成藥餌，也可以直接潑灑于水體之中，進(jìn)行生態(tài)防治。
中國(guó)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1、CRM5/20，文獻(xiàn)號(hào)#7，分類(lèi)號(hào)S943.113，題名水庫(kù)暴發(fā)性魚(yú)病及其防治技術(shù)研究I病原菌的分離，菌株的致病性及其生化特性，作者高漢嬌，陳昌福，出處水利漁業(yè)，1995(2)9-10，出版年1995，該文獻(xiàn)報(bào)道了從安徽、湖北兩省8座水庫(kù)中發(fā)生暴發(fā)性傳染病的鰱魚(yú)上分離的病原菌的致病力和生化特性測(cè)試結(jié)果，根據(jù)對(duì)5個(gè)具有較強(qiáng)致病力的菌株的生化特性分析并與標(biāo)準(zhǔn)菌株比較，初步認(rèn)為水庫(kù)中鰱鳙魚(yú)暴發(fā)性傳染病的病原菌是嗜水氣單胞菌。2、CRM3/20，文獻(xiàn)號(hào)#3，分類(lèi)號(hào)5941.4，題名淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)暴發(fā)性傳染病防治研究，出處水產(chǎn)科技情報(bào)，1991，18(1)20-21，出版年1991。3、NM6/20，文獻(xiàn)號(hào)#8，分類(lèi)號(hào)S941，題名沙市地區(qū)暴發(fā)性傳染病病原研究，作者；賀路、左文功等，出處淡水漁業(yè)，1992(3)13-16，出版年1992。以上3篇文獻(xiàn)，對(duì)魚(yú)類(lèi)暴發(fā)性傳染病病原進(jìn)行了分離、鑒定，但僅分離出嗜水氣單胞菌。4、CRM8/20，文獻(xiàn)號(hào)#10，分類(lèi)號(hào)S943.1，題名白鯽、鰱、鳊等養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)暴發(fā)性魚(yú)病病原研究初報(bào)，作者俞寧寧、毛云紅，出處魚(yú)類(lèi)病害研究，1991，13(2)17-19，出版年1991，此文獻(xiàn)報(bào)道分離到一種病原菌，未肯定病原菌的分類(lèi)位置。5、CRM11/20，文獻(xiàn)號(hào)#14，分類(lèi)號(hào)S948，題名養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性敗血病的菌苗和試用取得較大進(jìn)展，作者陳月英，出處魚(yú)類(lèi)病害研究，1994，16(2)28，出版年1994，此文僅就暴發(fā)病的嗜水氣單胞菌疫苗進(jìn)行了報(bào)道。
國(guó)外非專(zhuān)利文獻(xiàn)1、Pal R N，Tr ipathi S D.
Use of Terramycin for Fish Diseases in Carp and Catfish Culturein Indian Waters.
J.Inland Fish.Soc.India，1978，10166-168.
對(duì)鰱魚(yú)紅斑病作了報(bào)道，但未作病原的分離、鑒定以及疫苗研究。2、Biosco E G，Amaro C.
Sidarphores and Related Outer Membrane Proteins in Vibrio Spp.Which are Potential Pathogens of Fish and Shellfish.
J.Fish Dis.，1991，14249-263.
作者報(bào)道了河弧菌I、II型生物變種并通過(guò)菌細(xì)胞中鐵結(jié)合配位體和胞外膜蛋白的測(cè)定，認(rèn)為與其它致病弧菌一樣，僅對(duì)魚(yú)類(lèi)具有潛在致病能力。此外，沒(méi)有報(bào)道制備細(xì)菌疫苗。3、Karunasagar I，Rosaolind G & Karunasagar I.
Immunological Response of the Indian Major Carps to AeromonasHydriohila VaccineJ.Fish Dis.，1991，14413-417.4、Santos Y，Bandin I，Nunez S，Gravningen K & Toranzo A E.
Protection of Turbot，Scophthalmus Maximus(L.)，and Rainbow Trout，Oncorhynchus Mykiss(Richardson)，Against Vibrosis Using TwoDifferent VaccinesJ.Fish Dis.，1991，14407-411.
綜合以上國(guó)內(nèi)外背景技術(shù)文件，淡水魚(yú)類(lèi)暴發(fā)性傳染病是八十年代末以來(lái)出現(xiàn)于我國(guó)廣大淡水養(yǎng)殖地區(qū)的一種新的病害，國(guó)外未見(jiàn)對(duì)該病的研究報(bào)道，國(guó)內(nèi)的研究亦尚不充分，對(duì)其病原菌的分離、純化及研究?jī)H氣單胞菌一種，在疫苗的制備研究上也僅限于單一菌的疫苗，對(duì)有效地防治魚(yú)類(lèi)暴發(fā)性傳染病存在一定的局限。
本發(fā)明的目的是研究淡水魚(yú)類(lèi)暴發(fā)性傳染病的病原體，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出一種高效細(xì)菌二聯(lián)疫苗的制備工藝程序及其對(duì)魚(yú)體免疫的方法。
為實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，其總體技術(shù)方案和發(fā)明點(diǎn)是1、從罹病魚(yú)中分離、篩選、純化，確定了暴發(fā)性傳染病的主要致死的兩種病原體，即河弧菌CCTCC M96016和點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌CCTCC M96015。
河弧菌CCTCC M96016與Blosco E G，Amaro C(見(jiàn)前述背景文獻(xiàn))所描述的河弧菌I、I型不同43℃能生長(zhǎng)；發(fā)酵水楊苷產(chǎn)酸；利用D-葡糖酸鈣、腐胺；不能利用戊二酸、D-葡糖醛酸；從D-葡萄糖產(chǎn)氣；DNA中的G+C％為47(Tm)，故鑒定為河弧菌生物變種II(新生物變種)Vibrio fluvialisBiovar III.Blovar nov.。
點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌CCTCCM96015為產(chǎn)氣單胞菌屬中的運(yùn)動(dòng)性嗜中溫產(chǎn)氣單胞菌，按照國(guó)際細(xì)菌命名法規(guī)優(yōu)先律應(yīng)為點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌(Aeromonas Punctata)。
2、河弧菌CCTCC M96016和點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌CCTCC M96015二聯(lián)疫苗的制備。
3、免疫方法浸泡接種將魚(yú)置于盛有二聯(lián)疫苗及佐劑的容器中，通過(guò)魚(yú)體吸收接種。
注射接種逐條魚(yú)注射二聯(lián)疫苗接種。
本發(fā)明有以下顯著效果1、免疫保護(hù)率75％-80％，免疫保護(hù)期達(dá)一年。
2、直接對(duì)魚(yú)體免疫接種，費(fèi)用省，且不污染水體。
3、疫苗無(wú)刺激、無(wú)味、無(wú)毒，對(duì)人畜無(wú)害，安全可靠。
4、制備工藝較簡(jiǎn)單，易于工廠(chǎng)化生產(chǎn)。
5、使用方便，易于操作。
實(shí)施本發(fā)明的程序與步聚1、河弧菌CCTCC M96016疫苗和點(diǎn)狀產(chǎn)單胞菌CCTCC M96015疫苗的制備。
A、取河弧菌CCTCC M96016冷凍干燥菌種，接種于10毫升肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，28℃培養(yǎng)12小時(shí)；B、取A程序2毫升河弧菌菌液接種到1升肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，28℃培養(yǎng)12小時(shí)；
C、取B程序1升河弧菌液接種到30肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，28℃培養(yǎng)12小時(shí)；D、添加20％葡萄糖500毫升，繼續(xù)培養(yǎng)10-12小時(shí)；E、加入100毫升福爾馬林滅活；F、收獲河弧菌疫苗。
點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌CCTCC M96015疫苗制備程序和步聚與河弧菌CCTCC M96016疫苗制備相同。
肉湯培養(yǎng)基配方蛋白胨10克；牛肉膏5克；NaCl 3克；K2HPO42克；蒸餾水1000毫升PH7.2-7.42、二聯(lián)疫苗的制備方法取含菌體濕重1％-2％濃度的河弧菌CCTCC M96016疫苗和含菌體濕重1％-2％濃度的點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌CCTCC M96015疫苗按容量3∶2的比例混合、搖勻，收獲。置一20℃以下儲(chǔ)存。
3、對(duì)魚(yú)體免疫接種(1)浸泡接種取二聯(lián)疫苗于容器內(nèi)加池塘水稀釋400倍，加水稀釋前加入茛菪佐劑，茛菪加入量為終濃度0.01毫克/毫升，攪勻后將魚(yú)浸入疫苗稀釋液中浸泡接種15-30分鐘。浸泡魚(yú)的數(shù)量以不造成魚(yú)缺氧窒息為度。已接種的魚(yú)，放入養(yǎng)殖水體中。
(2)注射接種將二聯(lián)疫苗用0.85％無(wú)菌生理鹽水稀釋5倍，加入茛菪佐劑，使茛菪佐劑在注射液中的終濃度為0.01毫克/毫升，溶解搖勻后，用于魚(yú)體腹腔注射，用量10-13公分魚(yú)種0.1-0.2毫升/尾，接種后將魚(yú)放入養(yǎng)殖水體中。
經(jīng)生產(chǎn)魚(yú)池養(yǎng)殖試驗(yàn)，使用二聯(lián)疫苗采用浸泡接種方式免疫的3口魚(yú)池(每口7畝)，沒(méi)有發(fā)生暴發(fā)性傳染病，養(yǎng)殖存活率高達(dá)90-95％；而未經(jīng)免疫的魚(yú)池魚(yú)類(lèi)暴發(fā)性傳染疫嚴(yán)重發(fā)生，死亡率達(dá)40％。
實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)二聯(lián)疫苗魚(yú)體，采用注射接種效果優(yōu)于浸泡接種，使用者可根據(jù)具體情況選擇接種方式。
權(quán)利要求
1.淡水魚(yú)類(lèi)暴發(fā)性傳染病二聯(lián)疫苗的制備及免疫方法其特征在于A、疫苗的抗原是該傳染病的兩種病原細(xì)菌，河弧菌CCTCC M96016和點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌CCTCC M96015；B、用二聯(lián)疫苗對(duì)魚(yú)體浸泡接種、注射接種免疫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聯(lián)疫苗制備其特征在于A、取河弧菌冷凍干燥菌種，接種于肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，28℃培養(yǎng)12小時(shí)，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，接種到30升肉湯培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)12小時(shí)，添加20％葡萄糖液500毫升繼續(xù)培養(yǎng)10-12小時(shí)，用福爾馬林滅活，收獲疫苗。取點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌CCTCC M96015冷凍干燥菌種，以河弧菌CCTCC M96016疫苗制備的同樣程序制備點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌疫苗。B、取含菌體濕重1％-2％濃度的河弧菌CCTCC M96016和菌體濕重1％-2％濃度的點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌CCTCC M96015疫苗按容量3∶2的比例混合，收獲，置-20℃以下儲(chǔ)藏。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫方法其特征在于可選擇浸泡接種或注射接種浸泡接種，取二聯(lián)疫苗于容器中，加入茛菪佐劑，再加入池塘水， 使疫苗稀釋400倍，茛菪加入量為終濃度0.01毫克/毫升，攪勻后將魚(yú)投入容器內(nèi)浸泡接種疫苗15-30分鐘。注射接種，將二聯(lián)疫苗用0.8 5％無(wú)菌生理鹽水稀釋5倍，加入茛菪佐劑，使其終濃度為0.01毫克/毫升，溶解搖勻后，用注射器向魚(yú)體腹腔注射，用量為10-13公分的魚(yú)種0.1-0.2毫升/尾。
全文摘要
淡水魚(yú)類(lèi)暴發(fā)性傳染病二聯(lián)疫苗的制備及免疫方法。本發(fā)明主要包括用菌體濕重1-2％濃度的河弧菌CCTCC M96016疫苗和菌體濕重1-2％濃度的點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌CCTCC M96015疫苗按3∶2比例混勻制成二聯(lián)疫苗以及在使用前加入莨菪佐劑對(duì)魚(yú)體進(jìn)行浸泡和注射接種的兩種免疫方法。二聯(lián)疫苗制備工藝簡(jiǎn)單，易操作，不污染水體，對(duì)人畜無(wú)害；免疫保護(hù)期一年，免疫保護(hù)率75-80％。
文檔編號(hào)A61K39/106GK1156625SQ9611966
公開(kāi)日1997年8月13日 申請(qǐng)日期1996年10月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月24日
發(fā)明者徐伯亥, 李偉, 殷戰(zhàn), 蔡桃珍, 吳玉深 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所