專利名稱：：微小隱孢子蟲雙價蛋白疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了一種微小隱孢子蟲雙價蛋白疫苗，用于隱孢子蟲病的預(yù)防和治療，同時還提供了該疫苗的的制備方法，屬于傳染病疫苗制備
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種人畜共患的寄生性原蟲，主要寄生于人和其它哺乳動物的胃腸道、禽類的呼吸道等粘膜的上皮細胞內(nèi)，由它引起的疾病稱隱孢子蟲病。隱孢子蟲病分布廣泛，人畜感染率高，且危害嚴重，臨床上以嚴重水樣腹瀉為主要特征。在艾滋病人中隱孢子蟲感染率可達到10%50%，是艾滋病人的主要致死因素之一。在所有的隱孢子蟲種類中，以微小隱孢子蟲對人類健康危脅最大，美國CDC把微小隱孢子蟲列為B類生物武器。該病是今后醫(yī)學和獸醫(yī)學界防治的重要寄生蟲病。雖經(jīng)多年研究，迄今尚無有效的防治藥物以及預(yù)防辦法，己篩選了200多種藥物，包括所有的抗生素、抗球蟲藥和磺胺類藥物用于該病的治療，但沒有特效的藥物可以起到對隱孢子蟲的殺滅作用。隱孢子蟲的感染特點與免疫功能密切相關(guān)，宿主感染隱孢子蟲后其病情輕重、病程長短，治療效果可能主要取決于機體的免疫狀態(tài)。因此，免疫干預(yù)可能是控制隱孢子蟲病更合適的途徑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種微小隱孢子蟲雙價蛋白疫苗，是抗微小隱孢子蟲的新型疫苗，對于隱孢子蟲病的預(yù)防和治療有明顯效果。本發(fā)明還提供了該疫苗的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的微小隱孢子蟲雙價蛋白疫苗，其特征在于以原核表達載體pET28a為載體，將兩個微小隱孢子蟲保護性抗原基因串聯(lián)插入到pET28a原核表達載體的多克隆位點區(qū)，獲得了微小隱孢子蟲雙價蛋白疫苗。本發(fā)明微小隱孢子蟲雙價蛋白疫苗的制備工藝，包括以下步驟根據(jù)微小隱孢子蟲保護性抗原基因序列的開放性閱讀框設(shè)計引物進行PCR，TA克隆。將所得的兩個保護性抗原基因串聯(lián)克隆入原核表達載體pET28a載體，構(gòu)建微小隱孢子蟲雙價重組蛋白疫苗。用IPTG誘導表達，產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳、Westernblot分析表達產(chǎn)物的活性。重組蛋白經(jīng)純化后，進行動物保護性試驗效果驗證。雙價蛋白疫苗的具體制備工藝，包括以下步驟將CP12、CP21目的基因分別與T載體進行連接，克隆測序正確后，分別用^/z^/、fcoA7和^boA7、X力W進行雙酶切反應(yīng)，回收片段與經(jīng)過及做#/和屈W雙酶切反應(yīng)的原核表達載體pET-28a進行連接，構(gòu)建pET28-CP12-CP21重組載體。本發(fā)明的積極效果在于選用了兩個保護性抗原基因串聯(lián)進行了雙價蛋白疫苗的研制，以增強其免疫保護效果。微小隱孢子蟲蛋白疫苗能引起機體較強的細胞免疫和體液免疫反應(yīng)，且本研究引入的兩個基因又均是優(yōu)勢保護性抗原基因，因此會產(chǎn)生更為強烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而可以達到更好的預(yù)防動物微小隱孢子蟲病的目的。圖l:為pET28-CP12-CP21載體構(gòu)建示意圖2:為重組蛋白的SDS-PAGE及Westernblotting鑒定圖3:為蛋白疫苗對免疫小鼠抗微小隱孢子蟲感染的保護作用。表1:為各組小鼠血清特異性抗體IgG滴度變化情況表2:為試驗組和對照組小鼠脾臟CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)量具體實施例方式實施例l微小隱孢子蟲雙價蛋白疫苗的制備本發(fā)明以微小隱孢子蟲免疫相關(guān)蛋白基因CP12、CP21為例，進行重組原核表達載體的構(gòu)建。微小隱孢子蟲雙價蛋白疫苗的制備步驟參照CP12、CP21基因序列開放性閱讀框及原核表達載體pET28a物理圖譜設(shè)計引物并引入酶切位點。CP12上游引物QF1:5，-CTGGATCCATGTCAGATGCATCMTA-3，;其中5、端含有及^/7/位點；下游引物QR1:5'-GGGGCGAATTCTATTTGTTCATTCATCTG-3，;5'端含有CP21上游引物QF2:5，-CCGAATTCGGTGGCGGTGGCTCGATGTCTAAAAGAGCAT—3，其中5、端含有^:^/位點以及Linker序列；下游引物QR2:5，-CTGGCTCTCGAGCTATTCATCTGTTTGAAC-3，;5、端含有勘/位點。利用上述引物序列進行PCR反應(yīng)(通用參數(shù)為94°C4min;94°C45s，55°C50s，72°Clmin，30個循環(huán)后于72。C延伸10min)，將各個PCR純化產(chǎn)物克隆分別至PMD18-T載體，經(jīng)PCR及相對應(yīng)的酶切鑒定后，送去生物公司測序鑒定。凝膠回收各個目的片段然后與用勘7Z^/^X^/進行雙酶切的原核表達載體pET28a連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡cWiDH5a感受態(tài)細胞后篩選重組質(zhì)粒，用^M7〃7^i7o/進行雙酶切反應(yīng)鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DE3感受態(tài)用fe/^/和屈o/進行雙酶切反應(yīng)鑒定，將重組質(zhì)粒命名為pET28-CP12-CP21(如附圖l所示)。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒用IPTG誘導表達，產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳、Westernblot分析表達產(chǎn)物的活性，并將所表達出的目的蛋白通過親和層析的方法進行純化(如附圖2所示)。實施例2微小隱孢子蟲雙價蛋白疫苗的用途一、微小隱孢子蟲雙價蛋白疫苗的用途將60只46周齡，1822g的雌性清潔級BALB/c小鼠分成3組，每組20只，試驗組經(jīng)腹腔注射重組蛋白，共免疫三次，每次間隔2周，第一次免疫用0.lmL抗原溶液(含20yg重組蛋白)與等體積弗氏完全佐劑乳化后腹腔注射；第二次和第三次免疫用0.lmL抗原溶液(含20pg重組蛋白)與等體積弗氏不完全佐劑乳化后腹腔注射。佐劑對照組(NegativecontrolB)腹腔注射與試驗組等量的弗氏佐劑，第一次注射弗氏完全佐劑，第二次和第三次注射弗氏不完全佐劑。空白對照組腹腔注射PBS(NegativecontrolA)。三免后一周口服接種微小隱孢子蟲卵囊lX106個/只進行攻蟲試驗，攻蟲后每隔兩天收集各組糞便，用飽和硫酸鋅浮集法收集卵囊，將沉淀溶于一定量的水中，混勻后，取一滴置于血細胞計數(shù)板中，在低倍鏡下記數(shù)隱孢子蟲卵囊總數(shù)。同時進行體液和細胞免疫水平的檢測。于每次免疫前尾靜脈采血，分離血清，用微小隱孢子蟲卵囊抗原作為包被抗原，通過間接ELISA方法對鼠血清中IgG變化情況進行檢測。第三次免疫后l周，每組隨機各取4只小鼠放血處死，取脾臟，力Q2mLPBS，在200目篩上研磨，用PBS稀釋成細胞懸液(K)7個/mL)。取100uL細胞懸液，加FITC標記的抗CD4+和￡標記的抗008+兔抗鼠單克隆抗體，避光作用40min，然后用PBS洗液洗2遍，加入O.5mL熒光保存液，用流式細胞儀檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞的數(shù)量，并用SPSS軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。免疫保護性試驗結(jié)果顯示試驗組免疫保護率明顯優(yōu)于陰性對照組，排出的卵囊明顯減少，排出時間也縮減(見附圖3)。體液免疫檢測結(jié)果證實一免后實驗組與對照組相比IgG滴度變化不大。二免、三免后IgG滴度逐漸上升，攻蟲后實驗組抗體效價到最高，與陰性對照組相比差異極顯著(P<0.01)(見附表l)。細胞水平免疫檢測結(jié)果表明免疫組004+、CD8+變量明顯高于陰性對照組，與陰性對照組差異均極顯著(P〈0.01)(見附表2)。表1各組小鼠血清特異性抗體IgG滴度變化情況組別一免二免三免攻蟲PBS0.187±0.0290.213±0.0260.225±0.050.389±0.016佐劑對照組0.169±0.0540.177±0.0370.108±0.0320.312±0.034實驗組0.133±0.020.634±0.1580.732±0.1531.139±0.1897表2試驗組和對照組小鼠脾臟CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>綜合上述實驗結(jié)果，本發(fā)明的微小隱孢子蟲雙價蛋白疫苗pET28-CP12-CP21,對微小隱孢子蟲免疫保護率較高，可以用來作為微小隱孢子蟲病的預(yù)防和治療性疫苗。權(quán)利要求1、一種微小隱孢子蟲雙價蛋白疫苗，其特征在于以原核表達載體pET28a為載體，將兩個微小隱孢子蟲保護性抗原基因串聯(lián)插入到pET28a原核表達載體的多克隆位點區(qū)，獲得疫苗。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的微小隱孢子蟲保護性抗原基因為CP12和CP21。3、權(quán)利要求l所述雙價蛋白疫苗的制備工藝，是通過工藝實現(xiàn)的根據(jù)微小隱孢子蟲保護性抗原基因序列的開放性閱讀框設(shè)計引物進行PCR，TA克隆。將所得的兩個保護性抗原基因串聯(lián)克隆入原核表達載體pET28a載體，構(gòu)建微小隱孢子蟲雙價重組蛋白疫苗。4、權(quán)利要求2所述雙價蛋白疫苗的制備工藝，包括以下步驟將CP12、CP21目的基因與T載體進行連接，分別用及湖#/、和fcoA7、i%o7進行雙酶切反應(yīng)，回收片段與經(jīng)過及柳7/和屈o7雙酶切反應(yīng)的原核表達載體pET-28a進行連接，構(gòu)建pET28-CP12-CP21重組載體。全文摘要本發(fā)明提供一種微小隱孢子蟲雙價蛋白疫苗，其特征在于以原核表達載體pET28a為載體，將兩個微小隱孢子蟲保護性抗原基因串聯(lián)插入到pET28a原核表達載體的多克隆位點區(qū)，獲得了微小隱孢子蟲雙價蛋白疫苗。本發(fā)明疫苗選用了兩個優(yōu)勢保護性抗原，兩者優(yōu)勢組合，能夠引起機體更強的細胞免疫和體液免疫作用，從而可以達到更好的預(yù)防動物微小隱孢子蟲病的目的。文檔編號A61K39/015GK101658667SQ200910066479公開日2010年3月3日申請日期2009年1月16日優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日發(fā)明者于欽磊,宮鵬濤,張西臣,李建華,李淑紅,舉楊申請人:吉林大學