專利名稱：由二氧化三碳單元制成的大環(huán)化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有生物調(diào)節(jié)活性的大環(huán)物質(zhì)，它們的合成方法，以及從多種原料中分離它們的方法。本申請(qǐng)還描述了這些活性物質(zhì)本身或與其它活性物質(zhì)結(jié)合在酶調(diào)節(jié)和生物調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物化學(xué)過程的某些途徑和生物免疫機(jī)理的最佳功能是由大量生物調(diào)節(jié)活性物質(zhì)來保證的(Rompp Lexikon，《調(diào)節(jié)(Regulation)》，3826頁)。從化學(xué)觀點(diǎn)來看，至今所知的生物調(diào)節(jié)活性物質(zhì)有肽類，碳水化合物，甾類化合物或脂類，而且這些結(jié)構(gòu)單元可以同時(shí)出現(xiàn)(例如，糖肽，脂蛋白)。而且，生物調(diào)節(jié)活性物質(zhì)在治療一種或多種這些調(diào)節(jié)機(jī)理功能紊亂引起的疾病方面的應(yīng)用是已知的。甾類荷爾蒙，皮質(zhì)甾類和強(qiáng)心苷類，以及生長(zhǎng)荷爾蒙或血凝固因子的治療用途是這種情況許多實(shí)例中的幾個(gè)。但是，采用這類物質(zhì)的藥物療法常常伴有破壞性副作用，因此，其應(yīng)用受到很大限制。這方面的細(xì)致研究詳見Goodman和Gilman的《治療的藥理學(xué)基礎(chǔ)(The PharmacologicalBasis of Therapeutics)》，第8版，New York，1991。例如，用強(qiáng)心苷，增強(qiáng)收縮力這樣有用的治療作用會(huì)伴有心臟中毒副作用，結(jié)果，治療劑量必須非常嚴(yán)格地限制。作為其它例子可以提及皮質(zhì)甾類的應(yīng)用，但由于其一系列非常嚴(yán)重的副作用如肌病，骨質(zhì)疏松，精神紊亂，感染的敏感性增加等，所以只建議在非常嚴(yán)重的情況下進(jìn)行治療使用，而且只能用有限的時(shí)間。
盡管在用免疫調(diào)節(jié)活性物質(zhì)治療免疫學(xué)引起的病癥方面作出了很大努力，但以前的臨床試驗(yàn)仍不能使人信服。這種免疫治療應(yīng)用的目的是要實(shí)現(xiàn)對(duì)自身免疫疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化等疾病的根本性治療，因?yàn)橹两襁€沒有發(fā)現(xiàn)根治的辦法。根據(jù)E.Sercarz和S.K.Datta的“自身免疫性(Autoimmunity)”，《現(xiàn)代生物學(xué)(Current Biology)》，6，pp.875-881(1995)所述，這些自身免疫疾病幾乎都是由免疫調(diào)節(jié)紊亂引起的。為了戰(zhàn)勝這些以免疫系統(tǒng)相當(dāng)脆弱為特征的嚴(yán)重病癥如癌癥或AIDS，以前的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的治療作用收效甚微。
一些生物調(diào)節(jié)肽和蛋白質(zhì)已經(jīng)在M.J.Clemens的《細(xì)胞因子(Cytokines)》，Oxford 1991的專題著作中報(bào)道過其特征。在不同癌癥，自身免疫疾病和病毒感染(包括AIDS)中起著重要作用的細(xì)胞因子已經(jīng)被報(bào)道過多次。盡管如此，這些物質(zhì)和其它生物調(diào)節(jié)蛋白和肽的廣泛治療應(yīng)用仍缺乏向更大范圍推廣。其中原因之一某種程度上常常是因?yàn)榉浅ＹM(fèi)力的生產(chǎn)技術(shù)從只存在非常少量生物調(diào)節(jié)活性物質(zhì)的人或動(dòng)物組織液中提取然后純化生物調(diào)節(jié)活性物質(zhì)完全不適于提供治療所需的量。用基因技術(shù)生產(chǎn)生物調(diào)節(jié)多肽或糖蛋白對(duì)于人類治療意味著過敏性副作用和/或過敏反應(yīng)(盡管它們很少出現(xiàn))的相當(dāng)冒險(xiǎn)因素的危險(xiǎn)仍然存在。幾種“體外”高活性多肽因子的治療應(yīng)用的根本問題由事實(shí)證明它們?cè)凇绑w內(nèi)”完全不同，幾乎只有非常弱的活性。一方面，大量生理和酶的障礙妨礙了外部給藥的肽和蛋白質(zhì)到達(dá)病理作用發(fā)生部位(炎癥的病灶，癌癥的潰瘍部位等)。另一方面，它們很快被內(nèi)源性酶和那里存在的其它因素中和和代謝掉。用活性物質(zhì)天然肽，糖肽和糖苷口服給藥，事實(shí)證明經(jīng)過幾次降解過程這些物質(zhì)對(duì)腸胃系統(tǒng)實(shí)際上是無效的。
但是，生物調(diào)節(jié)活性物質(zhì)天然肽或糖肽相對(duì)快的降解過程也必須考慮到其“口服”傳遞。為了在病理作用發(fā)生或出現(xiàn)的部位如在炎癥的病灶或在癌癥的潰瘍部位完全達(dá)到治療有效的濃度，例如，已經(jīng)采用了活性物質(zhì)隱蔽傳遞的方式。R.Collier和D.Kaplan的《免疫毒素(Immuntoxine)》，Heidelburg 1988中對(duì)最終可能用來結(jié)合單克隆抗體(藥物打靶)的毒素的用途已有類似的描述。但是，治療技術(shù)仍然非常復(fù)雜，而且只能限制性地用于某些特定的情況。對(duì)于調(diào)節(jié)活性物質(zhì)，生物可利用度不僅依賴于穩(wěn)定性，而且依賴于純物理過程如溶解性和膜的滲透性。這就要考慮使親油物質(zhì)在血漿中有水溶性或使親水活性成分如Na+或K+離子有膜滲透性。例如，鉀離子正常情況下不能滲透線粒體膜。大環(huán)抗生素如無活菌素或真菌霉素使其能透過相應(yīng)離子的有機(jī)膜。
1967年(即發(fā)現(xiàn)“冠醚”的那年)以來已經(jīng)生產(chǎn)出大量新的化合物，這些化合物具有大環(huán)結(jié)構(gòu)，并形成了可能套住無機(jī)離子或較小分子的冠狀或穴狀結(jié)構(gòu)。但是，這種隱蔽形成的大環(huán)物質(zhì)的直接治療應(yīng)用的重要前提條件是低毒性和良好的生物同化作用，而這一點(diǎn)很難由合成的穴狀配體試劑完成。
許多基本的生物調(diào)節(jié)機(jī)理是由所謂鈉泵控制的。酶有將鈉離子從細(xì)胞內(nèi)泵送到細(xì)胞外部同時(shí)將鉀離子向相反方向傳送的能力。能量消耗是由三磷酸腺苷(ATP)的偶合水解傳遞的。該泵與被稱作Na+，K+-ATP酶(ATPase)的酶一致，而且其分布無處不有。幾種重要的細(xì)胞功能都受Na+，K+-ATP酶控制，如細(xì)胞體積，熱量的產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+離子濃度，神經(jīng)元的傳導(dǎo)，肌肉收縮或膜電位。
在大量免疫調(diào)節(jié)過程中一些重要的相也是由Na+，K+-ATP酶控制的，因此，鈉泵在免疫調(diào)節(jié)中也起重要作用。盡管對(duì)這種酶的總體分布，意義和調(diào)節(jié)機(jī)理還不是很清楚。人們認(rèn)為該酶的所謂“強(qiáng)心苷受體部位”是鈉泵生物調(diào)節(jié)所在功能位置。幾種植物中存在的強(qiáng)心苷以高親和力連接在該部位，不僅發(fā)揮它們的強(qiáng)心劑作用，而且也有使心臟中毒。但是，它們的毒性證明它們與該酶的內(nèi)源性配位體不一致。W.Schoner在《藥物研究的進(jìn)展(Progress in Drug Research)》，41，249-291(1993)上發(fā)表論文“內(nèi)源性毛地黃類因子(Endogenousdigitalis-like factors)”稱盡管已經(jīng)作了大量的研究，但還不能建立這些內(nèi)源性生物調(diào)節(jié)物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)。至今，還沒能從動(dòng)物組織和體液中分離出充足數(shù)量的內(nèi)源性因子來確定其準(zhǔn)確的特性和結(jié)構(gòu)。Na+，K+-ATP酶活性以及幾種生物調(diào)節(jié)機(jī)理可由與這些內(nèi)源性配位體一致或結(jié)構(gòu)上相似的因子有效地控制。
近來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種參與生物調(diào)節(jié)過程的簡(jiǎn)單的無機(jī)物。但是，值得注意的是所有這些無機(jī)物僅被用作簡(jiǎn)單的信使物或效應(yīng)物。它們主要缺乏發(fā)揮生物調(diào)節(jié)作用所必需的三維結(jié)構(gòu)和與其偶合所需的結(jié)構(gòu)特殊作用的能力。S.Snyder和D.Bredt在《美國(guó)科學(xué)(ScientificAmerican)》，1992(5)，22-29上發(fā)表論文“一氧化氮的生物作用”說這種氣體化合物是控制非特定免疫反應(yīng)的功能效應(yīng)物。在有機(jī)體中，一氧化氮的壽命非常短，為的是發(fā)揮其定位和最大毒性作用，而且總是“當(dāng)場(chǎng)”生成。如果免疫系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞即所謂巨噬細(xì)胞被細(xì)菌毒素或細(xì)胞因子活化，數(shù)小時(shí)內(nèi)它們可以產(chǎn)生相當(dāng)大量的一氧化氮，因此這被用作免疫武器。假設(shè)更簡(jiǎn)單的氣體化合物也參與生物調(diào)節(jié)過程，例如，已知乙烯是植物生物學(xué)中的重要因素。A.Verma在《科學(xué)(Science)》，259，381(1993)中發(fā)表論文稱一氧化碳也參與鳥苷一磷酸(GMP)環(huán)化的生理調(diào)節(jié)過程。
迄今為止，很少有關(guān)其它碳氧化物生物作用的報(bào)道，關(guān)于C3O2的更是少得可憐?，F(xiàn)在只知道這種化合物在室溫是氣體(bp 7℃)，它刺激粘膜，有芥末油和丙烯醛氣味。二氧化三碳代表相當(dāng)強(qiáng)的不可逆結(jié)血紅蛋白的血液毒素；對(duì)于小鼠，干空氣中C3O2濃度可以忍受的極限是0.2-0.4％。C3O2與水反應(yīng)形成丙二酸。但是，如果沒有痕量無機(jī)酸，該反應(yīng)就不能進(jìn)行得象前面所述的那樣快。從一氧化碳這方面考慮，人們認(rèn)為原始還原的地球大氣中也含有大量C3O2。而且最近H.Huntress等人在《自然(Nature)》，352，316-318(1991)中提供了在星際空間可能存在C3O2的證據(jù)。但是，直到現(xiàn)在，還沒有人提供在生物體液中可能存在C3O2的確鑿證據(jù)。考慮到單體氣體以及非晶態(tài)聚合物對(duì)水的敏感性，事先幾乎已經(jīng)排除了其可能具有生物作用。如果水反應(yīng)性非晶態(tài)聚合物是簡(jiǎn)單無機(jī)化合物原始合成可能的原料的話，則可以認(rèn)為H.Yanagawa和F.Egami在《前寒武紀(jì)研究(Precambrian Research)》，14，75(1981)中的假設(shè)基本上是可能的。
氣態(tài)C3O2或多或少很快地變成由黃轉(zhuǎn)深紅棕色的非晶態(tài)聚合物。人們對(duì)這些聚合物結(jié)構(gòu)的了解非常有限?？傊鼈儽幻枋鰹樵缙诒幻麨椤凹t碳”的非均勻非晶態(tài)物質(zhì)。二氧化三碳及其聚合物的化學(xué)性質(zhì)見T.Kappe和E.Ziegler在《Agnew.Chem.》，86，529(1974)上發(fā)表的論文。聚合產(chǎn)物部分溶于水或稀堿液，形成深黃色到深棕色溶液。已經(jīng)給這些非晶態(tài)不規(guī)則聚合物提出了幾個(gè)理想方程式，但它們沒有一個(gè)能用實(shí)驗(yàn)證明。由于概率最大的石墨類六方晶格結(jié)構(gòu)被認(rèn)為在周邊是不飽和的，而且必須相應(yīng)的不穩(wěn)定。該假設(shè)在N.S.Smith和D.A.Young在《無機(jī)化學(xué)(Inorganic Chemistry)》，2，829(1963)上發(fā)表的論文中有詳細(xì)的描述。
人們還知道，在血漿中還沒有象發(fā)現(xiàn)螯合物那樣發(fā)現(xiàn)什么生物高效物質(zhì)。例如，甾類荷爾蒙在血漿中以它們的硫酸鹽或葡糖醛酸鹽螯合物形式存在，它們的降解產(chǎn)物也是降解成螯合物。這些螯合的甾類常常表現(xiàn)出比純活性物質(zhì)更好的治療性能，正如US 2,565,115和US2,720,483所描述的螯合的雌激素甾類或硫酸脫氫表雄甾酮(DHEAS)。上述螯合作用調(diào)節(jié)這些甾類活性物質(zhì)的生物可利用度和同化作用，同時(shí)可以解釋改進(jìn)的治療性能。關(guān)于通過形成相應(yīng)的螯合物來調(diào)節(jié)多肽活性物的生物可利用度我們知道的還相對(duì)較少。蛋白質(zhì)與遍及在蛋白的酶螯合也有調(diào)節(jié)功能，如《生物化學(xué)科學(xué)的趨勢(shì)(Trends Biochemical Sciences)》，15，195(1990)中所述。多肽物質(zhì)的適當(dāng)螯合可以使這些活性物在治療應(yīng)用方面有所突破。查找遲鈍作用胰島素是要提及的已知范例。已知添加鋅鹽或硫酸魚精蛋白可以大大延長(zhǎng)胰島素的治療作用時(shí)間。但是，這些添加物可以引起不同的副作用。很多發(fā)明者都試圖提供能夠確保延遲胰島素釋放的適當(dāng)螯合物，但至今還未能實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明說明發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明的目的是提供具有生物調(diào)節(jié)活性的新大環(huán)物質(zhì)，它們沒有上述缺點(diǎn)并且使人們發(fā)現(xiàn)疾病對(duì)生物調(diào)節(jié)機(jī)理干擾。此外，該活性物能明顯改善治療效果和已知藥物的生物可利用度。
本發(fā)明目的由權(quán)利要求1-39中39個(gè)特征實(shí)現(xiàn)。
圖的簡(jiǎn)單說明

圖1水中com-(C3O2)6的電離質(zhì)譜。
圖2com-(C3O2)6·(NH3)2和com-(C3O2)6·(NH3)6胺復(fù)合物的電噴質(zhì)譜。
圖3n＝558的com-(C3O2)n的多電荷單元的LC偶合電噴質(zhì)譜。
圖4com-(C3O2H)60和com-(C3O2H)72的MALDI質(zhì)譜。
圖5com-(C3O2)10的KBr粒的紅外光譜。
圖6水中com-(C3O2)6的UV-VIS吸收譜。
圖7活性物混合物的HP膠滲透色譜和柱的分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
結(jié)構(gòu)說明本發(fā)明物質(zhì)是通過環(huán)齊聚合作用從簡(jiǎn)單無機(jī)二氧化三碳C3O2建立起框架結(jié)構(gòu)的化學(xué)化合物。雖然二氧化三碳O＝C＝C＝C＝O本身和由它形成的非晶態(tài)聚合物是已知的反應(yīng)性水敏感性物質(zhì)，但發(fā)明者還是驚訝地獲得了特別的水穩(wěn)定性環(huán)齊聚物二氧化三碳的結(jié)構(gòu)。它們的水穩(wěn)定性的基本前提條件是這些結(jié)構(gòu)中不再含有二氧化三碳反應(yīng)性積累的C＝C和C＝O雙鍵。這可以根據(jù)本發(fā)明解決，使得幾個(gè)，優(yōu)選4，6，8或10個(gè)二氧化三碳分子被環(huán)化成縮合的4-吡喃酮或2-吡喃酮環(huán)，并且，這些結(jié)構(gòu)還以雙株大環(huán)緊密相連。
本質(zhì)上這些結(jié)構(gòu)不是由環(huán)齊聚二氧化三碳構(gòu)成的，而且不是有機(jī)化合物?？梢哉J(rèn)為這些結(jié)構(gòu)及其二氧化三碳屬于無機(jī)化學(xué)范疇。
與大環(huán)緊密相連的環(huán)齊聚物二氧化三碳的結(jié)構(gòu)的化學(xué)式如下com-(C3O2)n其中n代表C3O2環(huán)齊聚合作用的度，com表示上述連接這些單元的具體的環(huán)齊聚物和大環(huán)(cyclooligomeric andmacroring)。
另外，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，在與大環(huán)緊密相連的環(huán)齊聚物的無數(shù)原則上可能的結(jié)構(gòu)中，只有很少幾個(gè)n值是特別穩(wěn)定的。這些環(huán)齊聚物大環(huán)結(jié)構(gòu)中優(yōu)選n等于4，6或10，或者在式com-(C3O2)n中n是4，6或10的倍數(shù)。
具有較大優(yōu)選n值的本發(fā)明活性物質(zhì)也可以認(rèn)為是多個(gè)較小的式com-(C3O2)n環(huán)齊聚物二氧化三碳單元的集合。這里定義的由二氧化三碳構(gòu)成的一系列環(huán)齊聚物和大環(huán)的第一個(gè)成員有下面詳述的非常重要的性質(zhì)環(huán)六聚物二氧化三碳com-(C3O2)6用質(zhì)譜儀實(shí)驗(yàn)測(cè)定的摩爾質(zhì)量M＝408.19對(duì)應(yīng)于式C18O12，同時(shí)對(duì)應(yīng)于二氧化三碳摩爾質(zhì)量M＝68.032的六倍。至于結(jié)構(gòu)，幾種可能的異構(gòu)體是可以想象的，例如，縮合的2-吡喃酮環(huán)或頭對(duì)頭縮合的4-吡喃酮環(huán)，或下面指出的有6種變化形式的頭對(duì)尾縮合的4-吡喃酮環(huán)結(jié)構(gòu)，提出該假設(shè)最大的可能性是基于譜和其它性質(zhì)。
推測(cè)實(shí)際的電子分布位于這里用PYRON(吡喃酮)和PYRYLIUM(吡喃鎓)表示的有限結(jié)構(gòu)之間，但可以使溶劑和介質(zhì)依賴其它或多或少極化的互變異構(gòu)電子結(jié)構(gòu)。羥基-吡喃和吡喃鎓鹽衍生物一些通式為(C3O2)6·H1-6的環(huán)六聚物二氧化三碳的還原衍生物可以在質(zhì)譜中見到(圖1)。在水溶液中本發(fā)明活性物質(zhì)還可以羥基-吡喃衍生物形式存在。由添加幾倍的氫形成的還原的羥基-吡喃衍生物的通式為com-(C3O2)n·Hm其中，鍵合氫原子的數(shù)量m受環(huán)外氧原子數(shù)量n的限制，即m≤n。
如果完全還原的羥基-吡喃衍生物為式com-(C3O2)6環(huán)六聚物其摩爾質(zhì)量M＝414.24，對(duì)形成無機(jī)和有機(jī)衍生物特別重要，而且，與com-(C3O2)6一起是形成自締合物和不同衍生物的環(huán)六聚物中的基本單元。假設(shè)的環(huán)六聚物二氧化三碳com-(C3O2)6的4-羥基-吡喃結(jié)構(gòu)如下
總之，強(qiáng)離子試劑象酸或堿以及幾種容易離解的鹽的存在使人們認(rèn)為可以形成有陰離子An和陽離子Ka的吡喃鎓鹽化合物。由本發(fā)明活性物質(zhì)與酸，堿和通式Ka·An的鹽化合物形成吡喃鎓鹽衍生物的化學(xué)式是com-(C3O2)n·KanAnn其中Ka和An是陽離子和陰離子平衡離子，這些離子中和吡喃鎓結(jié)構(gòu)上的2n個(gè)兩性電荷。吡喃鎓鹽化合物的結(jié)構(gòu)可以表示如下，其中平衡離子不一定位于水溶液中。
陰離子An和陽離子Ka平衡離子可以下列形式存在-單個(gè)和均一的無機(jī)或有機(jī)陽離子和陰離子，例如，所有Ka＝Na+和所有An＝Cl-，-無機(jī)或有機(jī)陽離子和陰離子的混合物，例如，相互關(guān)系對(duì)應(yīng)于這些離子的生理濃度，或-本身含有平衡離子如氨基酸，甜菜堿，離子皂的兩性離子化合物。
在水中，本發(fā)明活性物質(zhì)的吡喃鎓鹽衍生物幾乎完全溶解。具有陰離子如硫酸鹽的氯化物的吡喃鎓鹽在丙酮或乙醇中的溶解性較低，但也可用于本發(fā)明所述活性物質(zhì)的分離。在生理流體中活性物質(zhì)的兩性電荷被那里存在的陰離子和陽離子中和。因此，平衡離子的統(tǒng)計(jì)分布比某些離子的化學(xué)統(tǒng)一的鹽化合物更適合所說情況。
與金屬離子，優(yōu)選過渡金屬離子如Fe(III)，Sb(III)，Cd(II)，Pt(II)，Au(III)，Pb(IV)形成的某些復(fù)合物可用于本發(fā)明化學(xué)物質(zhì)的分離和檢測(cè)。與復(fù)合無機(jī)或有機(jī)陰離子如SCN-，BF4-，Cr2O72-，MnO4-，苦味酸根，雷納克酸根形成的化合物也可用于分離和檢測(cè)。加合物，螯合物具有無機(jī)元素或有機(jī)化合物的分子加合物的形成是由本發(fā)明二氧化三碳構(gòu)成的環(huán)齊聚物和大環(huán)的強(qiáng)締合能力促成的。具有有機(jī)化合物的化學(xué)計(jì)量的或非化學(xué)計(jì)量的加合物被稱為螯合物。二氧化三碳構(gòu)成的環(huán)齊聚物和大環(huán)可以與下列幾種情況形成穩(wěn)定的加合物-優(yōu)選2-6個(gè)環(huán)六聚物，-氨分子，有機(jī)胺，氨基酸，肽類或其它有胺功能的物質(zhì)。天然氨基酸，生物胺和它們有胺功能的衍生物尤其屬于本發(fā)明范圍。這些胺加合物的通式為com-(C3O2)n·(R1R2R3N)m其中R1，R2和R3分別是氫原子或有機(jī)基團(tuán)，m是1-n的數(shù)，n的定義如上。
實(shí)驗(yàn)上，式com-(C3O2)6·(NH3)2表示的環(huán)六聚物的二胺加合物的摩爾質(zhì)量用ES質(zhì)譜儀測(cè)定結(jié)果為M＝442.2，式com-(C3O2)6·(NH3)6表示的六胺加合物的摩爾質(zhì)量為M＝510.4(圖2)。對(duì)于二胺加合物，兩個(gè)氨或胺分子極可能由氫鍵連到吡喃酮環(huán)的羰基上。由于在六胺復(fù)合物情況下已經(jīng)涉及到大環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部空腔，所以，也可以認(rèn)為它們是主-客復(fù)合物。主-客復(fù)合物本發(fā)明活性物質(zhì)第二個(gè)特別重要的結(jié)構(gòu)性質(zhì)是由這種方式實(shí)現(xiàn)的，即縮合的吡喃酮或羥基吡喃環(huán)另外形成本發(fā)明大環(huán)，優(yōu)選圓筒形大環(huán)。該環(huán)結(jié)構(gòu)的分子維數(shù)適合于形成本發(fā)明主-客這種發(fā)明。作為“客”，較小分子的元素或分子片斷被認(rèn)為在空間上要適合圓筒形空腔，和/或由特定的結(jié)合力連接到它們周圍的分子上。圓筒形大環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)六聚物二氧化三碳的形式和維數(shù)如下圖所示。
陽離子如鉀，銨，銀或銣，或陰離子如氟，氯，甲酸根或硫氰酸根非常合適內(nèi)徑2.9-3.2埃，高4.9-5.2埃的環(huán)六聚物大環(huán)的內(nèi)部圓筒形空腔。在本發(fā)明申請(qǐng)中，離子或天然元素或分子存在于com-(C3O2)6單元的圓筒形大環(huán)結(jié)構(gòu)的空腔中，并且被它包圍。質(zhì)譜儀測(cè)量的摩爾質(zhì)量對(duì)應(yīng)于各部分之和，證明這些主-客復(fù)合物是獨(dú)立的化合物。發(fā)明者實(shí)驗(yàn)證明了環(huán)六聚物二氧化三碳與較小無機(jī)或有機(jī)化合物，一般指與Y如氨，羥基胺，甲醇，乙醇，丙醇，丙酮，二氯甲烷，氯仿，乙酰膽堿，甲酸，乙酸以及幾種氨基酸和碳水化合物形成的主-客復(fù)合物的存在。根據(jù)本發(fā)明，物質(zhì)Y或其結(jié)構(gòu)的一部分在本發(fā)明活性物質(zhì)的內(nèi)部空腔中是以“客”的身份存在的，如下圖所示。
通過這種“包圍”使物質(zhì)Y的某些性質(zhì)被“罩住”，從而可以獲得新的本發(fā)明性質(zhì)如膜的傳輸性和生物利用度有所改善。不同摩爾量的活性物質(zhì)M≤2,000道爾頓上述式com-(C3O2)n表示的環(huán)齊聚物二氧化三碳或式com-(C3O2H)n表示的羥基-吡喃，其中n是4，6，10，12或18，以及它們的所有衍生物，加合物，摩爾量低于上述限制的主-客復(fù)合物都屬于這類低摩爾量物質(zhì)。由2-4個(gè)環(huán)六聚物單元形成的自締合物也被認(rèn)為是低摩爾量活性物質(zhì)。因此解釋了由發(fā)明者測(cè)定的摩爾量為M＝816 D的com-(C3O2)12和摩爾量為M＝1,224 D的com-(C3O2)18的存在。M＞2,000道爾頓首先，這里分類的活性物質(zhì)表現(xiàn)為多種摩爾量化合物的混合物。但是，更深入地分析證明，雖然原則上可以有無限多化合物，但實(shí)際上只有非常少量，即有特殊分子量的化合物能被得到和被測(cè)定。
水-乙腈溶液中的活性物質(zhì)的LC-MS，電噴質(zhì)譜(圖3)說明存在一系列多電荷離子(m/z)。所測(cè)最密部分A31的m/z＝1,225.7 D，精確地對(duì)應(yīng)于式為com-(C3O2)18的質(zhì)子化分子。借助式M＝n[m/z-1](J.R.Chapmann的《實(shí)用質(zhì)譜儀(Practical MassSpectrometry)》，第202頁，J.Wiley，New York，1993)測(cè)定相應(yīng)聚合物的實(shí)驗(yàn)?zāi)柫繛镸＝31×1,224.6＝37,962.6 D。
一些測(cè)定的化合物的摩爾量列于下面表中。
注釋*已知標(biāo)準(zhǔn)作為對(duì)比**用MALDI得到的三個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)量的平均值測(cè)量借助于MALDI質(zhì)譜儀(MS)，凝膠滲透色譜(GP)或聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進(jìn)行。MALDI質(zhì)譜(圖4)的結(jié)果證明，存在的相應(yīng)n＝60，特別是n＝72的化合物其濃度明顯大于所有其它化合物。用這種方法測(cè)定的摩爾量精度上與n＝60和n＝72的式com-(C3O2H)n羥基-吡喃低聚物符合地非常好。這些化合物既可以認(rèn)為是n＝60和n＝72的環(huán)齊聚物，也可以看成是s＝10或s＝12個(gè)環(huán)六聚物基本單元{com-(C3O2H)6}s的自締合物。這些化合物com-(C3O2H)60和com-(C3O2H)72的生理化學(xué)和分光性質(zhì)表明了結(jié)構(gòu)高度對(duì)稱，這些可以用，例如，10，12或更多個(gè)com-(C3O2H)6單元的球形排列說明。五角形或六角形對(duì)稱的夾層排列也可以說明大量?jī)尚噪姾傻闹泻妥饔谩?br> 借助于聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在M≈5kD區(qū)域和摩爾量約為10kD，12.5kD，15kD，30kD，60kD和120kD的其它任意地帶有很強(qiáng)的帶。這些符合低聚合作用度n＝72，144，180，216，432，864和1,728的可接受精度。特別奇怪的是，這些數(shù)字代表數(shù)字6和12的倍數(shù)。用16.5％聚丙烯酰胺濃度的凝膠，絕大部分最強(qiáng)的帶在M≈5kD范圍。但是，如果相同的樣品被用于不同的凝膠，例如，聚丙烯酰胺含量較低的凝膠，則主帶可能出現(xiàn)在兩倍以上的區(qū)域(≈10kD)。這種異?？梢杂没钚晕镔|(zhì)具體的締合-解離平衡解釋。締合平衡和膜轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)明者還測(cè)定了有較高分子量的化合物的透析和超濾中的特別異常之處。在透析一段時(shí)間之后在膜的兩側(cè)可以探測(cè)到較大的正常的不透過膜的活性物質(zhì)。這可以解釋為下列方程1的較高締合物解離成較小可滲透膜的形式，而且在向外的透析液中重新構(gòu)成較大的自締合物。長(zhǎng)時(shí)間透析之后膜兩側(cè)逐漸平衡。{com-(C3O2)n}s_{com-(C3O2)n}s-p+{com-(C3O2)n}p(1)其中s＝2，3，4，5，6，10或12以及這些數(shù)的倍數(shù)，且p＜s。簡(jiǎn)單環(huán)齊聚物和它們成倍締合的有較高摩爾量的衍生物之間的平衡取決于多種因素，或者受，例如，溶劑性質(zhì)，pH值，堿金屬和其它離子的濃度，溫度和與溶液中存在的其它物質(zhì)螯合等因素的影響。平衡方程式(1)使本發(fā)明具有較大摩爾量的活性物質(zhì)能夠穿透細(xì)胞內(nèi)空間，這種情況通常情況下是被阻斷的。在膜外空間本發(fā)明活性物質(zhì)可以較大com-(C3O2)n化合物存在。通過方程式(1)的解離這些活性物質(zhì)可以穿透膜，進(jìn)而達(dá)到膜的內(nèi)部空間，在這里，它們經(jīng)過締合作用重新形成較大化合物。
由于它們的穩(wěn)定性，較大自締合物也可以為活性物質(zhì)的生理儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)服務(wù)，進(jìn)而到達(dá)病理表現(xiàn)的位置。它們?cè)诖孙@示它們的生物調(diào)節(jié)和治療效果，或與其它活性物質(zhì)螯合后表現(xiàn)這種效果。不穿透膜的物質(zhì)Y在被“罩住”的膜之間的轉(zhuǎn)運(yùn)過程可以根據(jù)本發(fā)明以“藏”在活性物質(zhì)圓筒內(nèi)空腔中的方式進(jìn)行。分光特性一般地，本發(fā)明活性物質(zhì)的分子光譜相對(duì)貧帶(band-poor)，這符合相應(yīng)結(jié)構(gòu)高度對(duì)稱的情況。在KBr顆粒上得到的紅外光譜(圖5)說明了在3500-3000cm-1，1680-1620cm-1，1400-1385cm-1，1210cm-1，1100cm-1，和830-600cm-1之間的幾個(gè)特征吸收帶，其中在1660cm-1的強(qiáng)帶被稱為4-吡喃酮環(huán)的“環(huán)呼吸頻率”。在1720cm-1處沒有IR吸收帶說明不可能有2-吡喃酮結(jié)構(gòu)。
UV-VIS光譜的最強(qiáng)吸收的最大值位于約190nm處，其肩部約在220nm和265nm處(圖6)。證據(jù)表明，在約320nm處沒有所希望的螯合雙帶的強(qiáng)吸收(峰)，而只在240-400nm處有弱的非特定傾斜吸收存在。但是，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了由于310-340nm放射性激發(fā)使一些加合物發(fā)射400-450nm范圍的熒光。這表明較強(qiáng)但對(duì)稱地禁止遷移行為存在。分析反應(yīng)式com-(C3O2)n的活性物質(zhì)可以通過與五氯化銻或與Liebermann-Burchard試劑以薄層色譜方式進(jìn)行的陽性反應(yīng)測(cè)定。分離中使用硅膠60備用板(Merck)，洗脫混合物為1-丙醇∶乙酸乙酯∶20％乙酸(60∶10∶30)。作為噴灑試劑，可用在四氯化碳中的飽和五氯化銻溶液或在20mL絕對(duì)乙醇中的2mL乙酸酐和2mL濃硫酸混合物。噴灑之后，將該板在120℃加熱約10分鐘，在λ＝365nm處檢測(cè)UV光。熒光點(diǎn)表明有本發(fā)明活性物質(zhì)的存在。
以胺加合物形式存在的活性物質(zhì)表現(xiàn)出陽性水合茚三酮反應(yīng)，這一點(diǎn)可用來對(duì)它們進(jìn)行分析檢測(cè)或分光光度計(jì)測(cè)定。由于大多數(shù)氨基酸和肽也表現(xiàn)這種反應(yīng)，因此，該分析只適用于色譜分離之后。對(duì)于薄層色譜分離，硅膠60備用板(Merck)和1-丙醇∶乙酸乙酯∶20％乙酸(50∶30∶20，v/v)混合物被用作洗脫劑。作為噴灑試劑，使用含有0.1％水合茚三酮溶液和2％(v/v)冰醋酸和0.5％(v/v)對(duì)稱可力丁的乙醇。在Rf＝0.32-0.45區(qū)域的黃點(diǎn)表明有一些本發(fā)明活性物質(zhì)存在。
本發(fā)明活性物質(zhì)的羥基-吡喃基團(tuán)表現(xiàn)出與Folin-Ciocalteu試劑稍微有陽性苯酚反應(yīng)，這一點(diǎn)可用于測(cè)定。由于用于蛋白質(zhì)測(cè)定的已知的Lowry法也基于這個(gè)反應(yīng)，所以必須首先對(duì)蛋白質(zhì)或苯酚物質(zhì)進(jìn)行色譜分離。
對(duì)于根據(jù)本發(fā)明物質(zhì)的分子量進(jìn)行的分析分離，可用HP-GP(高效凝膠滲透色譜)法。分離優(yōu)選在TSK G-2000SW(Toso-Haas)柱(600×7.5mm)中進(jìn)行，用50mM硼酸鹽緩沖液(pH＝8.1)作洗脫劑?；旌衔镏谢钚晕镔|(zhì)成分的摩爾量借助于標(biāo)定圖(圖7A)通過測(cè)量殘留體積來測(cè)定(圖7)。用已知分子量的聚乙二醇標(biāo)準(zhǔn)作標(biāo)定曲線。
對(duì)于根據(jù)組分的極性進(jìn)行的色譜分離，可用反相HPLC法，優(yōu)選用Nucleosil 5 C18柱(Macherey Nagel)作為固相，優(yōu)選用梯度為10-90％乙腈的水作為洗脫劑。
本發(fā)明吡喃鎓鹽衍生物的特征是它們表現(xiàn)出平衡離子已知的分析反應(yīng)，例如，鹵化物與銀離子或硫酸離子與鋇的沉淀反應(yīng)。
本發(fā)明活性物質(zhì)表現(xiàn)出與強(qiáng)心甾類糖苷如哇巴因，地高辛等的抗體的高敏感性交叉反應(yīng)。由于這些有機(jī)化合物本身不是致免疫的，而是首先與較大的蛋白分子如BSA或抗生物素蛋白進(jìn)行化學(xué)偶合。通過用這些螯合物給兔子幾次給藥可以得到具體的抗哇巴因或抗地高辛抗體。這些抗體與本發(fā)明活性物質(zhì)的交叉反應(yīng)可以用酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)法或放射免疫測(cè)定(RIA)法檢測(cè)。這些方法允許對(duì)非常少量的活性物質(zhì)(pg量級(jí))進(jìn)行高敏感性測(cè)定。對(duì)人體液的這種測(cè)定可能會(huì)由于強(qiáng)心苷的存在而受到破壞，但強(qiáng)心苷只出現(xiàn)在對(duì)心臟病的特殊藥物治療中。
具有較大摩爾量(M＞2.0kD)的本發(fā)明活性物質(zhì)表現(xiàn)出與免疫球蛋白有值得注意的特殊反應(yīng)。這些與人或動(dòng)物免疫球蛋白的免疫特定沉淀反應(yīng)是在瓊脂糖膠中用分光光度法和Ouchterlouny法或用Laurell免疫電泳法檢測(cè)。與正常血清中的免疫球蛋白的反應(yīng)和與病理血清中的免疫球蛋白的反應(yīng)之間的顯著差別使這些反應(yīng)可以用于各種免疫病理的診斷。O-烷基和O-酰基衍生物通過R表示的無機(jī)或有機(jī)分子基團(tuán)與基本結(jié)構(gòu)中的氧原子結(jié)合，形成通式com-(C3O2)n·Rm無機(jī)和/或有機(jī)衍生物或螯合物，其中R＝無機(jī)或有機(jī)分子和/或有機(jī)基團(tuán)，優(yōu)選甲基，乙基，乙?；?，芐基，且m≤2n。制備根據(jù)本發(fā)明，自從二氧化三碳被認(rèn)為可以用已知方法制備以后，它就能被用作合成本發(fā)明大環(huán)物質(zhì)的起始原料。
根據(jù)本發(fā)明，可以用光化學(xué)方法或使用適當(dāng)助劑將用分餾方法純化的C3O2轉(zhuǎn)化成環(huán)齊聚物衍生物。二氧化三碳的合成是用已知方式進(jìn)行，即在五氧化磷存在下和/或通過加熱從少量二羧酸如丙二酸或其衍生物中除去兩倍的水。但是，用這種方法會(huì)形成不需要的二氧化三碳非晶態(tài)聚合物。與此相反，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在非質(zhì)子傳遞溶劑中進(jìn)行所說酸或其酯的熱脫氫反應(yīng)更適合本發(fā)明活性物質(zhì)的形成。根據(jù)本發(fā)明，將所說酸或其相應(yīng)衍生物溶解于非質(zhì)子傳遞溶劑，優(yōu)選二甲基甲酰胺，加熱并攪拌。將混合物加熱到120-150℃，幾分鐘后已經(jīng)明顯形成C3O2。對(duì)于將這種方式產(chǎn)生的二氧化三碳轉(zhuǎn)化成本發(fā)明環(huán)齊聚物活性物質(zhì)，要用光化學(xué)活化反應(yīng)和/或根據(jù)本發(fā)明加入適當(dāng)助劑。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)那些對(duì)大環(huán)結(jié)構(gòu)的形成起樣板作用的物質(zhì)是有效的助劑。優(yōu)選那些離子的穩(wěn)定的鹽化合物，離子的半徑對(duì)應(yīng)于內(nèi)徑為2.9-3.1埃的com-(C3O2)6大環(huán)的內(nèi)部空腔。優(yōu)選的離子有銣(2.94埃)，鉀(2.66埃)，氨(2.86埃)和氟(2.72埃)。
發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，一些酶，優(yōu)選那些屬于“聚酮化合物合酶(PHSs)”類的酶，可用于本發(fā)明二氧化三碳環(huán)齊聚物和大環(huán)相關(guān)衍生物的合成?？梢允褂脦追N羧酸衍生物，優(yōu)選丙二酸，優(yōu)選以丙二酸單酰-輔酶A形式。這種丙二酸單酰-輔酶A可以在生物素存在下由乙酰-輔酶A和CO2很容易地制備。
根據(jù)本發(fā)明，也可以從一氧化碳制成的一些大規(guī)模產(chǎn)物的副產(chǎn)物中分離出本發(fā)明生物調(diào)節(jié)活性物質(zhì)。發(fā)明者驚喜地發(fā)現(xiàn)幾種已知的由一氧化碳或合成氣體經(jīng)過工業(yè)化生產(chǎn)制成的有機(jī)合成產(chǎn)物可以含有少量但是可檢測(cè)量的本發(fā)明活性物質(zhì)。這可以用CO和合成氣體含有少量二氧化三碳解釋。為了增加這些大規(guī)模產(chǎn)物中極低含量的本發(fā)明活性物質(zhì)，使用了分餾方法。將2-60份(“份”表示“重量份額”，除非另有說明)，優(yōu)選20份，水或水性緩沖液加到100份原料(優(yōu)選由合成氣體制成的工業(yè)甲醇)中，然后先用蒸餾塔從該混合物中蒸餾出甲醇。殘余的水相表現(xiàn)出本發(fā)明活性物質(zhì)的含量有所增加。加入新鮮甲醇相并反復(fù)重復(fù)蒸餾過程，得到所要濃度的本發(fā)明活性物質(zhì)。采用分餾或固相(優(yōu)選活性炭或反相氧化硅)吸收方法從該溶液中分離出本發(fā)明活性物質(zhì)，然后加入溶劑混合物，優(yōu)選水-乙醇，進(jìn)行解吸。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明活性物質(zhì)也可以從植物提取物，植物細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)菌培養(yǎng)物中分離。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大量植物種類中不存在本發(fā)明活性物質(zhì)本身，但存在未定義的其它螯合物，優(yōu)選毒性植物成分。優(yōu)選的粗原料是那些含有毒性成分如生物堿或心臟毒性糖苷(cardiotoxic glycoside)。而且，皂草苷或鞣酸含量相對(duì)較高的植物種類也可以作為分離本發(fā)明活性物質(zhì)的適當(dāng)原料。根，根莖，莖，葉，皮或種子，或最初用已知方式經(jīng)過細(xì)胞形成得到的相應(yīng)的植物細(xì)胞培養(yǎng)物都是合適的植物原料。
如果需要制備小分子量二氧化三碳衍生物，優(yōu)選com-(C3O2)n，可采用本發(fā)明下列方法將10份萃取劑，優(yōu)選30％醇-水混合物，加到1份用己烷脫脂的干燥植物原料中，并在光加熱下浸泡24小時(shí)。重復(fù)該過程幾次，優(yōu)選2-3次，然后濃縮合并的醇萃取物。在沸騰濃縮的酊劑之前加入酸，優(yōu)選乙酸或鹽酸，相對(duì)于酊劑的量為0.01-5％，優(yōu)選1％，并在短時(shí)間內(nèi)(優(yōu)選10-30分鐘)保持在80-100℃。用堿，優(yōu)選NH4OH，中和冷卻的溶液，每100份液體用1-20，優(yōu)選5-10份活性炭處理。濾出的活性炭再用水洗滌并過濾。真空干燥的活性炭用沸騰的萃取劑(優(yōu)選1∶1乙醇-水)處理，并將該過程重復(fù)兩次。這樣得到的本發(fā)明活性物質(zhì)的溶液是穩(wěn)定的并適于長(zhǎng)期保存。也可以將合并的溶液濃縮和凍干。重復(fù)重結(jié)晶，優(yōu)選從醇-醚混合物中重結(jié)晶，將產(chǎn)生的固體殘余物純化。這樣分離的加合物是長(zhǎng)期穩(wěn)定的。
如果需要制備大分子量二氧化三碳化合物的環(huán)齊聚物，可采用本發(fā)明下列方法在每1份重量用己烷脫脂的干燥植物原料中加入5-20，優(yōu)選8份甲醇，并在光加熱下浸泡1-36，優(yōu)選16小時(shí)。重復(fù)該過程幾次，優(yōu)選兩次，然后濃縮合并的萃取物。將濃縮的溶液倒入可混水的有機(jī)溶劑，優(yōu)選丙酮或乙醇中，比例為1∶20-1∶2，優(yōu)選1∶8。通過過濾或離心分離形成的沉淀，并將其溶解于最少量的水或緩沖液中。全部過程重復(fù)1-5次，優(yōu)選2次。將這樣得到的粗產(chǎn)物溶解于最少量的用pH 9-10.5緩沖液堿化的水中，優(yōu)選用排出限為3kD的膜對(duì)用pH 9-10.5緩沖液堿化的蒸餾水進(jìn)行滲析。長(zhǎng)時(shí)間(優(yōu)選3-4天)滲析后，經(jīng)過幾次更換膜外水量，濾出膜內(nèi)溶液，細(xì)心地濃縮并凍干。
根據(jù)本發(fā)明，有離子交換作用的天然吸收劑或離子固相，如樹脂，凝膠或改性多糖類可用于不同摩爾量的本發(fā)明活性物質(zhì)的分離。由于本發(fā)明活性物質(zhì)的兩性離子屬性，可以使用陰離子交換劑和陽離子交換劑或混合床交換相。首先，用離子交換相處理植物或其它原料的萃取物。當(dāng)該成分附著在固相上之后用過量中性或弱酸性洗脫劑，優(yōu)選水或緩沖液洗滌該塔，直到洗脫液中探測(cè)不到常見成分(碳水化合物，氨基酸)。用稀無機(jī)酸，優(yōu)選鹽酸，或有機(jī)酸，優(yōu)選甲酸或乙酸對(duì)陽離子交換劑相進(jìn)行解吸。用稀堿，優(yōu)選0.1-0.3摩爾氫氧化銨或氫氧化鉀溶液將附著在陰離子相或混合床相上的本發(fā)明活性物質(zhì)釋放出來。用溶劑，優(yōu)選用甲醇或乙腈水溶液從反相氧化硅解吸。
根據(jù)本發(fā)明，用0.2-5％，優(yōu)選1.2％十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液，或1-12摩爾，優(yōu)選8摩爾脲溶液從中性相如硅膠，聚酰胺或各種多糖類中解吸。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明不同摩爾量的活性物質(zhì)的分離和純化采用凝膠過濾或膜透析和超濾方法進(jìn)行。對(duì)于本發(fā)明活性物質(zhì)的分離，根據(jù)它們的分子量，借助于合成的固相，優(yōu)選用Sephacryl 200，SephadexLH-200或TSK HW-60，進(jìn)行凝膠色譜分離。可用弱堿緩沖液，優(yōu)選乙酸銨或碳酸氫銨，或0.01-0.3摩爾，優(yōu)選0.15摩爾NaCl或KCl溶液作為洗脫劑。用這些分離方法首先是將較高分子量的化合物洗脫，然后，較小的化合物如com-(C3O2)6或com-(C3O2)10才從塔中流出。
根據(jù)本發(fā)明，由從植物成分得到的本發(fā)明活性物質(zhì)形成的幾種螯合物可以直接分離。采用有機(jī)溶劑，優(yōu)選乙醚的丙酮，可使這些幾乎粘稠的黃棕色螯合物從濃甲醇植物萃取物中沉淀。經(jīng)過幾次，優(yōu)選3-5次，沉淀，這樣得到的螯合物已經(jīng)相對(duì)均勻。根據(jù)本發(fā)明，下列鹽析方法可用于本發(fā)明螯合物的裂解。將螯合物溶解于水，其中溶有相對(duì)于最終溶液含量為5-50％(w/w)，優(yōu)選15％的無機(jī)鹽，優(yōu)選硫酸銨。將有機(jī)溶劑，優(yōu)選正丁醇或2-丙醇，倒入該溶液，并將其劇烈搖動(dòng)，該相被分離。重復(fù)這一過程2-5次，優(yōu)選3次，同時(shí)用酸將水相的pH值調(diào)至1。根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)一步裂解之后，將螯合物溶解于水，用氨將pH值調(diào)至10，倒入氯化物溶劑，優(yōu)選二氯甲烷或氯仿(比例為1∶0.5，優(yōu)選1∶2)，攪拌。用力搖動(dòng)之后分離出非常穩(wěn)定的泡沫狀乳液，然后，減壓除去有機(jī)溶劑。
也可以從細(xì)菌原料中分離本發(fā)明活性物質(zhì)。為此，根據(jù)本發(fā)明可用各類細(xì)菌培養(yǎng)物，優(yōu)選BCG(卡介菌)，小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)或大腸埃希氏桿菌。首先進(jìn)行物理處理，優(yōu)選用超聲波處理，然后用稀無機(jī)酸，優(yōu)選鹽酸，水解。任意中和過濾的水解物，并將其用于固相，優(yōu)選正常或反相硅膠。用各種中性洗脫劑處理固相直到在洗脫液中探測(cè)不到氨基酸，碳水化合物和其它簡(jiǎn)單的水解產(chǎn)物。用稀堿，優(yōu)選0.1-0.2摩爾氫氧化銨，或用甲醇或乙醇水溶液或乙腈對(duì)反相進(jìn)行本發(fā)明活性物質(zhì)的解吸。
動(dòng)物組織和組織液中可能含有少量未定義螯合物的本發(fā)明活性物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，首先對(duì)小心凍干的有機(jī)液(優(yōu)選尿)組織進(jìn)行有機(jī)萃取，然后用選擇性親和力色譜法從濃縮的有機(jī)萃取物中分離和純化本發(fā)明活性物質(zhì)。為此目的，將已知強(qiáng)心苷，優(yōu)選哇巴因或嚏根草因，共價(jià)連接到固相(優(yōu)選Sepharose)上。這種親和相滯留濃縮的粗原料溶液中的本發(fā)明活性物質(zhì)。用弱酸或中性緩沖液洗滌塔多次后，借助于堿性緩沖液，得到本發(fā)明化合物。生物調(diào)節(jié)應(yīng)用發(fā)明者發(fā)現(xiàn)本發(fā)明活性物質(zhì)有效地控制了已知作為鈉泵的Na+，K+-ATP酶活性。通過所謂的主動(dòng)膜轉(zhuǎn)運(yùn)這種廣泛分布的酶調(diào)節(jié)了最重要的堿金屬離子的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)濃度。為此所必需的能量由ATP水解傳送，它直接偶合該酶的活性。本發(fā)明活性物質(zhì)可以控制該酶的復(fù)合活性?？刂频姆较蚝蛷?qiáng)度取決于濃度和本發(fā)明活性物質(zhì)的摩爾量。所說堿金屬離子和其它無機(jī)離子的性質(zhì)和濃度主要影響該控制效果。在紅細(xì)胞懸浮液中加入本發(fā)明活性物質(zhì)可以觀察到細(xì)胞外Na濃度即鈉泵的活化程度有所增加。相反，用本發(fā)明較小摩爾量的活性物質(zhì)的具體濃度實(shí)現(xiàn)體外Na+，K+-ATP酶的抑制。
當(dāng)將本發(fā)明活性物質(zhì)與哇巴因或其它強(qiáng)心苷一起使用時(shí)可以觀察到這些苷的毒副作用有所降低。以0.02-2/1，優(yōu)選1∶1摩爾苷的摩爾比加入本發(fā)明活性物質(zhì)后嚏根草苷的LD50值明顯升高，說明急性毒性有所降低。而且，如果實(shí)驗(yàn)成立，本發(fā)明活性物質(zhì)就能控制其它幾種主要酶如膠原酶，透明質(zhì)酸酶，磷酸激酶等的活性。根據(jù)上面所述，本發(fā)明活性物質(zhì)可用作Na+，K+-ATP酶的內(nèi)源性配位體。免疫調(diào)節(jié)作用發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明活性物質(zhì)的幾種免疫調(diào)節(jié)作用。這些機(jī)理可以部分地用上述Na+，K+-ATP酶的控制解釋，因?yàn)檫@些酶主要參與大量免疫過程。
另外，本發(fā)明活性物質(zhì)在對(duì)Fc受體有特殊親和力的那些受體中呈現(xiàn)新的免疫調(diào)節(jié)作用。這些受體固定在多種免疫細(xì)胞上，它們的占據(jù)或非占據(jù)在控制這些細(xì)胞的活性方面起著根本性的作用。在臨床試驗(yàn)中本發(fā)明活性物質(zhì)導(dǎo)致病理活化殺傷細(xì)胞(K細(xì)胞)和抗體依賴細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)中的其它淋巴細(xì)胞的活性明顯降低。相反，在自發(fā)細(xì)胞毒素(SCMC)中的天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的活性受到本發(fā)明活性物質(zhì)不同程度的影響對(duì)于風(fēng)濕病患者，生理超刺激自生細(xì)胞毒性明顯被抑制。對(duì)于健康的試驗(yàn)者，自發(fā)細(xì)胞毒性只受到不明顯地影響。因此，臨床數(shù)據(jù)證明，通過抑制自攻擊過程，本發(fā)明活性物質(zhì)適合于常見風(fēng)濕病的治療，或預(yù)防組織或器官移植產(chǎn)生的排斥反應(yīng)。值得注意的是所有這些效果都是用異常少量(μg/kg范圍)的活性物質(zhì)得到的。換句話說，本發(fā)明化合物的毒性極低。因此，本發(fā)明最重要的藥物毒性先決條件是完成對(duì)人類的治療應(yīng)用。本發(fā)明活性物質(zhì)的風(fēng)濕病治療用途還有另一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選n＝6的com-(C3O2)n小環(huán)齊聚物及其加合物表現(xiàn)出異常強(qiáng)的止痛和解痙效果。局部給藥之后立即表現(xiàn)出止痛和解痙效果是風(fēng)濕病治療應(yīng)用中重要的優(yōu)點(diǎn)。迅速緩解疼痛和解痙是通過正常免疫調(diào)節(jié)功能的重新建立長(zhǎng)期維持的。本發(fā)明較大分子量的活性物質(zhì)能夠發(fā)揮顯著的模仿免疫刺激的非特定效果。這是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中用細(xì)菌感染明確證實(shí)的。用活性物質(zhì)治療使用了致命銅綠假單胞菌劑量的動(dòng)物，其存活率明顯比對(duì)照組動(dòng)物的更高。
本發(fā)明有生物調(diào)節(jié)功能的活性物質(zhì)既可以作為純物質(zhì)或混合物質(zhì)分別給藥，也可以藥物組合物形式給藥，因此，藥物組合物除包含本發(fā)明物質(zhì)外還包含一個(gè)和/或幾個(gè)藥物上安全的賦形劑和/或載體。這些物質(zhì)包括0.9％氯化鈉溶液，1-5％葡萄糖或果糖溶液，羧甲基纖維素，馬鈴薯淀粉，乳糖，羊毛脂，甘露糖醇，硬脂酸鎂，1，2-丙二醇，甘油，十六烷基十八烷醇，對(duì)羥苯甲酸甲酯，月桂基硫酸鈉和滑石。在這樣制備的藥物組合物中還可以任意加入其它治療用活性物質(zhì)或賦形劑。這些草藥配方還包括適于下列方式給藥的所有制劑胃腸外，肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下，動(dòng)脈周圍或動(dòng)脈內(nèi)注射，口服給藥如用片劑，膠囊劑或滴劑，或外部給藥如用軟膏，乳膏，凝膠或栓劑。
下列實(shí)施例將進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1由二氧化三碳合成制備在裝有回流水冷卻器的玻璃反應(yīng)器中將15份丙二酸溶解于80份乙酸酐，油浴(80℃)加熱并攪拌。在回流冷卻器延伸部分接上另外兩個(gè)干冰冷卻阱，目的是收集揮發(fā)的化合物。全部酸溶解之后加入0.2份氟化銣，并用250W日光燈進(jìn)行光化學(xué)照射。將油浴溫度升至130-150℃，反應(yīng)混合物逐漸變成深棕色。在強(qiáng)真空下?lián)]發(fā)的二氧化三碳及其衍生物被冷凝在用干冰和丙酮冷卻的阱中。冷凝物經(jīng)過真空分餾純化。用已知色譜法純化和分析這樣得到的活性物質(zhì)。實(shí)施例2從工業(yè)甲醇中分離將pH為9的250份0.1摩爾乙酸銨緩沖液加到1000份由合成氣體制成的甲醇中。首先用蒸餾塔從混合物中蒸餾掉甲醇，再在殘留的水相中加入1000份甲醇，并重復(fù)蒸餾甲醇3-4次。將最后殘留的水相小心濃縮并用活性炭處理。將50份過濾分離并在空氣中干燥的活性炭用含有80％(v/v)乙醇的400份水在80-90℃處理，浸漬30分鐘后加溫過濾。重復(fù)此萃取過程2次。將合并的乙醇萃取物細(xì)心濃縮并凍干。實(shí)施例3從嚏根草類中分離將數(shù)份淡紫色嚏根草(Helleborus purpurascens)(毛茛科)的干燥和粗糙切碎的根和根莖用120份己烷脫脂，然后80份二氯甲烷進(jìn)行預(yù)萃取。除去萃取劑后用200份含有30％(v/v)乙醇的水在室溫浸漬干燥殘余物24小時(shí)。重復(fù)萃取過程兩次，然后將合并的萃取物過濾并真空濃縮。將這樣得到的250份萃取物加到3份濃鹽酸中并在95℃加熱20分鐘。中和之后用少量活性炭處理溶液并過濾。將真空濃縮的濾液倒入8倍體積的丙酮中，將離心所得沉淀溶解于最少量的水中，并用丙酮重復(fù)沉淀2-3次。將沉淀溶解于最少量的0.1摩爾的氯化鈉溶液中，并從充有TSK HW-60的凝膠柱上方引入該溶液。用0.125摩爾的氨水溶液(還可以含有10％(v/v)2-丙醇)以5cm/h的流速進(jìn)行洗脫。在230nm處測(cè)量光密度。實(shí)施例4從葡萄種子中分離活性物質(zhì)將25份干燥和研磨的葡萄種子加到pH＝9.6的150份0.5摩爾硼酸鹽緩沖液中，并在90℃加熱和浸漬30分鐘。濃縮過濾的溶液，并將其倒入攪拌的8倍體積冷乙醇中。離心產(chǎn)生沉淀，將沉淀溶解于最少量的水中，并每次用6倍量的冷乙醇沉淀兩次。將溶解于稍微有點(diǎn)兒堿性pH的最少量的乙酸銨緩沖液中的沉淀用分子排阻限為30，10，3和1kD的膜進(jìn)行超濾分離。將這樣分離的餾分的pH重新調(diào)節(jié)到弱酸性pH值并凍干。實(shí)施例5從美國(guó)商陸中分離活性物質(zhì)將100份干燥的美國(guó)商陸根切碎成0.5-1.2mm顆粒，并用600份己烷進(jìn)行24小時(shí)的處理進(jìn)行脫脂。首先擠掉己烷，然后空氣干燥植物原料直到聞不到己烷氣味。用800份含有5％(v/v)乙酸的水在室溫浸漬干燥的植物原料4小時(shí)，并將該過程重復(fù)兩次。過濾合并的萃取物并真空濃縮。在該水溶液中分批加入15-50份硫酸銨并使之溶解。通過離心和過濾除去鹽析過程沉淀出的蛋白質(zhì)。在50份上清液中加入50份1-丁醇并將之劇烈搖動(dòng)。一段時(shí)間后分離有機(jī)相，并重復(fù)丁醇萃取過程兩次。合并的丁醇溶液再用0.1％氨水萃取一次。真空濃縮水相，凝膠過濾純化。實(shí)施例6從大腸埃希桿菌制備在含有20份胰胨，10份酵母提取物，20份NaCl和30份瓊脂并補(bǔ)充有適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)添加物的2000份體積高壓滅菌后的培養(yǎng)基中以1∶100的稀釋程度接種大腸埃希桿菌K-12。培養(yǎng)保持在37℃直到達(dá)到2×109細(xì)胞/mL的飽和密度。用超聲波處理反應(yīng)混合物，并將反應(yīng)混合物與1.0N乙酸一起在90℃加熱20分鐘。冷卻后過濾并真空濃縮。將150份濃縮溶液吸附在反相氧化硅(RP18)上進(jìn)行柱色譜(Merck)分離，固相首先用2％(v/v)乙酸水溶液洗滌，然后用1000份由正丙醇∶乙酸乙酯∶20mM硼砂/硼酸鹽緩沖劑(600∶100∶300％(v/v))組成的緩沖混合物洗滌，最后用水洗滌。固相只有用這些中性洗脫劑洗滌直到洗脫液中測(cè)不到有氨基酸，碳水化合物和其它簡(jiǎn)單的水解產(chǎn)物存在。本發(fā)明活性物質(zhì)的解吸用乙腈進(jìn)行，真空濃縮除去過量乙腈。最后，濃縮這樣得到的本發(fā)明活性物質(zhì)的溶液。實(shí)施例7從動(dòng)物體液分離將10,000份豬尿凍干，固體剩余物用600份甲醇萃取三次。將甲醇萃取物濃縮成20份。用適當(dāng)活化的嚏根草苷溶液處理100份溴化氰活化的Sepharose 4B直到80％的所用苷與固相共價(jià)結(jié)合。將10份濃甲醇溶液用到這樣制備的親和層析柱上并洗脫一段時(shí)間，直到在洗脫液中探測(cè)不到更多的化學(xué)化合物。經(jīng)過用0.5-0.2摩爾甲酸的梯度洗脫從層析柱上洗脫出本發(fā)明活性物質(zhì)，然后將其凍干。在填充Sephadex LH-20(Pharmacia)的柱上進(jìn)行活性物質(zhì)的純化。首先將活性物質(zhì)吸附在柱上，然后用20-60％(v/v)的丙酮水溶液梯度洗脫。實(shí)施例8免疫調(diào)節(jié)的應(yīng)用通過對(duì)從100/1-10/1效應(yīng)物/靶細(xì)胞比例的K562靶細(xì)胞放出的51Cr同位素進(jìn)行的測(cè)定來測(cè)量NK細(xì)胞的自發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(SCMC)。對(duì)于10個(gè)健康對(duì)象中的8個(gè)，本發(fā)明活性物質(zhì)將溶解活性平均提高了15％。通過用本發(fā)明活性物質(zhì)給藥，生理活性平均增加141％的16個(gè)風(fēng)濕病患者的生理SCMC活性明顯趨于正常?？贵w依賴細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)中的效應(yīng)物細(xì)胞以更加一致的方式受到本發(fā)明活性物質(zhì)的影響。下面圖表1證明，在健康者和風(fēng)濕病患者身上的ADCC活性減小。圖表1 用和沒用活性物質(zhì)治療的健康者和風(fēng)濕病患者的細(xì)胞毒性
ADCC 抗體依賴細(xì)胞SCMC 自發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的細(xì)胞毒性這種活性的正常化作用可用活性物質(zhì)對(duì)Fc受體的特殊親和力解釋。實(shí)施例9在器官移植中的免疫抑制應(yīng)用本發(fā)明物質(zhì)的免疫抑制作用可以明顯地減輕器官移植時(shí)的排斥反應(yīng)。對(duì)小鼠的一系列心臟移植實(shí)驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)上證實(shí)了這一點(diǎn)。
Corry，R.，Winn，H.和Ressel，P.的同種(動(dòng)物)心臟移植方法(《移植(Transplantation)》，16，343(1973))被用于無病原體的5-6周齡小鼠，Sprague Dawley DBA/2系作為供體，C57BL/6系作為受體。
用作供體的動(dòng)物靜脈內(nèi)肝素化之后，它們的心臟被取出并保持在冰冷的Ringer乳酸鹽溶液中直到準(zhǔn)備好C57BL/6受體動(dòng)物。供體主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈與受體腹部主動(dòng)脈和腔靜脈之間的吻合術(shù)采用顯微外科技術(shù)完成。
血液重新開始流動(dòng)之后觀察心跳的頻率和強(qiáng)度，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為0-+4。通過剖腹手術(shù)可以看到，脈搏停止后出現(xiàn)排斥反應(yīng)。試驗(yàn)組中的小鼠經(jīng)過皮下給藥獲得以下數(shù)量的活性物質(zhì)-移植前3天，2.0mg/kg-手術(shù)當(dāng)天，3.0mg/kg-手術(shù)后第三天，2.5mg/kg-以后每3天，1.5mg/kg對(duì)照組中的動(dòng)物僅用安慰劑檸檬酸鹽緩沖液處理。
移植實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果如下動(dòng)物編號(hào) 治療用藥 存活時(shí)間(天)1活性物質(zhì) 242活性物質(zhì) 313活性物質(zhì) 184活性物質(zhì) 215活性物質(zhì) 426活性物質(zhì) 187活性物質(zhì) 68活性物質(zhì) 339活性物質(zhì) 1210 活性物質(zhì) 22
11 安慰劑 812 安慰劑 613 安慰劑 1014 安慰劑 9用安慰劑治療的動(dòng)物的存活率平均為8.2天。用活性物質(zhì)治療的動(dòng)物的存活率平均為22.7天，顯然幾乎是安慰劑治療動(dòng)物存活時(shí)間的3倍。這個(gè)結(jié)果可以用對(duì)T淋巴細(xì)胞引起的排斥反應(yīng)的特殊抑制作用解釋。實(shí)施例10巨噬細(xì)胞的刺激作用將從10個(gè)正常小鼠提取的脾淋巴細(xì)胞懸浮于用HEPES緩沖的RPMI1640培養(yǎng)基，并補(bǔ)充10％胎牛血清。將懸浮液保持在37℃1小時(shí)使得巨噬細(xì)胞粘連。在試驗(yàn)組中給小鼠腹膜內(nèi)給藥5mg/kg活性物質(zhì)，24小時(shí)后殺死小鼠。對(duì)照組動(dòng)物不接受任何活性物質(zhì)。將從兩個(gè)組得到的淋巴細(xì)胞在盛有5×105個(gè)粘連巨噬細(xì)胞的試管中培養(yǎng)。
巨噬細(xì)胞的刺激指數(shù)LPS PHA對(duì)照組 288％ 165％活性物質(zhì)組 402％ 1,346％試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，通過用活性物質(zhì)處理的動(dòng)物中的LPS(脂多糖)和PHA(植物血凝素)得到的刺激指數(shù)(SI)明顯更大。實(shí)施例11表觀免疫刺激作用的應(yīng)用非特定表觀免疫刺激作用是通過測(cè)定感染致命劑量的綠膿假單胞菌動(dòng)物的存活率確定的。
在分別有30-100個(gè)小鼠的三個(gè)試驗(yàn)組中，每個(gè)動(dòng)物都接受致命劑量的綠膿假單胞菌。I.在致命量假單胞菌感染之前的第7，14和28天給第一組施用2μg活性物質(zhì)；在第21天施用0.25mL生理NaCl溶液，II.給第二組也施用與第一組同樣劑量的活性物質(zhì)，但在第21天施用0.06mg環(huán)磷酰胺，III.不給對(duì)照組任何活性物質(zhì)。％致命假單胞菌感染后的存活率
I.＿×＿×＿×＿活性物質(zhì)II.＿○＿○＿○＿活性物質(zhì)+環(huán)磷酰胺III.＿#＿#＿#＿對(duì)照組本發(fā)明活性物質(zhì)使存活率明顯增加。雖然環(huán)磷酰胺已知的免疫抑制作用會(huì)降低存活率，但它們的存在仍然超過了對(duì)照組的值。相互作用指明本發(fā)明活性物質(zhì)具有非特定表觀免疫刺激作用，其中至今還沒有闡明的新免疫機(jī)理也是可以想象的。最近已被證明，致命劑量的假單胞菌感染后細(xì)胞因子會(huì)立即爆炸似的釋放。因此，病發(fā)細(xì)胞因子休克被認(rèn)為是突然死亡的直接原因。本發(fā)明的免疫抑制作用可以防止這種細(xì)胞因子休克，并且不用真正的免疫刺激就可以驚人地增大存活率。實(shí)施例12用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定活性物質(zhì)利用本發(fā)明活性物質(zhì)與抗哇巴因(a-OU)抗血清的交叉反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)Harris等人的方法(《高血壓(Hypertension)》，17，930(1991))由分析前(pro analysi)哇巴因(Sigma)和抗生物素蛋白(Fluka)合成哇巴因-抗生物素蛋白螯合物(OU-con)。將V.Dibartolo等人的改進(jìn)方法(《生命科學(xué)(Life Sciences)》，57，1417(1995))用于相應(yīng)抗哇巴因血清的制備。
首先在每個(gè)ELISA微滴定板中加入0.1μg/50μL OU-con螯合物溶液，并在4℃培養(yǎng)過夜。用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH＝7.4)洗去未結(jié)合的螯合物，用1％明膠溶液圍住未占據(jù)的結(jié)合部位。
將50μL活性物質(zhì)含量未知的樣品溶液與固定量抗哇巴因血清(0.5μg/50μL)在聚丙烯試管中混合，并保持在室溫2小時(shí)。然后，從每個(gè)活性物質(zhì)抗血清樣品中提取50μL加到各板中，并繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。用PBS洗去未結(jié)合的抗血清之后用蛋白A堿性磷酸酶(Sigma)的1∶500溶液在室溫處理該板2小時(shí)。除去未結(jié)合的酶之后，每塊板用50μL對(duì)硝基苯基磷酸酯溶液(1mg/mL)處理，培養(yǎng)30分鐘后自動(dòng)記錄405nm處的吸收值(埃)。
為了構(gòu)造標(biāo)定曲線，將范圍在5ng/mL-0.1mg/mL的已知量的活性物質(zhì)與常量抗血清混合，用上述方法處理，所測(cè)吸收值代表相應(yīng)濃度的作用。
權(quán)利要求
1.大環(huán)物質(zhì)，其特征在于它的框架結(jié)構(gòu)是由無機(jī)二氧化三碳C3O2經(jīng)過環(huán)齊聚合作用構(gòu)成的，形成縮合的4-吡喃酮或2-吡喃酮環(huán)另外連在基本化合物的堆積的C＝O和C＝C雙鍵不再存在的大環(huán)結(jié)構(gòu)上，這種框架結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于通式com-(C3O2)n，其中符號(hào)com表示連接上述C3O2單元的環(huán)齊聚物和大環(huán)，n代表二氧化三碳的環(huán)齊聚合作用的聚合度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的大環(huán)物質(zhì)，其特征在于二氧化三碳環(huán)齊聚物結(jié)構(gòu)表達(dá)式中的數(shù)字n等于4，6或10，或者4，6或10的倍數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2之一的大環(huán)物質(zhì)，其特征在于該物質(zhì)具有吡喃酮，吡喃鎓或不同互變異構(gòu)限結(jié)構(gòu)代表的依賴介質(zhì)的電子分布，其中這些物質(zhì)可在溶液中的與其它物質(zhì)相互配平。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的大環(huán)物質(zhì)，其特征在于由6個(gè)不同的頭尾縮合的4-吡喃酮構(gòu)成的二氧化三碳環(huán)六聚物com-(C3O2)6的溶液中存在吡喃酮-吡喃鎓平衡，可表示如下
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的大環(huán)物質(zhì)，其特征在于該物質(zhì)以通式com-(C3O2)n·Hm表示的羥基-吡喃衍生物形式存在，該衍生物是將氫加到框架環(huán)外的氧原子上形成的，其中m是結(jié)合的氫原子數(shù)且m≤n，H是氫原子，com和n定義如上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的大環(huán)物質(zhì)，其特征在于式com-(C3O2)n二氧化三碳環(huán)齊聚物或其式com-(C3O2H)n羥基-吡喃衍生物是構(gòu)成加合物吡喃鎓鹽，主-客復(fù)合物，自締合物及無機(jī)或有機(jī)衍生物的基本單元，其中com和n定義如上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的大環(huán)物質(zhì)，其特征在于環(huán)齊聚物基本單元具有帶內(nèi)部空腔的圓筒形大環(huán)結(jié)構(gòu)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一的大環(huán)物質(zhì)，其特征在于存在式com-(C3O2)n·KanAnn的吡喃鎓鹽，其中Ka是陽離子和An是陰離子平衡離子，這些離子中和吡喃鎓框架中的兩性電荷。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一的大環(huán)物質(zhì)，其特征在于其以式com-(C3O2)n·(R1R2R3N)m的胺加合物形式存在，其中R1，R2和R3分別是氫原子或有機(jī)基團(tuán)，m是數(shù)字1-n，所說物質(zhì)由二氧化三碳環(huán)齊聚物框架和1-n個(gè)氨，有機(jī)胺，氨基酸，肽或其它帶有胺官能團(tuán)的物質(zhì)的分子組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9之一的大環(huán)物質(zhì)，其特征在于無機(jī)或有機(jī)分子或有機(jī)基團(tuán)R連接在基本框架的氧原子上，因此制成通式com-(C3O2)n·Rm的無機(jī)和/或有機(jī)衍生物或螯合物，其中R是無機(jī)或有機(jī)分子和/或有機(jī)基團(tuán)，m≤2n。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10之一的大環(huán)物質(zhì)，其特征在于存在基本單元com-(C3O2)n或com-(C3O2H)n以式{com-(C3O2)n}s或{com-(C3O2H)n}s的穩(wěn)定自締合物形式存在，其中s＝2，3，4，5，6，10或12，以及這些數(shù)的倍數(shù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的大環(huán)物質(zhì)，其特征在于對(duì)應(yīng)于s＝12和n＝6且摩爾量為4,898或4,970的化合物有高度對(duì)稱結(jié)構(gòu)框架。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12之一的大環(huán)物質(zhì)，其特征在于它以方程式{com-(C3O2)n}s_{com-(C3O2)n}s-p+{com-(C3O2)n}p的較小和較大化合物之間動(dòng)態(tài)平衡的形式在溶液中存在，其中s有權(quán)利要求11給出的值，且p＜s。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13之一的大環(huán)物質(zhì)，其特征在于所說物質(zhì)具有由單個(gè)物質(zhì)或它們的混合物產(chǎn)生的生物調(diào)節(jié)活性。
15.制備根據(jù)權(quán)利要求1-14之一的有生物調(diào)節(jié)活性的大環(huán)物質(zhì)的方法，其特征在于在形成大環(huán)結(jié)構(gòu)的條件下用半徑適合于大環(huán)空腔的離子的鹽形式的輔劑光化學(xué)活化和/或環(huán)齊聚合作用化二氧化三碳。
16.制備根據(jù)權(quán)利要求1-14之一的有生物調(diào)節(jié)活性的大環(huán)物質(zhì)的方法，其特征在于用屬于聚酮化合物-合酶(PKS)類的酶處理象丙二酸單酰-輔酶A這樣的脂肪酸衍生物。
17.分離根據(jù)權(quán)利要求1-14之一的有生物調(diào)節(jié)活性的大環(huán)物質(zhì)的方法，其特征在于-大規(guī)模使用由合成氣體或通過氧合成制備的有機(jī)產(chǎn)物，-通過分餾富集所含生物調(diào)節(jié)活性物質(zhì)，-通過真空蒸餾和低溫濃縮分離這些活性物質(zhì)，及-通過吸附在固相上并用各種溶劑解吸純化。
18.分離根據(jù)權(quán)利要求1-14之一的有生物調(diào)節(jié)活性的大環(huán)物質(zhì)的方法，其特征在于-將含有毒苷，生物堿或鞣酸的植物或植物細(xì)胞培養(yǎng)物用作粗原料，-用水溶液萃取這種粗原料中的未化學(xué)定義的螯合物，-通過用丙酮，醇或其它溶劑進(jìn)行水解和/或沉淀裂解這些螯合物，-將所得混合物放入離子交換器或中性吸收物質(zhì)中，洗去其它成分，-用堿性緩沖液或選擇官能團(tuán)溶劑的混合物將活性物質(zhì)解吸，及-用滲析，濾膜，凝膠色譜或其它方法進(jìn)行純化，并根據(jù)分子大小選擇性分離。
19.分離根據(jù)權(quán)利要求1-14之一的有生物調(diào)節(jié)活性的大環(huán)物質(zhì)的方法，其特征在于活性物質(zhì)是從細(xì)菌培養(yǎng)物中得到的，其中-培養(yǎng)液用超聲波處理和/或在酸性pH值液體中水解，-用液-液萃取法初步分離活性物質(zhì)，-將活性物質(zhì)放到活性炭或其它吸收劑中，-選擇性地加到含溫醇-水溶液或其它溶劑混合物的溶液中，及-用色譜法或其它分離方法純化。
20.分離根據(jù)權(quán)利要求1-14之一的有生物調(diào)節(jié)活性的大環(huán)物質(zhì)的方法，其特征在于活性物質(zhì)是從動(dòng)物組織，組織液或組織培養(yǎng)物中提取的，其中-濃縮和/或凍干水提取物，-用液-液和液-固萃取法預(yù)純化，-放入含共價(jià)結(jié)合的特殊苷或蛋白質(zhì)的親和固相中，及-用溶劑混合物選擇性地釋放。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-14的大環(huán)活性物質(zhì)在制備治療劑中的用途，用于-生物調(diào)節(jié)Na+，K+-ATP酶和其它酶，或-抑制自身免疫病中的破壞性自身攻擊過程，或-通過結(jié)合Fc受體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，或-通過連接神經(jīng)受體治療疼痛，或-緩解肌肉或血管痙攣。
22.用根據(jù)權(quán)利要求1-14的活性物質(zhì)作為治療劑的用途，用于-控制Na+，K+-ATP酶和其它酶，或-刺激免疫系統(tǒng)，或-控制吞噬作用。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的用途，其特征在于使用加合物，吡喃鎓鹽，環(huán)齊聚物的主-客復(fù)合物衍生物。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-14之一的大環(huán)活性物質(zhì)的用途，用來制備這些物質(zhì)與已知藥物活性物質(zhì)構(gòu)成的藥物螯合物或加合物，用于-減弱強(qiáng)心苷，生物堿或其它藥劑的急性和/或慢性毒性，或-改善甾類，肽或其它活性物質(zhì)的生物利用度。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-14之一的大環(huán)活性物質(zhì)的用途，用來制備由不可透膜的離子或較小物質(zhì)構(gòu)成的主-客復(fù)合物并能使它們透過細(xì)胞膜的藥物。
26.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的活性物質(zhì)的用途，用來治療炎癥，風(fēng)濕病和自身免疫疾病。
27.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的活性物質(zhì)的用途，用來治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，紅斑狼瘡，重癥肌無力和其它自身免疫疾病。
28.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的活性物質(zhì)的用途，用來抑制器官或組織移植產(chǎn)生的排斥反應(yīng)。
29.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的活性物質(zhì)的用途，用來治療由于急性或慢性免疫防御能力減弱引起的疾病或細(xì)胞因子介導(dǎo)的休克現(xiàn)象。
30.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的活性物質(zhì)的用途，用來治療由于Na+，K+-ATP酶系統(tǒng)生物調(diào)節(jié)功能缺陷引起的心血管疾病。
31.藥劑，其特征在于它含有權(quán)利要求1-14的生物調(diào)節(jié)活性物質(zhì)和生理上可接受的載體
32.根據(jù)權(quán)利要求31的藥劑，其特征在于它可以口服，表面，靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)給藥。
33.根據(jù)權(quán)利要求31和32的藥劑，其特征在于它以片劑，囊劑，軟膏，凝膠或注射形式給藥。
34.根據(jù)權(quán)利要求31-33的藥劑，其特征在于它還含有其它佐劑。
35.自身免疫病理疾病的診斷劑，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1-14之一的活性物質(zhì)本身或其標(biāo)記形式被用來檢測(cè)血液或組織樣品。
36.心血管病理疾病的診斷劑，其特征在于使用了根據(jù)權(quán)利要求1-14的活性物質(zhì)本身或其標(biāo)記形式，和/或通過凝膠色譜，ELISA或放射性免疫測(cè)定進(jìn)行分析。
37.免疫學(xué)疾病的診斷劑，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1-14的活性物質(zhì)的特定的沉淀反應(yīng)用免疫球蛋白或其片斷進(jìn)行。
38.自身免疫病理疾病的診斷方法，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1-14之一的活性物質(zhì)本身或其標(biāo)記形式被用來檢測(cè)血液或組織探針。
39.心血管病理疾病的診斷方法，其特征在于使用了根據(jù)權(quán)利要求1-14之一的活性物質(zhì)本身或其標(biāo)記形式，和/或通過凝膠色譜，ELISA或放射性免疫測(cè)定進(jìn)行分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有生物調(diào)節(jié)活性的大環(huán)結(jié)構(gòu)框架物質(zhì),通過環(huán)齊聚合作用和其它形成大環(huán)結(jié)構(gòu)的作用從二氧化三碳合成該物質(zhì)。這些活性物質(zhì)本身和/或它與其它已知物質(zhì)的穩(wěn)定的加合物的應(yīng)用。本說明書描述了這些活性物質(zhì)以及它們的有機(jī)和無機(jī)衍生物的特性,它們的合成制備,以及它們的分離和純化方法。本說明書還描述了這些活性物質(zhì)在酶調(diào)節(jié)和生物調(diào)節(jié)方面的用途,含有這些活性物質(zhì)的藥物組合物以及它們?cè)谠\斷和治療方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P21/00GK1209132SQ96180086
公開日1999年2月24日 申請(qǐng)日期1996年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月5日
發(fā)明者F·克勒克 申請(qǐng)人:克勒克博士多納圖爾股份有限公司