專利名稱：新的陽離子類脂及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的陽離子類脂及其應用。更具體講，本發(fā)明涉及新的陽離子類脂和它們在傳遞生物活性劑方面的應用。
背景技術：
生物活性劑如藥物活性物質和診斷劑的胞內傳遞對于各種疾病的治療和/或診斷通常是非常有利的。例如，生物活性劑的胞內傳遞，可以從亞細胞或分子水平影響細胞機能。
人們已研制出多種直接傳遞生物活性劑到活細胞內的方法。其中包括這類被稱作“載體法”的方法，此方法包括使用載體促進生物活性劑胞內傳遞到特定靶細胞如疾病細胞內。治療劑的胞內傳遞在本文中還稱為“轉染”。
人們已研制出多種用于轉染生物活性劑的載體。例如，脂質體和聚合物已被用于轉染遺傳物質，包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。然而，目前可用的載體(包括脂質體和聚合物)對于生物活性物質在體內的胞內傳遞一般是無效的。此外，目前可用載體在體外細胞轉染方面的應用也是有限的。
除載體法外，人們還研制出可直接轉染生物活性劑(包括遺傳物質)到細胞內的其它可供選擇的多種方法。這些方法包括，例如，磷酸鈣沉淀法和電穿孔法。然而，這些方法對于生物活性劑在體內的胞內傳遞也一般是無效的。
人們對于人或其它動物體內的各種疾病，例如遺傳性疾病，以及它們的相關蛋白轉錄的表征和認識已大有進展。這也迫使人們去研制開發(fā)或尋求用生物活性劑治療這類疾病的改進方法。這些不同方法涉及或需求胞內傳遞生物活性劑。然而，如上所述，目前的生物活性劑體內轉染細胞的方法一般是無效的。這樣阻礙了對治療各種疾病的改進方法的研究和使用。
細胞膜為選擇性屏障，它能阻止物質隨機進入細胞內。因此，胞內傳遞生物活性劑過程中最主要的困難被認為是如何將活性劑從胞外區(qū)轉移到胞內區(qū)。同樣也難以將生物活性劑定位于選定細胞膜的表面。
載體也是由病毒載體構成。具體講，轉染遺傳物質的載體是由完整病毒發(fā)展而來，病毒包括腺病毒和逆轉錄病毒。但是，只有有限量生物活性物質能被包封在病毒囊內。并且，在生物活性物質包括遺傳物質情況下，病毒載體可能會與所包封的遺傳物質和患者之間發(fā)生不希望的相互作用。
為使?jié)撛诘呐c病毒有關的相互作用降至最低程度，人們嘗試僅使用某些病毒組分。但這在體內是難以實現的，因為病毒組分必須能識別和達到靶細胞。盡管人們進行了廣泛深入研究，但仍未能尋找到適當的用于體內傳遞生物活性物質到細胞內的具有良好靶向性的病毒介導載體。
如上所述，脂質體已被用作胞內傳遞生物活性劑(包括遺傳物質)的載體。使用脂質體作為生物活性劑載體的早期方法之一公開在Szoka和Papahadjopou1os，生物物理和生物工程年度綜述，第9卷，第467-508頁(1980)中。此公開方法包括通過向溶在醚類溶劑中的磷脂內加入遺傳物質水溶液制備脂質體。蒸發(fā)醚相，得到包封在類脂微囊內的遺傳物質。
包封生物活性劑到脂質體中的另一方法包括擠壓脫水-再水化微囊。除上面所描述的這些方法外，用脂質體包封生物活性劑的其它方法也是公知的。
近年來，人們研制開發(fā)了由陽離子類脂，如N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(“DOTMA”)或包括陽離子聚合物如polysine制成的脂質體。例如，參見Xiaohuai和Huang，生物化學&生物物理學報，第1189卷，第195-203頁(1994)。特別是由陽離子物質制得的脂質體(以下稱作“陽離子脂質體”)已用于遺傳物質，包括DNA，轉染細胞的研究。據認為，陽離子脂質體與DNA中核苷酸的陰電荷磷酸鹽基團鍵合。研究表明，與其它載體如陽離子聚合物相比，陽離子脂質體在體外能更有效介導遺傳物質轉染細胞。此外，體外研究還表明，較之其它傳遞方法(包括電穿孔法和磷酸鈣沉淀法)，陽離子脂質體能提供改進的細胞轉染。
然而，目前能得到的陽離子類脂和陽離子脂質體對于生物活性劑的體內胞內傳遞一般是無效的。此外，它們對于生物活性劑在血清內的胞內傳遞一般也是無效的。因為細胞需要血清來生存，所以這是一種嚴重缺陷。實質上，在包含陽離子類脂和陽離子脂質體的基因轉染研究過程中，通常需要從組織培養(yǎng)浴中移去血清。轉染后，補充血清。這樣必須包括附加操作步驟，從而使得陽離子類脂和陽離子脂質體感染細胞變得復雜和麻煩。
特別需要新的和/或更好的陽離子類脂用于胞內傳遞生物活性劑。本發(fā)明的目的就在于此以及其它重要目的。
本發(fā)明概述本發(fā)明涉及陽離子類脂，它包括至少一個，優(yōu)選至少兩個陽離子基團，并且所述類脂可用于胞內傳遞生物活性劑。
具體講，在本發(fā)明的方案之一中，本發(fā)明涉及下式陽離子類脂化合物
其中x，y和z各自獨立代表0至約100的整數；每一X1獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；每一X2獨立代表O或S；每一Y1獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)a-，S(R6)a-，P(R6)a-或-CO2R6，其中a代表整數1至3；每一Y2獨立代表-N(R6)b-，-S(R6)b-或-P(R6)b-，其中b代表整數0至2；每一Y3獨立代表磷酸酯殘基，N(R6a-，S(R6)a，-P(R6)a-或-CO2R6，其中a代表整數1至3；R1，R2，R3和R4各自獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基；每一R5獨立代表氫或含有1至約10個碳原子的烷基；和每一R6獨立代表-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-Q，其中c和d各自獨立代表整數0至約100；每一Q獨立代表磷酸酯殘基，-N(R11)q，-S(R11)q，-P(R11)q或-CO2R6，其中q代表整數1至3；X3和X4各自獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；每一R7獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基；每一R8獨立代表氫或含1至約60個碳原子的烷基；R9和R10各自獨立代表含1至約20個碳原子的亞烷基；和每一R11獨立代表-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-W，其中每一W獨立代表磷酸酯殘基，-N(R12)w，-S(R12)w，-P(R12)w或-CO2R6，其中w代表整數1至3；和R12代表-[R7-X3]c-R8；其條件是式(I)化合物包括至少一個，且優(yōu)選至少兩個季鹽部分。
在另一方案中，本發(fā)明涉及下式陽離子類脂化合物Y1-R1-Y1(II)其中每一Y1獨立代表磷酸酯殘基，N(R2)a-，S(R2)a，-P(R2)a-或-CO2R2，其中a代表整數1至3；R1代表包含0至約30個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-雜原子或雜原子基的1至約60個碳原子的亞烷基；R2代表式-R4-[(X1-R5)x-Y2]y-R6基，其中x和y各自獨立代表整數0至約100；每一X1獨立代表直接鍵，-O-，-S-，-NR3-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R3)-，-N(R3)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-；每一X2獨立代表O或S；每一Y2獨立代表-S(R2)b，-N(R2)b-或-P(R2)b-，其中b代表整數0至2；每一R3獨立代表氫或1至約10碳原子的烷基；
R4和R5各自獨立代表直接鍵或包含0至約15個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-雜原子或雜原子基的1至約30個碳原子的亞烷基；和每一R6獨立代表氫或代表包含0至約30個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-雜原子或雜原子基的1至約60個碳原子的烷基；其條件是式(II)化合物包括至少一個，且優(yōu)選至少兩個季鹽部分。
在再一方案中，本發(fā)明涉及下式陽離子類脂化合物
其中x，y和z各自獨立代表整數0至約100；每一X1獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-，每一X2獨立代表O或S；每一Y1獨立代表-O-，-N(R6)a-，S(R6)a，或-P(R6)a-，其中a代表整數1至2；每一Y2獨立代表-N(R6)a-，-S(R6)a-或-P(R6)a-，其中a代表整數0至2；每一Y3獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)b-，S(R6)b-，P(R6)b-或-CO2R6，其中b代表整數1至3；R1，R2，R3和R4各自獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基；每一R5獨立代表氫或1至約10個碳原子的烷基；和每一R6獨立代表-[R7-X3]C-R8或-R9-[X4-R10]d-Q，其中c和d各自獨立代表整數0至約100；每一Q獨立代表磷酸酯殘基，-N(R11)q，-S(R11)q，-P(R11)q或-CO2R11，其中q代表整數1至3；X3和X4各自獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；
每一R7獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基；每一R8獨立代表氫或含1至約60個碳原子的烷基；R9和R10各自獨立代表含1至約20個碳原子的亞烷基；和每一R11獨立代表-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-W，其中每一w獨立代表磷酸酯殘基，-N(R12)w，-S(R12)w，-P(R12)w或-CO2R12，其中w代表整數1至3；和R12代表-[R7-X3]c-R8；其條件是式(III)化合物包括至少一個，且優(yōu)選至少兩個季鹽部分。
包括至少一個，且優(yōu)選至少兩個陽離子基團的陽離子類脂化合物也是本發(fā)明的主題。
本發(fā)明的另一方面涉及陽離子類脂組合物，該組合物由包含至少一個，優(yōu)選至少兩個陽離子基團的陽離子類脂化合物組成。
本發(fā)明的再一方面涉及用于胞內傳遞生物活性劑的陽離子類脂制劑。此制劑包括與生物活性劑結合的包含至少一個，優(yōu)選至少兩個陽離子基團的陽離子類脂化合物。
本發(fā)明還進一步涉及用于胞內傳遞生物活性劑的陽離子類脂制劑的制備方法。此方法包括一同混合生物活性劑和包括具有至少一個，優(yōu)選至少兩個陽離子基團的陽離子類脂化合物的陽離子類脂組合物。
本發(fā)明還包括胞內傳遞生物活性劑的方法。該方法包括將具有至少一個，優(yōu)選至少兩個陽離子基團的陽離子類脂化合物和生物活性劑與細胞接觸。
根據本說明書和權利要求書，本發(fā)明的這些和其它各方面變得更加清楚。
附圖簡述附
圖1和2圖解表示使用本發(fā)明陽離子類脂化合物和現有技術公開的化合物的轉染試驗中表達蛋白質的量。
發(fā)明詳述如上和全文中所用，下列術語，除非另有說明，應理解為具有下述含義。
“烷基”是指鏈中具有1至約60個碳原子的直鏈或支鏈脂族烴基。“低級烷基”是指具有1至約8個碳原子的烷基。“高級烷基”是指具有約10至約20個碳原子的烷基。烷基可以被一個或多個相同或不同的烷基取代基任選取代。其中“烷基取代基”包括鹵素，芳基，羥基，烷氧基，芳氧基，芳烷氧基，烷硫基，芳硫基，芳烷氧基，芳烷硫基，羧基，烷氧基羰基，氧代和環(huán)烷基。烷基鏈中可任選地插入一個或多個氧，硫或取代或未取代氮原子，其中氮取代基為低級烷基?！爸ф溚榛笔侵钙渲械图壨榛缂谆?，乙基或丙基連接于線性烷基鏈上的烷基。典型的烷基包括甲基，乙基，異丙基，正丁基，叔丁基，正戊基，庚基，辛基，癸基，十二烷基，十三烷基，十四烷基，十五烷基和十六烷基。優(yōu)選的烷基包括1至約4個碳原子的低級烷基和包含約12至約16個碳原子的高級烷基。優(yōu)選的烷基還包括被一個或多個鹵原子取代的烷基。優(yōu)選的鹵代烷基為氟代烷基，它包括，例如，式CF3(CF2)n(CH2)m-氟代烷基，其中m和n各自獨立為0至約22的整數。典型的氟代烷基包括全氟甲基，全氟乙基，全氟丙基，全氟丁基，全氟環(huán)丁基，全氟戊基，全氟己基，全氟庚基，全氟辛基，全氟壬基，全氟癸基，全氟代十一烷基和全氟代十二烷基。
“鏈烯基”是指含有至少一個碳-碳雙鍵的烴基。鏈烯基可被一個或多個“烷基取代基”任選取代。典型的鏈烯基包括乙烯基，烯丙基，正戊烯基，癸烯基，十二碳烯基，十四碳二烯基，十七碳-8-烯-1-基和十七碳-8，11-二烯-1-基。
“炔基”是指含有碳-碳三鍵的烴基。炔基可被一個或多個“烷基取代基”任選取代。典型的炔基包括乙炔基，丙炔基，正戊炔基，癸炔基和十二碳炔基。優(yōu)選的炔基包括低級炔基。
“環(huán)烷基”是指含有約4至約10個碳原子的非芳香單或多環(huán)體系。環(huán)烷基可任選為部分不飽和的。環(huán)烷基還可被芳基取代基，氧代和/或亞烷基任選取代。優(yōu)選的單環(huán)環(huán)烷基環(huán)包括環(huán)戊基，環(huán)己基和環(huán)庚基。優(yōu)選的多環(huán)環(huán)戊基環(huán)包括金剛烷基，八氫化萘基，十氫化萘基，樟腦，莰烷，降金剛烷基，二環(huán)[2.2.2]辛-5-烯，順式-5-降冰片烯，5-降冰片烯，(1R)-(-)桃金娘烷，降冰片烷和反-3-氧代-三環(huán)[2.2.1.02.6]庚烷。
“芳基”是指含有約6至約10個碳原子的芳香碳環(huán)基。芳基可任選被一個或多個相同或不同的芳基取代基取代，其中“芳基取代基”包括烷基，鏈烯基，炔基，芳基，芳烷基，羥基，烷氧基，芳氧基，羧基，芳?；?，鹵素，硝基，三鹵代甲基，氰基，烷氧基羰基，芳氧基羰基，芳烷氧基羰基，酰氧基，酰氨基，芳酰氨基，氨基甲?；榛被柞；榛被柞；?，芳硫基，烷硫基，亞烷基和-NRR′，其中R和R″各自獨立代表氫，芳基和芳烷基。典型的芳基基團包括取代或未取代苯基以及取代或未取代萘基。
“?；笔侵竿榛?CO-，其中烷基如上所述。優(yōu)選的?；ㄆ渲型榛?至約30個碳原子的酰基。典型的?；ㄒ阴；；?-甲基丙?；□；妥貦磅；?。
“芳酰基”是指芳基-CO-基團，其中芳基如上所述。典型的芳?；ū郊柞；?-和2-萘?；?。
“烷氧基”是指烷基-O-基團，其中烷基如上所述。典型的烷氧基基團包括甲氧基，乙氧基，正丙氧基，異丙氧基，正丁氧基和庚氧基。
“芳氧基”是指芳基-O-基團，其中芳基如上所述。典型的芳氧基基團包括苯氧基和萘氧基。
“烷硫基”是指烷基-S-基團，其中烷基如上所述。典型的烷硫基基團包括甲硫基，乙硫基，異丙硫基和庚硫基。
“芳硫基”是指芳基-S-基團，其中芳基如上所述。典型的芳硫基包括苯硫基和萘硫基。
“芳烷基”是指芳基-烷基-基團，其中芳基和烷基各自如上所述。典型的芳烷基包括芐基，苯乙基和萘甲基。
“芳烷氧基”是指芳烷基-O-基團，其中芳烷基如上所述。典型的芳烷氧基為芐氧基。
“芳烷硫基”是指芳烷基-S-基團，其中芳烷基如上所述。典型的芳烷硫基為芐硫基。
“二烷基氨基”是指-NRR′基團，其中R和R″各自獨立代表如上所述的烷基。典型的烷基氨基包括乙基甲基氨基，二甲基氨基和二乙基氨基。
“烷氧基羰基”是指烷基-O-CO-基團。典型的烷氧基羰基包括甲氧基羰基，乙氧基羰基，丁氧基羰基和叔丁氧基羰基。
“芳氧基羰基”是指芳基-O-CO-基團。典型的芳氧基羰基包括苯氧基-和萘氧基-羰基。
“芳烷基氧基羰基”是指芳烷基-O-CO-基團。典型的芳烷基氧基羰基為芐氧基羰基。
“氨基甲酰基”是指H2N-CO-基團。
“烷基氨基甲酰基”是指R′RN-CO-基團，其中R和R′之一為氫而其它R和R′為如上所述的烷基。
“二烷基氨基甲?；笔侵窻′RN-CO-基團，其中R和R′各自獨立代表如上所述的烷基。
“酰氧基”是指?；?O-基團，其中?；缟纤?。
“酰氨基”是指?；?NH-基團，其中?；缟纤?。
“芳?；被笔侵阜减；?NH-基團，其中芳?；缟纤?。
“亞烷基”是指具有1至約30個碳原子的直鏈或支鏈二價脂族烴基。亞烷基可以是直鏈，支鏈或環(huán)狀的。亞烷基也可以任選為不飽和的和/或被一個或多個“烷基取代基”取代。亞烷基鏈中也可以任選地插入一個或多個氧，硫或取代或未取代氮原子，其中氮取代基為如上所述的烷基。典型的亞烷基包括亞甲基(-CH2-)，亞乙基(-CH2CH2-)，1，3-亞丙基(-(CH2)3-)，亞環(huán)己基(-C6H10-)，-CH＝CH-CH＝CH-，-CH＝CH-CH2-，-(CF2)n(CH2)m-，其中n為約1至約22的整數，m為0至約22的整數，-(CH2)n-N(R)-(CH2)m-，其中m和n各自獨立為0至約30的整數且R代表氫或烷基，亞甲二氧基(-O-CH2-O-)和1，2-亞乙基二氧基(-O-(CH2)2-O-)。優(yōu)選亞烷基含有約2至約3個碳原子。
“鹵代”或“鹵化物”是指氟化物，氯化物，溴化物或碘化物。
“雜原子基”是指含有至少一個雜原子的基團。
“氨基酸”是指天然存在的或合成的氨基酸。
“多肽”是指具有兩個或多個通過肽鍵鍵合的氨基酸殘基的生物活性系列物。優(yōu)選具有約3至約40個氨基酸殘基的多肽。
“磷酸酯殘基”是指衍生自磷酸(O＝P(OH)3)的取代基。優(yōu)選磷酸酯殘基為被一個或多個烷基和/鏈烯基取代的磷酸酯。優(yōu)選的磷酸酯包括磷脂。磷脂之中優(yōu)選磷酸甘油酯，且特別優(yōu)選二?；视土姿狨?。典型的二?；视土姿狨?，2-二油?；视?3-乙基磷酸酯。
“季鹽”是指銨、锍或膦類化合物，其中銨、锍或膦離子的氫原子被烷基取代。對于季銨和膦化合物，其分子結構包括與四個有機基團，例如四個烷基的氮或磷。季锍化合物的分子結構包括與三個有機基團連接的硫原子。這些分子結構為正電性的，且通常稱作陽離子基。盡管不是必需的，但陽離子一般與帶陰電的酸基結合在一起。陰電基通常稱作陰離子或陰離子基。典型的陰離子包括，例如，鹵離子。季鹽一般為氮，硫或磷的最終烷基化步驟的產物。
“類脂”是指合成或天然存在的兩親化合物，它包括親水組分和疏水組分。類脂包括，例如，脂肪酸，中性脂肪，磷脂，糖酯，脂族醇和蠟，萜烯和甾族化合物。
“陽離子類脂化合物”是指包括陽離子基團的類脂，且通常在溶液中起陽離子作用。優(yōu)選的陽離子類脂化合物為包括至少一個陽離子基團的類脂，并且更優(yōu)選包括至少兩個或多個陽離子基團的類脂。
“陽離子基“是指帶正電荷的基團。優(yōu)選的陽離子基包括季鹽陽離子。典型的季鹽為銨，膦和锍鹽。
“抗衡離子”是指陰離子?！翱伤幱谩钡年庪x子實質上是無毒的并且不會使所締合陽離子變?yōu)樗帉W上不可接受。
“陽離子類脂組合物”是指包括陽離子類脂化合物的組合物。典型的陽離子類脂組合物包括懸浮液，乳液，囊狀組合物和六方形H II相結構?！瓣栯x子類脂制劑”是指包括陽離子類脂化合物和生物活性劑的組合物。
“電荷密度”是指每單位質量或體積上的電荷數量。
“微囊”或“微囊體”是指其特征是存在內空隙的球狀體。優(yōu)選的微囊或微囊體是由類脂配制形成，類脂包括本發(fā)明的陽離子類脂化合物。在任何給定的微囊或微囊體中，類脂可以單層或雙層形式存在，且單層-或雙層類脂可用于形成一個或多個單-或雙層。在多于一個單-或雙層情況下，單-或雙層一般是同心的。類脂微囊或微囊體包括這些通常被稱作脂質體，微膠粒等實體物。因此，類脂可用于形成單膜層微囊(由一個單層或雙層構成)，寡膜層微囊(由約兩個或約三個單層或雙層構成)或多膜層微囊(由多于約三個單層或雙層構成)。微囊的內空隙通常用液體，包括，例如，含水液體，氣體，氣體前體，和/或固體物質，包括，例如，生物活性劑填充。
“陽離子微囊”或“陽離子微囊組合物”是指用陽離子類脂化合物配制得到的微囊或微囊體。
“陽離子微囊制劑”是指包括微囊或微囊體和生物活性劑的組合物。
“脂質體”是指由兩親化合物，包括類脂化合物，典型地以一或多同心層，例如雙層形式聚集而成的一般球狀體。
“乳狀液”是指兩種或多種液體的類脂混合物，且一般為膠態(tài)形式。類脂可以非均相地分散在乳狀液中。另一方面，類脂可以以，例如，球或層(包括單-或雙層)形式聚集。
“懸浮液”是指浮動在液體中的細碎膠?；旌衔铩?br>
“六方形H II相結構”是指類脂在液體介質如含水介質中一般是片狀聚集，其中在管中，類脂的親水部分一般面向內，與液態(tài)環(huán)境相結合。類脂的疏水部分一般向外輻射，這種復雜結構假定為六角管形。六方相結構中通常一同堆積有眾多這種六角管。
本文所用的“患者”是指動物，包括哺乳動物，優(yōu)選人。
“生物活性劑”是指能夠在體外和/或體內產生生物學效應的物質。就性質上來說，生物學效應優(yōu)選為治療效應。如這里所用，“生物活性劑”還指在就性質而言屬于診斷的應用方面使用的物質，如在診斷患者是否患有或無疾病的方法中使用的物質。生物活性劑可以是中性的或為帶正電或帶負電的。優(yōu)選生物活性劑為帶負電的。適當的生物活性劑的實例包括藥劑和藥物，合成有機分子，蛋白質，維生素，甾族化合物，聚陰離子，核苷，核苷酸，多核苷酸和診斷劑，如對患者進行核磁共振成象，超聲或計算機控制斷層照相時使用的造影劑。
“陰離子基”是指帶負電的基團。優(yōu)選的陰離子基包括磷酸根(PO4-)。
“陰離子生物活性劑”是指包括至少一個陰離子基的生物活性劑。某些遺傳物質，例如，多核苷酸，為代表性的陰離子生物活性劑。
“遺傳物質”一般是指核苷酸和多核苷酸，包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。遺傳物質可通過本領域技術人員公知的化學合成方法，或采用重組技術，或結合這兩種方法制備。DNA和RNA可任選地包括非天然核苷酸，并且可以為單或雙鏈。“遺傳物質”還指有義和反義DNA和RNA，即與DNA和/或RNA中的核苷酸的特定序列互補的核苷酸序列。
“藥劑”或“藥物”是指用于預防，診斷，緩解，治療或治愈患者疾病，痛苦，病癥或損傷的任何治療或預防劑。治療有用的多核苷酸和多肽也包括在藥物的定義內。
“與…結合”是指將生物活性劑與本發(fā)明陽離子類脂化合物結合。陽離子類脂化合物可以與生物活性劑以任何不同的方法結合。例如，當陽離子類脂化合物為陽離子微囊或陽離子微囊組合物形式時，生物活性劑可包封在微囊的內空隙中。同樣還可以知道，生物活性劑可結合在微囊的層或壁上，例如，通過分散在包含在微囊層或壁內的類脂上結合。此外，還可以知道，生物活性劑可定位在微囊的表面。在這種情況下，生物活性劑可與微囊的表面存在相互的化學作用，且大體上保持與其粘附。這種相互作用可采取如靜電相互作用，氫鍵，范得瓦耳斯力或共價鍵等形式。另一方面，或除上所述外，生物活性劑可與微囊的表面進行有限的相互作用。這種有限的相互作用將容許生物活性劑從微囊的第一表面遷移到微囊的第二表面。
“細胞內的”或“細胞內地”是指細胞質膜內的區(qū)域，包括原生質，胞質和/或核質。“胞內傳遞”是指傳遞生物活性劑到細胞質膜內的區(qū)域。
“細胞”是指構成生物組織的細小的原生質團，包括被膜所包圍的各種原生質。所述細胞包括有核和無核細胞和細胞器。
“免疫活性”是指免疫系統(tǒng)抗病原體或感染劑的能力。
本發(fā)明部分涉及一類新的陽離子類脂化合物，它們非常適用與胞內傳遞一種或多種生物活性劑。這類新類脂的更詳盡說明見下。
具體講，在其中的一種實施方案中，本發(fā)明涉及下式陽離子類脂化合物
其中x，y和z各自獨立代表0至約100的整數；每一X1獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；每一X2獨立代表O或S；每一Y1獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)a-，S(R6)a-，P(R6)a-或-CO2R6，其中a代表整數1至3；每一Y2獨立代表-N(R6)b-，-S(R6)b-或-P(R6)b-，其中b代表整數0至2；每一Y3獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)a-，S(R6)a-，P(R6)a-或-CO2R6，其中a代表整數1至3；R1，R2，R3和R4各自獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基；每一R5獨立代表氫或含有1至約10個碳原子的烷基；和每一R6獨立代表-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-Q，其中c和d各自獨立代表0至約100的整數；每一Q獨立代表磷酸酯殘基，-N(R11)q，-S(R11)q，-P(R11)q或-CO2R11，其中q代表整數1至3；X3和X4各自獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；每一R7獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基；每一R8獨立代表氫或含1至約60個碳原子的烷基；R9和R10各自獨立代表含1至約20個碳原子的亞烷基；和每一R11獨立代表-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-W，其中每一W獨立代表磷酸酯殘基，-N(R12)w，-S(R12)w，-P(R12)w或-CO2R12，其中w代表整數1至3；和R12代表-[R7-X3]c-R8；其條件是式(I)化合物包括至少一個，且優(yōu)選至少兩個季鹽部分。
上述式(I)中，x，y和z各自獨立代表0至約100的整數。優(yōu)選x，y和z各自獨立代表0至約50的整數，其中較優(yōu)選整數0至約20。更優(yōu)選的是，x，y和z各自獨立代表0至約10的整數；更優(yōu)選整數0至約5。在某些特別優(yōu)選的實施方案中，x為1，y為2或3，且z為0或1。
上述式(I)中，每一X1獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-。優(yōu)選每一X1獨立代表-C(＝O)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝O)-，-C(＝O)-O-或-O-C(＝O)-。
上述X1，X3和X4的定義中，每一X2獨立代表O或S。優(yōu)選X2代表O。
上述式(I)中，每一Y1獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)a-，S(R6)a-，P(R6)a-或-CO2R6，其中a代表整數1至3。優(yōu)選每一Y1獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)a-，或-CO2R6，其中a代表2或3，優(yōu)選a代表3。
上述式(I)中，每一Y2獨立代表-N(R6)b-，-S(R6)b-或-P(R6)b-，其中b代表整數0至2。優(yōu)選Y2代表-N(R6)b-，其中b代表1或2。
上述式(I)中，每一Y3獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)a-，S(R6)a-，P(R6)a-或-CO2R6，其中a代表整數1至3。優(yōu)選每一Y3獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)a-或-CO2R6，其中a代表整數2或3。優(yōu)選a代表3。
上述式(I)中，R1，R2，R3和R4各自獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基。優(yōu)選R1，R2，R3和R4各自獨立代表含有1至約10個碳原子的直鏈亞烷基或約4至約10個碳原子的亞環(huán)烷基。較優(yōu)選R1，R2，R3和R4各自獨立代表含有1至約4個碳原子的直鏈亞烷基或含有約5至約7個碳原子的亞環(huán)烷基。更優(yōu)選R1，R2，R3和R4各自獨立代表亞甲基，亞乙基或亞環(huán)己基。
在上述X1，X3和X4的定義中，每一R5獨立代表氫或含有1至約10個碳原子的烷基。優(yōu)選每一R5獨立代表氫或含有1至約4個碳原子的烷基。更優(yōu)選R5代表氫。
在上述Y1，Y2和Y3定義中，每一R6獨立代表-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-Q，其中c和d各自獨立代表0至約100的整數。優(yōu)選c和d各自獨立代表0至約50的整數，其中較優(yōu)選整數0至約20。更優(yōu)選的是，c和d各自獨立代表0至約10的整數，其中較優(yōu)選整數0至約5。在特別優(yōu)選的實施方案中，c代表0或1而d代表1。
上述R6中的Q各自獨立代表磷酸酯殘基，-N(R11)q，-S(R11)q，-P(R11)q或-CO2R11，其中q代表整數1至3。優(yōu)選每一Q獨立代表磷酸酯殘基，-N(R11)q或-CO2R11，其中q代表2或3。優(yōu)選q代表3。
同樣在上述R6的定義中，X3和X4各自獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-，其中X2和R5的定義同前所述。優(yōu)選X3和X4獨立代表-C(＝O)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝O)-，-C(＝O)-O-或-O-C(＝O)-。
在上述R6，R11和R12的定義中，，每一R7獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基。優(yōu)選每一R7獨立代表1至約10個碳原子的亞烷基，更優(yōu)選1至約4個碳原子的亞烷基。較優(yōu)選的是，每一R7獨立代表亞甲基或亞乙基。
在上述R6，R11和R12的定義中，每一R8獨立代表氫或含1至約60個碳原子的烷基。優(yōu)選的是，每一R8獨立代表氫或1至約40個碳原子的烷基，其中較優(yōu)選氫或1至約20個碳原子的烷基。更優(yōu)選的是，每一R8獨立代表氫或1至約16個碳原子的烷基。在某些特別優(yōu)選的實施方案中，每一R8獨立代表氫，甲基，十二烷基或十六烷基。
在上述R6和R11定義中，R9和R10各自獨立代表含1至約20個碳原子的亞烷基。優(yōu)選R9和R10各自獨立代表1至約10個碳原子的亞烷基，更優(yōu)選R9和R10各自獨立代表1至約4個碳原子的亞烷基。愈加優(yōu)選的是，R9和R10各自獨立代表亞甲基或亞乙基。
上述Q中的每一R11獨立代表-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-W，其中c，d，X3，X4，R7，R8，R9和R10各自獨立地如上所述。
上述R11中的每一W獨立代表磷酸酯殘基，-N(R12)w，-S(R12)w，-P(R12)w或-CO2R12，其中w代表整數1至3。優(yōu)選W代表磷酸酯殘基，-N(R12)w或-CO2R12，其中w代表2或3。優(yōu)選w代表3。
在上述W的定義中，R12代表-[R7-X3]c-R8，其中c，X3，R7和R8各自獨立地如上所述。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供下式陽離子類脂化合物Y1-R1-Y1(II)其中每一Y1獨立代表磷酸酯殘基，N(R2)a-，S(R2)a-，P(R2)a-或-CO2R2，其中a代表整數1至3；
R1代表包含0至約30個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-雜原子或雜原子基的1至約60個碳原子的亞烷基；R2代表式-R4-[(X1-R5)x-Y2]y-R6基，其中x和y各自獨立代表整數0至約100；每一X1獨立代表直接鍵，-O-，-S-，-NR3-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R3)-，-N(R3)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-；每一X2獨立代表O或S；每一Y2獨立代表-S(R2)b，-N(R2)b-或-P(R2)b-，其中b代表整數0至2；每一R3獨立代表氫或1至約10碳原子的烷基；R4和R5各自獨立代表直接鍵或包含0至約15個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-雜原子或雜原子基的1至約30個碳原子的亞烷基；和每一R6獨立代表氫或代表包含0至約30個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-雜原子或雜原子基的1至約60個碳原子的烷基；其條件是式(II)化合物包括至少一個，且優(yōu)選至少兩個季鹽部分。
上述式(II)中，每一Y1獨立代表磷酸酯殘基，N(R2)a-，S(R2)a-，P(R2)a-或-CO2R2，其中a代表整數1至3。優(yōu)選每一Y1獨立代表磷酸酯殘基，N(R2)a-，或-CO2R2，其中a代表2或3，優(yōu)選a代表3。
同樣在上述式(II)中，R1代表包含0至約30個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-雜原子或雜原子基的1至約60個碳原子的亞烷基。優(yōu)選的是，R1代表1至約40個碳原子的亞烷基，其中優(yōu)選1至約20個碳原子的亞烷基。更優(yōu)選的是，R1代表含1至約10個碳原子的直鏈亞烷基或含約4至約10個碳原子的亞環(huán)烷基。愈加優(yōu)選的是，R1代表含1至約4個碳原子的直鏈亞烷基或含約5至約7個碳原子的亞環(huán)烷基。
在上述Y1的定義中，R2代表式-R4-[(X1-R5)x-Y2]y-R6基，其中x和y各自獨立代表整數0至約100。優(yōu)選的是，x和y各自獨立代表0至約50的整數，其中較優(yōu)選整數0至約20。更優(yōu)選的是，x和y各自獨立代表整數0至約10。
在上述R2的定義中，每一X1獨立代表直接鍵，-O-，-S-，-NR3-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R3)-，-N(R3)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-。優(yōu)選X1代表直接鍵，-C(＝X2)-N(R3)-，-N(R3)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，或-O-C(＝X2)-。
在上面X1，R1，R4，R5和R6的定義中各X2獨立地是O或S。優(yōu)選地，X2是O。
在上面R2的定義中各Y2獨立地是-S(R2)b-，-N(R2)b-或-P(R2)b-，其中b是0至2的整數。優(yōu)選地，Y2是-N(R2)b-而b是1或2。
在上面X1、R1、R4、R5和R6的定義中，各R3獨立地是氫或1至約10個碳的烷基。優(yōu)選地，各R3獨立地是氫或1至約4個碳的烷基。更優(yōu)選地，R3是氫。
在上面R2的定義中，各R4和R5獨立地是直接鍵或含有0至約15個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-雜原子或雜原子基團的1至30個碳的亞烷基。優(yōu)選地各R4和R5獨立地是直接鍵或1至約20個碳的亞烷基。更優(yōu)選地，各R4和R5獨立地是直接鍵，1至約10個碳的直鏈亞烷基或4至約10個碳的亞環(huán)烷基。還更優(yōu)選地，各R4和R5獨立地是直接鍵，1至約4個碳的直鏈亞烷基或5至約7個碳的亞環(huán)烷基。
在上面R2中，各R6獨立地是氫或含有0至約30個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-雜原子或雜原子基團的1至約60個碳的烷基。優(yōu)選地，各R6獨立地是氫或1至約40個碳的烷基。更優(yōu)選地，各R6獨立地是氫或1至20個碳的烷基。
在本發(fā)明的另一方案中，提供下式的陽離子類脂化合物。
其中各x、y和z獨立地是0至約100的整數；
各X1獨立地是-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-、-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；各X2獨立地是O或S；各Y1獨立地是-O-，-N(R6)a-，-S(R6)a-或-P(R6)a-，其中a是0至2的整數；各Y2獨立地是-N(R6)a-、-S(R6)a-或-P(R6)a-，其中a是0至2的整數；各Y3獨立地是磷酸殘基，N(R6)b-，S(R6)b-，P(R6)b-或-CO2R6，其中b是1至3的整數；各R1，R2，R3和R4獨立地是1至約20個碳的亞烷基；各R5獨立地是氫或1至約10個碳的烷基；和各R6獨立地是-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-Q，其中各c和d獨立地是0至約100的整數；各Q獨立地是磷酰殘基，-N(R11)q，-S(R11)q，-P(R11)q或-CO2R11，其中q是1至3的整數；各X3和X4獨立地是-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；各R7獨立地是1至20個碳的亞烷基；各R8獨立地是氫或1至約60個碳的烷基；各R9和R10獨立地是1至約20個碳的亞烷基；和各R11獨立地是-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-W，其中各W獨立地是磷酸殘基，-N(R12)w，-S(R12)w，-P(R12)w或-CO2R12，其中w是1至3的整數；且R12是-[R7-X3]c-R8；條件是式(III)化合物包含至少一個，優(yōu)選至少兩個季鹽。
在上面式(III)中，各x，y和z獨立地是0至約100的整數。優(yōu)選地，各x、y和z獨立地是0至約60的整數，而整數0至約20是更優(yōu)選的。還更優(yōu)選地，各x、y和z獨立地是0至約10的整數。進一步更優(yōu)選地，各x、y和z獨立地是0至約5的整數。在某些具體的優(yōu)選方案中，x是1，y是2或3而Z是0或1。
在上面式(III)中，各X1獨立地是-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-。優(yōu)選地，各X1獨立地是-C(＝O)-NR5-，-NR5-C(＝O)-，-C(＝O)-O-或-O-C(＝O)-。
在上面X1，X3和X4的定義中，各X2獨立地是O或S。優(yōu)選地，X2是O。
在上面式(III)中，各Y1獨立地是-O-，-N(R6)a-，-S(R6)a-或-P(R6)a-，其中a是0至2的整數。優(yōu)選地，Y1為-N(R6)a-，其中a是1或2。
在上面式(III)中，各Y2獨立地是-N(R6)a-，-S(R6)a-或-P(R6)a-，其中a是0至2的整數。優(yōu)選地，Y2是-N(R6)a-。
在上面式(III)中，各Y3獨立地是磷酸殘基，N(R6)b-，S(R6)b-，P(R6)b-或-CO2R6，其中b是1至3的整數。優(yōu)選地，各Y3獨立地是磷酸殘基或N(R6)b-，其中b是2或3。優(yōu)選地，b是3。
在上面式(III)中，各R1，R2，R3和R6獨立地是1至約20個碳的亞烷基。優(yōu)選地，各R1，R2，R3和R4獨立地是1至約10個碳的直鏈亞烷基或約4至約10個碳的亞環(huán)烷基。更優(yōu)選地，各R1，R2，R3和R4獨立地是1至約4個碳的亞烷基或約5至約7個碳的亞環(huán)烷基。還更優(yōu)選地，各R1，R2，R3和R4獨立地是亞甲基，亞乙基或亞環(huán)已基。
在上面X1，X3和X4的定義中，各R5獨立地是氫或1至約10個碳的烷基。優(yōu)選地，各R5獨立地是氫或1至約4個碳的烷基。更優(yōu)選地，R5是氫。
在上面Y1，Y2和Y3的定義中，各R6獨立地是-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-Q，其中各c和d獨立地是0至約100的整數。優(yōu)選地，各c和d獨立地是0至約50的整數，0至約20的整數更優(yōu)選。還更優(yōu)選地，各c和d獨立地是0至約10的整數，而0至5的整數進一步更優(yōu)選。在某些具體的優(yōu)選方案中，c是0或1而d是1。
在上面R6中各Q獨立地是磷酸殘基，-N(R11)q，-S(R11)q-，-P(R11)q或-CO2R11，其中q是1至3的整數。優(yōu)選地，各Q獨立地是磷酸殘基，-N(R11)q或-CO2R11，其中q是2或3。優(yōu)選地，q是3。
也在上面R6的定義中，各X3和X4獨立地是-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(=X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-，其中X2和R5如前所述。優(yōu)選地，各X3和X4獨立地是-C(＝O)-NR5-，-NR5-C(＝O)-，-C(＝O)-O-或-O-C(＝O)-。
在上面R6，R11和R12的定義中，各R7獨立地是1至約20個碳的亞烷基。優(yōu)選地，各R7獨立地是1至約10個碳的亞烷基，而1至約4個碳的亞烷基是優(yōu)選的。更優(yōu)選地，各R7獨立地是亞甲基或亞乙基。
同樣在上面R6，R11和R12的定義中，各R8獨立地是氫或1至約60個碳的烷基。優(yōu)選地，各R8獨立地是氫或1至約40個碳的烷基，而1至約20個碳的烷基更優(yōu)選。在某些具體的優(yōu)選方案中，各R8獨立地是氫，甲基，十二烷基或十六烷基。
在上面R6和R11的定義中，各R9和R10獨立地是1至約20個碳的亞烷基。優(yōu)選地，各R9和R10獨立地是1至約10個碳的亞烷基。更優(yōu)選地，各R9和R10獨立地是1至約4個碳的亞烷基。還更優(yōu)選地，各R9和R10獨立地是亞甲基或亞乙基。
在上面的Q中，各R11獨立地是-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-W，其中各c、d，X3，X4，R7，R8，R9和R10獨立地如前所述。
在上面R11中，各W獨立地是磷酸殘基，-N(R12)w，-S(R12)W、-P(R12)W或-CO2R12，其中w是1至3的整數。優(yōu)選地，各w獨立地是磷酸殘基，-N(R12)w或-CO2R12，其中w是2或3。優(yōu)選地，w是3。
在上面W中，R12是-[R7-X3]c-R8，其中各c、X3、R7和R8獨立地如前所述。
在上式中，當任何符號在具體通式或取代基中出現多于一次時，在各自情況下其意義是彼此獨立的。
同樣在上式中，當各兩個或多個相鄰符號被定義為“直接鍵”以提供多重的，相鄰直接鍵時，多重的和相鄰的直接鍵轉移為單直接鍵。
上面式(I)，(II)和(III)的化合物是陽離子類脂化合物的例子，它們是本發(fā)明的主題。陽離子類脂化合物的陽離子或正電荷性質歸結于至少一個陽離子基團的存在。在優(yōu)選的方案中，至少兩個陽離子基團存在于本發(fā)明的陽離子類脂化合物中。陽離子基團存在賦予了陽離子類脂化合物需要的且有利的性質，這類性質是原來已知的化合物所沒有的。特別是，與現有技術的類脂化合物相比，本發(fā)明的陽離子類脂化合物具有改進的結合生物活性劑和/或與其螯合的能力。這些陽離子類脂化合物與生物活性劑的這種結合和/或螯合以后通稱為“相互作用”。因此，本發(fā)明的陽離子類脂化合物特別適合用作生物活性劑的載體和用于生物活性劑的細胞內輸送。
本發(fā)明人不愿意受任何理論或操作理論的束縛，認為本發(fā)明陽離子類脂化合物改進的與生物活性劑相互作用的能力是由于，至少部分地歸結為本發(fā)明類脂化合物加強的電荷密度。在此聯(lián)系中，本發(fā)明陽離子類脂化合物具有由于至少一個，優(yōu)選地至少兩個陽離子基團存在的增加的正電荷密度。如下面詳細討論的，這一增強的電荷密度導致了與生物活性劑出乎意料的理想相互作用。
生物活性劑，無論是中性的(不帶電荷的)還是帶正電或負電的，典型地含有偶極矩和/或一個或多個雜原子，例如，氮，氧和硫原子。這些雜原子通常具有一個或多個未共離電子對。據認為，帶正電荷的本發(fā)明類脂化合物與偶極矩的負電區(qū)和/或與雜原子上的未共離電子對靜電相互作用。
本發(fā)明的陽離子類脂化合物具有與陰離子和含有一個或多個陰離子基的生物活性劑相互作用的特別改進的能力。與中性或正電荷生物活性劑相化，這類陰離子生物活性劑具有更大的負電荷密度。
由于本發(fā)明陽離子類脂化合物與生物活性劑相互作用的改進的能力，本發(fā)明類脂化合物特別適合用作細胞內輸送生物活性劑的載體。因而，本發(fā)明的陽離子類脂化合物特別可用于體外和/或體內治療疾病，包括遺傳疾病，該病包括或需要細胞內輸送生物活性劑的方法中。
如下面詳細討論的，陽離子化合物也特別適合用于配制陽離子微囊，包括微膠粒和脂質體。本發(fā)明人已發(fā)現陽離子脂質體也特別適合用作細胞內輸送生物活性劑的載體。
如上面指出的，本發(fā)明的陽離子類脂化合物包含至少一個，優(yōu)選地至少兩個，陽離子基團。在另一方案中，陽離子化合物包含多于至少兩個陽離子基團，例如，至少三個陽離子基團。在另一方案中，陽離子類脂化合物包含至少四個陽離子基團。在另一方案中，陽離子類脂化合物包含至少五個陽離子基團。在某些方案中，陽離子類脂化合物包含多于五個陽離子基團。
僅僅用于舉例說明，而不是限制，陽離子基團可以，例如，由式(I)化合物中的Y1提供。這樣的話，例如，當式(I)中Y1是N(R6)a-而a是3時，形成季鹽，其中Y1的氮原了連接到四個其它碳原子上。因此氮原子帶正電荷。
除了上面討論的陽離子基團外，其它陽離子基團，以本公開為基礎，對普通技術人員將是顯而易見的。
在其中陽離子基團包含四級鹽的方案中，陽離子類脂化合物一般(盡管不是必須)與抗衡離子關聯(lián)。優(yōu)選地，抗衡離子是藥學上可接受的抗衡離子。
在本發(fā)明的某些優(yōu)選的方案中，抗衡離子選自由鹵離子，R13SO-3，R13CO-2，磷酸根，亞硫酸根，硝酸根，葡糖酸根，葡糖醛酸根，半乳糖醛酸根，丙酸根和甲磺酸根組成的一組，其中R13是氫，1至約20個碳的烷基或6至約10個碳的芳基。優(yōu)選地，R13是氫或1至約10個碳的烷基或苯基。在另一優(yōu)選的方案中，抗衡離子是鹵離子(氟離子，氯離子，溴離子或碘離子)，而碘離子是優(yōu)選的。以本公開為基礎，各種其他抗衡離子，包括藥理上可接受的抗衡離子，對本專業(yè)熟練的技術人員將是顯而易見的。
本專業(yè)熟練的技術人員應該認識到，一旦置于本發(fā)明的領域，陽離子類脂組合物將很容易從陽離子類脂化合物配制。根據所需的物理性質，陽離子類脂組合物可以從陽離子類脂化合物，單獨或其它物質，例如，用于穩(wěn)定組合物的物質一起制備。
通常需要將陽離子類脂化合物與其他物質，包括穩(wěn)定化物質，例如，附加的兩親化合物結合，用以穩(wěn)定化和/或改進組合物的性質。從本發(fā)明陽離子類脂化合物和其它的兩親化合物制備的組合物包括，例如，懸浮液、乳化液、小囊和六方形H II相結構。
以本公開為基礎，用于穩(wěn)定本發(fā)明組合物的大量物質是容易得到的和對本專業(yè)熟練的技術人員是顯而易見的。包括在這類物質中的有其它的兩親化合物，如類脂，和脂肪物質。最終與本發(fā)明陽離子類脂化合物結合的具體穩(wěn)定化物質可根據需要選擇以使產生的組合物的性質最佳。據信，合適的穩(wěn)定化物質是容易辨認的，本發(fā)明陽離子類脂化合物的組合物可以由本專業(yè)熟練的技術人員不需過分實驗而制備。
在某些情況下，也需要將陽離子類脂化合物與可以促進類脂與細胞膜熔接的物質結合。這類物質增強陽離子類脂組合物細胞內輸送生物活性劑的能力。某些這類物質也可以促進基因表達。后者特別適合用于遺傳物質的轉移?？梢源龠M陽離子類脂組合物與細胞膜熔接的物質的例子包括，例如，硫酸銨、細胞松馳素B，氯喹，甘油，丙二醇和聚(乙二醇)。
在本發(fā)明的一個方案中，提供包含陽離子液體懸浮液和/或乳化液的陽離子液體組合物。本懸浮液和乳化液是公知的并可以用常規(guī)技術制得。本專業(yè)熟練的技術人員應該到，懸浮液是分得很細的顆粒漂浮在液體中的混合物，而乳化液是兩種或多種液體的膠體混合物。懸浮液/乳化液的組分通常通過機械攪拌，非強制性但優(yōu)選地在少量已知為乳化劑的附加物質存在下混合在一起。
典型地在制備懸浮液/乳化液時，陽離子類脂化合物可加到乙醇或氯仿或任何其他合適的有機溶劑中，并通過手動或通過機械技術攪拌。然后將溶劑從混合物中蒸出，留下陽離子類脂的干燥釉質。類脂再懸浮于含水介質，如磷酸鹽緩沖的食鹽水中，產生懸浮液/乳化液。為了使包括類脂的液體達到更均勻大小分布，混合物可以用常規(guī)超聲技術超聲化以及微觀流化(例如，用微觀流化機，Newton，MA)，和/或用擠壓器(LipexBiomembranes，Vancouver，Canada)高壓擠出(例如，600psi)。液體也可以進行一次或多次冷凍和融熔的循環(huán)以促進基本均一的懸浮液/乳化液的形成。另外，鹽，例如，氯化鈉，被非強制性地以約0.05摩爾濃度(M)至約1.0M的濃度加到懸浮液/乳化液中，以促進基本均一的分散體的形成。在懸浮液/乳化液的制備期間，生物活性劑可被加到陽離子類脂化合物如在類脂被加到有機溶劑中的步驟或在制備的其他階段，或者如果需要，可以在陽離子類脂懸浮液/乳化液已經形成后加入。在制備懸浮液/乳化液時，特別有用的添加劑有，例如，大豆卵磷脂，葡萄糖，PluronicF-68和D、L-α-生育酚(維生素E)，一般的量為約重量百分數0.03至約5。當需要靜脈內施用時這些添加劑特別有用。用于配制類脂懸浮液/乳化液的技術和事劑在本專業(yè)是公知的，并可用于本發(fā)明的懸浮液/乳化液。合適的懸浮液/乳化液配合劑報道于，例如，ModernPharmaceutics，pp.505-507，Gilbert Baker and Christopher Rhodes，eds.Marcel Dekker Inc.，New York，NY(1990)，該文獻全文引作本文參考。
在本發(fā)明的另一方案提供包含陽離子微囊組合物的陽離子類脂組合物。陽離子微囊組合物包括微膠粒和/或脂質體。特別針對陽離子微膠粒組合物，提供如下討論。
微膠?？梢杂么罅繉τ诒緦I(yè)熟練的技術人員顯而易見的常規(guī)微膠粒制備方法中的一種制備。這些方法典型地包括將陽離子類脂化合物懸浮于有機溶劑中，蒸發(fā)溶劑，再懸浮于含水介質中，超聲化并離心。前述方法，以及其他方法在下列文獻中討論，例如Canfield et al.，Methods in Enzymology，Vol.189，pp.418-422(1990)；El-Gorab et al，Biochem.Biophys.Acta，Vol.306，pp.58-66(1973)；Colloidal Surfactant，Shinoda，K.，Nakagana，Tamamushi and Isejura，Academic press，NY(1963)(especially“The Formation of Micelles”，Shinoda，Chapter l，PP.1-88)；Catalysis in Micellar and Macromolecular Systems，Fendler and Fendler，Academic Press，NY(1975).上述公開物的內容全部引作本文參考。微膠?？梢栽谏锘钚詣┐嬖谙轮苽?，或生物活性劑可以被加人預先形成的微膠粒中。
在微膠粒組合物中一般需要包括一種或多種穩(wěn)定化物質?？梢耘c陽離子類脂化合物結合而使產生的微膠粒組合物穩(wěn)定的物質的例子包括溴化月桂基三甲基銨，溴化十六烷基三甲基銨，溴化肉豆蔻基三甲基銨，氯化烷基二甲基芐基銨，其中烷基有約12至約16個碳，氯化或溴化芐基二甲基十二烷基銨，溴化或氯化芐基二甲基十六烷基銨，溴化或氯化芐基二甲基十四烷基銨，溴化或氯化鯨蠟基二甲基乙基銨，溴化和氯化鯨蠟基吡啶翁和月桂基硫酸酯。
除了上面舉例的之外，用于使微膠粒組合物穩(wěn)定的其他物質以本文為基礎對于本專業(yè)熟練的技術人員是顯而易見的。
如上面指出的，陽離子微囊組合物可包含陽離子脂質體。陽離子脂質體作為用于細胞內輸送生物活性劑的載體特別有效，因此是優(yōu)選的陽離子類脂組合物。本發(fā)明的陽離子脂質體是高度穩(wěn)定的，并可以基本完全將生物活性劑捕集在微囊內。這樣的話，包含陽離子脂質體的組合物是用于轉染生物活性劑的高度有效的載體，其中脂質體可以(A)依靠靜電引力(如前面對于陽離子類脂化合物一般性討論的)與生物活性劑有效地相互作用；和(B)將生物活性劑捕集在脂質體微囊。陽離子脂質體也是高度生物共容的。
陽離子脂質體組合物可包含一種或多種陽離子類脂化合物。在任何給出的脂質體中，陽離子類脂化合物可以是單層或雙層形式，而單或雙層類脂可被用于形成一個或多個單或雙層。在多于一個單或雙層的情況下，單或雙層一般是濃的。這樣，類脂可被用于形成單片脂質體(包含一個單層或雙層)，寡片脂質體(包含兩個或三個單層或雙層)或多片脂質體(包含多于三個單層或雙層)。
對于上面的懸浮液/乳化液和微膠粒，陽離子脂質體組合物優(yōu)選地從本發(fā)明陽離子類脂化合物和附加的穩(wěn)定化物質，包括附加的兩親性化合物配制。在脂質體的情況下，附加的兩親性化合物優(yōu)選地包含類脂。大量的附加的類脂可以購買到，可以摻入脂質體組合物。優(yōu)選地類脂被選于使某些脂質體的需要的性質最佳化，包括血清穩(wěn)定性和血小板半衰期。基于本公開，適合的類脂在陽離子脂質體組合物制備方面的選擇性對于本專業(yè)熟練的技術人員是顯而易見的，并可不經實驗實現。
可被用于與本發(fā)明陽離子類脂化合物結合并在陽離子脂質體組合物的制劑中的類脂包括ZONYLTM氟代表面活性劑(杜邦化學公司，Wilmington，DE)和在如下公開物中描述的含氟化合物S.Gaentzler et al.，New Journal of Chemistry，Vol.17(5)，PP.337-344(1993)；C.Santaella et al.，New Journal of Chemistry，Vol.16(3)，pp.399-404(1992)；and L.sole-Violan，New Journal of Chemistry，Vol.17(8，9)，pp.581-583(1993)；這些文獻全文引作本文參考。其他可被用于制備陽離子脂質體組合物的示例性類脂包括磷脂酰膽堿與飽和和不飽和類脂，包括二油酰基磷脂酰膽堿，二肉豆蔻?；字Ｄ憠A，二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)和二硬脂酰基磷脂酰膽堿；磷脂酰乙醇胺類，如二油?；字Ｒ掖及泛投貦磅；字Ｒ掖及?DPPE)；磷脂酰絲氨酸；磷脂酰甘油；鞘脂類；鞘磷脂；溶脂類(lysolipids)；糖脂類，如神經節(jié)苷脂GM1；糖脂；硫苷脂；硫糖鞘磷脂；磷脂酸類，如二棕櫚?；字?DPPA)；棕櫚酸，硬脂酸；花生四烯酸；油酸；脂肪酸；類脂與醚和酯連接的脂肪酸；可聚合的類脂；膽固醇，膽固醇硫酸酯和膽固醇半琥珀酸酯；12-{[(7′-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基]甲基氨基}十八烷酸；N-[12-{[(7′-二乙基氨基香豆素-3-基)羰基]甲基氨基}十八烷?；鵠-2-氨基棕櫚酸；膽甾烯基-4′-三甲基氨基丁酸酯；N-琥珀酰基二油?；字Ｒ掖及罚?，2-二油?；?sn-甘油；1，2-二棕櫚?；?sn-3-琥珀?；视?；1，3-二棕櫚?；?2-琥珀酰基-甘油；1-十六烷基-2-棕櫚?；视突字Ｒ掖及?；和棕櫚?；甙腚装彼帷?br>
帶有聚合物的類脂，包括親水聚合物聚(乙二醇)(PEG)，聚乙烯基吡咯烷酮，和聚(乙烯基醇)，也可被包括在本發(fā)明的脂質體組合物中。合適的親水聚合物的例子包括，例如，PEG 2000，PEG5000和PEG8000，它們分別具有分子量2000，5000和8000?；诒竟_，其他合適的聚合物，親水與否，對于本專業(yè)熟練的技術人員將是顯而易見的?？梢酝ㄟ^烷基化或?；磻獡降街|體表面的聚合物對于改善脂質體的穩(wěn)定性和大小分布特別有用。帶有親水聚合物示例性類脂包括，例如，二棕櫚?；字Ｒ掖及?PEG，二油酰基磷脂酰乙醇胺-PEG和二硬脂基磷脂酰乙醇胺-PEG。
基于本公開，除了上面舉例的那些之外，其他可用于制備陽離子脂質體組合物的物質對于本專業(yè)熟練的技術人員是顯而易見的。
穩(wěn)定化物質，例如，與本發(fā)明陽離子類脂化合物結合的附加兩親化合物的量將隨許多因素而變化，包括所選的本發(fā)明特定的陽離子類脂化合物，所選的特定的穩(wěn)定化物質，所用的具體用途，輸送模式，等等。在具體情況下與本發(fā)明陽離子類脂化合物結合的穩(wěn)定化物質的量，和穩(wěn)定化物質與陽離子類脂化合物的比例，將是變化的，并很容易由本專業(yè)熟練的技術人員基于本公開確定。一般地，例如，已經發(fā)現更高的陽離子類脂化合物與穩(wěn)定化類脂的比例，即大于4∶1，3∶1或2∶1的比例是優(yōu)選的。
很多與制備陽離子脂質體組合物相關的方法可以得到。因此，陽離子脂質體可以用本專業(yè)熟練的技術人員熟知的大量的常規(guī)脂質體制備技術的任意一個制備。這些技術包括溶劑滲析，French壓，擠壓(有或沒有凍融)，逆相蒸發(fā)，微乳化和簡單凍-融。脂質體可以通過各種包括搖動或渦旋的方法制備。這可以例如，通過用機械搖動裝置，如Wig-L-BugTM(Crescent Dental，Lyons，IL)實現。常規(guī)微乳化裝置，如MicrofluidizerTM(Microfiuidics，Woburn，MA)了可被使用。
從本發(fā)明的陽離子類脂化合物制備脂質體組合物的其他方法包括，例如，超聲化，螯合滲析，均化，溶劑灌輸，自發(fā)形成，溶劑揮發(fā)，控制的洗滌劑滲析，等等，各自包括以各種形式制備脂質體。與從本發(fā)明的陽離子類脂化合物制備脂質體有關的包括凍-融技術的方法是優(yōu)選的。合適的凍-融技術例如在共同待審的美國申請序號07/838504，1992年2月19日申請中描述，該文全文引作本文參考。脂質體的制備可以在溶液，如食鹽水溶液，磷酸鹽緩沖水溶液，或無菌水，含有一種或多種生物活性劑，中進行，使得生物活性劑被包裹在脂質體內或摻入脂質體膜內。另外，生物活性劑可被加到預先形成的脂質體中。
如果需要，脂質體的大小可以通過多種技術調節(jié)，包括擠壓，過濾，超聲化和均化。另外，脂質體的大小可以通過將液芯的層狀流引入液體的不混溶套內而調節(jié)。其他調節(jié)陽離子脂質體大小和調節(jié)產生的脂質體的生物分布和脂質體透明度的方法以本公開為基礎對于本專業(yè)熟練的技術人員將是顯而易見的。優(yōu)選地，陽離子脂質體的大小通過在壓力下擠過確定大小的孔而調節(jié)。盡管用于本發(fā)明的脂質體可以是任何大小，但優(yōu)選地脂質體是小的，即，外徑小于約100納米(nm)。
許多前面的脂質體的制備技術，以及其他的，討論于，例如，美國專利4728578，英國專利申請GB 2193095A；美國專利4728575；美國專利4737323；國際申請序號PCT/US 85/01161；Mayer et al.，Biochimica et Biophysica Acta，Vol.858，pp.161-168(1986)；Hope et al.，Biochimica et Biophysica Acta，Vol.812，pp.55-65(1985)；U.S.Patent No.4,533,254；Mayhew et al.，Methods inEnzymology，Vol.149，pp.64-77(1987)；Mayhew et al.，Biochimica etBiophysica Acta，Vol 755，pp.169-74(1984)；Cheng et al，InvestigativeRadiology，Vol.22，pp.47-55(1 987)；國際申請?zhí)朜o.PCT/US89/05040；U.S.4,162,282；U.S.4,310,505；U.S.4,921,706；and Liposome Technology，Gregoriadis，G.，ed.，Vol.I，pp.29-31，51-67 and 79-108(CRC Press Inc.，Boca Raton，Fl 1984)，這些文獻全文引作本文參考。
盡管許多變化技術的任何一個都可被使用，但本發(fā)明脂質體可以優(yōu)選地用搖動技術制備。優(yōu)選地，搖動技術包括用機械搖動裝置，如Wig-L-BugTM(Crescent Dental，Lyons，IL)，如在1993年12月30日申請的共待審的美國申請序號160232中披露的攪拌，該公開全文引作本文參考。
如本專業(yè)熟練技術人員認識的，任何陽離子類脂化合物和含有陽離子類脂化合物，有或沒有生物活性劑的組合物可被凍干貯存，在劇列攪拌下，例如，在含水介質(如無菌水或磷酸鹽緩沖溶液，或食鹽水溶液)中重組。為了預防作為凍干結果的燒結或熔化，包括預防這類熔化或燒結發(fā)生的添加劑是有用的。有用的添加劑包括山梨醇，甘露糖醇，氯化鈉，葡萄糖，海藻糖，聚乙烯基吡咯烷酮和聚(乙二醇)，例如，PEG400。這些和其他添加劑在如下文獻中描述，如U.S.Pharmacopeia，USP XXII，NF XVII，The United StatesPharmacopeia，The National Formulary，United States PharmacopeialConvention Inc.，12601 Twinbrook Parkway，Rockville，MD 20852，該文獻全文引作本文參考。凍干的制劑一般具有較長儲存壽命的優(yōu)點。
本發(fā)明人現已發(fā)現，通過使用陽離子類脂組合物，包括懸浮液/乳化液和微囊組合物而細胞內輸送生物活性劑，可以通過氣體物質的存在而增強。期望氣體物質促進由生物活性劑的細胞吸收。這樣的話，在某些優(yōu)選的方案中，氣體，如惰性氣體，被摻入陽離子類脂組合物中。另外，氣態(tài)物質的前體可被摻入陽離子類脂組合物中。這類前體包括，例如，可以體內轉變?yōu)闅怏w，優(yōu)選地為惰性氣體的物質。
優(yōu)選的氣體是惰性和生物共容性氣體，即，不損害生物功能的氣體。優(yōu)選的氣體包括選自由空氣，希有氣體，如氦，氖，氬和氙，二氧化碳，氮，氟，氧，六氟化硫，氟代烴，全氟代烴，和其混合物組成的一組。以本公開為基礎，其他氣體，包括上面舉例的氣體，對于本專業(yè)熟練的技術人員很容易顯而易見。
在優(yōu)選的方案中，氣體包含全氟代烴。優(yōu)選地，全氟代烴選自由全氟甲烷，全氟乙烷，全氟丙烷，全氟丁烷，全氟環(huán)丁烷，和其混合物組成的一組。更優(yōu)選地，全氟代烴氣體是全氟丙烷或全氟丁烷，而全氟丙烷特別優(yōu)選。
如上指出的，在陽離子類脂組合物中摻入氣體物質的前體也是理想的。這類前體包括可以體內轉化為氣體的物質。優(yōu)選地，氣體前體是生物共容的，而體內產生的氣體也是生物共容的。
在適用于本發(fā)明組合物的氣體前體之間的是pH敏感劑。這些藥劑包括可以，例如，暴露于中性或酸性pH時，包封氣體的物質。這類pH敏感劑的例子包括選自由無機酸，有機酸和其混合物組成的酸的鹽。碳酸(H2CO3)是合適的無機酸的例子，氨基丙二酸是合適的有機酸的例子。其它酸，包括無機和有機酸，以本公開為基礎，對于本專業(yè)熟練技術人員是顯而易見的。
優(yōu)選地，氣體前體是選自由堿金屬鹽，銨鹽和其混合物組成的一組鹽。更優(yōu)選地，鹽選自由碳酸鹽，碳酸氫鹽，倍半碳酸鹽，氨基丙二酸鹽和其混合物組成的一組。
用于本發(fā)明陽離子類脂組合物的氣體前體物質的例子包括碳酸鋰，碳酸鈉，碳酸鉀，碳酸氫鋰，碳酸氫鈉，碳酸氫鉀，碳酸鎂，碳酸鈣，碳酸氫鎂，碳酸銨，碳酸氫銨，倍半碳酸銨，倍半碳酸鈉，氨基丙二酸鈉和氨基丙二酸銨。氨基丙二酸鹽是本專業(yè)公知的，其制備描述于，例如，Thanassi，Biochemistry，Vo1.9，no.3，PP.525-532(1970)；Fitzpatrick etal.，Inorganic Chemistry，Vol.13，no.3pp.568-574(1974)；and Stelmashoket al.，Koordinatsionnaya Khimiya，Vol.3，no.4，pp.524-527(1977)，這些公開物全文引作本文參考。
除了或代替對pH改變敏感，氣體前體物質也包括對溫度變化敏感的化合物。這類溫度敏感劑包括具有大于約37℃的沸點的物質。示例性的溫度敏感劑有乳酸甲酯，全氟戊烷和全氟己烷。氣體前體物質也可以是光活化的物質，如重氨鹽離子和氨基丙二酸鹽。如本文后更充分討論的，某些類脂組合物，和特別是微囊組合物，可被設計成在靶組織上通過聲波在顆粒上的作用形成氣體。氣體前體的例子在，例如，美國專利5088499和5149319中描述。這些專利全文引作本文參考。除了上面舉例的之外，以本公開為基礎，其他氣體前體對本專業(yè)熟練的技術人員是顯而易見的。
在某些優(yōu)選的方案中，氣體試劑，例如，空氣或全氟代烴氣體，與液體全氟代烴，如全氟己烷，全氟庚烷，全氟溴代辛烷(PFOB)，全氟萘烷，全氟十二萘烷，全氟碘代辛烷，全氟三丙基胺和全氟三丁基胺結合。
用于細胞內輸送生物活性劑，例如，基因物質的優(yōu)選的組合物包括生物活性劑，全氟代烴氣體和具有高于約37℃沸點的氣體前體，如全氟戊烷。如下面詳細討論的，能量，例如，熱或超聲波，優(yōu)選地在施用組合物后被應用于患者以幫助生物活性劑的細胞內輸送。
氣體物質和/或氣體前體優(yōu)選地摻入本發(fā)明的陽離子類脂組合物中，而不考慮組合物的物理性質。這樣的話，期望氣體物質和/或前體被摻入懸浮液/乳化液或囊狀組合物中，包括微膠粒和脂質體。往陽離子類脂組合物中摻入氣體物質和/或前體可通過用多種方法中的任何一種實現。例如，充氣微囊的形成可通過搖動或攪動包含氣體或氣體前體和本發(fā)明陽離子類脂的含水混合物而實現。這樣促進了其中包裹了氣體或氣體前體的穩(wěn)定化微囊的形成。氣體或氣體前體陽離子類脂組合物可以用類似于早先討論的關于將生物活性劑摻入囊狀組合物中的其他方法制備。
氣體物質和/或前體也可和任何常規(guī)和公知的技術摻入陽離子類脂組合物中。例如，非強制性地在生物活性劑存在下，將氣體直接通入本發(fā)明陽離子類脂化合物的含水混合物中。另外，氣體灌輸法可以如美國專利5352435和5228446中公開的使用，該文獻全文引作本文參考。將氣體或氣體前體摻入陽離子類脂組合物中的合適方法也在美國專利4865836中公開，該文獻全文引作本文參考。以本公開為基礎，其他方法對本專業(yè)熟練的技術人員是顯而易見的。
在優(yōu)選的方案中，氣體物質和/或氣體前體物質被摻入微囊組合物中，而微膠粒和脂質體是優(yōu)選的。脂質體是特別優(yōu)選的，因為它們具有高穩(wěn)定性和生物共容性。如下面詳細討論的，氣體或氣體前體或兩者都被包裹的微囊是有利的，其中它們可以在體內更容易被監(jiān)測，例如，通過包括超聲波的監(jiān)測技術。這樣的話，循環(huán)和輸送微囊到靶組織和/或細胞可以通過非侵害性操作來觀察。氣體前體-或充氣微囊是優(yōu)選的，也因為應用高能超聲波，射頻，光能，例如，激光，和/或熱，產生人工發(fā)熱區(qū)，可被用于體內爆破微囊因而促進被捕集的氣體(或其前體)和生物活性劑的釋放。因此，微囊組合物允許生物活性劑的體內受控釋放。
除了被捕集于微囊內之外，生物活性劑可以位于，或不是，在微囊之外或在內脂膜內。因此，在某些方案中，除了或代替，被捕集在微囊內生物活性劑也可以被覆蓋在脂質體或微膠粒的表面和/或在類脂膜內。
被摻入本發(fā)明類脂組合物中的生物活性劑優(yōu)選地是在體外和/或體內產生治療生物作用的物質。用于此方法和本發(fā)明組合物中特別合適的生物活性劑是遺傳物質。遺傳物質的例子包括，例如，表達載體攜帶的基因，如質粒，噬粒，粘粒，酵母菌人工染色體(YAC)和缺損或“輔助”病毒反義和有義寡核苷酸；硫代磷酸脫氧寡核苷酸；反基因核酸；和單鏈及雙鏈RNA和DNA，包括編至少部分基因的DNA，如編碼人白細胞抗原(HLA)、肌營養(yǎng)不良蛋白、囊性纖維化跨膜受體(CFTR)、白細胞介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子(TNF)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)的DNA。DNA也可編碼某些可用于治療各種類型的病理或病癥，包括與免疫能力的喪失或缺失有關的病癥的蛋白質。這類包括免疫能力的病理或病癥包括，例如，獲得性免疫缺失綜合癥(AIDS)，癌癥，慢性病毒感染和自身免疫性疾病。
特別地，DNA可被選擇表達腺苷脫氨酶(ADA)用于治療ADA缺乏；生長激素用于治療生長不足或幫助組織愈合；胰島素用于治療糖尿?。稽S體化激素釋放激素(LHRH)拮抗劑作為分娩控制劑；LHRH用于治療前列腺或乳腺癌；腫瘤坯因子和/或白細胞介素-2用于治療晚期癌癥；高密度脂蛋白(HDL)受體用于治療肝??；胸苷激酶用于治療卵巢癌、腦腫瘤或人體免疫缺失病毒(HIV)感染；HLA-B7用于治療惡性黑瘤；IL-2用于治療成神經細惡性黑瘤或腎癌；白細胞介素-4(IL-4)用于治療癌癥；HIV env用于治療HIV感染；抗過敏ras/p53用于治療肺癌；和VIII用于治療血友病B。這類治療描述于，例如，Science，Vol.258，pp.744-746(1992)，該文獻全文引作本文參考。
如上指出的，本發(fā)明提供陽離子類脂制劑，它包括陽離子類脂組合物與一種或多種生物活性劑結合。陽離子類脂組合物可包括陽離子懸浮液/乳化液和/或陽離子微囊組合物，包括陽離子脂質體組合物和/或陽離子微膠粒組合物。另外，陽離子類脂組合物可包含一種或多種陽離子類脂化合物，非強制性穩(wěn)定化物質，如兩親性化合物，氣體或其前體結合。這些陽離子類脂制劑可以根據多種技術的任一種制備。例如，陽離子類脂制劑可以從陽離子類脂化合物，生物活性劑和氣體或氣體前體的混合物制備。在微囊組合物的情況下，生物活性劑被捕集于脂質體或微膠粒的微囊內。在某些情況下，生物活性劑也可被摻入微囊的膜壁內。在懸浮液/乳化液的情況下，生物活性劑一般均勻分散于整個懸浮液/乳化液。另外，陽離子類脂組合物可以從陽離子類脂化合物和氣體或氣體前體預先形成。在后一情況下，生物活性劑然后在使用前加到類脂組合物中。例如，可以制備質體和氣體的含水混合物，往其中加入生物活性劑，攪拌產生陽離子脂質體制劑。陽離子脂質體制劑也容易分離，其中氣體和/或生物活性劑填充的脂質體微囊一般漂浮在水溶液的頂部。過量的生物活性劑可以從剩下的水溶液中回收。
本發(fā)明的制劑可被用于體外或體內應用。在體外應用的情況下，包括細胞培養(yǎng)應用，陽離子類脂制劑可被加到在培養(yǎng)液中的然后溫育。如果需要，當用脂質體時，能量，如聲能，可被用于培養(yǎng)基以破裂脂質體并釋放任何治療劑。
對于體內應用，本發(fā)明的制劑可以以許多適合選擇的給藥途徑對患者給藥，即，非腸胃的，口服，或腹膜內給藥。優(yōu)選的非腸胃給藥包括由如下途徑的給藥靜脈內；肌內；間質的；動脈內；皮下；眼內；滑膜內；經表皮的，包括經皮的；通過肺部吸入；眼的；舌下的和頰的；局部給藥，包括眼的，皮膚的，眼的；直腸的；通過吹入法鼻內吸入。在非腸胃給藥的途徑中，靜脈內給藥是優(yōu)選的。
本發(fā)明的陽離子類脂制劑也可通過用陽離子類脂制劑涂覆醫(yī)用器械，例如，導管，如血管成形術氣球導管而給藥。涂覆可以，例如，通過將醫(yī)用器械浸入陽離子類脂制劑或陽離子類脂制劑和合適溶劑，例如，水基緩沖液，含水溶劑，乙醇，二氟甲烷，氯仿等的混合物中而實現。制劑的量自然依賴于器械的表面，隨后對患者給藥。另外，凍干的陽離子類脂制劑混合物可以特別地附著在器械表面。這類附著技術描述于，例如，K.Ishihara et al.，Journal of Biomedical Materials Research，Vol.27，pp.1309-1314(1993)，該文獻全文引作本文參考。
給藥的有用劑量和給藥的具體模式將取決于年齡，體重和被治療的具體動物和其部位，所用的具體生物活性劑和陽離子類脂化合物，治療或診斷用途，和制劑的形式，例如，懸浮液，乳化液，微膠?；蛑|體，并對本專業(yè)的技術人員是顯而易見的。典型地，劑量在較低水平給藥并增加，直至達到理想的治療效果。被給藥的陽離子類脂化合物的量可以變化并一般取決于被給藥的生物活性劑的量。例如，類脂化合物與生物活性劑的重量比優(yōu)選地為約1∶1至約15∶1，而重量比約5∶1至約10∶1是更優(yōu)選的。一般地，被給藥的陽離子類脂化合物的量將從約0.1毫克(mg)至約1克(g)之間變化。作為一般性指導，對每靠我患者體重典型地約0.1mg至約10mg具體生物活性劑，和約1mg至約100mg陽離子類脂組合物，被給藥，盡管更高和更低的量可被使用。
在包含氣體或氣體前體和生物活性劑的微囊類脂制劑對患者給藥之后，能量優(yōu)選地以超聲波能量的形式，可被施用于靶組織以區(qū)分含有氣體或氣體前體和生物活性劑的微囊的位置。施用的能量也可被用于有效地釋放生物活性劑并促進生物活性劑的細胞內吸收。本專業(yè)熟練的技術人員應該認識到，用超聲能量介導細胞內傳遞的此方法優(yōu)選地影響其傳聲窗口允許超聲波能量傳遞的組織。這是身體大部分組織的情況，包括肌肉和器官組織，如心臟和肝臟，以及大部分其他生命結構。對于腦組織，需要通過除去部分腦殼建立一個“外科窗口”，因為超聲波能量一般不能穿過骨頭。血管內的和/或腔下的超聲波傳導器可被用于對選定的身體內的組織和/或位點，例如，主動脈和食管施加超聲波能量。
陽離子類脂制劑可被配制得在脈管系統(tǒng)內充分穩(wěn)定，使得它們全身循環(huán)并提供血庫平衡。本專業(yè)熟練的技術人員應認識到，類脂制劑，包括那些包含懸浮液/乳化液和微囊的如脂質體和微膠粒，可用某些物質包衣以使由網狀內皮系統(tǒng)的吸收最小化。合適的包衣包括，例如，連接糖部分的神經節(jié)苷脂和糖脂，如葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸，葡糖醛酸，聚(乙二醇)，聚(丙二醇)，聚乙烯基吡咯烷酮，聚(乙烯醇)，葡萄糖，淀粉，磷?；突酋；囊?，二-， 三-，寡-和多糖和血清蛋白，只要陽離子類脂制劑的循環(huán)半衰期是一個足夠的時間周期，在通過身體時，它們一般會通過靶組織。在包含氣體或氣體前體的類脂制劑的情況下，能量，聲能，可被聚焦到被治療的組織上，例如，患病組織。然后生物活性劑將在靶組織中定點釋放。本發(fā)明人也已發(fā)現，抗體，碳水化合物，肽，糖肽，糖脂和卵磷脂也幫助類脂制劑和生物活性劑的組織瞄準。因此，這些材料也被摻入類脂制劑中。
超聲波可被用于診斷和治療目的。一般地，診斷超聲波的能量水平不足以引起囊核的破裂而促進生物活性劑的釋放和細胞內吸收。而且，診斷超聲波包括施用一種或多種聲音脈沖。脈沖之間的暫停允許反射的音波信號被接收和分析。受限制的用于診斷超聲的脈沖的量限制被傳送到被研究的組織上的有效能量。
另一方面，更高能超聲波，例如，由治療超聲波儀器產生的超聲波，一般可以引起囊核的破裂。一般地，治療超聲波機用約10至100％頻寬比，取決于用超聲波治療的組織面積。通常由較大數量的肌肉塊，例如，背和股，以及高度血管化的組織，如心臟組織為特征的身體面積，將需要較大頻寬比，例如，高達約100％。
在治療的超聲波中，連續(xù)波超聲波被用于輸送較高能量水平。對于囊核的破裂，連續(xù)波超聲波是優(yōu)選的，盡管聲能也可以脈沖。如果用中聲能，聲波一般以回聲序列長8至約20脈沖或一次更多脈沖。優(yōu)選地，回聲序列長為約一次20脈沖。另外，所用聲波頻率從0.25久100兆赫(MHz)變化。一般地用于治療超聲波頻率的范圍在約0.75至約3MHz是優(yōu)選的，而約1和約2MHz更優(yōu)選。另外，能量水平可從約0.05瓦(W)至約5.0W變化，而能量水平約0.1至約0.5W是優(yōu)選的。對于非常小的囊核，例如，其中微囊具有小于約0.5微米的核，較高的聲頻通常是優(yōu)選的。這是因為較小的囊核可以在較高的聲頻更有效地吸收聲能。當用更高頻率時，例如大于約10MHz，聲能一般穿透流體和組織只達到有限深度。因此，外部施用聲能可以適于皮膚和其他表面組織。然而，對于深層結構，一般需要聚焦超聲波能使其優(yōu)選指向聚焦區(qū)內。另外，超聲波能可以通過間質探針，血管內超聲波導管或腔內導管施用。這類探針產管可以，例如，在食管中使用，用于診斷和/或治療食管癌。
本發(fā)明進一步在下面實施例中敘述。在這些實施例中，實施例1至9是實際的實施例。實施例10至12是預示實施例。這些實施例只用于舉例說明，而不限制權利要求。用于下面實施例的各種原料是商品。N，N-二甲基乙二胺和碘甲烷購自Aldrich Chemical Co.(Milwankee，WI)。
實施例1合成N，N′-二(十二烷基氨基羰基亞甲基)-N，N′-二(β-N，N，N-三甲基銨甲基氨基羰基亞甲基)-N，N′-二甲基乙二胺四碘化物(EDTA-LA-TMA四碘化物)
合成途徑(i)合成N，N′-二(十二烷基氨基羰基亞甲基)乙二胺-N，N′-二乙酸(EDTA-LA)
將干燥甲醇(60ml)中的十二烷基胺(3.71g，0.02mol)加到乙二胺四乙酸二酐(2.56g，0.01mol)在干燥甲醇(30ml)中的懸浮液中?；旌衔镌?0℃攪拌6小時。產生的白色固體沉淀通過過濾分離并在室溫真空干燥產生3.43g(64％)標題化合物。m.p.156-158℃。
IR3320cm-1為OH；1670cm-1為-C(＝O)-。
(ii)合成N，N′-二(十二烷基氨基羰基亞甲基)-N，N′-二(β-N，N-二甲基氨基乙基氨基羰基亞甲基)乙二胺(EDTA-LA-DNA)
將步驟(i)的EDTA-LA(3.14g，0.005mol)，N，N-二甲基乙二胺(0.88g，0.01mol)和CHCl3(100ml)混合。固體物質溶解后，將溶液冷至5℃，滴加1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(2.227g，0.011mol)的CHCl3(20ml)溶液。觀察到沉淀。反應混合物在室溫攪拌約24小時。反應混合物過濾，濾液用0.5％乙酸(100ml)洗滌以分解任何過量的DCC。形成白色奶色溶液，它分開為兩層。底部有機層干燥(Na2SO4)并真空濃縮產生3.81g標題化合物軟固體。
IR3280cm-1；2900cm-1；1640cm-1；1530cm-1。
(iii)合成EDTA-LA-TMA四碘化物步驟(ii)的EDTA-LA-DMA(3.66g，4.77mmol)，碘代甲烷(3.41g，24mmol)和乙醇(30ml)的溶液被回流2小時。乙醇溶液被真空濃縮，產生的殘余物凍干過夜。得到3.98gEDTA-LA-TMA四碘化物，本發(fā)明范圍內的一個化合物，黃色固體。
IR3260cm-1；1650cm-1。
實施例2合成N，N″-二(十六烷基氨基羰基亞甲基)-N，N′，N″-三(β-N，N，N-三甲基銨甲基氨基羰基亞甲基)-N，N′，N″-三甲基二亞乙基三胺六碘化物(DTPA-HA-TME六碘化物)
合成途徑(i)合成N，N″-二(十六烷基氨基羰基亞甲基)二亞乙基三胺-N，N′，N″-三乙酸(DTPA-HA)
將干燥甲醇(60ml)中的十六烷基胺(4.82g，0.02mo1)加到二亞乙基三胺五乙酸二酐(3.57g，0.01mol)在干燥甲醇(30ml)中的懸浮液中。產生的混合物在50℃攪拌6小時。將反應混合物冷卻，過濾收集產生的白色固體沉淀。將白色固體沉淀真空于燥產生5.9g標題化合物。
IR3320cm-1為OH；1670cm-1為-C(＝O)-。
(ii)合成N，N″-二(十六烷基氨基羰基亞甲基)-N，N′，N″-三(β-N，N-二甲基氨基乙基氨基羰基亞甲基)二亞乙基三胺(DTPA-HA-DMA)
步驟(i)的DTPA-HA(4.2g，0.05mol)，N，N-二甲基乙二胺(0.88g，0.01mol)和CHCl3(100ml)的溶液被冷卻至0-5℃。經此溶液中滴加DCC(2.23g，0.011mol)的CHCl3(20ml)溶液。反應混合物在室溫攪拌24小時。過濾除去產生的沉淀并用0.5％乙酸(100ml)洗滌。得到一白色，牛奶狀溶液，再次過濾，干燥(Na2SO4)，真空濃縮。得到標題化合物軟固體(3.5g)。
(iii)合成DTPA-HA-TMA六碘化物步驟(ii)的DTPA-HA-DMA(4.7g，4.8mol)，碘代甲烷(3.41g)和甲醇(50ml)的溶液回流2小時。甲醇溶液被真空濃縮，產生的殘渣被凍干過夜。得到6g DTPA-HA-TME六碘化物，本發(fā)明范圍內的化合物，黃色固體。
實施例3合成N，N′-二(十二烷基氨基羰基亞甲基)-N，N′-二(β-N，N，N-三甲基銨甲基氨基羰基亞甲基)-N，N′-二甲基亞環(huán)己基-1，4-二胺四碘化物(CDTA-LA-TMA四碘化物)
合成途徑(i)合成N，N′-二(十二烷基氨基羰基亞甲基)亞環(huán)己基-1，4-二胺-N，N′-二乙酸(CDTA-LA)
十二烷基胺(3.71g，0.02mol)在干燥甲醇(60ml)中的溶液被加到環(huán)已烷-1，4-二胺-N，N，N′，N″，-四乙酸二酐(3.1g，0.01mol)在干燥甲醇(30ml)中的懸浮液中。產生的混合物在50℃攪拌6小時。過濾產生標題化合物(4.8g)白色固體。
(ii)合成N，N′-二(十二烷基氨基羰基亞甲基)-N，N′-二(β-N，N-二甲基氨基乙基氨基羰基亞甲基)亞環(huán)己基-1，4-二胺(CDTA-LA-DMA)
步驟(i)的CDTA-LA(3.4g，0.05mol)，N，N-二甲基乙二胺(O.88g，0.01mol)和CHCl3(100ml)的溶液被冷卻至O-5℃。經此溶液中滴加DCC(2.23g，0.011mol)的CHCl3(20ml)溶液。反應混合物在室溫攪拌24小時并過濾。濾液用0.5％乙酸(100ml)洗滌以分解任何過量的DCC并再次過濾。濾液干燥(Na2SO4)并真空濃縮產生標題化合物(4.2g)軟固體。
(iii)合成CDTA-LA-TMA四碘化物步驟(ii)的CDTA-LA-DMA(3g)，碘代甲烷(3.5g)和甲醇(30ml)的溶液被回流2小時。甲醇混合物被真空濃縮，產生的殘余被被凍干過夜。得到3.1g CDTA-LA-TMA四碘化物，本發(fā)明范圍內的一個化合物為固體。
實施例4合成1，1，7，7，-四(β-N，N，N，N-四甲基銨乙基氨基羰基亞甲基)-4-十六烷基氨基羰基亞甲基-N，N′，N″-三甲基-1，4，7-三氮雜庚烷七碘化物(DTPA-MHA-TTMA七碘化物)
合成途徑(i)合成4-十六烷基氨基羰基亞甲基-1，4，7-三氮雜庚烷-1，1，7，7-四乙酸(DTPA-MHA)
二亞乙基三胺五乙酸(3.93g，0.01mol)，十六烷基胺(3.4g，0.01mol)和CHCl3(300ml)的溶液被冷卻至0-5℃。經此溶液中滴加DCC(2.23g，0.011mol)的CHCl3(15ml)溶液。反應混合物在室溫攪拌24小時并過濾。濾液用0.5％乙酸(100ml)洗滌并再次過濾。將濾液干燥(Na2SO4)并真空濃縮。產生的剩余物用水重結晶，產生標題化合物白色固體(3.7g)。
(ii)合成1，1，7，7-四(β-N，N-二甲基氨基乙基氨基羰基亞甲基)-4-十六烷基氨基羰基亞甲基-1，4，7-三氮雜庚烷(DTPA-MHA-TDMA)
步驟(i)的DTPA-MHA(3g)，N，N-二甲基乙二胺(1.76g)和CHCl3(200ml)的溶液被冷卻至0-5℃。向此溶液中滴加DCC(4.5g，0.02mol)的CHCl3(20ml)溶液。反應混合物在室溫下攪拌過夜。過濾收集產生的沉淀，濾液用0.5％乙酸(100ml)洗滌并再次過濾。將濾液干燥(Na2S04)并真空濃縮。產生的剩余物經硅膠柱純化。得到標題化合物軟固體(2.8g)。
(iii)合成DTPA-MHA-TTMA七碘化物DTPA-MHA-TDMA(2.24g)，碘代甲烷(3.5g，0.03mol)和甲醇(30ml)的溶液被回流2小時。甲醇溶液被真空濃縮，產生的剩余物被凍干過夜產生2.4g DTPA-MHA-TTMA七碘化物，本發(fā)明范圍內的化合物。
實施例5用類似于實施例1至4的操作，制備本發(fā)明范圍內的下列化合物。
實施例5AN，N′-二(十二烷氧基羰基亞甲基)-N，N′-二(β-N，N，N-三甲基銨甲基氨基羰基亞甲基)乙二胺二碘化物
實施例5BN，N，N″，N″-四(β-N，N，N-三甲基銨乙基氨基羰基亞甲基)-N′-(1，2-二油酰基甘油基-3-磷酸基乙醇氨基羰基亞甲基)二亞乙基三胺四碘化物
實施例5CN，N′-二(十六烷基氨基羰基亞甲基-N，N′-二(三甲基銨甲基氨基羰基亞甲基)乙二胺二碘化物
實施例5DN，N′-二(十六烷氧基羰基亞甲基)-N-(β-N，N，N-三甲基銨甲基氨基羰基亞甲基)-N-甲基-N′-(羰基亞甲基)乙二胺二碘化物
實施例5EN，N′-二(十六烷基氨基羰基亞甲基)-N，N′-二(β-N，N，N-三甲基銨甲基氨基羰基亞甲基)-N，N′-二甲基乙二胺四碘化物
本發(fā)明的制劑進行各種生物試驗，其結果與有用的治療活性相關聯(lián)。這些試驗可用于確定本發(fā)明制劑細胞內輸送生物活性劑，包括遺傳物質的能力。這些試驗也可用于測定本發(fā)明制劑治療遺傳疾病，包括與免疫能力喪失或缺失有關的病理或病癥的能力。
實施例6下列實施例涉及用本發(fā)明陽離子類脂化合物和公開于現有技術中的化合物細胞內輸送遺傳物質。包括在這些轉移研究中的遺傳物質是編碼氯霉素乙?；D移酶(“CAT”)的DNA。表達的CAT的量(每mL毫微克(ng/mL))用Boehringer Mannheim CAT ELISATM工具箱試驗，其結果表解于附圖1和2。
LIPOFECTAMINETM和LIPOFECTION從Gibco BRL，LifeTechnologies，Inc.(Gaither-sburg，MD)的一個部門購買。LIPOFECTAMINETM是N-[2-({2，5-二(3-氨基丙基)氨基]-1-氧戊基}氨基)乙基-N，N-二甲基-2，3-二(9-十八烯氧基)-1-丙銨三氟乙酸鹽和二油?；字Ｒ掖及?“DOPE”)的3∶1脂質體制劑。LIPOFECTIN是N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨氯化物(“DOTMA”)和DOPE的脂質體制劑。(參見Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.84，P.7413(1987)。)TRANSFECTAMTM從Promega Corp(MadisoN，WI)購買。TRANSFECTAMTM是包含精胺首基的陽離子脂多胺化合物。(參見Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.86，P.6982(1989)；J.Neurochem.，Vol.54，P.1812(1990)；和DNA and Cell Biology，Vol.12，P.553(1993)。)“DOTAP”指1，2-二油?；?3-丙基-N，N，N-三甲基銨鹵化物。
實施例6A本實施例敘述在沒有血清存在下，在實施例5C和5D中制備的化合物，Lipofection，Lipofectamine和DOTAP和Transfectam的生物試驗。
HeLa細胞(American Type Culture Collection，Rockville，MD)在EMEM培養(yǎng)基(Mediatech，Washington，DC)中培養(yǎng)。細胞在6-孔板(Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)中生長，密度為4×105細胞/孔，直到它們在VWR型2500 CO2溫育器(VWR，Philadelphia，PA)中6-80％融合。DNA(1.7μg)在HEPES緩沖鹽水(HBS)中稀釋至50μl(HEPES 20mM，150mM NaCl，pH7.4)用于各孔被感染。10μl在實施例5C和5D中制備的陽離子類脂化合物，Lipofection，Lipofectamine，DOTAP和Transfectam的溶液各自在HBS中稀釋為50μl。DNA和類脂溶液通過翻轉而混合并在室溫溫育15分鐘。溫育后，DNA和陽離子類脂(100μ1)的各個混合物被加到沒有血清的1.9mL培養(yǎng)基中并通過翻轉混合。將培養(yǎng)基從6-孔板中除去，并用含有類脂和DNA的培養(yǎng)基取代。細胞然后在CO2氣氛中在37℃溫育5-6小時。溫育后，除去類脂/DNA介質，并用完整的介質取代。細胞然后溫育48-72小時，分析表達的蛋白質的濃度。分析結果用SLT Labinstruments SPECTRA Shell板讀數器(SLT，Salzburg，Austria)測量，它聯(lián)在Centris 650計算機(Apple Computer，Inc.，Cupertino，CA)上并用DeltaSoft II 4.13S版本(Biometallics，Inc.)Princeton，NJ)控制。分析結果描繪在附圖1中，它顯示出，與現有技術的化合物相比，當用本發(fā)明的陽離子類脂化合物時，增加CAT的表達。因此，與現有技術的化合物相比，在此實施例中進行的實驗證明，本發(fā)明的陽離子類脂化合物提供有用的和改進的生物活性劑的細胞轉移。
實施例6B此實施例敘述在血清存在下，在實施例5D制備的化合物，Lipofectin和Lipofectamine的生物試驗。
HeLa細胞如上所述在4mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)，只是培養(yǎng)基用富集的胎牛血清(Gibco BRL Life Technologies，Gaithersburg，MD)和青霉素/鏈霉素(Boehringer Marmheim Biochemicals(BMB)，Indianapolis，IN)補充，細胞在6-孔板(Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)中生長，密度為4×105細胞/孔，有到它們在VWR型2500CO2溫育器(VWR，Philadelphia，PA)中60-80％融合。DNA(3.3μg)在HEPES緩沖的鹽水(HBS)(HEPES 20mM，150mM NaCl，Ph7.4)中稀釋至100μl用于各孔感染。制備20μl溶液(1)實施例5D的陽離子類脂化合物與變量的DOPE混合；(2)Lipofectin；和(3)Lipofectarmine。這些在HBS中稀釋至100μL用于各孔。實施例5D的化合物和DOPE以重量比5∶1，6∶1，7∶1，9∶1，11∶1和14∶1混合。DNA和類脂溶液通過翻轉混合，并在室溫溫育15分鐘。溫育后，DNA和陽離子類脂的混合物(200μL)被加到各孔中(除了HeLa(CELLS)標準，不往其中加DNA與陽離子類脂)，混合物通過上下吸移幾次而攪動。細胞然后在CO2氣氛中于37℃溫育48-72小時。溫育后，蛋白質水平如上所述分析。
分析結果描繪于附圖2中，它顯示出，與現有技術化合物相比，當用本發(fā)明的陽離子類脂化合物轉移細胞時，增加CAT的表達。特別理想的轉移在包含6∶1的實施例5D與DOPE的組合物中觀察到。在此實施例中進行的實驗證明，與現有技術的化合物相比，本發(fā)明的陽離子類脂化合物提供生物活性劑改進的細胞轉移。
實施例7進行了在大鼠體內的實驗，證明了本發(fā)明陽離子類脂化合物對于細胞內輸送遺傳物質非常有效。實驗也證明了用超聲波能量用于體內瞄準帶含有遺傳物質的微囊組合物的特定組織的效果。
含有β-半乳糖苷酶基因的質粒pSVβ-gal(Promega，Madison，WI)與實施例5D中制備的陽離子類脂化合物混合。將產生的混合物經尾靜脈分別注射到三個Sprague Dartey大鼠(大鼠(A)，(B)和(C))。大鼠(A)不用超聲波。在對大鼠(B)和(C)分別注射期間，將超聲波能量施用于后腿內側。48小時后，將大鼠處死并取出組織。組織在2％福爾馬林中固定72小時，切成薄片并放在X-gal溶液中。在37℃16小時后，對組織進行檢查。從大鼠(A)得到的組織顯藍色，指示出一般轉染。從大鼠(B)和(C)得到的組織只在施用超聲波能量的位點顯藍色。這表示其因表達的定位可以用本發(fā)明的化合物和方法實現。
實施例8本發(fā)明的陽離子類脂組合物從六份在實施例5D制備的化合物和1份用若丹明(Avanti Polarlipids，Alabaster，AL)標記的二棕櫚?；字Ｒ掖及?DPPE)制備。將陽離子類脂組合物溶于乙醇，將Mansfield血管成形術導管頭(Boston Scientific Corp.，Watertown，MA)浸入乙醇制劑中，取出并使其干燥。此操作重復三次。涂覆過的導管頭然后被放在裝有若丹明熒光濾光片的Nikon光顯微鏡上。將一對照導管，沒有用陽離子類脂組合物涂覆的，也放在光顯微鏡上。觀察到涂覆過的導管頭的熒光，而對照導管頭沒有熒光。這證明在各個涂覆的導管上存在類脂組合物的涂層。涂覆過的導管頭然后被浸入普通食鹽水，水和人血清中用于改變時間周期并在光顯微鏡下觀察。導管頭的熒光被再次觀察到，這證明若丹明標記的類脂組合物涂層附著在導管表面。因此，本發(fā)明的類脂組合物可以通過將組合物涂在將要對患者使用的導管上而輸送到體內特定部位。
實施例9本發(fā)明的陽離子類脂制劑由用PCR以熒光素-12 DVTP(去氧尿嘧啶三磷酸酯，從Boehringer Mannheim Biochemicals(BMB)，Indianapolis，IN購買)熒光標記的DNA(5μg)，六份在實施例5D制備的化合物和1份DPPE制備。將導管隨后浸入如實施例8中所述(組合物)的陽離子類脂制劑的乙醇溶液中。對照導管不用陽離子類脂制劑涂覆。誘發(fā)熒光并如實施例8中所述觀察涂覆的導管。對于對照導管沒有觀察到熒光。這證明本發(fā)明的陽離子類脂制劑附著在導管表面。因此，本發(fā)明的類脂制劑可以通過將制劑涂在將要給患者使用的導管上而輸送到體內特定位置。
實施例10本發(fā)明的陽離子類脂制劑將從6份實施例5D的化合物，1份DPPE(二棕櫚?；字Ｒ掖及?和10μg含有內皮細胞生長因子和Respiratory Syncytial Virus RSV生長因子的基因的質粒DNA制備。制劑被凍干，將1至10μg凍干的制劑涂覆到血管成形術導管的氣球上。涂覆將通過簡單地將氣球浸入制劑中完成。血管成形術導管將被導入患者的左前下冠狀動脈以橫過血流動力學上明顯狹窄的區(qū)域。導管將用涂覆過的氣球充氣6個大氣壓。狹窄將被減輕而氣球上凍干的涂層將沉積在動脈壁上。內皮細胞的轉移導致內皮細胞生長因子的定點產生。動脈壁的愈合將被改善，成纖維細胞增生將降低，也導致再狹窄的減輕。
實施例11重復實施例10所述的操作，只是根據K.Ishihara et al.，Journal ofBiomedical Materials Research，Vol，27，pp.1309-1314(1993)所述的過程對導管氣球的表面進行修飾以改進凍干的陽離子類脂制劑的連接。
實施例12
重復實施例12所述的操作，只是用包含，例如，DacronTM和/或網篩的血管斯坦特印模取代血管成形術導管。在斯坦特印模的表面得到改進的內皮愈合。
權利要求
1.下式陽離子類脂化合物
其中x，y和z各自獨立代表0至約100的整數；每一X1獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；每一X2獨立代表O或S；每一Y1獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)a-，S(R6)a-，P(R6)a-或-CO2R6，其中a代表整數1至3；每一Y2獨立代表-N(R6)b-，-S(R6)b-或-P(R6)b-，其中b代表整數0至2；每一Y3獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)a-，S(R6)a-，P(R6)a-或-CO2R6，其中a代表整數1至3；R1，R2，R3和R4各自獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基；每一R5獨立代表氫或含有1至約10個碳原子的烷基；和每一R6獨立代表-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-Q，其中c和d各自獨立代表整數0至約100；每一Q獨立代表磷酸酯殘基，-N(R11)q，-S(R11)q，-P(R11)q或-CO2R6，其中q代表整數1至3；X3和X4各自獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；每一R7獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基；每一R8獨立代表氫或含1至約60個碳原子的烷基；R9和R10各自獨立代表含1至約20個碳原子的亞烷基；和每一R11獨立代表-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-W，其中每一W獨立代表磷酸酯殘基，-N(R12)w，-S(R12)w，-P(R12)w或-CO2R12，其中w代表整數1至3；和R12代表-[R7-X3]c-R8；其條件是式(I)化合物包括至少兩個季鹽部分。
2.根據權利要求1的化合物，其中所述季鹽包括可藥用抗衡離子。
3.根據權利要求2的化合物，其中所述抗衡離子選自鹵離子，R13SO3-，R13CO2-，磷酸根，亞硫酸根，硝酸根，葡糖酸根，葡糖醛酸根(guluronate)，半乳糖醛酸根，丙酸根和甲磺酸根，其中R13代表氫，1至約20個碳原子的烷基或約6至約10個碳原子的芳基。
4.根據權利要求1的化合物，其中c，d，x，y和z各自獨立代表0至約50的整數；每一Q獨立代表磷酸酯殘基，-CO2R11或-N(R11)q，其中q代表2或3；和每一W獨立代表磷酸酯殘基，-CO2R12或-N(R12)w，其中w代表2或3。
5.根據權利要求4的化合物，其中q和w各自代表3。
6.根據權利要求5的化合物，其中c，d，x，y和z各自獨立代表0至約20的整數；和X2代表O。
7.根據權利要求6的化合物，其中c，d，x，y和z各自獨立代表0至約10的整數；和X1，X3和X4各自獨立代表-C(＝O)-NR5-，-NR5-C(＝O)-，-C(＝O)-O-或-O-C(＝O)-。
8.根據權利要求7的化合物，其中c，d，x，y和z各自代表0至約5的整數。
9.根據權利要求8的化合物，其中R1，R2，R3和R4各自獨立代表含有1至約10個碳原子的直鏈亞烷基或含約4至約10個碳原子的亞環(huán)烷基；每一R5獨立代表氫或含有1至約4個碳原子的烷基；每一R7獨立代表含1至約10個碳原子的亞烷基；每一R8獨立代表氫或含有1至約40個碳原子的烷基；R9和R10各自獨立代表含1至約10個碳原子的亞烷基。
10.根據權利要求9的化合物，其中R1，R2，R3和R4各自獨立代表含有1至約4個碳原子的直鏈亞烷基或含約5至約7個碳原子的亞環(huán)烷基；R5代表氫；每一R7獨立代表含1至約4個碳原子的亞烷基；每一R8獨立代表氫或含有1至約20個碳原子的烷基；R9和R10各自獨立代表含1至約4個碳原子的亞烷基。
11.根據權利要求10的化合物，其中每一Y1獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)a-，或-CO2R6；Y2代表-N(R6)b-；和每一Y3獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)a-或-CO2R6。
12.根據權利要求11的化合物，其中x為1。
13.根據權利要求12的化合物，其中y為2和z為0。
14.根據權利要求13的化合物，其中每一Y1獨立代表N(R6)a-，或-CO2R6；和R6代表-[R7-X3]c-R8。
15.根據權利要求14的化合物，其中R1，R2，R3和R4各自獨立代表亞甲基，1，2-亞乙基或亞環(huán)己基；和每一R8獨立代表氫或約1至約16碳原子的烷基。
16.根據權利要求15的化合物，其中a為3；和每一c各自獨立代表0或1。
17.根據權利要求16的化合物，其中b為1。
18.根據權利要求17的化合物，所述化合物為N，N′-雙(十二烷氧基羰基亞甲基)-N，N′-雙(β-N，N，N-三甲銨乙基氨基羰基亞甲基)乙二胺二鹵化物。
19.根據權利要求18的化合物，其中所述鹵化物為氯化物，溴化物或碘化物。
20.根據權利要求17的化合物，所述化合物為N，N′-雙(十六烷基氨基羰基亞甲基)-N，N′-雙(三甲銨乙基氨基羰基亞甲基)乙二胺二鹵化物。
21.根據權利要求20的化合物，其中所述鹵化物為氯化物，溴化物或碘化物。
22.根據權利要求16的化合物，其中b為2。
23.根據權利要求22的化合物，所述化合物為N，N′-雙(十二烷基氨基羰基亞甲基)-N，N′-雙(β-N，N，N-三甲銨乙基氨基羰基亞甲基)-N，N′-二甲基乙二胺四鹵化物。
24.根據權利要求23的化合物，其中所述鹵化物為氯化物，溴化物或碘化物。
25.根據權利要求22的化合物，所述化合物為N，N′-雙(十二烷基氨基羰基亞甲基)-N，N′-雙(β-N，N，N-三甲銨乙基氨基羰基亞甲基)-N，N′-二甲基環(huán)己烷亞基-1，4-二胺四鹵化物。
26.根據權利要求25的化合物，其中所述鹵化物為氯化物，溴化物或碘化物。
27.根據權利要求22的化合物，所述化合物為N，N′-雙(十六烷基氨基羰基亞甲基)-N，N′-雙(β-N，N，N-三甲銨乙基氨基羰基亞甲基)-N，N′-二甲基乙二胺四鹵化物。
28.根據權利要求27的化合物，其中所述鹵化物為氯化物，溴化物或碘化物。
29.根據權利要求16的化合物，其中每一b獨立為1或2。
30.根據權利要求29的化合物，所述化合物為N，N′-雙(十六烷氧基羰基亞甲基)-N-(β-N，N，N-三甲銨乙基氨基羰基亞甲基)-N-甲基-N′-(羧基亞甲基)乙二胺二鹵化物。
31.根據權利要求30的化合物，其中所述鹵化物為氯化物，溴化物或碘化物。
32.根據權利要求12的化合物，其中y為2且z為0或1。
33.根據權利要求32的化合物，其中a為3；b為2；c各自獨立為0或1；和d為1。
34.根據權利要求33的化合物，其中R11代表-[R7-X3]c-R8。
35.根據權利要求34的化合物，其中R1，R2，R3，R4和R7各自獨立代表亞甲基或1，2-亞乙基；和每一R8獨立代表氫或1至約16碳原子的烷基。
36.根據權利要求35的化合物，所述化合物為N，N″-雙(十六烷基氨基羰基亞甲基)-N，N′，N″-三(β-N，N，N-三甲銨乙基氨基羰基亞甲基)-N，N′，N″-三甲基二亞乙基三胺六鹵化物。
37.根據權利要求36的化合物，其中所述鹵化物為氯化物，溴化物或碘化物。
38.根據權利要求12的化合物，其中y為3且z為0。
39.根據權利要求38的化合物，其中a為3；b為2；c各自獨立為0或1；和d為1。
40.根據權利要求39的化合物，其中R1，R2，R3，R4和R7各自獨立代表亞甲基或1，2-亞乙基；每一R8獨立代表氫或1至約16碳原子的烷基；每一R9和R10各自獨立代表亞甲基或1，2-亞乙基；和R11代表甲基。
41.根據權利要求40的化合物，所述化合物為1，17，7-四(β-N，N，N，N-四甲銨乙基氨基羰基亞甲基)-4-十六烷基氨基羰基亞甲基-N，N′，N″-三甲基-1，4，7-三氮雜庚烷七鹵化物。
42.根據權利要求41的化合物，其中所述鹵化物為氯化物，溴化物或碘化物。
43.根據權利要求12的化合物，其中y為3且z為0。
44.根據權利要求43的化合物，其中a為3；b為1；c為0；和d為1。
45.根據權利要求44的化合物，其中R1，R2和R3各自獨立代表亞甲基或1，2-亞乙基；每一R8獨立代表氫或甲基；每一R9和R10各自獨立代表亞甲基或1，2-亞乙基；和R11代表甲基。
46.根據權利要求45的化合物，所述化合物為N，N，N″，N″-四(β-N，N，N-三甲銨乙基氨基羰基亞甲基)-N′-(1，2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇氨基羰基亞甲基)二亞乙基三胺七鹵化物。
47.根據權利要求46的化合物，其中所述鹵化物為氯化物，溴化物或碘化物。
48.下式陽離子類脂化合物Y1-R1-Y1(II)其中每一Y1獨立代表磷酸酯殘基，N(R2)a-，S(R2)a-，P(R2)a-或-CO2R2，其中a代表整數1至3；R1代表包含0至約30個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-雜原子或雜原子基的1至約60個碳原子的亞烷基；R2代表式-R4-[(X1-R5)x-Y2]y-R6基，其中x和y各自獨立代表整數0至約100；每一X1獨立代表直接鍵，-O-，-S-，-NR3-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R3)-，-N(R3)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-；每一X2獨立代表O或S；每一Y2獨立代表-O-，-S(R2)b，-N(R2)b-或-P(R2)b-，其中b代表整數0至2；每一R3獨立代表氫或1至約10碳原子的烷基；R4和R5各自獨立代表直接鍵或包含0至約15個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-雜原子或雜原子基的1至約30個碳原子的亞烷基；和每一R6獨立代表氫或代表包含0至約30個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-雜原子或雜原子基的1至約60個碳原子的烷基；其條件是式(II)化合物包括至少兩個季鹽部分。
49.根據權利要求48的化合物，其中所述季鹽包括可藥用抗衡離子。
50.根據權利要求49的化合物，其中所述抗衡離子選自鹵離子，R7SO3-，R7CO2-，磷酸根，亞硫酸根，硝酸根，葡糖酸根，葡糖醛酸根(guluronate)，半乳糖醛酸根，丙酸根和甲磺酸根，其中R7代表氫，1至約20個碳原子的烷基或約6至約10個碳原子的芳基。
51.根據權利要求48的化合物，其中x和y各自獨立代表0至約50的整數。
52.根據權利要求51的化合物，其中每一Y1獨立代表磷酸酯基，N(R2)a-或-CO2R2。
53.根據權利要求52的化合物，其中每一Y1獨立代表N(R2)a-或-CO2R2。
54.根據權利要求53的化合物，其中x和y各自獨立代表0至約20的整數；和X2代表O。
55.根據權利要求54的化合物，其中x和y各自獨立代表0至約10的整數。
56.根據權利要求55的化合物，其中X1各自獨立代表-C(＝Z2)-N(R3)-，-N(R3)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，或-O-C(＝X2)-。
57.根據權利要求56的化合物，其中R1代表含1至約40碳原子的亞烷基；每一R3獨立代表氫或1至約4個碳原子的烷基；R4和R5各自獨立代表直接鍵或含1至約20個碳原子的亞烷基；和每一R6獨立代表氫或含1至約40個碳原子的烷基。
58.根據權利要求57的化合物，其中R1代表含1至約20碳原子的亞烷基；R3代表氫；和每一R6獨立代表氫或1至約20碳原子的烷基。
59.根據權利要求58的化合物，其中R1獨立代表含1至約10個碳原子的直鏈亞烷基或含約4至約10個碳原子的亞環(huán)烷基；和R4和R5各自獨立代表直接鍵，含1至約10個碳原子的直鏈亞烷基或含4至約10個碳原子的亞環(huán)烷基。
60.根據權利要求59的化合物，其中R1獨立代表含1至約4個碳原子的直鏈亞烷基或含約5至約7個碳原子的亞環(huán)烷基；和R4和R5各自獨立代表直接鍵.含1至約4個碳原子的直鏈亞烷基或含5至約7個碳原子的亞環(huán)烷基。
61.下式陽離子類脂化合物
其中x，y和z各自獨立代表整數0至約100；每一X1獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；每一X2獨立代表O或S；每一Y1獨立代表-O-，-N(R6)a-，-S(R6)a-，或-P(R6)a-，其中a代表整數0至2；每一Y2獨立代表-N(R6)a-，-S(R6)a-或-P(R6)a-，其中a代表整數0至2；每一Y3獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)b-，S(R6)b-，P(R6)b-或-CO2R6，其中b代表整數1至3；R1，R2，R3和R4各自獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基；每一R5獨立代表氫或1至約
c-R8或-R9-[X4-R10]d-Q，其中c和d各自獨立代表整數0至約100；每一Q獨立代表磷酸酯殘基，-N(R11)q，-S(R11)q，-P(R11)q或-CO2R11，其中q代表整數1至3；X3和X4各自獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；每一R7獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基；每一R8獨立代表氫或含1至約60個碳原子的烷基；R9和R10各自獨立代表含1至約20個碳原子的亞烷基；和每一R11獨立代表-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-W，其中每一W獨立代表磷酸酯殘基，-N(R12)w，-S(R12)w，-P(R12)w或-CO2R12，其中w代表整數1至3；和R12代表-[R7-X3]c-R8；其條件是式(III)化合物包括兩個季鹽部分。
62.根據權利要求61的化合物，其中所述季鹽包括可藥用抗衡離子。
63.根據權利要求62的化合物，其中所述抗衡離子選自鹵離子，R13SO3-，R13CO2-，磷酸根，亞硫酸根，硝酸根，葡糖酸根，葡糖醛酸根(guluronate)，半乳糖醛酸根，丙酸根和甲磺酸根，其中R7代表氫，1至約20個碳原子的烷基或約6至約10個碳原子的芳基。
64.根據權利要求61的化合物，其中c，d，x，y和z各自獨立代表0至約50的整數；每一Q獨立代表磷酸酯殘基，-N(R11)q或-CO2R11，其中q代表2或3；和每一W獨立代表磷酸酯殘基，-N(R12)w或-CO2R12，其中w代表2或3。
65.根據權利要求64的化合物，其中q和w各自代表3。
66.根據權利要求65的化合物，其中c，d，x，y和z各自獨立代表0至約20的整數；和X2代表O。
67.根據權利要求66的化合物，其中c，d，x，y和z各自獨立代表0至約10的整數；和X1，X3和X4各自獨立代表-C(＝O)-NR5-，-NR5-C(＝O)-，-C(＝O)-O-或-O-C(＝O)-。
68.根據權利要求67的化合物，其中c，d，x，y和z各自代表0至約5的整數。
69.根據權利要求68的化合物，其中R1，R2，R3和R4各自獨立代表含有1至約10個碳原子的直鏈亞烷基或含約4至約10個碳原子的亞環(huán)烷基；每一R5獨立代表氫或含有1至約4個碳原子的烷基；每一R7獨立代表含1至約10個碳原子的亞烷基；每一R8獨立代表氫或含有1至約40個碳原子的烷基；和R9和R10各自獨立代表含1至約10個碳原子的亞烷基。
70.根據權利要求69的化合物，其中R1，R2，R3和R4各自獨立代表含有1至約4個碳原子的直鏈亞烷基或含約5至約7個碳原子的亞環(huán)烷基；R5代表氫；R7獨立代表含1至約4個碳原子的亞烷基；每一R8獨立代表含有1至約20個碳原子的烷基；和R9和R10各自獨立代表含1至約4個碳原子的亞烷基。
71.根據權利要求70的化合物，其中Y1代表-N(R6)a-；Y2代表-N(R6)a-；和每一Y3獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)b-或-CO2R6。
72.陽離子類脂化合物，所述化合物包括至少兩個陽離子基團。
73.陽離子類脂組合物，該組合物包括權利要求1的陽離子類脂化合物組成。
74.根據權利要求73的陽離子類脂組合物，所述組合物選自微膠粒，脂質體和它們的混合物。
75.根據權利要求74的陽離子類脂組合物，所述組合物進一步包括穩(wěn)定組合物的兩親化合物。
76.根據權利要求75的陽離子類脂組合物，所述組合物進一步包括氣體，氣體前體或它們的混合物。
77.根據權利要求76的陽離子類脂組合物，其中所述氣體選自全氟甲烷，全氟乙烷，全氟丙烷，全氟丁烷，全氟環(huán)丁烷，以及它們的混合物。
78.根據權利要求76的陽離子類脂組合物，所述組合物包括氣體和氣體前體的混合物。
79.陽離子類脂組合物，所述組合物包括權利要求48的陽離子類脂化合物。
80.根據權利要求79的陽離子類脂組合物，所述組合物選自微膠粒，脂質體及其混合物。
81.根據權利要求80的陽離子類脂組合物，所述組合物進一步包括穩(wěn)定組合物的兩親化合物。
82.根據權利要求81的陽離子類脂組合物，所述組合物進一步包括氣體，氣體前體或它們的混合物。
83.根據權利要求82的陽離子類脂組合物，其中所述氣體選自全氟甲烷，全氟乙烷，全氟丙烷，全氟丁烷，全氟環(huán)丁烷，以及它們的混合物。
84.根據權利要求82的陽離子類脂組合物，所述組合物包括氣體和氣體前體的混合物。
85.陽離子類脂組合物，所述組合物包括權利要求61的陽離子類脂化合物。
86.根據權利要求85的陽離子類脂組合物，所述組合物選自微膠粒，脂質體及其混合物。
87.根據權利要求86的陽離子類脂組合物，所述組合物進一步包括穩(wěn)定組合物的兩親化合物。
88.根據權利要求87的陽離子類脂組合物，所述組合物進一步包括氣體，氣體前體或它們的混合物。
89.根據權利要求88的陽離子類脂組合物，其中所述氣體選自全氟甲烷，全氟乙烷，全氟丙烷，全氟丁烷，全氟環(huán)丁烷，以及它們的混合物。
90.根據權利要求88的陽離子類脂組合物，所述組合物包括氣體和氣體前體的混合物。
91.用于胞內傳遞生物活性劑的陽離子類脂制劑，所述制劑包括生物活性劑以及與其結合的包含至少兩個陽離子基團的陽離子類脂化合物。
92.根據權利要求91的類脂制劑，所述制劑選自微膠粒，脂質體及其混合物。
93.根據權利要求92的類脂制劑，其中所述生物活性劑實質上被包封在所述微膠?；蛑|體內。
94.根據權利要求91的制劑，其中所述生物活性劑包括遺傳物質。
95.用于胞內傳遞生物活性劑的陽離子類脂制劑，所述制劑包括生物活性劑以及與其結合的陽離子類脂組合物，其中所述陽離子類脂組合物包括權利要求1的陽離子類脂化合物。
96.根據權利要求95的類脂制劑，所述制劑選自微膠粒，脂質體及其混合物。
97.根據權利要求96的類脂制劑，其中所述生物活性劑實質上被包封在所述微膠?；蛑|體內。
98.根據權利要求95的類脂制劑，其中所述生物活性劑包括遺傳物質。
99.用于胞內傳遞生物活性劑的陽離子類脂制劑，所述制劑包括生物活性劑以及與其結合的陽離子類脂組合物，其中所述陽離子類脂組合物包括權利要求48的陽離子類脂化合物。
100.根據權利要求99的類脂制劑，所述制劑選自微膠粒，脂質體及其混合物。
101.根據權利要求100的類脂制劑，其中所述生物活性劑實質上被包封在所述微膠?；蛑|體內。
102.根據權利要求99的類脂制劑，其中所述生物活性劑包括遺傳物質。
103.用于胞內傳遞生物活性劑的陽離子類脂制劑，所述制劑包括生物活性劑以及與其結合的陽離子類脂組合物，其中所述陽離子類脂組合物包括權利要求61的陽離子類脂化合物。
104.根據權利要求103的類脂制劑，所述制劑選自微膠粒，脂質體及其混合物。
105.根據權利要求104的類脂制劑，其中所述生物活性劑實質上被包封在所述微膠?；蛑|體內。
106.根據權利要求103的類脂制劑，其中所述生物活性劑包括遺傳物質。
107.用于胞內傳遞生物活性劑的陽離子類脂制劑，所述制劑包括生物活性劑以及與其結合的權利要求72的陽離子類脂組合物。
108.根據權利要求107的類脂制劑，所述制劑選自微膠粒，脂質體及其混合物。
109.根據權利要求108的類脂制劑，其中所述生物活性劑實質上被包封在所述微膠?；蛑|體內。
110.根據權利要求107的制劑，其中所述生物活性劑包括遺傳物質。
111.用于胞內傳遞生物活性劑的陽離子類脂制劑的制備方法，此方法包括一同混合生物活性劑和包括具有至少兩個陽離子基團的陽離子類脂化合物的組合物。
112.根據權利要求111的方法，其中所述組合物選自微膠粒，脂質體及其混合物。
113.根據權利要求112的方法，所述方法包括充分包封所述生物活性劑在所述微膠?；蛑|體內。
114.根據權利要求111的方法，其中所述生物活性劑包括遺傳物質。
115.用于胞內傳遞生物活性劑的陽離子類脂制劑的制備方法，此方法包括一同混合生物活性劑和包括權利要求1的陽離子類脂化合物的陽離子類脂組合物。
116.根據權利要求115的方法，其中所述組合物選自微膠粒，脂質體及其混合物。
117.根據權利要求116的方法，所述方法包括充分包封所述生物活性劑在所述微膠?；蛑|體內。
118.根據權利要求115的方法，其中所述生物活性劑包括遺傳物質。
119.用于胞內傳遞生物活性劑的陽離子類脂制劑的制備方法，此方法包括一同混合生物活性劑和包括權利要求48的陽離子類脂化合物的陽離子類脂組合物。
120.根據權利要求119的方法，其中所述組合物選自微膠粒，脂質體及其混合物。
121.根據權利要求120的方法，所述方法包括充分包封所述生物活性劑在所述微膠?；蛑|體內。
122.根據權利要求119的方法，其中所述生物活性劑包括遺傳物質。
123.用于胞內傳遞生物活性劑的陽離子類脂制劑的制備方法，此方法包括一同混合生物活性劑和包括權利要求61的陽離子類脂化合物的陽離子類脂組合物。
124.根據權利要求123的方法，其中所述組合物選自微膠粒，脂質體及其混合物。
125.根據權利要求124的方法，所述方法包括充分包封所述生物活性劑在所述微膠?；蛑|體內。
126.根據權利要求123的方法，其中所述生物活性劑包括遺傳物質。
127.胞內傳遞生物活性劑的方法，該方法包括用包括陽離子類脂化合物和生物活性劑的陽離子類脂組合物接觸細胞，其中所述陽離子類脂化合物包含至少兩個陽離子基團。
128.權利要求127的方法，其中所述組合物選自微膠粒，脂質體及其混合物。
129.權利要求128的方法，其中所述生物活性劑實質上被包封在微膠?；蛑|體內。
130.權利要求127的方法，其中所述生物活性劑包括遺傳物質。
131.權利要求130的方法，其中所述遺傳物質選自多核苷酸，DNA，RNA，多肽及其混合物。
132.胞內傳遞生物活性劑的方法，該方法包括用包括權利要求1的陽離子類脂化合物和生物活性劑的陽離子類脂組合物接觸細胞。
133.權利要求132的方法，其中所述組合物選自微膠粒，脂質體及其混合物。
134.權利要求133的方法，其中所述生物活性劑實質上被包封在微膠?；蛑|體內。
135.權利要求132的方法，其中所述生物活性劑包括遺傳物質。
136.胞內傳遞生物活性劑的方法，該方法包括用包括權利要求48的陽離子類脂化合物和生物活性劑的陽離子類脂組合物接觸細胞。
137.權利要求136的方法，其中所述組合物選自微膠粒，脂質體及其混合物。
138.權利要求137的方法，其中所述生物活性劑實質上被包封在微膠粒或脂質體內。
139.權利要求136的方法，其中所述生物活性劑包括遺傳物質。
140.胞內傳遞生物活性劑的方法，該方法包括用包括權利要求61的陽離子類脂化合物和生物活性劑的陽離子類脂組合物接觸細胞。
141.權利要求140的方法，其中所述組合物選自微膠粒，脂質體及其混合物。
142.權利要求141的方法，其中所述生物活性劑實質上被包封在微膠?；蛑|體內。
143.權利要求140的方法，其中所述生物活性劑包括遺傳物質。
144.對患有遺傳性疾病的患者的治療方法，該方法包括對患者施用治療有效量的權利要求91的制劑。
145.根據權利要求144的方法，其中所述病癥包括與免疫活性的缺失或衰減有關的病理學或病癥。
146.根據權利要求144的方法，其中所述施用包括對患者施用涂布有所述制劑的導管。
147.對患有遺傳性疾病的患者的治療方法，該方法包括對患者施用治療有效量的權利要求95的制劑。
148.根據權利要求147的方法，其中所述病癥包括與免疫活性的缺失或衰減有關的病理學或病癥。
149.對患有遺傳性疾病的患者的治療方法，該方法包括對患者施用治療有效量的權利要求99的制劑。
150.根據權利要求149的方法，其中所述病癥包括與免疫活性的缺失或衰減有關的病理學或病癥。
151.對患有遺傳性疾病的患者的治療方法，該方法包括對患者施用治療有效量權利要求103的制劑。
152.根據權利要求151的方法，其中所述病癥包括與免疫活性的缺失或衰減有關的病理學或病癥。
153.下式陽離子類脂化合物
其中x，y和z各自獨立代表0至約100的整數；每一X1獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；每一X2獨立代表O或S；每一Y1獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)a-，S(R6)a-，P(R6)a-或-CO2R6，其中a代表整數1至3；每一Y2獨立代表-N(R6)b-，-S(R6)b-或-P(R6)b-，其中b代表整數0至2；每一Y3獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)a-，S(R6)a-，P(R6)a-或-CO2R6，其中a代表整數1至3；R1，R2，R3和R4各自獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基；每一R5獨立代表氫或含有1至約10個碳原子的烷基；和每一R6獨立代表-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-Q，其中c和d各自獨立代表整數0至約100；每一Q獨立代表磷酸酯殘基，-N(R11)q，-S(R11)q，-P(R11)q或-CO2R6，其中q代表整數1至3；X3和X4各自獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；每一R7獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基；每一R8獨立代表氫或含1至約40個碳原子的烷基；R9和R10各自獨立代表含1至約20個碳原子的亞烷基；和每一R11獨立代表-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-W，其中每一W獨立代表磷酸酯殘基，-N(R12)w，-S(R12)w，-P(R12)w或-CO2R6，其中w代表整數1至3；和R12代表-[R7-X3]c-R8；其條件是式(I)化合物包括至少一個季鹽部分。
154.下式陽離子類脂化合物Y1-R1-Y1(II)其中每一Y1獨立代表磷酸酯殘基，N(R2)a-，S(R2)a-，P(R2)a-或-CO2R2，其中a代表整數1至3；R1代表包含0至約30個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(=X2)-X2-雜原子或雜原子基的1至約60個碳原子的亞烷基；R2代表式-R4-[(X1-R5)x-Y2]y-R6基，其中x和y各自獨立代表整數0至約100；每一X1獨立代表直接鍵，-O-，-S-，-NR3-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R3)-，-N(R3)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-；每一X2獨立代表O或S；每一Y2獨立代表-S(R2)b，-N(R2)b-或-P(R2)b-，其中b代表整數0至2；每一R3獨立代表氫或1至約10碳原子的烷基；R4和R5各自獨立代表直接鍵或包含0至約15個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-雜原子或雜原子基的1至約30個碳原子的亞烷基；和每一R6獨立代表氫或代表包含0至約30個-O-，-S-，-NR3-或-X2-(R3X2)P(＝X2)-X2-雜原子或雜原子基的1至約60個碳原子的烷基；其條件是式(II)化合物包括至少一個季鹽部分。
155.下式陽離子類脂化合物
其中x，y和z各自獨立代表整數0至約100；每一X1獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；每一X2獨立代表O或S；每一Y1獨立代表-O-，-N(R6)a-，-S(R6)a-，或-P(R6)a-，其中a代表整數0至2；每一Y2獨立代表-N(R6)a-，-S(R6)a-或-P(R6)a-，其中a代表整數0至2；每一Y3獨立代表磷酸酯殘基，N(R6)b-，S(R6)b-，P(R6)b-或-CO2R6，其中b代表整數1至3；R1，R2，R3和R4各自獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基；每一R5獨立代表氫或1至約10個碳原子的烷基；和每一R6獨立代表-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-Q，其中c和d各自獨立代表整數0至約100；每一Q獨立代表磷酸酯殘基，-N(R11)q，-S(R11)q，-P(R11)q或-CO2R11，其中q代表整數1至3；X3和X4各自獨立代表-O-，-S-，-NR5-，-C(＝X2)-，-C(＝X2)-N(R5)-，-N(R5)-C(＝X2)-，-C(＝X2)-O-，-O-C(＝X2)-或-X2-(R5X2)P(＝X2)-X2-；每一R7獨立代表含有1至約20個碳原子的亞烷基；每一R8獨立代表氫或含1至約60個碳原子的烷基；R9和R10各自獨立代表含1至約20個碳原子的亞烷基；和每一R11獨立代表-[R7-X3]c-R8或-R9-[X4-R10]d-W，其中每一W獨立代表磷酸酯殘基，-N(R12)w，-S(R12)w，-P(R12)w或-CO2R12，其中w代表整數1至3；和R12代表-[R7-X3]c-R8；其條件是式(III)化合物包括至少一個季鹽部分。
全文摘要
本發(fā)明公開了包括至少兩個陽離子基團的陽離子類脂化合物。此陽離子類脂化合物特別適于用作胞內傳遞生物活性劑(包括藥物和遺傳物質)的載體。本發(fā)明陽離子類脂化合物的組合物包括懸浮液,乳狀液,微膠粒和脂質體。
文檔編號A61K48/00GK1177342SQ96192058
公開日1998年3月25日 申請日期1996年1月29日 優(yōu)先權日1995年2月21日
發(fā)明者埃文·C·昂格爾, 沈德康, 吳觀麗 申請人:ImaRx藥物公司