專(zhuān)利名稱(chēng)：：齲齒的替補(bǔ)療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明通過(guò)國(guó)家牙科研究所，公共衛(wèi)生署基金第DEO4529號(hào)，至少部分受到聯(lián)邦政府的基金資助。政府對(duì)本發(fā)明享有一定的權(quán)力。
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及齲齒預(yù)防的方法與組合物。相關(guān)領(lǐng)域說(shuō)明某種細(xì)菌在宿主中形成菌落的能力由許多因素決定，例如細(xì)菌的代謝需要，以及該菌與已先存在的細(xì)菌菌群的相互作用。細(xì)菌間的相互作用通?？煞譃椤罢缘摹被颉柏?fù)性的”。在正性相互作用中，一種“效應(yīng)物”細(xì)菌菌株改變微環(huán)境而有利于第二種，“靶”有機(jī)體形成菌落。在負(fù)性相互作用中，效應(yīng)物菌株改變微環(huán)境從而減弱或完全阻止靶細(xì)菌形成菌落。在宿主中競(jìng)爭(zhēng)形成菌落的細(xì)菌間的負(fù)性相互作用通常被稱(chēng)為細(xì)菌的干擾。利用細(xì)菌間的干擾作用，以一種非致病性效應(yīng)物菌株替代致病菌株的治療方案稱(chēng)為替補(bǔ)療法。成功的替補(bǔ)療法需要這樣的效應(yīng)物菌株1)非致病性，2)改變微環(huán)境從而阻止病原體的定居或過(guò)度生長(zhǎng)，3)在易感宿主中持續(xù)定居防止靶病原體的再感染，并攻擊性地取代易感組織中為宿主固有菌群一部分的病原體。眾所周知齲齒由口腔中生長(zhǎng)的細(xì)菌所引起。人類(lèi)中引起齲齒的主要病原菌為變異鏈球菌。變異鏈球菌與產(chǎn)生齲齒有關(guān)的典型特征包括產(chǎn)生乳酸的能力及其在牙釉質(zhì)上聚積的能力(即形成牙斑)(Gibbons等，1969年，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)98卷341-346頁(yè)；Makinen等，1972年，《國(guó)際牙科雜志》(Int.Dent.J)22卷362-386頁(yè)和Jordan，1965年，《紐約科學(xué)院年報(bào)》(Ann.N.Y.Acad.Sci.)131卷，905-912頁(yè))。應(yīng)用替補(bǔ)療法原理，需要分離一種非齲齒致病性效應(yīng)變異鏈球菌菌株，如某種乳酸合成缺陷的變異鏈球菌株。齲齒替補(bǔ)療法的應(yīng)用進(jìn)展近來(lái)已有綜述(Hillman等，1986年，見(jiàn)《口腔研究中的新生物技術(shù)》(NewBiotechnologiesinOralResearch)H.M.Myers，編，S.Karger.Basel，Switzerland出版，1-17頁(yè))。生產(chǎn)一種適用于齲齒替補(bǔ)療法的乳酸缺陷型變異鏈球菌菌株，遇到了相當(dāng)大的困難。乳酸合成缺陷對(duì)變異鏈球菌是致死性的。Abhyanakar等(1985年，《牙科研究雜志》(J.Dent.Res.)64卷，1267-1271頁(yè))利用一種含有已存在(自發(fā)的)影響丙酮酸代謝的突變的非典型變異鏈球菌株，通過(guò)化學(xué)誘變，獲得了一種乳酸脫氫酶(IDH)-缺陷的變異鏈球菌突變株。然而，該菌株中化學(xué)誘導(dǎo)和自發(fā)產(chǎn)生的突變?nèi)圆坏湫?。而且，化學(xué)誘導(dǎo)的非典型突變能恢復(fù)成野生型，從而具有致病性，產(chǎn)生齲齒現(xiàn)象。后來(lái)在其它變異鏈球菌株中產(chǎn)生LDH-缺陷型的嘗試也失敗了(Hillman等，1994年，《感染與免疫》(Infect.Immun.)62卷，60-64頁(yè)；Chen等，1994年，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)176卷，1542-1545頁(yè))。很清楚，本領(lǐng)域需要一種穩(wěn)定，乳酸缺陷型，非齲齒致病性的變異鏈球菌菌株，適用于防止和/或治療齲齒的替補(bǔ)療法。發(fā)明概述本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)通過(guò)在與乳酸合成路徑有關(guān)的基因中導(dǎo)入突變可獲得乳酸缺陷型變異鏈球菌株，并通過(guò)在該菌株中導(dǎo)入一個(gè)重組醇脫氫酶(adh)基因以避免該突變的致死性。重組的adh防止該細(xì)菌中代謝產(chǎn)物(如丙酮酸)的堆積，從而避免乳酸缺陷的致死性。該策略可用來(lái)生產(chǎn)適合齲齒替補(bǔ)療法的變異鏈球菌株。總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明以在齲齒易感宿主中預(yù)防和/或治療齲齒的方法和組合物為特征。本發(fā)明的一個(gè)特色為一種重組變異鏈球菌株，該菌株的特征在于乳酸產(chǎn)生缺陷(如由于乳酸脫氫酶活性的喪失)，和替代的重組醇脫氫酶(ADH)的產(chǎn)生?！叭樗岙a(chǎn)生缺陷”或“乳酸缺陷”指重組變異鏈球菌株相對(duì)于野生型變異鏈球菌產(chǎn)生乳酸的量大為降低。優(yōu)選“乳酸缺陷型”重組變異鏈球菌產(chǎn)生的乳酸幾乎檢測(cè)不到。本發(fā)明的特色還在于生產(chǎn)本發(fā)明中重組菌株的方法。優(yōu)選的重組變異鏈球菌菌株具有以下特征1)乳酸產(chǎn)生缺陷；2)重組醇脫氫酶的產(chǎn)生；和3)產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌素敏感性變異鏈球菌株具有抗菌活性的細(xì)菌素；和4)可任選為營(yíng)養(yǎng)缺陷型(例如D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型)。另外優(yōu)選的重組變異鏈球菌菌株為乳酸產(chǎn)生缺陷型，能產(chǎn)生重組醇脫氫酶，并為營(yíng)養(yǎng)缺陷型(例如為D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型)。本發(fā)明的另一特色在于一種藥物組合物，包括重組乳酸缺陷、重組ADH-產(chǎn)生的變異鏈球菌及藥用載體。本發(fā)明的特色還在于一種在齲齒易感宿主中降低齲齒發(fā)病率和嚴(yán)重性的方法，該方法為給齲齒易感宿主口服能有效替代宿主口腔中致齲齒變異鏈球菌劑量的重組變異鏈球菌株，該重組菌株具有1)重組的醇脫氫酶基因和2)乳酸產(chǎn)生缺陷。本發(fā)明的另一特色在于維持宿主口腔內(nèi)D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌(如，D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異鏈球菌)的組合物，含有能夠維持D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌生長(zhǎng)的D-丙氨酸。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)為重組變異鏈球菌1)為乳酸缺陷型，從而不會(huì)引起齲齒，和2)能有效地替代宿主口腔中能引起齲齒的變異鏈球菌菌株。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)為，重組的變異鏈球菌菌株為D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，該菌株的定居可通過(guò)給予D-丙氨酸得到控制。本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)可以從下述的優(yōu)選實(shí)施方案和權(quán)利要求中顯示。附圖簡(jiǎn)述圖1示運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌醇脫氫酶II的氨基酸序列(SEQIDNO1)和DNA序列(SEQIDNO2)。圖2示葡萄糖對(duì)變異鏈球菌菌株CH4ts和NG8(對(duì)照)的生長(zhǎng)，存活，及胞內(nèi)丙酮酸濃度的影響。符號(hào)MG8加葡萄糖，——□——；NG8不加葡萄糖，——○——；CH4ts加葡萄糖，——○——；CH4ts不加葡萄糖，—△—。圖3示葡萄糖濃度和溫度對(duì)10％稀釋率的變異鏈球菌菌株CH4ts連續(xù)培養(yǎng)的影響。圖A符號(hào)——□——，光密度；——○——，葡萄糖濃度；圖B符號(hào)—○—，pH；——□——，乳酸濃度；——△——，理論洗出；——○——，乙醇濃度；—□—，三羥基丁酮濃度。圖4示葡萄糖濃度和溫度對(duì)0.6％稀釋率的變異鏈球菌菌株CH4ts連續(xù)培養(yǎng)的影響。符號(hào)——□——，光密度；——○——，葡萄糖；—○—，理論洗出。發(fā)明詳述齲齒由通常生活在口腔中的變異鏈球菌產(chǎn)生的乳酸及其聚積引起。但是，由于變異鏈球菌中乳酸產(chǎn)生途徑的突變對(duì)細(xì)菌是致死的，因此將乳酸缺陷型變異鏈球菌導(dǎo)入口腔，取代產(chǎn)生乳酸的變異鏈球菌是不可能的。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)能存活的乳酸缺陷型變異鏈球菌菌株可通過(guò)導(dǎo)入編碼重組醇脫氫酶(ADH)的核酸轉(zhuǎn)化菌株產(chǎn)生，同時(shí)在乳酸合成途徑中引入突變，而獲得重組產(chǎn)生ADH的乳酸缺陷型菌株。重組的ADH阻止了細(xì)菌代謝產(chǎn)物的堆積，從而消除了乳酸缺陷的致死性。該策略可用來(lái)生產(chǎn)適合齲齒替補(bǔ)療法的重組變異鏈球菌菌株。本發(fā)明中重組變異鏈球菌菌株“重組變異鏈球菌菌株”是利用多種重組核酸技術(shù)(即涉及DNA或RNA人工操作的技術(shù))中的任何一種，產(chǎn)生的變異鏈球菌非天然產(chǎn)生菌株?？偟膩?lái)說(shuō)，本發(fā)明中重組變異鏈球菌菌株至少有以下特征1)乳酸產(chǎn)生缺陷，和2)重組醇脫氫酶(ADH)的產(chǎn)生。優(yōu)選的重組變異鏈球菌菌株還具有以下特征，即能產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌素敏感性變異鏈球菌菌株具有抗菌活性的細(xì)菌素。這里所指的“細(xì)菌素”，是變異鏈球菌菌株JH1000產(chǎn)生的特異性細(xì)菌素或細(xì)菌素樣毒素(Hillman等，1984年，《感染與免疫》(Infect.Immun.)44卷，141-144頁(yè))。變異鏈球菌JH1000產(chǎn)生的細(xì)菌素表觀分子量低于1000Da，并對(duì)細(xì)菌素敏感性變異鏈球菌菌株具有抗菌活性。細(xì)菌素的產(chǎn)生為變異鏈球菌與通常存在于口腔內(nèi)，不產(chǎn)生細(xì)菌素的變異鏈球菌菌株提供了選擇優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明重組變異鏈球菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素，可以消除固有的細(xì)菌素敏感性變異鏈球菌株，從而干擾細(xì)菌素敏感性菌株的定居，促進(jìn)重組變異鏈球菌株在口腔中的生長(zhǎng)。出于能夠控制本發(fā)明中重組變異鏈球菌株在口腔中生長(zhǎng)的愿望，優(yōu)選的重組變異鏈球菌株對(duì)通常不存在于哺乳動(dòng)物宿主口腔中的有機(jī)物質(zhì)應(yīng)該為營(yíng)養(yǎng)缺陷型，再優(yōu)選的為D-氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，更加優(yōu)選的為D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的生長(zhǎng)可通過(guò)調(diào)節(jié)該菌株?duì)I養(yǎng)缺陷的有機(jī)物的量而得到控制。因此，如果需要除去宿主中的重組變異鏈球菌，只要停止供應(yīng)該菌株?duì)I養(yǎng)缺陷的特異有機(jī)物，就可終止細(xì)菌的生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明的重組變異鏈球菌菌株具有以下特征1)乳酸缺陷，和2)產(chǎn)生重組的ADH，進(jìn)一步的特征為3)產(chǎn)生細(xì)菌素，和/或4)對(duì)某特異有機(jī)物營(yíng)養(yǎng)缺陷，優(yōu)選D-氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷，更優(yōu)選D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷?，F(xiàn)將詳細(xì)闡述本發(fā)明的每一種重組變異鏈球菌菌株的生產(chǎn)。用于生產(chǎn)本發(fā)明重組變異鏈球菌株的親本變異鏈球菌株用于生產(chǎn)本發(fā)明重組變異鏈球菌株的變異鏈球菌株可為任何一株變異鏈球菌。用于生產(chǎn)本發(fā)明重組變異鏈球菌株的優(yōu)選變異鏈球菌株對(duì)通常生活在口腔中的野生型變異鏈球菌株，應(yīng)具有選擇優(yōu)勢(shì)。選擇優(yōu)勢(shì)可通過(guò)能促進(jìn)該菌株在口腔中生存的諸多特性中的任何一種(如抗菌化合物的產(chǎn)生，相對(duì)代謝需求，相對(duì)生長(zhǎng)率、代謝物清除劑的產(chǎn)生)，和取代生活在口腔中的固有菌株而獲得。并且，本發(fā)明重組變異鏈球菌株的定居基本上不破壞其它非變異鏈球菌株(如與產(chǎn)生齲齒無(wú)關(guān)的正常菌群)的定居。例如，用產(chǎn)生高水平細(xì)菌素的變異鏈球菌JH1000的變異株感染人志愿者，結(jié)果該菌株取代了口腔中固有致齲齒變異鏈球菌株(推測(cè)部分是因?yàn)镴H1000菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素)而沒(méi)有影響口腔中其它固有革蘭氏陽(yáng)性菌(Hillman等，1987年，《牙科研究雜志》(J.Dent.Res.)66卷，1092-1094頁(yè))。優(yōu)選的變異鏈球菌株產(chǎn)生變異鏈球菌JH1000的細(xì)菌素。更優(yōu)選的重組變異鏈球菌菌株來(lái)自相對(duì)于變異鏈球菌JH1000能產(chǎn)生更多細(xì)菌素的變異鏈球菌JH1000變異株?！白儺愔辍笔墙?jīng)過(guò)遺傳修飾的細(xì)菌，相對(duì)于來(lái)源的親本菌株顯示表型的改變。表型改變可以是諸多遺傳損傷中任意一種的結(jié)果，如改變位于1)與結(jié)構(gòu)基因操縱相連的啟動(dòng)子(如導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng))；和/或2)編碼特異產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因(如產(chǎn)物活性增強(qiáng))。遺傳損傷是野生型核酸序列的改變，其結(jié)果是導(dǎo)致細(xì)菌表型的改變。例如，變異鏈球菌JH1000的“細(xì)菌素變異株”是相對(duì)于變異鏈球菌JH1000親本菌株具有增強(qiáng)的細(xì)菌素活性的細(xì)菌。優(yōu)選變異鏈球菌JH1000變異株的細(xì)菌素活性相對(duì)于其親本變異鏈球菌有所提高，優(yōu)選提高約10倍，再優(yōu)選約1.5-5倍，最優(yōu)選約2-4倍，通常較親本變異鏈球菌JH1000菌株提高約3倍。這些變異株細(xì)菌素活性增強(qiáng)的原因可以是相對(duì)于親本菌株細(xì)菌素的產(chǎn)量增加，和/或產(chǎn)生的細(xì)菌素相對(duì)于野生型變異鏈球菌細(xì)菌素具有增強(qiáng)的抗菌活性?！白儺愔辍笨赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域眾所周知的多種方法產(chǎn)生，如誘變(即將細(xì)菌暴露于誘變劑)，篩選自發(fā)突變體，或用重組技術(shù)進(jìn)行遺傳操作。誘變可通過(guò)將細(xì)菌暴露在紫外燈下，或任何化學(xué)誘變劑下，按本領(lǐng)域熟知的方法完成(例如甲基磺酸乙酯(EMS)，亞硝酸，羥胺，核苷酸類(lèi)似物(如5-溴尿嘧啶，2-氨基嘌呤)，或交聯(lián)劑(如吖啶))。產(chǎn)生變異菌株的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見(jiàn)，如Sambrook等，1989年《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularClonmgALaboratoryManual)第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約)?！白园l(fā)突變”為天然發(fā)生的突變，即沒(méi)有人為的直接遺傳操作，或暴露于誘變劑。自發(fā)突變體的篩選可通過(guò)培養(yǎng)菌株，并通過(guò)，如，變異菌株產(chǎn)生或過(guò)量產(chǎn)生的某種特異因子，如細(xì)菌素，來(lái)篩選所需的變異株。篩選自發(fā)突變株的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的(參見(jiàn)，如Sambrook等，上文)。用重組技術(shù)產(chǎn)生變異株的方法也為本領(lǐng)域熟知(參見(jiàn)，如Sambrook等，1989年，上文)。例如，細(xì)菌素活性增強(qiáng)的變異鏈球菌JH1000變異株可通過(guò)編碼細(xì)菌素DNA的多拷貝表達(dá)，和/或能提高轉(zhuǎn)錄水平的細(xì)菌素啟動(dòng)子的突變而產(chǎn)生。醇脫氫酶基因由于乳酸合成缺陷對(duì)變異鏈球菌是致死性的(Hillman等，1994年，《感染與免疫》(Intect.Immun.)62卷，60-64頁(yè)；Hillman等，1994年《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol)176卷，1542-1545頁(yè))，重組乳酸缺陷型變異鏈球菌株的缺陷必須通過(guò)重組醇脫氫酶(ADH)的產(chǎn)生來(lái)彌補(bǔ)。重組ADH的產(chǎn)生防止了代謝物，如丙酮酸，的堆積，否則將引起乳酸缺陷型變異鏈球菌的死亡?！爸亟MADH的產(chǎn)生”指重組的變異鏈球菌株表達(dá)具有功能的ADH酶，該酶利用重組DNA技術(shù)引入變異鏈球菌中(即用編碼ADH酶的DNA轉(zhuǎn)化變異鏈球菌)?！稗D(zhuǎn)化”指新的DNA(即相對(duì)細(xì)胞為外源性DNA)進(jìn)入細(xì)胞后誘導(dǎo)的永久性(即穩(wěn)定的)遺傳改變。編碼ADH的DNA可從任何有機(jī)體中獲得，優(yōu)選的是從細(xì)菌中獲得，再優(yōu)選的是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌或鼠鏈球菌，最優(yōu)選的是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。編碼ADH的DNA也可從變異鏈球菌中獲得，因此，導(dǎo)入的編碼ADH的DNA與變異鏈球菌中固有的adh基因結(jié)合，在變異鏈球菌的基因組中形成多拷貝的編碼ADH的DNA?；蛘?，重組的ADH可通過(guò)在變異鏈球菌adh基因的調(diào)控機(jī)制中引入一突變而產(chǎn)生(例如在adh啟動(dòng)子上引入突變從而提高adh基因的轉(zhuǎn)錄)。優(yōu)選的重組ADH是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的醇脫氫酶II，該酶已被克隆與測(cè)序(GenbankAccessionNo.M15394；Conway等，1987年《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)169卷，2591-2597頁(yè)，在此引入作為參考)。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌醇脫氫酶II的氨基酸序列(SEQIDNO1)和DNA序列(SEQIDNO2)見(jiàn)圖1所示。鑒定、克隆、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化及表達(dá)編碼感興趣DNA(如ADH)的DNA片段的方法已常規(guī)化，并為本領(lǐng)域熟知(參見(jiàn)，例如Sambrook等，1989年《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularCloningALaboratoryManual)第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約)。例如，分離編碼ADH的DNA可通過(guò)從基因組DNA，或已有的該基因克隆中對(duì)該序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增而完成。重組ADH的表達(dá)可通過(guò)將adh結(jié)構(gòu)基因與一在變異鏈球菌中有利于表達(dá)的啟動(dòng)子(如spaP或天然ldh啟動(dòng)子)操縱連接而完成。功能性ADH的產(chǎn)生可通過(guò)，如用本領(lǐng)域熟知的傳統(tǒng)的ADH活性法(例如NAD依賴(lài)的乙醇氧化法)進(jìn)行(Neal等，1986年，《歐洲生物化學(xué)雜志》(Eur，J.Biochem.)154卷，119-124頁(yè)，在此引入作為參考)。乳酸缺陷型變異鏈球菌的產(chǎn)生“乳酸缺陷”或“乳酸產(chǎn)生缺陷”指變異鏈球菌株產(chǎn)生的乳酸量較野生型變異鏈球菌顯著降低。優(yōu)選的“乳酸缺陷型”重組變異鏈球菌產(chǎn)生的乳酸量幾乎檢測(cè)不到。本發(fā)明重組變異鏈球菌的乳酸缺陷是乳酸合成途徑缺陷的結(jié)果。“缺陷”是編碼基因的DNA改變，從而阻礙了功能性基因產(chǎn)物的表達(dá)?！叭毕荨卑▽?dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的抑制或顯著降低的改變?！叭毕荨币舶ńY(jié)構(gòu)基因的改變，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和翻譯的基因產(chǎn)物無(wú)功能性，或相對(duì)于野生型基因產(chǎn)物其功能顯著降低。“乳酸合成途徑的缺陷”是阻止或顯著降低乳酸產(chǎn)量的遺傳缺陷。乳酸合成途徑缺陷可包括，例如，促進(jìn)乳酸合成的酶的遺傳損傷，和/或與編碼乳酸合成所必需酶的結(jié)構(gòu)基因操縱相連的啟動(dòng)子的損傷。優(yōu)選的乳酸合成途徑缺陷是因?yàn)榫幋a乳酸脫氫酶的基因(ldh)的缺陷(例如ldh結(jié)構(gòu)基因的缺陷，和/或與ldh結(jié)構(gòu)基因操縱連接的啟動(dòng)子的缺陷)。具有LDH缺陷的變異鏈球菌株稱(chēng)作LDH-菌株。乳酸合成途徑缺陷可通過(guò)誘變(即將細(xì)菌暴露于誘變劑下)，自發(fā)突變株的篩選，或應(yīng)用重組技術(shù)進(jìn)行遺傳操作而引入。如上所述，以上每種技術(shù)均為本領(lǐng)域熟知(參見(jiàn)，例如Sambrook等，上文)。優(yōu)選的乳酸合成途徑缺陷可應(yīng)用重組技術(shù)引入，如將缺陷型ldh結(jié)構(gòu)基因?qū)爰?xì)菌，隨后發(fā)生位點(diǎn)特異性重組，野生型ldh被缺陷型ldh取代。變異鏈球菌ldh基因已被克隆，其核苷酸序列也已確定(GenBankaccessionNo.M72545)，重組的ldh基因已在大腸桿菌中表達(dá)(Duncan等，1991年《感染與免疫》(Infect.Immun.)59卷，3930-3934頁(yè)；Hillmam等，1990年，《(感染與免疫》(Infect.Immun.)58卷，1290-1295頁(yè)，在此引入作為參考)。營(yíng)養(yǎng)缺陷型重組變異鏈球菌株的產(chǎn)生在某些情況下需除去宿主口腔中生活的重組變異鏈球菌，感染的重組變異鏈球菌優(yōu)選為營(yíng)養(yǎng)缺陷型?！盃I(yíng)養(yǎng)缺陷型”細(xì)菌是指為了生長(zhǎng)，除了碳源外，還需某種特異有機(jī)物質(zhì)的細(xì)菌。例如，“D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌”是指沒(méi)有D-丙氨酸就不能生長(zhǎng)的細(xì)菌。盡管營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌在所需的有機(jī)物質(zhì)缺乏時(shí)常能短時(shí)期存在(即存活但不生長(zhǎng))，但其維持需定期供應(yīng)該有機(jī)物質(zhì)。例如，D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌需定期供應(yīng)D-丙氨酸才能生長(zhǎng)并維持在小生境如口腔中定居。由于哺乳動(dòng)物通常不能產(chǎn)生D-氨基酸，而且D-丙氨酸也不能由正常菌群中的有機(jī)體分泌，因而D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌不能從宿主口腔的正常環(huán)境中獲得D-丙氨酸。因此，本發(fā)明治療方法中營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌的應(yīng)用提供了這樣的優(yōu)點(diǎn)，即口腔中重組變異鏈球菌的生長(zhǎng)可通過(guò)停止供應(yīng)特異有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物，如D-丙氨酸而被阻斷。細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷可通過(guò)多種本領(lǐng)域熟知的技術(shù)產(chǎn)生，例如化學(xué)誘變，自發(fā)突變體的篩選，和/或重組技術(shù)(例如轉(zhuǎn)座子誘變，用缺陷的或無(wú)功能的基因重組置換)(參見(jiàn)，例如Sambrook等，上文)。優(yōu)選的營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異鏈球菌株可通過(guò)自發(fā)突變體的篩選，或重組方法(例如在D-氨基酸合成途徑中引入缺陷)獲得。優(yōu)選的D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異鏈球菌株可通過(guò)在編碼丙氨酸消旋酶的基因中引入缺陷而產(chǎn)生，該酶可將L-丙氨酸轉(zhuǎn)換為D-丙氨酸。幾種不同細(xì)菌中編碼丙氨酸消旋酶的基因已被克隆(嗜熱脂肪芽孢桿菌，Tanizavua等，1988年，《生物化學(xué)》(Biochem)27卷，1311-16頁(yè)；枯草芽孢桿菌，F(xiàn)errari等，Subtilis，1985年《生物技術(shù)》(Biotechnol.)(NY)3卷，1003-7頁(yè)；大腸桿菌，Lobocka等，1994年《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)176卷，1500-10頁(yè)；鼠傷寒沙門(mén)氏菌，Galakatos等，1986年《生物化學(xué)》(Biochem)23卷，3255-60頁(yè)；和鼠傷寒沙門(mén)氏菌，Wasserman等，1984年《生物化學(xué)》23卷，5182-7頁(yè))。含本發(fā)明中重組變異鏈球菌的藥物組合物“藥物組合物”是適于給齲齒易感患者口腔用藥的本發(fā)明中重組變異鏈球菌株的組合物。通常說(shuō)，本發(fā)明中的藥物組合物包括重組變異鏈球菌株和適于藥用的載體?！斑m于藥用的載體”指能將重組變異鏈球菌株導(dǎo)入至宿主口腔中的媒介物，該媒介物與細(xì)菌細(xì)胞和宿主細(xì)胞的生存相容。適用于本發(fā)明中活的重組變異鏈球菌菌株給藥的適于藥用的載體對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。適于藥用的載體的篩選有賴(lài)于許多因素，包括用于給藥的變異鏈球菌株，以及用于導(dǎo)入重組變異鏈球菌的制劑。適用于本發(fā)明重組變異鏈球菌導(dǎo)入的藥用載體包括，但不限于，鹽水緩沖液(如磷酸緩沖鹽水)，適于藥用的培養(yǎng)基(如Luria肉湯，腦心浸液肉湯(BHI))，或其它可保持細(xì)菌生存能力的溶液。另外，這樣的藥用載體可以為水溶液或非水溶液，懸浮液，和乳濁液。許多適于存活或凍干菌口腔用藥的藥用載體在本領(lǐng)域是眾所周知的(參見(jiàn)，例如，《雷明頓氏藥物科學(xué)》(Remington＇sPharmaceuticalSciences)第18版，1990年，MackPublishingCo.，EastonPA，在此引入作為參考；及藥物組合物L(fēng)ACTINEXTM，一種用于存活乳酸桿菌口腔用藥的商品制劑)。本發(fā)明的重組變異鏈球菌株可被配制成任何適于口腔用藥的組合物。例如，重組變異鏈球菌株可用重組變異鏈球菌培養(yǎng)物配制成親液膠或細(xì)胞膏，或者直接將重組變異鏈球菌培養(yǎng)物進(jìn)行口腔用藥。重組變異鏈球菌也可以漱口水、牙膏、牙線、咀嚼膠或可咀嚼藥片的形式給藥。藥物組合物還應(yīng)包括維持組合物中細(xì)菌存活的營(yíng)養(yǎng)物。藥物組合物尚可包括能提高組合物的適口性和/或使患者更易接受，而不降低組合物效果的調(diào)味劑、著色劑、芳香劑、或其它化合物。制備口腔用藥制劑的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的(參見(jiàn)，例如，《雷明頓氏藥物科學(xué)》(Remington＇sPharmaceuticalSciences)第18版，上文，在此引入作為參考)。維持本發(fā)明中營(yíng)養(yǎng)缺陷型重組變異鏈球菌生存的組合物口腔中重組營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異鏈球菌株必須定期供應(yīng)其營(yíng)養(yǎng)缺陷的有機(jī)物才能維持其定居。長(zhǎng)時(shí)間缺乏該有機(jī)物，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株將停止生長(zhǎng)并不能在口腔中持久定居。例如，在D-丙氨酸缺乏時(shí)，D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株將因細(xì)胞壁的削弱而溶菌。本發(fā)明治療方法中應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異鏈球菌株，為在發(fā)生任何不希望的副作用時(shí)消除該菌株提供了一個(gè)“自動(dòng)保險(xiǎn)”機(jī)制。然而，由于本發(fā)明重組變異鏈球菌株與口腔中正常生長(zhǎng)的固有變異鏈球菌株相似，因此產(chǎn)生不希望的副作用的可能性很小。本發(fā)明中營(yíng)養(yǎng)缺陷型重組變異鏈球菌在口腔中定居的維持可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷維持量的該菌株?duì)I養(yǎng)缺陷的有機(jī)物的口腔給藥來(lái)實(shí)現(xiàn)?！凹?xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷維持量”指足以維持營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌在口腔中生存的有機(jī)物的量。例如，若重組變異鏈球菌為D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷，“D-丙氨酸細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷維持量”為足以維持D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株在宿主口腔中生存的D-丙氨酸的量。通常，單劑量D-丙氨酸細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷維持量的D-丙氨酸含約1-100mg，優(yōu)選約5-75mg，更優(yōu)選約10-50mg，最優(yōu)選約20-25mg的D-丙氨酸。D-丙氨酸在溶液形式的藥物組合物中的濃度范圍約為0.01-167mg/ml(后者為D-丙氨酸在25℃水中的飽和溶液)，優(yōu)選約0.1-50mg/ml，更優(yōu)選約1-25mg/ml。D-丙氨酸在藥物組合物中的濃度可根據(jù)所用的載體以及D-丙氨酸在該特異載體中的飽和度而有所變化。維持營(yíng)養(yǎng)缺陷型重組變異鏈球菌在口腔中生存所必需的有機(jī)物可用多種方式配制。例如，若重組變異鏈球菌為D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，維持D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的組合物可配制成漱口水，咀嚼膠，牙線，牙膏，可咀嚼藥片，或任何其它適于對(duì)宿主口腔用藥的形式。除有機(jī)物(例如D-丙氨酸)外，組合物中還可含有可提高組合物的適口性和/或使患者更易接受而不影響組合物中有機(jī)物作用的調(diào)味劑、著色劑、芳香劑或其它化合物。為本發(fā)明重組變異鏈球菌株口腔用藥以及該菌株在口腔中的維持而配制的藥物組合物必須不影響口腔以及口腔中生長(zhǎng)的任何有用正常菌群的內(nèi)在特征。適于口腔用藥的制劑的制備方法在本領(lǐng)域是眾所周知的(參見(jiàn)，例如，《雷明頓氏藥物科學(xué)》(Remington′sPharmaceuticalSciences)第18版，Gennaro編，1990年，MackPublishingCo.，Easton，PA，在此引入作為參考)。給藥本發(fā)明重組變異鏈球菌可用于任何齲齒易感宿主，優(yōu)選變異鏈球菌可在其口腔中生長(zhǎng)的宿主，再優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主(如人，犬，馬，貓科動(dòng)物，羊等)，更優(yōu)選的宿主為人。重組變異鏈球菌株可給任何年齡的宿主用藥，如兒童時(shí)期，青春期，或成年時(shí)期。本發(fā)明重組變異鏈球菌株可以多種方式進(jìn)行口腔用藥。例如，重組變異鏈球菌菌株可以懸浮液，可咀嚼藥片，藥丸，膠囊，持續(xù)釋放的制劑(例如含重組變異鏈球菌株的口腔植入物)或親液粉的形式進(jìn)行給藥。重組變異鏈球菌株也可通過(guò)將親液膠(lyophil)，培養(yǎng)物，或細(xì)胞膏直接用于患者牙齒而進(jìn)行給藥。只要治療組合物是用于口腔，任何給藥方式都是可以的。優(yōu)選重組變異鏈球菌可通過(guò)直接將細(xì)菌細(xì)胞懸液用于患者的牙齒而給藥，例如通過(guò)刷牙和牙線。通常，給予患者的重組變異鏈球菌的量是足以取代宿主口腔中致齲齒變異鏈球菌株的量?！白阋匀〈拗骺谇恢兄慢x齒變異鏈球菌株的量”是指足以使重組變異鏈球菌株在口腔中生長(zhǎng)，并消除口腔中產(chǎn)生乳酸并致齲齒的固有變異鏈球菌株(例如通過(guò)細(xì)菌間對(duì)營(yíng)養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)和/或通過(guò)重組變異鏈球菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素)的量。用于本發(fā)明中藥物組合物的術(shù)語(yǔ)“單位劑量”指適用于受體單位劑量的物理法劃分單位，每單位含經(jīng)計(jì)算與所需稀釋劑，即載體或賦形劑，可共同產(chǎn)生預(yù)期療效的預(yù)先確定量的活性物質(zhì)(如活的重組變異鏈球菌)。根據(jù)不同患者的不同情況，如身高，體重，年齡，病情(如產(chǎn)生乳酸并致齲齒的固有變異鏈球菌的粘著性和/或數(shù)目)和對(duì)治療的反應(yīng)(如宿主口腔對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的敏感性)，具體的劑量可有較寬的變動(dòng)范圍。確定適宜的用藥方式與劑量的方法通常由現(xiàn)職牙醫(yī)或其他臨床醫(yī)生根據(jù)實(shí)際情況確定。這樣的確定方式對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是常規(guī)的(參見(jiàn)，例如，《雷明頓氏藥物科學(xué)》(Remington′sPharmaceuticalSciences)第18版，Gennaro編，MackPublishingCompany，Easton，PA，1990)。通常，給予患者的重組變異鏈球菌數(shù)量約為102-1015個(gè)菌體，優(yōu)選約為103-1014個(gè)菌體，更優(yōu)選約為105-1012個(gè)菌體，通常約1011個(gè)菌體。合適的給藥劑量可通過(guò)足以使鏈球菌屬的細(xì)菌在動(dòng)物模型口腔中生長(zhǎng)的量來(lái)推算，例如鼠鏈球菌在鼠口腔中的生長(zhǎng)。合適的劑量也可通過(guò)產(chǎn)細(xì)菌素菌株變異鏈球菌JH1000及其表達(dá)不同水平細(xì)菌素活性的變異株在人口腔中生長(zhǎng)的合適劑量來(lái)估算(Hillman等，1987年，《牙科研究雜志》(J.Dent.Res.)66卷，1092-1094頁(yè)，在此引入作為參考)。可多劑量應(yīng)用重組變異鏈球菌株以達(dá)到在口腔中生長(zhǎng)并取代宿主固有致齲齒變異鏈球菌株的目的。通常，本發(fā)明的重組變異鏈球菌株僅需給予患者一次。若重組變異鏈球菌株為營(yíng)養(yǎng)缺陷型，該菌株的生長(zhǎng)必須通過(guò)給予含合適有機(jī)物的組合物來(lái)維持。例如，若重組變異鏈球菌株為D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，必須給予D-丙氨酸使該菌株在口腔中持續(xù)定居。D-丙氨酸，或其它合適的有機(jī)物，通常一星期至少給藥一次，優(yōu)選一天至少一次，更優(yōu)選一天至少二次，并能作為患者常規(guī)牙齒護(hù)理的一部分給藥，例如，作為牙膏，牙線或漱口水的成份。重組變異鏈球菌株在宿主口腔中成功定居可通過(guò)培養(yǎng)患者口腔中的細(xì)菌來(lái)證實(shí)，重組菌株的鑒定，可通過(guò)例如重組ADH的產(chǎn)生，細(xì)菌素的產(chǎn)生，ELISA，在選擇性pH指示物培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)或其它本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌鑒定方法來(lái)進(jìn)行。下面的實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明而非對(duì)本發(fā)明加以限制。盡管它們?cè)诳赡苡玫降姆椒ㄖ惺堑湫偷模珜?duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)也可采用他們熟知的其它方法。實(shí)施例實(shí)施例1材料與方法菌株，質(zhì)粒，與生長(zhǎng)條件產(chǎn)生變異鏈球菌菌株CH4ts(Chen等，1994年，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)176卷，1542-1545頁(yè))和分離變異鏈球菌菌株NG8(Lee等，1989年，《感染與免疫》(Imfect.Immun.)57卷，33063313頁(yè))的方法在此之前已有描述。用于克隆的大腸桿菌菌株DH5α可容易得到。含克隆的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶(PDC)基因的質(zhì)粒pLO1276(Conway等，1987年，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)169卷，949-954頁(yè))，含克隆的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌醇脫氫酶II(adh)基因的質(zhì)粒pLO1286(Conway等，1987年，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)169卷，2591-2597頁(yè))，含克隆的變異鏈球菌spaP基因的以pCR2為基礎(chǔ)的質(zhì)粒pCR3-8(Crowley等，1995年，《(牙科研究雜志》(J.Dent.Res.)74卷摘要No.1511)、以及含來(lái)自變異鏈球菌的四環(huán)素抗性基因的質(zhì)粒pVA981(Tobian等，1984年，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bactoriol.)160卷，556-563頁(yè))的構(gòu)建在此之前均已有描述。上面引用的每篇參考文獻(xiàn)在此引入作為上述質(zhì)粒的構(gòu)建，以及列舉菌株的產(chǎn)生或分離的相應(yīng)描述的參考。CH4ts的分批和連續(xù)培養(yǎng)物在添加了0.5％胰蛋白胨和1％葡萄糖的Carlsson合成培養(yǎng)基(Carlsson等，1970年，《齲齒研究》(CariesRes.)4卷，297-304頁(yè))中生長(zhǎng)。用于ADH活性試驗(yàn)的細(xì)菌在添加1％葡萄糖的Todd-Hewitt肉湯中生長(zhǎng)。在適宜的情況下還應(yīng)用了氨芐青霉素(50μg/ml)，四環(huán)素(10μg/ml)，和紅霉素(5μg/ml)。培養(yǎng)物試驗(yàn)分批和連續(xù)培養(yǎng)的樣品在指定時(shí)間移出，并確定其pH及550nm處的光吸收。4℃離心移去細(xì)胞，得到的無(wú)細(xì)胞液用酶學(xué)方法檢測(cè)葡萄糖、乙醇、和乳酸(Sigma化學(xué)公司，St.Louis，MO)，并用氣-液色譜法(Hillman等，1987年，《感染與免疫》(Infect，Immun.)55卷，1399-1402頁(yè))分析3-羥基丁酮。用磷酸緩沖鹽水(PBS)離心洗滌細(xì)胞團(tuán)一次，并用化學(xué)法(Friedmam等，1957年，見(jiàn)S.P.Colowick與N.O.Kaplan編《酶學(xué)方法》(MethodsinEnzymology)AcademicPress，Inc.NewYork，第414-418頁(yè))測(cè)定胞內(nèi)丙酮酸濃度。圖中所列數(shù)據(jù)為兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。醇脫氫酶活性試驗(yàn)200ml大腸桿菌和變異鏈球菌株過(guò)夜培養(yǎng)物的菌體于4℃離心收集并用100mMKPO4緩沖液(pH8.5)洗滌兩次。細(xì)胞用重懸于1ml緩沖液并通過(guò)弗氏細(xì)胞壓碎器以15,000psi壓力破碎。4℃離心30分鐘除去菌體碎片。無(wú)菌體抽提液保存在冰上并按Neale等的方法(Neale等，1986年，《歐洲生物化學(xué)雜志》(Eur.J.Biochem.)154卷，119-124頁(yè))進(jìn)行NAD依賴(lài)的乙醇氧化試驗(yàn)。乳酸脫氫酶活性試驗(yàn)LDH活性試驗(yàn)按前述方法(Hillman等，1990年，《感染與免疫》(Infect.Immun.)58卷，1290-1259頁(yè))進(jìn)行。概括地說(shuō)，LDH活性試驗(yàn)為用分光光度計(jì)在340nm處檢測(cè)果糖-1，6-二磷酸(FDP)和丙酸酸依賴(lài)的NAPH的氧化。反應(yīng)混合物包括100μmol磷酸鉀，pH6.2，0.2μmolNADH，10μmol丙酮酸鈉，和1-5μl待測(cè)樣品，終體積為1ml。測(cè)量活性的本底水平1分鐘后，加入20μmolFDP啟動(dòng)反應(yīng)。實(shí)施例2用于在變異鏈球菌中表達(dá)的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌adh結(jié)構(gòu)基因的克隆質(zhì)粒pADH含有與變異鏈球菌spaP基因調(diào)控序列融合的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌adh開(kāi)放閱讀框。pADH可如下構(gòu)建，首先用SacI和DraIII消化質(zhì)粒pCR3-8，然后用綠豆核酸酶處理消化后的DNA以除去絕大部分spaP基因，只保留其啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、和開(kāi)放閱讀框5′端的52個(gè)堿基。線性質(zhì)粒pCR3-8質(zhì)粒的4.2kb片段用瓊脂糖凝膠電泳回收。用正向(5′CTTCTTCAACTTTTTATATTCCTTTCG(SEQIDNO3))和反向(5′CGGAGGCATTGTTTG(SEQIDNO4))合成引物以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)由質(zhì)粒pLO1286中擴(kuò)增除了轉(zhuǎn)錄起始密碼子(ATG)和另外一個(gè)(G)堿基之外的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌adh基因完整的開(kāi)放閱讀框。用瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增片段，并用綠豆核酸酶和多核苷酸激酶處理，最后連入pCR3-8片段與spaP形成可轉(zhuǎn)譯的融合基因。所得質(zhì)粒pADH用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株。DH5α的轉(zhuǎn)化體在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上篩選。用限制性?xún)?nèi)切酶分析確定pADH插入序列的正確大小與方向。在克隆到變異鏈球菌中之前，將含有來(lái)自變異鏈球菌的四環(huán)素抗性基因的質(zhì)粒pVA981的3.5kbHincII片段(Tobian等，1984年，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)160卷，556-563頁(yè))插入pADH的ScaI位點(diǎn)，將pADH轉(zhuǎn)變?yōu)閜ADH-tet。pADH-tet構(gòu)建物用于轉(zhuǎn)化DH5α，在含四環(huán)素的Luria肉湯培養(yǎng)基(LB)上篩選出的轉(zhuǎn)化體用于試驗(yàn)對(duì)氨芐青霉素的敏感性。最后按Perry和Kuramitsu的方法(Perry等，1981年，《感染與免疫》(Infect.Immun.)32卷，1295-1297頁(yè))用pADH-tet轉(zhuǎn)化變異鏈球菌。實(shí)施例3葡萄糖濃度對(duì)分批培養(yǎng)的CH4ts和NG8生長(zhǎng)的影響CH4ts(ldhts)及其親本菌株變異鏈球菌NG8的過(guò)夜分批培養(yǎng)物，在30℃下生長(zhǎng)。CH4ts含一乳酸脫氫酶(LDH)溫度敏感突變。CH4ts的LDH在30℃時(shí)如同野生型，但培養(yǎng)溫度升至42℃時(shí)，熱不穩(wěn)定的LDH將失活。因此該菌株可用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LDH在變異鏈球菌LDH突變體的致死性中的作用。洗滌后的細(xì)胞用含和不含葡萄糖的新鮮配制的培養(yǎng)基1∶1000稀釋?zhuān)⒃?2℃水浴中培養(yǎng)。在圖2(圖A)所示的時(shí)間，通過(guò)將樣品涂布于腦心浸液(BH1)平板并將平板30℃培養(yǎng)以計(jì)數(shù)活菌。結(jié)果表明，葡萄糖缺乏時(shí)(虛線)，CH4ts(空心三角)和NG8(空心圓)的表現(xiàn)相同3小時(shí)后停止生長(zhǎng)，隨后細(xì)胞逐漸死亡(半衰期＝23.5小時(shí))。但是，當(dāng)葡萄糖存在時(shí)(實(shí)線)，與其親本(空心方框)不同，CH4ts(空心圓)在3小時(shí)內(nèi)停止生長(zhǎng)并加速了細(xì)菌的死亡(半衰期＝12.1小時(shí))。這個(gè)差異在時(shí)間上與丙酮酸在突變體菌體內(nèi)高濃度的聚積相關(guān)(圖2B)。實(shí)施例4葡萄糖和溫度對(duì)連續(xù)培養(yǎng)的CH4ts和NG8的生長(zhǎng)及終產(chǎn)物終度的影響CH4ts在恒化反應(yīng)罐中30℃生長(zhǎng)至飽和。在培養(yǎng)溫度升至42℃之前，提供每小時(shí)0.1稀釋率的培養(yǎng)基流入液，維持72小時(shí)。在3小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞密度開(kāi)始以與理論洗出率相同的速率下降，表明細(xì)胞生長(zhǎng)停止(圖3)。這與反應(yīng)罐中觀察到的葡萄糖濃度的升高相關(guān)。當(dāng)連續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用每小時(shí)0.006的稀釋率重復(fù)時(shí)，當(dāng)溫度升至42℃時(shí)，可獲得CH4ts的穩(wěn)定生長(zhǎng)(圖4)。緊跟著溫度的改變，與預(yù)期的洗出率一致，乳酸濃度降低。乳酸產(chǎn)生的終止伴隨著乙醇和3-羥基丁酮產(chǎn)生的開(kāi)始，導(dǎo)致連續(xù)培養(yǎng)物pH的逐漸升高。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，葡萄糖濃度仍檢測(cè)不到。這些數(shù)據(jù)表明在限制葡萄糖條件下，連續(xù)培養(yǎng)的CH4ts于42℃可獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)。在限制葡萄糖條件下，CH4ts的表現(xiàn)如同化學(xué)誘導(dǎo)的鼠鏈球菌LDH缺陷突變株，以提高乙醇和3-羥丁酮的產(chǎn)量來(lái)代替乳酸的產(chǎn)生(Hillman等，1987年，《感染與免疫》(Infect.Immun)55卷，1399-1042頁(yè))。這些結(jié)果與發(fā)酵和酶學(xué)研究的結(jié)果相符，表明變異鏈球菌具有可調(diào)節(jié)的丙酮酸代謝替代途徑。在合適的培養(yǎng)條件下，除乳酸外，野生型變異鏈球菌還產(chǎn)生大量的甲酸、乙酸、乙醇和3-羥基丁酮(Yamada等，1975年，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)124卷，55-61頁(yè)；Hillman等，1987年，《感染與免疫》(InfectImmun.)55卷，1399-1402頁(yè))。但是，這些替代途徑顯然不足以彌補(bǔ)LDH活性的缺乏。實(shí)施例5ADH的產(chǎn)生消除了變異鏈球菌LDH致死性用含有與變異鏈球菌spaP調(diào)控序列融合的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌adh開(kāi)放閱讀框的pADH轉(zhuǎn)化的大腸桿菌株DH5α可表達(dá)克隆的ADH活性(特異活性為6.95μmol/min/mg蛋白)。這個(gè)結(jié)果與以前發(fā)表的結(jié)果一致，即spaP啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)在大腸桿菌中是有活性的(Lee等，1988年，《感染與免疫》(Infect.Immun.)56卷，2114-2119頁(yè))。其ADH活性水平約為用pLO1286轉(zhuǎn)化的DH5α中的ADH活性水平(特異活力為41.8μmol/min/mg蛋白)的17％，pLO1286具有原始克隆的adh基因和來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的調(diào)控序列。來(lái)自pVA981(pADH-tet)的四環(huán)素抗性基因的插入對(duì)pCR2骨架上氨芐青霉素抗性基因的打斷并不影響ADH活性水平。一微克的pADH-tet用于轉(zhuǎn)化CH4ts。坎貝爾型重組將spaP∷adh融合基因引入CH4ts的染色體。插入位點(diǎn)尚未鑒定，但可能在spaP或內(nèi)源性adh基因的同源區(qū)。在42℃，含四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以選擇轉(zhuǎn)化的CH4ts。從長(zhǎng)出的幾百個(gè)克隆中，一稱(chēng)作CH4ts∷adh的純化分離株，與其野生型祖親本NG8(ADH特異活性，＜1.0μmol/min/mg蛋白)相比，具有明顯更高的ADH活性(特異活性，60.43μmol/min/mg蛋白)。在添加2％葡萄糖的Todd-Hewitt肉湯中，CH4ts∷adh與NG8在42℃生長(zhǎng)48小時(shí)。CH4ts∷adh的無(wú)菌體培養(yǎng)液比NG8的無(wú)菌體培養(yǎng)液(pH4.0，乙醇含量＜1mM)具有更高的pH(4.7)和乙醇含量(21.60mM)。用更高(5，10或20％)濃度的葡萄糖可得到相同的結(jié)果。在添加了0.5％胰蛋白胨和1％不同碳源的合成培養(yǎng)基中，對(duì)CH4ts∷adh和NG8在42℃的生長(zhǎng)作了比較(表1)。表1.野生型和補(bǔ)充ADH的LDH缺陷型變異鏈球菌的生長(zhǎng)特性</tables>上述結(jié)果為兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。除乳酸和乙醇外的其它發(fā)酵終產(chǎn)物未測(cè)定。當(dāng)葡萄糖，乳糖或蔗糖作為碳源時(shí)(CH4ts∷adhNG8)的生長(zhǎng)速率與產(chǎn)量相當(dāng)。當(dāng)半乳糖，山梨糖醇，甘露糖醇作為碳源時(shí)，CH4ts∷adh比NG8具有短得多的倍增時(shí)間和更高的產(chǎn)量。生長(zhǎng)在任何碳源中的CH4ts∷adh的培養(yǎng)液中均檢測(cè)不到乳酸，而其乙醇含量比NG8培養(yǎng)液中高得多。這些數(shù)據(jù)表明，在相同的生長(zhǎng)條件下，重組變異鏈球菌株CH4ts∷adh比NG8野生型對(duì)照菌株表現(xiàn)出高得多的ADH活性水平。而且，CH4ts轉(zhuǎn)化體可在非允許溫度條件下生長(zhǎng)，表明克隆的ADH活性消除了LDH缺陷引起的代謝障礙。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，當(dāng)葡萄糖，乳糖或蔗糖作為唯一碳源且生產(chǎn)產(chǎn)量也相當(dāng)時(shí)，CH4ts∷adh與NG8的生長(zhǎng)速率與生長(zhǎng)產(chǎn)量相似。但是，在需氧條件下，NG8在甘露糖醇和山梨糖醇中生長(zhǎng)差，而CH4ts∷adh卻生長(zhǎng)良好。這個(gè)結(jié)果表明克隆的ADH活性提供了足夠量的乙醇作為多元醇代謝中產(chǎn)生的大量電子的吸收庫(kù)。NG8在半乳糖中生長(zhǎng)也較差。還不清楚為什么在這種碳源中CH4ts∷adh比NG8生長(zhǎng)要好，這種碳源通過(guò)變異鏈球菌中塔格糖6-磷酸途徑代謝(Hamilton等，1979年，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)140卷，1102-1104頁(yè))，特別是因?yàn)樗鼈冊(cè)谌樘侵械纳L(zhǎng)情況是相當(dāng)?shù)摹?shí)施例6丙酮酸脫羧酶的產(chǎn)生并不消除變異鏈球菌LDH-致死性與實(shí)施例2-5所述相似的研究用于確定LDH缺陷是否能被丙酮酸脫羧酶的產(chǎn)生所彌補(bǔ)。來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶(pdc)基因(Conway等，1987年，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)169卷，949-954頁(yè))與spaP融合，并通過(guò)如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌adh基因所述的自殺載體導(dǎo)入CH4ts中。四環(huán)素抗性、表達(dá)PDC的轉(zhuǎn)化體分離后在上述的非允許溫度42℃下進(jìn)行生長(zhǎng)試驗(yàn)。表達(dá)克隆的PDC活性的LDH-變異鏈球菌在非允許溫度下不能生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明變異鏈球菌中LDH-缺陷的致死性不能被PDC的產(chǎn)生消除。而且，這些數(shù)據(jù)還表明ADH濃度在LDH缺陷型變異鏈球菌的丙酮酸代謝中并未飽和。實(shí)施例7JH1000和產(chǎn)生更高水平細(xì)菌素活性的JH1000變異株的分離變異鏈球菌株JH1000的分離已有描述(Hillman等，1984年，《感染與免疫》(Infect.Immun.)44卷，141-144頁(yè))。概括地說(shuō)，JH1000從在含桿菌肽的輕唾液瓊脂上的115種被測(cè)物中獲得的變異鏈球菌新分離株中得到鑒定。在延遲拮抗試驗(yàn)中JH1000抑制所有其它變異鏈球菌株和多種實(shí)驗(yàn)室菌株的生長(zhǎng)。有證據(jù)表明(Hillman等，1984年，《感染與免疫》(Infect.Immun.)44卷，141-144頁(yè))JH1000產(chǎn)生一種小的(小于1000Da)，穩(wěn)定的抗生素樣，細(xì)菌素樣化合物，該化合物現(xiàn)已鑒定。該化合物被稱(chēng)作變異鏈球菌細(xì)菌素。微生物學(xué)和血清學(xué)試驗(yàn)證明JH1000是變異鏈球菌菌種中的一個(gè)代表。細(xì)菌素敏感性變異菌株，無(wú)論是天然產(chǎn)生的，還是化學(xué)誘變的，對(duì)細(xì)菌素的殺傷性有抗性的菌株還未被鑒定。這個(gè)結(jié)果表明，與大多數(shù)抗生素不同，遭受抗性野生型(致病)菌株超感染的風(fēng)險(xiǎn)極小。按本領(lǐng)域熟知的方法(Hillman，1978年，《感染與免疫》(InfectImmun.)21卷，206-212頁(yè))，用甲基磺酰乙酯(EMS)對(duì)JH1000菌株進(jìn)行化學(xué)誘變。JH1005為EMS誘導(dǎo)的JH1000變異株的一個(gè)例子。通過(guò)將待測(cè)菌株在肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)8小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，可鑒定出產(chǎn)生高水平細(xì)菌素的變異株。離心培養(yǎng)物除去菌體，取20μl培養(yǎng)上清在微滴定板的孔中系列稀釋?zhuān)瑢⒑邪芯?通常為鼠鏈球菌BHT-2，StrR)和lmg/ml鏈霉素的100μl頂層瓊脂加到每個(gè)孔中。孵育過(guò)夜后，測(cè)定阻止指示菌株生長(zhǎng)的最低稀釋度。用這種覆蓋物方法，JH1000的EMS誘變(JH1005)和自發(fā)(JH1140)變異株被發(fā)現(xiàn)，它們可產(chǎn)生提高了約3倍的細(xì)菌素樣活性水平。JH1000以及JH1000變異株，能產(chǎn)生乳酸，因而不適宜于替補(bǔ)療法以預(yù)防和/或治療齲齒。實(shí)施例8人口腔中變異鏈球菌JH1000變異株的生長(zhǎng)細(xì)菌素活性提高的JH1000變異株在嚙齒類(lèi)動(dòng)物和人口腔中的生長(zhǎng)已有描述(Hillman等，1987年，《牙科研究雜志》(J.Dent.Res.)66卷，1092-1094頁(yè))。概括地說(shuō)，用含有標(biāo)準(zhǔn)牙齒預(yù)防的感染法將JH1000或JH1000變異株用于人志愿者牙齒，隨后用含約1011JH1000或JH1000變異株的細(xì)菌懸液刷牙或用牙線洗牙。細(xì)菌素活性水平與細(xì)菌在口腔中的生長(zhǎng)能力緊密相關(guān)。用JH1005菌株感染一年以后，口腔中固有的變異鏈球菌逐漸被JH1005所代替。另外，在三個(gè)被試者中，有兩個(gè)變異鏈球菌總數(shù)明顯降低。實(shí)施例9用轉(zhuǎn)座子誘變變異鏈球菌株產(chǎn)生變異鏈球菌的重組突變株質(zhì)粒pTV1-OK是在變異鏈球菌和大腸桿菌中能條件復(fù)制的乳酸乳球菌質(zhì)粒pWV01的repA(ts)衍生物(Leenhouts等，1991年，《質(zhì)粒》(Plasmid)，26卷，55-66頁(yè))。它在質(zhì)粒骨架上帶有在大腸桿菌和變異鏈球菌中均能表達(dá)的卡那霉素抗性基因，并含有一為變異鏈球菌提供紅霉素抗性的轉(zhuǎn)座子Tn917。將pTV1-OK質(zhì)粒轉(zhuǎn)入變異鏈球菌JH1005菌株，在含卡那霉素的BHI瓊脂中于28℃篩選轉(zhuǎn)化細(xì)菌。用1mgpTV1-OKDNA轉(zhuǎn)化JH1005，可產(chǎn)生四種卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體，與早期實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化頻率一致(Hillman等，1994年，《感染與免疫》(Infect.Immun.)62卷，60-64頁(yè))。如Camilli等所述(1990年，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)172卷，3738-3744頁(yè))，通過(guò)升溫(45℃)產(chǎn)生宿主染色體DNA中Tn917插入的獨(dú)立庫(kù)。概括地說(shuō)，在允許溫度(28℃)并存在卡那霉素條件下生長(zhǎng)的飽和培養(yǎng)物以1/50或1/100傳代培養(yǎng)。溫度升至45℃并過(guò)夜培養(yǎng)后，在含選擇濃度紅霉素的BHI瓊脂上涂布樣品以分離在宿主染色體上插入有Tn917的插入體。發(fā)現(xiàn)在總共109個(gè)克隆形成單位中有105保留了對(duì)這種抗生素的抗性。百分之九十隨機(jī)挑選的紅霉素抗性克隆通過(guò)復(fù)制斑顯示出對(duì)卡那霉素敏感。這個(gè)發(fā)現(xiàn)說(shuō)明90％的紅霉素抗性克隆是pTV1-OK的丟失與Tn917轉(zhuǎn)座入JH1005染色體的共同結(jié)果。用Southern雜交分析隨機(jī)選出的紅霉素抗性突變株，結(jié)果表明Tn917轉(zhuǎn)座是隨機(jī)的并導(dǎo)致單一染色體插入。Southern雜交分析也表明10％的紅霉素抗性/卡那霉素抗性克隆是在JH1005染色體上帶有完整的pTV1-OK質(zhì)粒的復(fù)制子融合的結(jié)果?？敲顾孛舾锌寺〉莫?dú)立庫(kù)用于檢測(cè)細(xì)菌素產(chǎn)生，對(duì)1％甘氨酸的敏感性，酸敏感性，以及依賴(lài)甘露糖醇厭氧生長(zhǎng)的不可能性或在D-丙氨酸供應(yīng)缺乏時(shí)生長(zhǎng)的不可能性。每類(lèi)突變體的分離頻率范圍約1-2×10-3。對(duì)兩種細(xì)菌素缺乏突變株的Southern雜交分析表明至少存在兩個(gè)不連鎖的與細(xì)菌素產(chǎn)生有關(guān)的基因和至少三個(gè)與酸敏感有關(guān)的不連鎖的基因座。通過(guò)自然轉(zhuǎn)化，將從JH1005分離得到的Tn917誘導(dǎo)的酸敏感等位基因轉(zhuǎn)入NG8后，轉(zhuǎn)座子(編碼紅霉素抗性)與突變體表型以高頻率共遺傳。這種連鎖表明Tn917引起的損傷與突變體表型有關(guān)。在天然可轉(zhuǎn)化的菌株NG8中，在溫度升高后以相似的轉(zhuǎn)座頻率和質(zhì)粒丟失率也可獲得Tn917突變體庫(kù)。應(yīng)用標(biāo)記獲救技術(shù)已在大腸桿菌中克隆了一個(gè)與細(xì)菌素產(chǎn)生有關(guān)的基因。突變體的染色體DNA用EcoRI完全消化(EcoRI不能在Tn917內(nèi)酶切)并連入pUC19多克隆序列的EcoRI位點(diǎn)中。將文庫(kù)轉(zhuǎn)化MC1061并篩選氨芐青霉素抗性，將能生長(zhǎng)的克隆影印至含紅霉素的培養(yǎng)基中。兩個(gè)能生長(zhǎng)的克隆含有在點(diǎn)雜交分析中與Tn917探針?lè)磻?yīng)的質(zhì)粒DNA。近來(lái)，應(yīng)用Tn917的紅霉素近端和紅霉素遠(yuǎn)端以外的引物對(duì)這些質(zhì)粒進(jìn)行了測(cè)序。這是一個(gè)利用Tn917在變異鏈球菌和口腔鏈球菌中成功的誘變。以前應(yīng)用如pTV1或pLTV3構(gòu)建物的失敗(Youngman，1987年，見(jiàn)Hardy編，《質(zhì)粒一項(xiàng)實(shí)用方法》(PlasmidsApracticalapproack)，IRLPress，Oxford79-103頁(yè)；Camilli等，1990年，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)172卷，3738-3744頁(yè))是因?yàn)橘|(zhì)粒骨架不能在變異鏈球菌中復(fù)制。利用乳球菌復(fù)制子pWV01Ts的復(fù)制功能，發(fā)現(xiàn)pTV1-OK在變異鏈球菌允許溫度下能穩(wěn)定維持，從而為非允許溫度下Tn917轉(zhuǎn)座的發(fā)生提供了足夠的機(jī)會(huì)。因此，上述方法可用于生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異鏈球菌株，以及具有期望表型的其它變異鏈球菌衍生菌株，以用于本發(fā)明。實(shí)施例10LDH-，ADH+，產(chǎn)生細(xì)菌素的變異鏈球菌株的構(gòu)建JH1000的ldh基因已被克隆和測(cè)序(Hillman等，1990年，《感染與免疫》(Infect.Immun.)58卷，1290-1295頁(yè)；Duncan等，1991年，《感染與免疫》(Infect.Immun.)59卷，3930-3934頁(yè))。概括地說(shuō)，用pBR322作為載體，將JH1000ldh基因克隆到大腸桿菌MC1061菌株中。一個(gè)含ldh基因的克隆，p10-5，通過(guò)與寡核苷酸探針的雜交得到鑒定，該探針根據(jù)從JH1000中純化的LDH蛋白的氨基末端序列推導(dǎo)得出(Hillman等，1990年，《感染與免疫)》(Infect.Immun.)58卷，1290-1295頁(yè))。這個(gè)結(jié)果通過(guò)p10-5/MC1061轉(zhuǎn)化體無(wú)菌體粗提液中的JH1000LDH活性得到證實(shí)。克隆的ldh的核苷酸序列業(yè)已確定，其調(diào)控信號(hào)及開(kāi)放閱讀框也已推斷出。JH1000ldh基因的序列可與從GenBank中獲得，登錄號(hào)M72545(描述LDHSM)。克隆的ldh基因可用限制性?xún)?nèi)切酶Hpal消化p10-5構(gòu)建物而滅活。這導(dǎo)致從ldh開(kāi)放閱讀框中除去了510個(gè)堿基，從而永久地滅活了該基因。用瓊脂糖凝膠電泳回收消化物中合適大小的DNA片段，用綠豆核酸酶處理以產(chǎn)生平頭末端，與牛小腸磷酸酶反應(yīng)去磷酸。用PCR擴(kuò)增運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌adh基因完整的開(kāi)放閱讀框(除了以鳥(niǎo)苷酸殘基取代的頭三個(gè)堿基和在開(kāi)放閱讀框末端加上的一個(gè)可翻譯和轉(zhuǎn)錄的密碼子)。凝膠純化后，這個(gè)片段用綠豆核酸酶處理產(chǎn)生平頭末端，與多核苷酸激酶反應(yīng)磷酸化。這個(gè)產(chǎn)物與上述的p10-5產(chǎn)物連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，用氨芐青霉素抗性篩選。純化克隆的透化細(xì)胞隨后按上述方法檢測(cè)ADH活性。純化ADH陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒并用限制性圖譜檢測(cè)以證實(shí)其遺傳結(jié)構(gòu)。通過(guò)去除pBR322骨架上的氨芐青霉素抗性基因，并用來(lái)自pVA981的四環(huán)素抗性基因取代，以進(jìn)一步修飾一個(gè)這樣的遺傳結(jié)構(gòu)。用這一質(zhì)粒結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化JH1140，轉(zhuǎn)化體在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中篩選。純化長(zhǎng)出的異源二倍體轉(zhuǎn)化體，在Todd-Hewitt肉湯中生長(zhǎng)過(guò)夜，以合適的稀釋度涂布于葡萄糖四氮唑培養(yǎng)基上。在燭罐中孵育3天后，長(zhǎng)出的紅色克隆，表明了LDH的缺失(或表明酸產(chǎn)量降低)，分離純化紅色克隆，作為假定的LDH缺陷突變體。通過(guò)測(cè)定2天的陳舊肉湯培養(yǎng)物的乳酸和乙醇產(chǎn)量，并通過(guò)Southern雜交分析以及通過(guò)上述的分光光度法測(cè)定無(wú)菌體抽提物的LDH活性來(lái)證實(shí)該轉(zhuǎn)化體的表型與基因型。這些菌株的乳酸產(chǎn)量應(yīng)該檢測(cè)不到，而在含1％或更多葡萄糖的肉湯中，培養(yǎng)基中的乙醇含量應(yīng)約為25mM。這些轉(zhuǎn)化體中的LDH活性應(yīng)當(dāng)檢測(cè)不到。通過(guò)在有氧和無(wú)氧環(huán)境下，檢測(cè)親本與轉(zhuǎn)化體在不同碳源中的生長(zhǎng)情況進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)化體菌株的特性。在增代時(shí)間和細(xì)胞產(chǎn)量方面，轉(zhuǎn)化體應(yīng)與親本菌株生長(zhǎng)得一樣好或者更好。為了精確評(píng)估不同生長(zhǎng)條件下的發(fā)酵終產(chǎn)物，親本和轉(zhuǎn)化體菌株也在恒化培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。在所有培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)化體菌株產(chǎn)生的乳酸應(yīng)檢測(cè)不到，僅在需氧培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生大量3-羥基丁酮。用常規(guī)和/或無(wú)菌大鼠，在齲齒大鼠模型中檢測(cè)了轉(zhuǎn)化體的致齲齒能力。轉(zhuǎn)化體應(yīng)不產(chǎn)生齲齒，而親本菌株應(yīng)使齲齒的發(fā)病率增高并使齲齒更嚴(yán)重。轉(zhuǎn)化體和親本菌株的蝕斑產(chǎn)量和細(xì)菌素產(chǎn)量也進(jìn)行了測(cè)定。因?yàn)檗D(zhuǎn)化體菌株至少在最小程度上滿(mǎn)足了上述要求(即乳酸產(chǎn)生缺陷，并不致齲齒)，該轉(zhuǎn)化體是適用于預(yù)防和治療齲齒的重組變異鏈球菌株。下面的菌株在1995年6月7日或之前，已保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，1301ParklawnDrive，Rockville，MD，USA(ATCC)保藏物ATCC登錄號(hào)JH1000登錄號(hào)55677JH1140登錄號(hào)55676該保藏根據(jù)《國(guó)際承認(rèn)用于專(zhuān)利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約》的條款和細(xì)則進(jìn)行。這確保活培養(yǎng)物自保藏之日起維持30年。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，該細(xì)菌可由ATCC取得，并且申請(qǐng)人保證以下條件一經(jīng)滿(mǎn)足，即可向公眾永久和無(wú)限制地提供該培養(yǎng)物的后代，所述條件為相關(guān)的美國(guó)專(zhuān)利獲得授權(quán)或任何相關(guān)的美國(guó)或外國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)向公眾公開(kāi)，申請(qǐng)人并且保證可向美國(guó)專(zhuān)利與商標(biāo)局長(zhǎng)根據(jù)35U.S.C§122和局長(zhǎng)條令(包括37CFR§1.14，細(xì)節(jié)參考886OG638)指定的人提供該培養(yǎng)物的后代。本申請(qǐng)的受讓人已同意如果保存的培養(yǎng)物在適宜條件下培養(yǎng)而死亡或丟失或破壞，接到通知后將盡快用同種培養(yǎng)物的活標(biāo)本替換該培養(yǎng)物?？色@得本保存菌株不能被理解為允許在與任何政府的主管部門(mén)依其專(zhuān)利法授予的權(quán)力相抵觸的情況下使用本發(fā)明。序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)者UniversityofFloridaResearchFoundation，Inc.(ii)發(fā)明題目齲齒的替補(bǔ)療法(iii)序列數(shù)4(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Fish&amp;Richardson(B)街道4225ExecutiveSquare，Suite1400(C)城市LaJolla(D)州California(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編92037(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，版本#1.25(vi)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日1996年6月7日(C)分類(lèi)(Viii)律師/代理人資料(A)姓名Wetherell，JohnR.(B)注冊(cè)號(hào)31，678(C)參考/文獻(xiàn)號(hào)07397/002WO1(ix)電訊資料(A)電話(619)678-5070(B)電傳(619)678-5099(2)SEQIDNO1資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1747堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞CDS(B)位置432..1747(xi)序列表述SEQIDNO1AAAGGCAAAATCGGTAACCACATCTCAATTATTAAACAATACTTCATAATAAAAAGACAA60CTTTTTCATAATTTGCATAAGTCTTGATGTAAAAAATACATATTTAGAAAGAACAAGCAG120CCTTGCTCATCACCGCTGTCGCGAGTAGAAAAATCTCGGCTTTCAGAAAAAGAGGCCGCT180TCGTTAAACAGACTATAAATGTGCTGGAATAAAGCGAACCCCTTGATCTGATAAAACTGA240TAGACATATTGCTTTTGCGCTGCCCGATTGCTGAAAATGCGTAAAAGGTGATTTTACTCG300TTTTCAGGAAAAACTTTGAGAAAACGTCTCGAAAACGGGATTAAAACGCAAAACAATAG360AAAGCGATTTCGCGAAAATGGTTGTTTTCGGGTTGTTGCTTTAAACTAGTATGTAGGGTG420AGGTTATAGCTATGGCTTCTTCAACTTTTTATATTCCTTTCGTCAACGAA470MetAlaSerSerThrPheTyrIleProPheValAsnGlu1510ATGGGCGAAGGTTCGCTTGAAAAAGCAATCAAGGATCTTAACGGCAGC518MetGlyGluGlySerLeuGluLysAlaIleLysAspLeuAsnGlySer152025GGCTTTAAAAATGCGCTGATCGTTTCTGATGCTTTCATGAACAAATCC566GlyPheLysAsnAlaLeuIleValSerAspAlaPheMetAsnLysSer30354045GGTGTTGTGAAGCAGGTTGCTGACCTGTTGAAAGCACAGGGTATTAAT614GlyValValLysGlnValAlaAspLeuLeuLysAlaGlnGlyIleAsn505560TCTGCTGTTTATGATGGCGTTATGCCGAACCCGACTGTTACCGCAGTT662SerAlaValTyrAspGlyValMetProAsnProThrValThrAlaVal657075CTGGAAGGCCTTAAGATCCTGAAGGATAACAATTCAGACTTCGTCATC710LeuGluGlyLeuLysIleLeuLysAspAsnAsnSerAspPheValIle808590TCCCTCGGTGGTGGTTCTCCCCATGACTGCGCCAAAGCCATCGCTCTG758SerLeuGlyGlyGlySerProHisAspCysAlaLysAlaIleAlaLeu95100105GTCGCAACCAATGGTGGTGAAGTCAAAGACTACGAAGGTATCGACAAA806ValAlaThrAsnGlyGlyGluValLysAspTyrGluGlyIleAspLys110115120125TCTAAGAAACCTGCCCTGCCTTTGATGTCAATCAACACGACGGCTGGT854SerLysLysProAlaLeuProLeuMetSerIleAsnThrThrAlaGly130135140ACGGCTTCTGAAATGACGCGTTTCTGCATCATCACTGATGAAGTCCGT902ThrAlaSerGluMetThrArgPheCysIleIleThrAspGluValArg145150155CACGTTAAGATGGCCATTGTTGACCGTCACGTTACCCCGATGGTTTCC950HisValLysMetAlaIleValAspArgHisValThrProMetValSer160165170GTCAACGATCCTCTGTTGATGGTTGGTATGCCAAAAGGCCTGACCGCC998ValAsnAspProLeuLeuMetValGlyMetProLysGlyLeuThrAla175180185GCCACCGGTATGGATGCTCTGACCCACGCATTTGAAGCTTATTCTTCA1046AlaThrGlyMetAspAlaLeuThrHisAlaPheGluAlaTyrSerSer190195200205ACGGCAGCTACTCCGATCACCGATGCTTGCGCCTTGAAGGCTGCGTCC1094ThrAlaAlaThrProIleThrAspAlaCysAlaLeuLysAlaAlaSer210215220ATGATCGCTAAGAATCTGAAGACCGCTTGCGACAACGGTAAGGATATG1142MetIleAlaLysAsnLeuLysThrAlaCysAspAsnGlyLysAspMet225230235CCAGCTCGTGAAGCTATGGCTTATGCCCAATTCCTCGCTGGTATGGCC1190ProAlaArgGluAlaMetAlaTyrAlaGlnPheLeuAlaGlyMetAla240245250TTCAACAACGCTTCGCTTGGTTATGTCCATGCTATGGCTCACCAGTTG1238PheAsnAsnAlaSerLeuGlyTyrValHisAlaMetAlaHisGlnLeu255260265GGCGGCTACTACAACCTGCCGCATGGTGTCTGCAACGCTGTTCTGCTT1286GlyGlyTyrTyrAsnLeuProHisGlyValCysAsnAlaValLeuLeu270275280285CCGCATGTTCTGGCTTATAACGCCTCTGTCGTTGCTGGTCGTCTGAAA1334ProHisValLeuAlaTyrAsnAlaSerValValAlaGlyArgLeuLys290295300GACGTTGGTGTTGCTATGGGTCTCGATATCGCCAATCTCGGTGATAAA1382AspValGlyValAlaMetGlyLeuAspIleAlaAsnLeuGlyAspLys305310315GAAGGCGCAGAAGCCACCATTCAGGCTGTTCGCGATCTGGCTGCTTCC1430GluGlyAlaGluAlaThrIleGlnAlaValArgAspLeuAlaAlaSer320325330ATTGGTATTCCAGCAAATCTGACCGAGCTGGGTGCTAAGAAAGAAGAT1478IleGlyIleProAlaAsnLeuThrGluLeuGlyAlaLysLysGluAsp335340345GTGCCGCTTCTTGCTGACCACGCTCTGAAAGATGCTTGTGCTCTGACC1526ValProLeuLeuAlaAspHisAlaLeuLysAspAlaCysAlaLeuThr350355360365AACCCGCGTCAGGGTGATCAGAAAGAAGTTGAAGAACTCTTCCTGAGC1574AsnProArqGlnGlyAspGlnLysGluValGluGluLeuPheLeuSer370375380GCTTTCTAATTTCAAAACAGGAAAACGGTTTTCCGTCCTGTCTTGATT1622AlaPheTTCAAGCAAACAATGCCTCCGATTTCTAATCGGAGGCATTTGTTTTTG1670TTTATTGCAAAAACAAAAAATATTGTTACAAATTTTTACAGGCTATTA1718AGCCTACCGTCATAAATAATTTGCCATTT1747(2)SEQIDNO2資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度438氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列表述SEQIDNO2MetAlaSerSerThrPheTyrIleProPheValAsnGluMetGlyGlu151015GiySerLeuGluLysAlaIleLysAspLeuAsnGlySerGlyPheLys202530AsnAlaLeuIleValSerAspAlaPheMetAsnLysSerGlyValVal354045LysGlnValAlaAspLeuLeuLysAlaGlnGlyIleAsnSerAlaVal505560TyrAspGlyValMetProAsnProThrValThrAlaValLeuGluGly65707580LeuLysIleLeuLysAspAsnAsnSerAspPheValIleSerLeuGly859095GlyGlySerProHisAspCysAlaLysAlaIleAlaLeuValAlaThr100105110AsnGlyGlyGluValLysAspTyrGluGlyIleAspLysSerLysLys115120125ProAlaLeuProLeuMetSerIleAsnThrThrAlaGlyThrAlaSer130135140GluMetThrArgPheCysIleIleThrAspGluValArgHisValLys145150155160MetAlaIleValAspArgHisValThrProMetValSerValAsnAsp165170175ProLeuLeuMetValGlyMetProLysGlyLeuThrAlaAlaThrGly180185190MetAspAlaLeuThrHisAlaPheGluAlaTyrSerSerThrAlaAla195200205ThrProIleThrAspAlaCysAlaLeuLysAlaAlaSerMetIleAla210215220LysAsnLeuLysThrAlaCysAspAsnGlyLysAspMetProAlaArg225230235240GluAlaMetAlaTyrAlaGlnPheLeuAlaGlyMetAlaPheAsnAsn245250255AlaSerLeuGlyTyrValHisAlaMetAlaHisGlnLeuGlyGlyTyr260265270TyrAsnLeuProHisGlyValCysAsnAlaValLeuLeuProHisVal275280285LeuAlaTyrAsnAlaSerValValAlaGlyArgLeuLysAspValGly290295300ValAlaMetGlyLeuAspIleAlaAsnLeuGlyAspLysGluGlyAla305310315320GluAlaThrIleGlnAlaValArgAspLeuAlaAlaSerIleGlyIle325330335ProAlaAsnLeuThrGluLeuGlyAlaLysLysGluAspValProLeu340345350LeuAlaAspHisAlaLeuLysAspAlaCysAlaLeuThrAsnProArg355360365GlnGlyAspGlnLysGluValGluGluLeuPheLeuSerAlaPhe(2)SEQIDNO3資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列表述SEQIDNO3CTTCTTCAACTTTTTATATTCCTTTCG27(2)SEQIDNO4資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列表述SEQIDNO4CGGAGGCATTGTTTG15本發(fā)明前面的描述是為了舉例說(shuō)明和解釋。它應(yīng)被理解為在不背離本發(fā)明的精神與范圍的條件下可進(jìn)行許多修改。因此，下面的權(quán)利要求應(yīng)被視為包括所有這樣的修改。權(quán)利要求1.一種重組變異鏈球菌株，其特征在于a)乳酸產(chǎn)生缺陷和b)產(chǎn)生重組醇脫氫酶。2.權(quán)利要求1的菌株，其中乳酸產(chǎn)生缺陷是因?yàn)槿樗崦摎涿富虻娜毕荨?.權(quán)利要求1的菌株，其中重組醇脫氫酶基因是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的醇脫氫酶基因。4.權(quán)利要求3的菌株，其中運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌醇脫氫酶基因編碼醇脫氫酶II。5.權(quán)利要求1的菌株，其中重組醇脫氫酶基因?yàn)槭箧溓蚓济摎涿富颉?.權(quán)利要求1的菌株，其中該菌株進(jìn)一步的特征為產(chǎn)生細(xì)菌素。7.權(quán)利要求6的菌株，其中細(xì)菌素分子量低于1000道爾頓，并對(duì)細(xì)菌素敏感性變異鏈球菌株具有抗菌活性。8.權(quán)利要求1的菌株，其中該菌株為D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。9.權(quán)利要求8的菌株，其中該菌株在丙氨酸消旋酶基因上有缺陷。10.權(quán)利要求1的菌株，其中該菌株由JH1000或其變異株衍生而來(lái)。11.一種重組變異鏈球菌株，其特征在于1)乳酸產(chǎn)生缺陷；2)產(chǎn)生重組醇脫氫酶；和3)產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌素敏感性變異鏈球菌株有抗菌活性的細(xì)菌素。12.權(quán)利要求11的菌株，其中該菌株為變異鏈球菌株JH1000或其變異株。13.權(quán)利要求12的菌株，其中該菌株為相對(duì)于變異鏈球菌株JH1000可產(chǎn)生升高水平的細(xì)菌素的變異鏈球菌JH1000的變異株。14.權(quán)利要求13的菌株，其中該變異鏈球菌JH1000變異株為變異鏈球菌JH1140或其變異株。15.權(quán)利要求11的菌株，其中該菌株為D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。16.權(quán)利要求15的菌株，其中該菌株在丙氨酸消旋酶上有缺陷。17.ATCC登錄號(hào)為55677的變異鏈球菌株JH1000。18.ATCC登錄號(hào)為55676的變異鏈球菌株JH1140。19.一種產(chǎn)生重組變異鏈球菌株的方法，該菌株的特征在于乳酸產(chǎn)生缺陷和產(chǎn)生重組的醇脫氫酶，該方法包括以下步驟用編碼醇脫氫酶的基因轉(zhuǎn)化變異鏈球菌株，以及在乳酸合成途徑中引入突變。20.權(quán)利要求19的方法，其中乳酸合成途徑中的突變?yōu)槿樗崦摎涿富蛏系娜毕荨?1.權(quán)利要求19的方法，其中醇脫氫酶為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的醇脫氫酶。22.權(quán)利要求19的方法，其中變異鏈球菌株產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌素敏感性變異鏈球菌株有抗菌活性的細(xì)菌素。23.權(quán)利要求22的方法，其中該變異鏈球菌株為JH1000或其變異株。24.權(quán)利要求23的方法，其中變異鏈球菌株JH1000變異株為變異鏈球菌株JH1140。25.權(quán)利要求19的方法，其中該菌株為D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。26.權(quán)利要求25的方法，其中該菌株在丙氨酸消旋酶上含有缺陷。27.一種降低齲齒易感宿主的齲齒發(fā)病率和嚴(yán)重性的方法，包括經(jīng)口腔給予齲齒易感宿主能有效替換宿主口腔中致齲齒變異鏈球菌株量的重組變異鏈球菌株，該菌株具有1)重組醇脫氫酶基因和2)乳酸產(chǎn)生缺陷。28.權(quán)利要求27的方法，其中重組變異鏈球菌株產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌素敏感性變異鏈球菌株有抗菌活性的細(xì)菌素。29.權(quán)利要求27的方法，其中乳酸產(chǎn)生缺陷是因?yàn)槿樗崦摎涿富蛏嫌腥毕荨?0.權(quán)利要求27的方法，其中重組醇脫氫酶基因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌醇脫氫酶基因。31.權(quán)利要求30的方法，其中運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌醇脫氫酶基因編碼醇脫氫酶II。32.權(quán)利要求27的方法，其中重組變異鏈球菌株為D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。33.權(quán)利要求32的方法，其中重組變異鏈球菌株在丙氨酸消旋酶基因上有缺陷。34.權(quán)利要求27的方法，其中重組變異鏈球菌株包含在漱口水、牙膏、咀嚼膠、牙線、可咀嚼藥片、親液膠或培養(yǎng)基中。35.權(quán)利要求32的方法，其中該方法還包括向宿主口腔給予能有效維持該重組變異鏈球菌菌株在宿主口腔中生長(zhǎng)的量的D-丙氨酸。36.權(quán)利要求35的方法，其中D-丙氨酸包含在漱口水、牙膏、牙線、咀嚼膠或可咀嚼藥片中。37.一種用于降低齲齒發(fā)病率及嚴(yán)重性的藥物組合物，包括重組變異鏈球菌株，該菌株具有1)重組醇脫氫酶基因和2)乳酸產(chǎn)生缺陷，和藥用載體。38.權(quán)利要求37的組合物，其中該重組變異鏈球菌產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌素敏感性變異鏈球菌株有抗菌活性的細(xì)菌素。39.權(quán)利要求37的組合物，其中乳酸產(chǎn)生缺陷是因?yàn)槿樗崦摎涿富蛏嫌腥毕荨?0.權(quán)利要求37的組合物，其中重組醇脫氫酶基因是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的醇脫氫酶基因。41.權(quán)利要求37的組合物，其中該重組變異鏈球菌株為D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。42.權(quán)利要求41的組合物，其中該重組變異鏈球菌菌株在丙氨酸消旋酶基因上有缺陷。43.權(quán)利要求41的組合物，其中該組合物中還含有D-丙氨酸。44.權(quán)利要求37的組合物，其中該組合物中還含有調(diào)味劑。45.權(quán)利要求37的組合物，其配制成漱口水、牙膏、咀嚼膠、牙線、可咀嚼藥片、親液膠或培養(yǎng)基。46.一種用以維持宿主口腔中D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌生長(zhǎng)的含有可維持D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌生長(zhǎng)量的丙氨酸的組合物。47.權(quán)利要求46的組合物，其中該D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌為D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異鏈球菌。48.權(quán)利要求46的組合物，其中維持D-丙氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌生長(zhǎng)的量約為0.01-167mg/ml。49.權(quán)利要求46的組合物，其中該組合物還含有調(diào)味劑。50.權(quán)利要求46的組合物，其配制成漱口水、牙膏、咀嚼膠、牙線或可咀嚼藥片。全文摘要本發(fā)明描述了以乳酸產(chǎn)生缺陷和重組醇脫氫酶(ADH)產(chǎn)生為特點(diǎn)的重組變異鏈球菌。這些重組變異鏈球菌適用于預(yù)防、治療齲齒的方法。文檔編號(hào)A61K8/99GK1192234SQ96195927公開(kāi)日1998年9月2日申請(qǐng)日期1996年6月7日優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日發(fā)明者J·D·希爾曼申請(qǐng)人:佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金會(huì)有限公司