專利名稱：重組球蟲病疫苗的制作方法
球蟲病是一種由細胞內的艾美球蟲屬(Eimeria)原生動物寄生蟲引起的家禽疾病。這種疾病是大型密集家禽繁殖場中的一種地方性疾病。據估計，光是在美國，每年用化療法防治這種疾病的費用就超過1億美元。由于對抗球蟲藥物產生抗性，因而要不斷開發(fā)新的藥劑，但現在藥物的開發(fā)所需的費用越來越高，消費者對食用家畜體內殘留藥物的接受程度也越來越低。
現已有很多文獻描述了對天然球蟲病感染的保護性免疫?，F已證明，在受控條件下每天服用少量活的卵囊，幾星期后便可對通常毒性劑量的侵染產生完全的免疫(Rose et al，Parasitology 7325，1976；Rose et al，Parasitology 88199，1984)。對感染具有獲得性抗性表明有可能建立一種疫苗而在雛雞體內誘導免疫，從而無需采用化學抑球蟲劑。事實上，這樣一種想法已經用Coccivac制劑(SterwinLaboratories，Opelika，Alabama，U.S.A)進行了驗證。
為了生產球蟲病疫苗，Murray等人(歐洲專利申請公告167.443)從禽艾美球蟲的子孢子或形成孢子的卵囊中制備了各種提取液，這些提取液中至少含有15種多肽，其中許多多肽都連結在子孢子表面。將這些提取液注射到小雞體內，則在用形成孢子的毒性禽艾美球蟲卵囊口服接種后盲腸損傷減輕。最近，Schenkel等人(美國專利4,650,676)公開了抗禽艾美球蟲裂殖子的單克隆抗體的制備方法。利用這些抗體，Schenkel等人鑒定出了這些抗體所針對的多種抗原。Schenkel等人將禽艾美球蟲子孢子與這些抗體一起預保溫，然后把這些經過處理的子孢子引入小雞的盲腸，證明盲腸損傷程度與未經處理的子孢子對照相比有所減輕。
重組DNA技術的進展提供了另一種可能的途徑，即亞單位疫苗。在應用現有的重組DNA方法時，是將特異的DNA順序插入一個適當的DNA載體中。形成能在宿主細胞內復制的重組DNA分子。常常用稱為質粒的環(huán)狀雙鏈DNA分子作載體。制備這種形式的重組DNA，必須使用能夠在特異的堿基順序位點切割DNA的限制性核酸內切酶。用限制酶在質粒和所要插入的外源DNA片段中進行切割后，就可以用一種稱為連接酶的酶把這兩個DNA分子共價連接起來。制備這類重組DNA分子的一般方法已有敘述(Cohen等人，美國專利4,237,224；Collins等人，美國專利4,304,863；Maniatis et al，Molecular CloningA LaboratoryManual，1982，Cold Spring Harbor Laboratory)。因為這些參考文獻在很大程度上說明了本領域的技術狀態(tài)，所以在此列為參考文獻。
制備出重組DNA分子后，只有滿足若干條件才能用這些分子來產生由插入的基因順序確定的產物。最重要的條件是，該重組分子應與宿主細胞相容，并因而能在宿主細胞中自主復制。最近的許多工作利用了大腸桿菌作為宿主細胞，因為它與廣泛圍的重組質粒相容。根據所用的載體/宿主細胞系統，將重組DNA分子引入宿主的方法可以是轉化、轉導和轉染。
對宿主細胞中是否存在重組質粒的檢測，可以方便地利用質粒標記活性(如抗生素抗性)來進行。例如，可以通過在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞，從未轉化的細胞中選擇出攜有編碼氨芐青霉素降解酶的質粒的宿主細胞。還可以利用兩個抗生素抗性標記，使質粒在某個位點編碼第二種抗生素降解活性，而所選用的限制性核酸內切酶能切割該位點，從而插入外源基因順序。這樣，含有正確重組質粒的宿主細胞就能通過對第一種抗生素有抗性，而對第二種抗生素敏感來鑒定。
只是將重組質粒插入宿主細胞并分離出轉化的宿主細胞，這本身并不能保證能產生大量的所需基因產物。為此，必須將外源基因順序與一個稱為啟動子的信號區(qū)以正確的相互關系相融合才能進行DNA的轉錄。此外，外源DNA也可以帶有其自身的啟動子，只要它能被宿主細胞識別就行。無論來源如何，啟動子都是一段DNA順序，該順序指導RNA聚合酶的結合，從而“啟動”DNA轉錄出信使RNA(mRNA)。
如果有了能產生大量mRNA的強啟動作用，則最終產生的所需基因產物將取決于從mRNA翻譯成蛋白質的有效性，而這一過程又取決于核糖體與mRNA結合的效率。在大腸桿菌中，mRNA上的核糖體結合位點包括一個起始密碼子(AUG)和一個上游的Shine-Dalgarno(SD)順序。此順序含有3～9個核苷酸，位于從AUG密碼子算起3～11個核苷酸處。該順序與大腸桿菌16S核糖體RNA(rRNA)的分端互補(Shine and Dalgarno，Nature 25434，1975)。顯然，mRNA中的SD順序與16SrRNA3′端順序之間的堿基配對，有利于核糖體與mRNA的結合。有關增強基因表達的綜述見Roberts and Lauer，Methods in Enzymology 68473，1979。
基于LacZ操縱子與λ噬菌體載體的結合建立了另一種表達系統(Huynh et al，in DNA Cloningvolume I，D.M.Glover，Ed)。在此系統中，β-半乳糖苷酶的結構基因與控制其表達的可誘導性啟動子一起被插入到噬菌體載體中。只要在β-半乳糖苷酶基因3′端的獨特克隆位點插入含有蛋白編碼區(qū)的mRNA的cDNA拷貝或基因組DNA片段，就會導致基因融合。
β-半乳糖苷酶基因的表達導致一種融合蛋白的生成該蛋白含有114kd的β-半乳糖苷酶和一個由cDNA插入片段編碼的羧基末端多肽，但條件是該插入片段含有一個取向(register)與β-半乳糖苷酶讀碼相同的開放讀碼。這樣，在利用β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使LacZ阻遏蛋白失活而誘導融合蛋白的表達后，通過基因文庫的免疫篩選能夠鑒定出一種噬菌體，該噬菌體含有一種基因其產物能被單克隆或多克隆抗血清識別。這一表達載體系統結合了噬菌體系統在包裝DNA并將其引入大腸桿菌細胞過程中的高效率和多肽與β-半乳糖苷酶融合體的高穩(wěn)定性。
疫苗亞單位途徑是將完整感染性生物的一個亞單位以免疫相關狀態(tài)輸入到宿主動物體內。該亞單位可以是一種由寄生蟲純化出的蛋白、一種在雜合系統中表達的重組蛋白或蛋白片段、一種含有單個中和決定簇的合成肽、或一種由病毒載體(如牛痘)引入的蛋白。宿主的免疫系統無需接觸過完整寄生蟲就能對該亞單位產生一個特異反應。在受到有毒劑量的感染性生物侵襲時，宿主的免疫系統只需受到它以前曾接觸過的疫苗亞單位的指導，便能產生有效的防護。
在文獻中可以找到循環(huán)抗體、小腸上皮中的分泌性IgA(Davis etal，Immunology 34879，1978)和細胞介導的免疫系統(Giambroniet al，Poultry Science 5938，1980)參與對球蟲病的獲得性抗性的證據。綜述見P.S.Davis in Avian Immunology，M.E.Rose，Ed.，British Poultry Science，Ltd.，Edenberg，361-385，1981。免疫系統的各種防護機制的可能參與，意味著要達到完全的、持續(xù)的保護作用，可能需要模擬天然感染過程的各個特殊方面的能力。這些方面包括在需要進行保護的位點的局部接觸、誘發(fā)對起主導作用的抗原加工細胞的發(fā)炎反應、適當的寄生蟲抗原的存在、可能還有與具有特定膜構型的MHC決定簇的關聯。
本發(fā)明提供具有艾美球蟲表面抗原的一個或多個免疫反應決定簇和/或抗原決定簇的純化蛋白或其片段。
更具體地說，本發(fā)明提供具有艾美球蟲表面抗原的一個或多個免疫反應決定簇和/或抗原決定簇的蛋白，所述表面抗原的表觀分子量約為28、37、120或高于200千道爾頓，該抗原能與保藏在美國典型培養(yǎng)物收集處(ATCC)并且指定登記號為HB9707至HB9712的一種或多種單克隆抗體特異結合。所述蛋白的例子有具有如

圖15、圖17、圖19和圖21所示的氨基酸順序的蛋白及其功能等價物。所述功能等價物是這樣一些蛋白，這些蛋白的氨基酸順序是由上述氨基酸順序通過加入、缺失、插入和氨基酸置換而衍生出來的，但條件是這些蛋白保留了艾美球蟲表面抗原的一個或多個免疫反應決定簇和/或抗原決定簇。所述蛋白可用于對家禽進行抗球蟲病免疫。
本發(fā)明還提供針對上述蛋白的抗體，尤其是一些單克隆抗體，例如登記號為HB9707、HB9708、HB9709、HB9710、HB9711和HB9712的單克隆抗體。
本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的DNA順序；含有這些DNA順序的重組載體，尤其是能夠指導所述DNA順序在可相容的宿主生物中表達的重組載體；用這些重組載體轉化的宿主生物，尤其是能夠表達包含在上述重組載體中的、編碼上述蛋白的DNA順序的轉化宿主生物。
本發(fā)明還提供具有禽艾美球蟲表面抗原的一個或多個免疫反應決定簇和/或抗原決定簇的蛋白的制備方法，該方法包括(a)在能夠表達編碼所述蛋白的DNA順序的條件下，培養(yǎng)用含所述DNA順序的重組載體轉化的宿主生物；(b)從該培養(yǎng)物中分離該蛋白或片段。
本發(fā)明還提供上述團體宿主生物的制備方法，該方法包括利用已知方法，用一個重組載體轉化宿主生物，所述載體含有編碼本發(fā)明蛋白的DNA順序。
本發(fā)明還提供預防家禽球蟲病的疫苗，其中含有一種或多種本發(fā)明的蛋白和一種生理上可接受的載體。
本發(fā)明還提供預防家禽球蟲病的疫苗，其中含有一種含編碼本發(fā)明蛋白的DNA順序或其片段的病毒載體和一種生理上可接受的載體，所述病毒載體能夠表達該DNA順序或片段。
本發(fā)明還提供一種預防家禽球蟲病的方法，該方法包括，給易患球蟲病的幼禽服用有效量的本發(fā)明疫苗。
對照附圖閱讀下列發(fā)明敘述部分和實施例能更容易地理解本發(fā)明。在附圖中圖1顯示了禽艾美球蟲子孢子ELISA測定的結果。將免疫小鼠血清(MS107-2；△)和對照小鼠血清(X)的稀釋液與4×104個純化的活的子孢子一起保溫。用結合有過氧化物酶的抗小鼠IgG抗體和過氧化物酶底物鄰苯二胺檢測結合在子孢子上的特異抗體。用TitertekMultiscan板式測量儀測量OD492。
圖2顯示了用從禽艾美球蟲子孢子中溶解出的蛋白進行Western吸印檢測的結果。將溶解出的子孢子蛋白用12.5％凝膠通過還原性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，然后轉移到硝酸纖維素膜上使其與每種抗體反應。用結合有過氧化物酶的抗小鼠IgG抗體和過氧化物酶底物4-氯-1-萘酚顯現由每種抗體識別出的特異蛋白。與每個膠條反應的抗體可在膠條頂部見到。
圖3顯示了從禽艾美球蟲的子孢子和裂殖子及堆型艾美球蟲(E.acervulina)的子孢子中溶解出的蛋白進行Western吸印檢測的結果。將各種不同的單克隆抗體和血清與結合在硝酸纖維素上的艾美球蟲蛋白一起保溫，用如圖2的說明中所述的方法進行顯現。所用的單克隆抗體包括3A5(1)、20C6(2)、7D1(3)、13A6(4)、6A5(5)和一種不與艾美球蟲蛋白反應的對照抗體。所用的血清包括小鼠107-2號免疫血清(7)和對照血清(8)。
圖4中，左圖顯示了用125I標記的禽艾美球蟲子孢子表面蛋白進行免疫沉淀檢測的結果。用IODOGEN或IODOBEADS方法標記子孢子表面蛋白，溶解這些蛋白，用12.5％凝膠進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，利用放射自顯影法顯示這些蛋白。右圖顯示了用活的子孢子免疫的小鼠的血清對125I標記子孢子表面蛋白進行免疫沉淀的結果。將免疫小鼠血清(105-1、105-2、105-3、107-1、107-2、107-3)和對照小鼠血清(對照)與125I-子孢子表面蛋白一起保溫，用偶聯在瓊脂糖上的抗小鼠抗體俘獲免疫復合物。將免疫復合物用Laemmli樣品緩沖液溶解，用12.5％凝膠通過SDS-凝膠電泳進行分離，用放射自顯影法進行顯示，M代表標準標記蛋白的分子量(千道爾頓)。
圖5顯示了用單克隆抗體對125I-子孢子表面蛋白進行免疫沉淀的結果。鑒定由每種抗體結合的125I-蛋白的方法如圖4的說明中所述。在每個凝膠泳道的頂部標出了所用的特異性子孢子單克隆抗體和對照抗體(對照)。標準標記蛋白的分子量以千道爾頓給出。
圖6顯示了空氣干燥的禽艾美球蟲子孢子制片的相差顯微照片和使用了種種單克隆抗體的免疫螢光染色圖形顯微照片。圖A、B、C、D的左側為相差顯微照片，顯示了長形的完整子孢子，它有一個大的后折射體(PRB)、一個小的前折射體(ARB)和與后折射體相對的頂端(A)。圖A、B、C、D的右側分別顯示了用以下抗體處理的制片單克隆抗體14C3(特異于表面抗原)、6A5(特異于表面蛋白和折射體蛋白)、11D2(特異于子孢子頂端)和對照抗體。用結合有若丹明的抗小鼠抗體對結合在制片上的抗體進行定位，并利用Leitz Dialux 22顯微鏡通過表面螢光來顯示。所有顯微照片都放大630倍。
圖7顯示了雞腎細胞內的細胞內子孢子和發(fā)育中的寄生蟲的抗體染色。用子孢子感染雞腎細胞，感染后在指定的時間對細胞進行處理以進行抗體染色。在固定前洗滌培養(yǎng)物以除去所有細胞外的子孢子。如圖所示，用抗體7D4、8A2、7B2和15A3制得相差顯微照片和相應的免疫螢光顯微照片。用結合有若丹明的抗小鼠抗體對結合在制片上的抗體進行定位，通過表面螢光進行顯示。所有顯微照片都放大630倍。
圖8顯示了雞腎細胞內的細胞內子孢子和發(fā)育中的寄生蟲的抗體染色。利用單克隆抗體14B1和19D6、免疫雞血清和發(fā)熒光和第二抗體，在指定的時間制得相差顯微照片和相應的免疫熒光顯微照片。
圖9顯示了抗子孢子抗體對細胞內子孢子發(fā)育的抑制。將純化的禽艾美球蟲子孢子與對照抗體(X)或抗子孢子抗體7D4(□)、8A2(○)、14B1(●)、或6A5(■)一起于40℃下預保溫1小時，然后用來感染MDBK細胞培養(yǎng)物。此外，還將子孢子與培養(yǎng)基(△)或抗球蟲藥物拉沙里菌素(*)一起預保溫。
感染后，通過測定3H-尿嘧啶對細胞培養(yǎng)物的摻入而測定細胞內子孢子的發(fā)育。由于拉沙里菌素阻滯子孢子的細胞內發(fā)育，所以用此藥物預處理的培養(yǎng)物顯示出3H-尿嘧啶的摻入最少。
圖10顯示了65kdβ-半乳糖苷酶融合蛋白樣品或所標出的其它樣品的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳/Western吸印分析的結果。進行Western吸印分析時，與羊抗小鼠HPOD結合物一起使用了鼠抗-β-半乳糖苷酶抗體(圖A)或混合在一起的單克隆抗體7D1、7D4和20C6(圖B)。A、B兩圖中的各泳道代表(1)β-半乳糖苷酶；(m)預染色的分子量標記，其分子量(kd)在圖A的左側標出；(2)總的細胞沉淀蛋白；(3)通過超聲處理從細胞沉淀中釋放出的蛋白；(4)超聲處理后用鹽酸胍從沉淀中溶解出的蛋白。
圖11是質粒PEV/2-4的示意圖，該質粒是含有噬菌體入m2-4的1.7kb EcoRI DNA插入片段的65kd蛋白表達質粒。插入片段中各限制酶位點的位置相對于EcoRI位點給出，這些位點包括PstI(P，在bp53和776處)、KpnI(K，在bp202處)、BstNI(B，在bp584、1303和1412處)、Sau3A(S，在bp1017和1439處)。
圖12是pEV3-SEQ的圖譜，該質粒含有一個帶有所標出的位點和多連接子，該連接子插在pEV-vrf3的EcoRI和SalI位點之間。用虛箭頭所標出的合成寡核苷酸CGGTCGACTCGAGCCA作為鏈終止DNA順序分析的引物。
圖13是編碼由單克隆抗體6A5識別的蛋白的cDNA克隆的限制圖譜。圖中給出了于1.1kb cDNA的Maxam-Gilbert DNA順序分析的限制性核酸內切酶位點。括號中的EcoRI位點位于0.9kb cDNA的末端。圖譜上方的橫杠表示由該DNA順序預測的開放讀碼，涂黑的部分為可能的信號肽。圖譜下部的直線表示用來進行鏈終止順序分析的exoIII缺失。
圖14是1.1kd cDNA分子的核苷酸順序，該順序編碼由單克隆抗體6A5識別的20kd蛋白。
圖15是圖14蛋白的氨基酸順序，是從圖14的核苷酸順序推測的。
圖16是1.7kb cDNA分子的核苷酸順序，該順序編碼由單克隆抗體7D1、7D4和20C6識別的65kd蛋白。
圖17是圖16蛋白的氨基酸順序，是由圖16的核苷酸順序推測的，這個氨基酸順序已通過對由所表達的65kd蛋白所產生的胰酶水解肽進行順序分析而加以驗證。將總氨基酸順序中相應于某些肽的區(qū)域畫下線表示。這些肽中已測定的順序畫了上線。
圖18是1.1kb cDNA分子的核苷酸順序，該順序編碼由單克隆抗體8A2識別的28kd蛋白。
圖19是圖18蛋白的氨基酸順序，是由圖18的核苷酸順序推測的。
圖20是3.2kb cDNA分子的核苷酸順序，該順序編碼由單克隆抗體7B2識別的蛋白。
圖21是圖20蛋白的氨基酸順序，是由圖20的核苷酸順序推測的。
圖22是經過免疫親和純化的65kd蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。凝膠通過考馬斯藍染色和Western吸印分析來顯示。泳道2和4、3和5含有從兩個制備物中純化的蛋白。泳道1和6含有分子量標記蛋白的混合物，這些蛋白分子量標示在圖的左側和右側。
圖23是經β-巰基乙醇還原的(圖A)和未還原的(圖B)65kd蛋白胰酶水解物的HPLC洗脫圖譜，顯示作為柱保留時間的函數的215nm光吸收。
圖24顯示了基本載體的四個成分的限制圖譜，該載體用于將編碼球蟲抗原的基因重組到牛痘病毒中。這些成分包括7.5k啟動子成分(a和b，左)、TK座位(a和b，右)、質粒pUC8的一部分(C)和來自M13tg131的多克隆位點(d)。病毒7.5k和TK啟動子的轉錄方向是從左至右(即從多連接子中的BglII限制位點到EcoRI位點)。
圖25顯示了由單克隆抗體8A2到識別的艾美球蟲抗原的N末端氨基酸順序，(A)中的單克隆抗體8A2是由一個在圖24載體的多連接子成分中含有AUG翻譯起始密碼子的構建體表達的；(B)中的單克隆抗體8A2與瘧疾的190kd先導片段(頭34個氨基酸)和圖24克隆載體的多連接子(下面13個氨基酸)融合。在該蛋白的成熟過程中，N末端的頭19個氨基酸可在冒號所標出的位置被切除。
在附圖中，使用了標準的單字母縮寫來表示核苷酸，使用了標準的一字母或三字母縮寫來表示氨基酸。這些縮寫的含義可以在一般的生化教科書中找到，例如Lehninger的《生化原理》一書的第96頁和798頁(Principles of Biochemistry，1g84，Worth Publishers，Inc.，New York)。
這里所用的下列術語將具有下列含義；“20kd蛋白”指一種能與單克隆抗體6A5特異結合的重組或合成蛋白，在用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定時其表觀分子量約為20千道爾頓。該蛋白還特異地與在SDS凝膠中表觀分子量約為28千道爾頓的艾美球蟲表面抗原(來自艾美球蟲蛋白的全提取液)反應。此抗原存在于子孢子的發(fā)育階段。編碼此蛋白的cDNA分子的核苷酸順序及由此推測出的氨基酸順序分別示于圖14和15。
“65kd蛋白”指一種能與單克隆抗體7D1、7D4和20C6特異結合的重組或合成蛋白，在用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定時其表觀分子量約為65千道爾頓。這些抗體還特異地與艾美球蟲提取液中其表觀分子量在SDS凝膠中約為120千道爾頓的表面抗原反應。此抗原存在于子孢子、裂殖體和裂殖子發(fā)育的各階段中。編碼此蛋白的cDNA分子的核苷酸順序及由此推測的氨基酸順序分別示于圖16和17。
“28kd蛋白”指一種能與單克隆抗體8A2特異結合的重組或合成蛋白， 在用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定時其表觀分子量約為28千道爾頓。此抗體還特異地與一種表觀分子量在SDS凝膠中約為37千道爾頓的艾美球蟲表面抗原反應。此抗原存在于子孢子、裂殖體和裂殖子發(fā)育階段中。編碼此蛋白的cDNA分子的核苷酸順序及由此推測的氨基酸順序分別示于圖18和19。
“45kd蛋白”指能與單克隆抗體7B2特異結合的重組或合成蛋白，在用SDS聚丙酰胺凝膠電泳進行測定時其表觀分子量約為45千道爾頓。此抗體還特異地與一種其表觀分子量在SDS凝膠中大于200千道爾頓的艾美球蟲表面抗原反應。此抗原存在于子孢子發(fā)育的各階段中。編碼此蛋白的cDNA分子的核苷酸順序及由此推測的氨基酸順序分別示于圖20和21。
術語“具有艾美球蟲表面抗原的一個或多個免疫反應決定簇和/或抗原決定簇的蛋白”指一種蛋白，該蛋白具有一個或多個這樣的區(qū)域或決定基，這些區(qū)域或決定基能夠在免疫感受態(tài)宿主生物體內誘發(fā)免疫反應和/或能夠與互補抗體特異結合。
由于遺傳密碼具有簡并性，所以應當理解，可能有許多核苷酸順序(功能等價物)都能編碼圖15、17、19和21所示的氨基酸順序。還應當理解，插入載體中的本發(fā)明DNA順序和片段的核苷酸順序可以包括并非實際結構基因一部分的核苷酸，只要求含這些順序和片段的重組載體能夠在適當的宿主生物中指導一種蛋白或片段的生成，這種蛋白或片段具有艾美球蟲表面抗原的一個或多個免疫反應決定簇和/或抗原決定簇。
此外，已知在蛋白質中可發(fā)生基本上不改變生物活性和免疫活性的氨基酸置換，Neurath等人的《蛋白質》一書中(“The Proteins”，Academic Press，New York，1979)，具體說是14頁的圖6，對此作了描述。最常見的氨基酸置換有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly，反之亦然。
本發(fā)明示例性實施方案的這些功能上等價的核苷酸順序變異和氨基酸置換，只要所產生的蛋白保留了艾美球蟲表面抗原的一個或多個免疫反應決定簇和/或抗原決定簇，就在本發(fā)明的范圍內。
術語“片段”指含有本發(fā)明的一段cDNA或蛋白亞順序的DNA順序或蛋白。這些片段可由較大分子經酶切而產生，對DNA使用限制性核酸內切酶，對蛋白使用蛋白酶。但本發(fā)明的片段并不限于任何形式的酶切產物，而包括其末端并不相應于任何酶切點的亞順序。這些片段可利用這里所提供的順序資料通過例如化學合成法制得。DNA片段可以通過由分離的信使RNA(mRNA)合成不完全的互補DNA(cDNA)來產生。蛋白片段也可通過表達編碼蛋白片段的DNA片段來產生。如果這些蛋白片段含有足以構成免疫反應決定簇和/或抗原決定簇的氨基酸殘基數，則可用于本發(fā)明。一般約需至少7或8個殘基。如下所述，可能需要把這些片段與免疫原性載體分子偶聯以使它們具有免疫反應性。
本發(fā)明的蛋白可以用本領域內已知的方法來制備，如用重組DNA方法、化學合成法或從艾美球蟲制備物中分離。
制備本發(fā)明蛋白所需的DNA可以利用圖14、16、18和20所提供的核苷酸順序資料來化學合成。這種化學合成可以用任何已知的方法進行，但優(yōu)選氨基亞磷酸酯(phosphoramidite)固相載體法(Matteucciet al.J.Am.Chem.Soc.1033185，1981)。
此外也可由艾美球蟲mRNA制備cDNA。信使RNA可利用標準技術從形成孢子的艾美球蟲卵囊或裂殖子中分離。然后可利用這些mRNA樣品，如Maniatis等人(同上)所述產生雙鏈cDNA。然后可將該cDNA插入適當的可用于轉化大腸桿菌的克隆載體中，以產生一個cDNA文庫。
接著，可以利用本發(fā)明的克隆基因或其片段作探針來篩選cDNA文庫。這此基因或片段可以利用DNA聚合酶I通過(例如)缺刻翻譯而進行放射標記，標記反應在四種脫氧核糖核苷酸存在下進行，其中一種核苷酸在α位含有32P作為探針(Maniatis等人，同上，第109頁)。
雖然在后面的實施例中是用禽艾美球蟲作mRNA的來源，但也可用這個種的克隆基因作探針而從其它種的艾美球蟲中分離基因，因為在各種不同的種中DNA順序具有同源性。
鑒定并分離出本發(fā)明的艾美球蟲基因后，將其插入適當的表達載體中，該載體含有所插入的基因順序進行轉錄和翻譯所必需的各成分。有用的克隆載體可以由染色體DNA順序、非染色體DNA順序和合成DNA順序的片段構成，例如已知的細菌質粒、噬菌體DNA、質粒和噬菌體DMA的各種組合(如經過修飾而引入了噬菌體DNA或其它表達控制順序的質粒)、或酵母質粒。本領域專業(yè)人員已知的、可用的特殊克隆載體包括(但并不限于)pEV-vrf質粒(pEV-vrf1、pEV-vrf2和pEV-vrf3)；SV40；腺病毒；酵母；λgt-WES-λB；Charon 4A和Charon 28；λgt11-λB；由M13衍生的載體，如pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pBR313、pBR322和pBR325；pAC105、pVA51；pACY177；pKH47；pACYC184；pUB110；pMB9；colE1；pSC101；pm121；RSF2124；pCR1或RP4。
如果基因和所需的克隆載體都用相同的限制酶切割，則易于將艾美球蟲基因插入克隆載體中，因為這種切割產生了互補的DNA末端。如果不能這樣做，則可能需要修飾切割后所產生的末端，方法是通過再消化單鏈DNA而產生平末端，或者通過用適當的DNA聚合酶填平單鏈末端而達到同樣的結果。采用這種方法時，可以用一種酶(如T4DNA連接酶)進行平末端連接。此外，也可以通過在DNA末端上連接某些核苷酸順序(連接子)來產生任何所需的位點。這些連接子可以含有編碼限制位點識別順序的特定寡核苷酸順序。切割后的載體和艾美球蟲基因還可以通過接上均聚物尾巴而加以修飾(Morrow，Meth.Enzymol.683，1979)。
可用于本發(fā)明的許多克隆載體都含有可用來選擇所需轉化體的一個或多個標記活性，如pBR322中的氨芐青霉素和四環(huán)素抗性、pUC8中的氨芐青霉素抗性和β-半乳糖苷酶活性、pEV-vrf2中的氨芐青霉素抗性。如果宿主細胞反而缺少這些載體所具有的活性，則對已插入了上述載體的宿主細胞的選擇就大大簡化了。
應當理解，插在克隆載體中選定位點的艾美球蟲基因的核苷酸順序，可以包括并非實際結構基因一部分的核苷酸。此外，該基因也可以只含有完整野生型基因的一部分。唯一的要求就是，插入克隆載體中的基因片段能夠指導具有艾美球蟲表面抗原的至少一個免疫反應決定簇和/或抗原決定簇的多肽或蛋白在適當的宿主生物中的產生。
適當的宿主生物的選擇受到本領域內已知的幾個因素的影響。這些因素包括，例如，與所選用的載體的相容性、由雜交質粒編碼的蛋白的毒性、所要的蛋白是否易于回收、表達特性、生物安全性和費用。這些因素的平衡問題一定會遇到，因此必須理解，并非所有宿主對特定重組DNA分子的表達都是等效的。
可用于本發(fā)明的適當的單細胞宿主生物包括(但不限于)植物、哺乳動物或酵母細胞及細菌，例如大腸桿菌、枯草桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)和放線菌。特別優(yōu)先的是大腸桿菌MC1061菌株，該菌株曾由Casadaban等人作了描述(J.Mol.Biol.138179，1980)?？梢允褂么司昊蚝匈|粒pRK248cIts的大腸桿菌K12的任何其它菌株。用于其它大腸桿菌K12菌株的質粒pRK248cIts可從ATCC得到，其登記號為ATCC33766。大腸桿菌MC1061菌株也已保藏，其登記號為ATCC53338。
可以用多種方法將重組克隆載體轉移到宿主細胞中。根據所選用的特定載體/宿主細胞系統，這種轉移可以通過轉化、轉導或轉染來進行。產生這樣一種轉化宿主細胞后，就可以培養(yǎng)該細胞，并可以從該培養(yǎng)物中分離蛋白表達產物。
產生本發(fā)明艾美球蟲蛋白的克隆可以用適當標記的、特異于這些蛋白的抗體來鑒定。優(yōu)選的單克隆抗體可以用如下的標準方法來制備。
用禽艾美球蟲的抗原蛋白來免疫諸如小鼠、大鼠、馬、綿羊、豬、兔等動物，得到產生抗體的體細胞用于與骨髓瘤細胞融合。
具有產生抗體能力的體細胞，特別是B細胞，適于與骨髓瘤細胞系融合。這些體細胞可以從已接觸過抗原的動物的淋巴結、脾和外周血中得到。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，使用小鼠脾細胞，這部分是因為這些細胞能與小鼠骨髓瘤細胞系產生相對較高百分比的穩(wěn)定融合體。但也有可能使用大鼠、兔、蛙或其它細胞。
現已由淋巴瘤建立了特化的骨鏈瘤細胞系，用于產生雜交瘤的融合方法(Khler and Milstein，Eur.J.Immunol.6511，1976，Shulmanet al，Nature 276269，1978，VolK等，J.Virol.42220，1982)。建立這些細胞系至少是由于三個原因。第一是為了有利于未融合的、不定地自我繁殖的骨髓瘤細胞及類似的細胞中選擇出融合的雜交瘤。這通常是利用有某些酶缺陷的骨髓瘤來進行的，這些酶缺陷使骨髓瘤不能在支持雜交瘤生長的某些選擇性培養(yǎng)基中生長。第二個原因源于淋巴瘤細胞固有的產生其自身抗體的能力。使用單克隆技術的目的是為了得到壽命無限的融合雜交細胞系，這些細胞系在雜交瘤的體細胞成分的遺傳控制下，產生所需的單一抗體。為減少雜交瘤產生的腫瘤細胞抗體，可以使用不能產免疫球蛋白輕鏈或重鏈，或抗體分泌機制有缺陷的骨髓瘤細胞系。選擇這些細胞系的第三個理由是因為它們的適用性強，融合效率高。
許多骨髓瘤細胞系都可以用來產生融合的雜交細胞，這些細胞系包括例如P3/X63-Ag8、P3/NSI/1-Ag4-1、SP2/O-Ag-14和S194/5.XXOBU.1。P3/X63Ag8和P3/NSI/1-Ag4-1細胞系已由Kohler和Milstein作了描述(Eur.J.Immunol.6511，1976)。Shulman等人(Nature276269，1978)建立了SP2/O-Ag14骨髓瘤細胞系。Trowbridge報導了S194/5.XXO.BU.1細胞系(J。Exp.Med.148313，1979)。在本發(fā)明的實施例中使用是的PAI-O小鼠細胞系(P3/X63-Ag8的一個不產生Ig的亞克隆)。
產生抗體的脾細胞或淋巴結細胞與骨髓瘤細胞的雜交體的制備方法通常包括在能夠促進細胞膜融合的一種或幾種因子(化學的、病毒的或電的)存在下，分別將這兩種體細胞以10∶1的比例與骨髓瘤細胞混合(但該比例也可以在20∶1至1∶1間變化)。最好用同一個種的動物作用于融合操作的體細胞和骨髓瘤細胞的來源。有關融合方法已由Kohler和Milstein(Nature 256495，1975；Eur.J.Immunol.6511，1976)、Gefter等人(Somatic Cell Genet.3231，1977)和Volk等人(J.Virol.42220，1982)作了描述。這些研究人員使用的促融合因子是仙臺病毒和聚7醇(PEG)。本發(fā)明實施例的融合操作使用的是PEG。
由于融合操作產生的活雜交體的頻率很低(例如，用脾作體細胞來源時，大致每1×105脾細胞只得到一個雜交體)，所以必須有一種手段從剩下的未融合細胞特別是未融合的骨髓瘤細胞中選擇出融合的雜交細胞。同時也需要有一種手段從所得的其它融合細胞中檢測所要的產生抗體的雜交瘤。
在選擇融合的雜交細胞時，一般是用支持雜交瘤生長但阻止骨髓瘤細胞生長的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞，而正常情況下骨髓瘤細胞將繼續(xù)不定地分裂。(用于融合的體細胞在體外培養(yǎng)中不能保持長期存活，因此不成為問題)。在本發(fā)明的實施例中，使用了缺少次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶的(HPRT陰性)骨髓瘤細胞。用次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(HAT)培養(yǎng)基選擇掉這些細胞。在HAT培養(yǎng)基中，融合的雜交細胞由于脾細胞具有HPRT陽性基因型而能夠存活。也可以使用帶有不同的遺傳缺陷(藥物敏感性等)的骨髓瘤細胞，從而能夠用支持基因型感受態(tài)雜交體生長的培養(yǎng)基選擇掉骨髓瘤細胞。
選擇性培養(yǎng)融合的雜交細胞需要幾周。在這段時間的初期，需要鑒定出那些產生所需抗體的雜交體，使它們可以在后續(xù)步驟中進行克隆和繁殖。通常，所得雜交體中產生所需抗體的有10％左右，但在1％至30％范圍內都是常見的。產生抗體的雜交體可以用幾種標準檢測方法中的任一種進行檢測，這些方法包括酶聯免疫檢測和放射免疫檢測技術，這些技術已見于文獻中[參見例如，Kennet等人(編者)，Monoclonal Antibodies and HybridomasA New Dimension inBiological Analyses，pp.376-384，1980，Plenum Press，New York)。本發(fā)明的實施例中使用了幾種檢測方法。
選擇出所需的融合雜交細胞并分別克隆出幾個產生抗體的細胞系后，每個細胞系都可以用兩種標準方法中的任一種進行繁殖?？梢詫㈦s交瘤細胞的懸浮液注射到組織相容性動物體內。接受注射的動物將因此而長出腫瘤，這些腫瘤分泌由融合的雜交細胞產生的特異性單克隆抗體?？梢猿槌鰟游锏捏w液，如血清或腹水液，從而提供高濃度的單克隆抗體。此外，也可以用實驗室培養(yǎng)皿分別對每個細胞系進行體外繁殖?？梢酝ㄟ^傾析、過濾或離心，收集含有高濃度的單一特異性單克隆抗體的培養(yǎng)基。
在大腸桿菌中產生艾美球蟲蛋白時，這些蛋白保留在細胞質或包含體中。因此，為分離這些蛋白、需要破碎外膜。這最好利用超聲處理或其它機械破碎裝置(如法式壓力室或Gaulin勻漿器)來進行。
也可以利用化學方法或酶法來破碎細胞。由于二價陽離子常常是維持細胞膜的完整性所必需的，所以用適當的螯合劑如EDTA或EGTA進行處理可以產生足夠的破碎作用，從而有利于蛋白從細胞中流出。同樣，曾用某些酶如溶菌酶來達到同樣的效果。該酶水解細胞壁的肽聚糖骨架。
也可以應用滲壓休克。簡單地說，這可通過如下過程來進行首先將細胞置于高滲溶液中，使細胞失水而收縮。而后置于低滲的“休克”溶液中，使水快速流入細胞而逐出所需的蛋白。
從細胞中分離出艾美球蟲蛋白后，可以利用鹽析法(如用硫酸鈉或硫酸銨)、超濾法或本領域專業(yè)人員公知的其它方法來濃縮這些蛋白。進一步的純化可以利用常規(guī)的蛋白純化技術進行，這些技術包括(但不限于)凝膠過濾、離子交換層析、制備性圓盤凝膠電泳或垂直板電泳、等電聚焦、低溫有機溶劑分級分離、或逆流分配。但最好用如下所述的免疫親和層析法進行純化。
本發(fā)明的蛋白或其片段也可以用適當的方法化學合成，如用完全固相合成法、部分固相法、片段縮合法或經典的溶液合成法。優(yōu)選如Merrifield所述的固相合成法(J.Am.Chem.Soc.852149，1963)。
這種合成用α氨基末端得到保護的氨基酸進行。帶有不穩(wěn)定側鏈的三官能團氨基酸也用適當的基團進行保護，這些基團將防止在肽合成過程中在該部位發(fā)生化學反應。選擇生地脫除α-氨基保護基，以便在氨基末端發(fā)生后續(xù)的反應。脫除α-氨基保護基的條件不使側鏈保護基脫保護。
α-氨基保護基是那些已知可用于肽分步合成領域的保護基，包括?；捅Ｗo基(例如甲?；?、三氟乙酰基、乙?；?、芳族尿烷型保護基(例如芐氧羰基(Cbz)和取代的芐氧羰基)、脂族尿烷保護基(例如叔丁氧羰基(Boc)、異丙氧羰基、環(huán)己氧羰基)和烷基型保護基(例如芐基、三苯甲基)。優(yōu)選的保護基是Boc。Tyr的側鏈保護基包括四氫吡喃基、叔丁基、三苯甲基、芐基、Cbz、4-Br-Cbz和2，6-二氯芐基。(優(yōu)選的Tyr側鏈保護基是2，6-二氯芐基。)Asp的側鏈保護基包括芐基、2，6-二氯芐基、甲基、乙基和環(huán)已基。優(yōu)選的Asp側鏈保護基是環(huán)已基。Thr和Ser的側鏈保護基包括乙酰基、苯甲酰基、三苯甲基、四氫吡喃基、芐基、2，6-二氯芐基和Cbz。優(yōu)選的Thr和Ser的保護基是芐基。Arg的側鏈保護基包括硝基、Tos和Cbz、金剛烷氧羰基或Boc。優(yōu)選的Arg保護基是Tos。Lys的側鏈氨基可以用Cbz、2-CLCbz、Tos或Bos來保護。優(yōu)選的Lys保護基是2-CL-Cbz基團。根據以下原則選擇側鏈保護基側鏈保護基在偶聯過程中保持不變，在氨基末端保護基脫保護過程中或在偶聯條件下不被切除。側鏈保護基必須在完成最終的肽合成后，能利用不改變目標肽的反應條件脫除。
固相合成通常是通過使α-氨基得到保護的(側鏈得到保護的)氨基酸與適當的固相載體偶聯而從羧基末端進行。如果與氯甲基化的或羥甲基樹脂連接，則形成酯鍵，所得到目標肽就將在C末端有一個游離羧基。此外，也可以用二苯甲基胺或對甲基二苯甲基胺樹脂，在這種情況下形成一個酰胺鍵，所得到的目標肽將在C末端具有一個羧酰胺基團。這些樹脂可以買到，其制備方法由Stewart等人描述(“SolidPhase Peptide Synthesis，2nd Editien，Pierce ChemicalCo，Rockford，IL，1984)。
C末端氨基酸Arg的側鏈用Tos保護，其α氨基官能團用Boc保護，用各種活化劑將該氨基酸偶聯到二苯甲基胺樹脂上，這些活化劑包括二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N′-二異丙基碳二亞胺和羰基二咪唑。連到樹脂載體上后，用三氟乙酸(TFA)或HCL的二惡烷溶液在0°到25℃的溫度下脫除α氨基保護基。引入甲硫氨酸(Met)后向TFA中加入二甲硫醚，以抑制可能的S-烷基化。脫除α氨基保護基后，將其余的被保護的氨基酸以所要求的順序分步偶聯，得到所需的肽順序。
進行偶聯反應時可以使用各種不同的活化劑，包括DDC、N，N′-二異丙基碳二亞胺、苯并三唑-1-基-氧-三(二甲胺基)-磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)和DCC-羥基苯并三唑(HOBt)。每種被保護的氨基酸的用量都是過量的(＞2.5當量)，偶聯反應通常在DMF、CH2Cl2或其混合物中進行。在偶聯反應的每個階段通過如Kaiser等人(Anal Biochem.345951970)所述的茚三酮反應監(jiān)測反應完全程度。如果測得偶聯反應不完全，則重復該偶聯反應。偶聯反應可以用Applied Biosystems Vega250型合成儀或其它市售儀器自動進行。完全合成出目標肽后，將肽-樹脂用TFA/二硫乙烷脫保護，然后用一種試劑(如液體HF)于0℃下水解1-2小時，從樹脂上切下肽并脫除所有的側鏈保護基。
固相載體上側鏈與側鏈的環(huán)化作用要求使用正交保護方案，以便能夠選擇性地切除酸性氨基酸(如Asp)和堿性氨基酸(如Lys)的側鏈官能團。Asp側鏈的9-芴基甲基(OFm)保護基和Lys側鏈的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保護基可以用于此目的。在這些情況下，用哌啶的DMF溶液選擇性地脫除用Boc保護的肽-樹脂的側鏈保護基。環(huán)化反應是用各種活化劑(包括DCC、DCC/HOBt或BOP)在固相載體上進行。HF反應則在如上所述的環(huán)化肽-樹脂上進行。
合成蛋白的純化可以按如上所述的重組產生的蛋白純化方法進行。
也可從禽艾美球蟲或其它種的艾美球蟲的膜蛋白提取物中，通過免疫沉淀或免疫親和層析來回收艾美球蟲蛋白。前已述及，這些方法能夠產生完整的野生型蛋白。在某些情況下，這些蛋白比用重組DNA方法產生的蛋白要大。用于此目的的單克隆抗體，可以利用合成的或天然的艾美球蟲蛋白作抗原按上述方法制備。
其它具有必需的免疫反應決定簇和/或抗原決定簇的有用蛋白是一些抗個體基因型抗體或其片段，它們針對本發(fā)明蛋白上的活性決定簇。這些抗個體基因型抗體可以針對其它特異于本發(fā)明蛋白上的決定簇的抗體而產生(即抗個體基因型抗體是抗抗體)。最好使用單克隆的抗個體基因型抗體。這些抗體可以作為疫苗而施用，使用方式與艾美球蟲蛋白本身所能夠采取的使用方式相同。
可以將一種或多種本發(fā)明的艾美球蟲蛋白和抗個體基因型抗體配成含有蛋白和生理上可接受載體的疫苗。合適的載體包括，例如中性PH的0.01至0.1M磷酸緩沖液或生理鹽水溶液。
可以以兩種方式之一產生抗球蟲病的增強免疫。首先可以將佐劑或免疫增強劑加到疫苗中。其次可以將本發(fā)明的蛋白以較大的形式給予所要免疫的動物，這種形式既可以是交聯復合物，也可以是與載體分子結合。
適于接種動物的佐劑包括(但不限于)佐劑65(含有花生油、二縮甘露醇單油酸酯和單硬脂酸鋁)；無機凝膠，例如氫氧化鋁、磷酸鋁和明礬；表面活性劑，例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、二甲基二(十八烷基)溴化胺、N，N-二(十八烷基)-N′，N′-雙(2-羥甲基)丙二胺、甲氧基十六烷基甘油、普盧龍尼克多元醇類；聚陰離子，如吡喃、硫酸葡聚糖、多聚IC、聚丙烯酸和carbopol；肽類，例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和特夫素；油乳膠。這些蛋白還可以在摻入脂質體或其它微載體之后施用。
摻入到脂質體或其它微載體中的方法，提供了一種能夠在長時間內持續(xù)釋放疫苗的手段。也可以用一種泵如ALza泵來達到同樣的目的。
本發(fā)明的蛋白特別是較小片段的免疫原性，可以通過與免疫原性載體分子(即一種具有在宿主動物體內獨立誘發(fā)免疫反應特性的大分子，本發(fā)明的蛋白和蛋白片段可與之共價連接)交聯或偶聯而得以增強。之所以要與載體分子交聯或結合，是因為小的蛋白片段有時起到半抗原(能夠與抗體特異結合但不能誘發(fā)抗體產生的分子，即它們不具有免疫原性)的作用。這些片段與免疫原性載體分子的結合，使得這些片段由于通常所說的”載體效應“而獲得了免疫原性。
合適的載體分子包括，例如，蛋白和天然或合成的聚合物，如多肽、多糖、脂多糖等。一種有用的載體是一種稱為QuilA的糖苷，它已由Morein等人作了描述(Nature 308457，1984)。特別優(yōu)選的是蛋白載體分子，包括(但不限于)哺乳動物血清蛋白，如鑰孔嘁血藍蛋白，人或牛γ球蛋白，人、?；蛎庋迩宓鞍祝蜻@些蛋白的甲基化衍生物或其它衍生物。其它蛋白載體對本領域專業(yè)人員來說將是顯而易見的。對準備在其體內誘導出抗艾美球蟲蛋白抗體的宿主動物來說，蛋白載體最好(但不一定)是外來的。
與載體分子進行共價偶聯時，可以采用本領域公知的方法，具體選擇哪一種方法將由所用載體分子的本質決定。如果免疫原性載體分子是蛋白，則在偶聯本發(fā)明的蛋白或片段時可以采用(例如)水溶性碳二亞胺如二環(huán)己基碳二亞胺或戊二醛。
象這樣一些偶聯劑，也可以用來使蛋白和片段自身交聯，而無需使用另外的載體分子。這樣交聯成蛋白或蛋白片段的聚集體，也能增強免疫原性。
施用有效量的本發(fā)明疫苗能夠保護家禽不受禽艾美球蟲的感染。在體外，針對禽艾美球蟲抗原的單克隆抗體與堆型艾美球蟲和百型艾美球蟲(E.Maxima)產生交叉反應，表明這些抗體也可以賦予針對這些種的保護作用。蛋白或蛋白片段的有效劑量范圍為接種動物每千克體重約10～50微克。優(yōu)選劑量為約25～50μg/kg。初次接種后，最好在一周至幾周后進行加強接種。也可以多次加強接種。這些加強接種的劑量范圍一般為約5～50μg/kg，最好約20～50μg/kg?？梢圆捎脴藴实慕o藥途徑，如皮下、皮內、肌肉內、口服、肛門或卵內給藥。
將本發(fā)明的球蟲抗原給予家禽的免疫系統時，可以將編碼這些抗原的基因克隆到細菌(例如大腸桿菌或沙門氏菌)或病毒(例如痘病毒或皰疹病毒)中，然后把這些活性載體系統通過口服、注射或其它常用的途徑施用于家禽。Carbit等人(Vaccines，1987，Cold SpringHarbor Laboratory，PP.68～71)描述了大腸桿菌的使用，而Clements(Pathol.Immunopathol.Res.6137，1987)描述了沙門氏菌的使用。Moss等人(Ann Rev.Immunol.5305，1987)綜述了采用重組痘病毒的病毒載體系統的使用。
有一種痘病毒，即牛痘病毒，可用來測試球蟲抗原在細胞培養(yǎng)物和動物體中的釋放?，F已發(fā)現，對分析研究來說，雖然也可采用另一種痘病毒載體即鳥痘病毒，但牛痘病毒更為有效。這是因為牛痘病毒比鳥痘病毒繁殖快，并且其宿主范圍并不僅限于雞細胞。可以將大量異源DNA插入牛痘病毒基因組中而不抑制病毒的成熟和感染性(Smithet al，Gene 2521，1983)。利用病毒插入并表達多個異源基因，可以誘導針對在感染動物體內表達的抗原的抗體產生(Rerkus et al，Science 229981，1985)。
用于產生重組牛痘病毒的技術能夠容易地通過常規(guī)操作而沿用于鳥痘病毒或皰疹病毒系統。在抗球蟲病疫苗中使用這些重組病毒作載體特別有利，因為接種的家禽對球蟲抗原和病毒載體都產生免疫(就是說，這類疫苗是二價的)。把另一些基因插入載體病毒中可以進一步擴大這類疫苗的用途。例如，可將新城疫病毒基因組的某些部分與球蟲抗原基因一起插入鳥痘病毒中，從而只用一種疫苗就能同時賦予針對新城疫、球蟲病和鳥痘的免疫。
施用本發(fā)明的活性載體疫苗時，可以采用本領域內公知的多種方法。例如，可以采用對家禽進行抗鳥痘病毒接種時常用的“刺份”法。此方法包括，用一個浸過疫苗的尖針刺進翅膀的皮膚內。該針通常象縫紉機針一樣在針尖附近有一個眼，這個眼能帶上一滴疫苗。此外，也可將活疫苗皮下或皮內注射到翅膀或其它任何部位中。
重組活性載體疫苗還可以加到飲用水中，甚至可以噴到所要接種的雞身上。這些疫苗還可在飼料中施用，最好在保護性封裝后施用(Balancou et al，Nature 322373，1986)；或者在卵中施用。在后一種方法中，將病毒疫苗直接注射到雞胚中(Sharma，Avian Dis.251155，1985)。
實施例除非特別說明，下面給出的固體混合物中的固體、液體中的液體以及液體中的固體的百分比分別以wt/wt、vol/vol、wt/vol計。
1.抗艾美球蟲抗原的單克隆抗體的制備1.1、寄生蟲的制備利用標準方法，將禽艾美球蟲、堆型艾美球蟲、波氏艾美球蟲、百型艾美球蟲的子孢子從生成孢子的卵束中分離出。簡要地說，就是用蒸餾水和20％的漂白粉洗滌生成孢子的卵束，然后再用蒸餾水洗滌。將卵束在組織勻漿器中打碎，通過離心回收不溶物(包括孢子束)。將沉淀中的釋放出的孢子束和其它物質再懸浮于含有0.25％胰酶和雞膽汁的Hank氏鹽溶液(pH8)中，在40℃保溫2小時。通過用含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640介質洗滌兩次，然后用PBS在pH7.4下洗滌兩次而除去提取溶液。
然后將子孢子在metrazimide梯度上進行純化[Wisher et al.，Parasitiology 88515(1984)]。簡要地說，就是將子孢子再懸浮于2ml PBS(pH7.0)中，然后將1ml懸浮液鋪在15ml metrazimide梯度上，該梯度的構成為12％、18％和24％的metrazimide(在PBS中，pH7.0)各5ml。通過在900×g下離心40分鐘而沉淀子孢子。通過沿著試管壁插入一21號針頭并將子孢子吸入針管而將純化的子孢子從18％和24％metrazimide之間的介面中分離出。
將純化的子孢子用PBS(pH7.0)洗滌3次，并馬上用于免疫接種、感染試驗、125I的表面標記，免疫熒光分析成SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[Laemmli，Natune 227680(1970)]以及Western吸印實驗。
禽艾美球蟲的裂殖子的分離如下面的6.2.3部分所述。將純化的裂殖子用于免疫接種，并用Laemmli樣品緩沖液溶解后用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western吸印實驗。
1.2、免疫接種按下列日程，將8只雌性Bal b/c小鼠(Charles River，Wilmington，Mass.)用純化的活的子孢子免疫。
第1天1×107個子孢子靜脈注射(i、v)第7天6×106個子孢子腹膜內注射(i.p.)第85天 6×106個子孢子i、p第120天 3×107個子孢子i、p第244天 融合前加強免疫接種第1天5×106個子孢子i.v.，5×106個子孢子i.p.
第2天同第1天第5天超免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合利用下列方法將每一只小鼠的血清都進行抗子孢子抗體的測試用純化的子孢子蛋白進行ELISA檢測、用溶解的子孢子蛋白進行Western吸印檢測、用125I標記的子孢子表面蛋白進行免疫沉淀分析、用純化的子孢子進行免疫熒光檢測。選擇具有最高子孢子抗體反應活性的小鼠(小鼠107-2)進行融合前加強免疫接種(見圖1該抗血清的ELISA分析)。第5天時，將小鼠殺死，取出脾臟用于制備脾細胞。
1.3、細胞培養(yǎng)和細胞融合在融合前兩天，在完全培養(yǎng)基[Iscove氏修改的Dulbecco氏培養(yǎng)基(IMDM、Gibco)，加有10％FBS、谷氨酰胺(2.0mm)、以及2-巰基乙醇(100μM)]加上HAT(100μM次黃嘌呤、0.4μM氨基蝶呤和16μM胸苷)中，從幼年小鼠中制備脾細胞喂養(yǎng)細胞。利用修改的dest.Grofh等人的方法[J、Immunol.Methods 35∶1(1980)]，將108個脾細胞與108個PAI-O小鼠骨髓瘤細胞融合。任何其它適于制備雜交瘤的骨髓瘤細胞都可利用。許多這類骨髓瘤細胞對本領域專業(yè)人員來說是已知的和可得的。
將這些細胞混合，離心沉淀并且在恒定的輕輕攪拌下，在37℃下1分鐘內再懸浮于1.0ml含35％(vol/vol)聚乙二醇的IMDM中。在37℃下保溫3分鐘后，再次沉淀細胞，并再輕輕懸浮于10ml IMDN+HAT中。然后，在完全培養(yǎng)基+HAT中將細胞稀釋到1×106個細胞/ml，并將其分散到含有5×105個脾細胞喂養(yǎng)細胞/ml完全培養(yǎng)基的24孔微量滴定板上。
利用下列方法對雜交瘤上清液進行抗子孢子抗體分析用純化的子孢子進行ELISA分析、用子孢子蛋白進行Western吸印分析、利用125I標記的子孢子表面蛋白進行免疫沉淀分析、用純化的子孢子和用子孢子感染的細胞進行免疫熒光測定。通過有限稀釋將雜交瘤克隆。
1.4、子孢子的ELISA分析將純化的子孢子(4×104)加到96孔U型底PVC平板的每一個小孔中，這些小孔中事先已加入含1％BSA的PBS(pH7.0)。通過在1000×g下離心5分鐘，使子孢子沉入孔底。將子孢子再懸浮于100μl稀釋的抗血清或雜交瘤上清液中，并在室溫下恒定攪拌保溫2小時，然后用含1％BSA的PBS(pH7.0)洗滌子孢子，以除去未結合的抗體。
為了檢測結合到子孢子上的特異抗體，將100μl過氧化物酶結合的山羊抗小鼠IgG加入再懸浮的子孢子中，并將懸浮液在室溫下保溫2小時。洗滌子孢子，加入底物溶液(含有0.4％mg/ml鄰苯二胺的0.1M檸檬酸緩沖液，pH4.5，0.12％過氧化氫)，在室溫下保溫30分鐘，即可看見結合的抗體。通過加入含有50mM偏亞硫酸氫鈉的2.5M H2SO4而終止反應。結合的抗體量通過有色底物的OD488讀數而確定。
在總共480個加有融合細胞的小孔中，有432個對雜交瘤生長呈現出陽性。其中，在初級子孢子ELISA測定中，358個雜交瘤對抗體產生呈現出陽性。在這些原始親本雜交瘤細胞的增殖和傳代過程中，有104個死亡或停止產生抗體，因此在隨后的用子孢子ELISA和Western吸印分析進行的篩選中呈現陰性。子孢子ELISA鑒定出205個雜交瘤細胞系可產生10倍于背景水平的抗體。
1.5、子孢子蛋白的Western吸印分析將純化的子孢子(約5×107個子孢子/ml/凝膠)溶于Laemmli樣品緩沖液中，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[或在12.5％的凝膠中，或在7.5-20％梯度凝膠(Laemmli，同上)中]進行分離，并電泳轉移至硝酸纖維素膜上。將纖維素膜在3％明膠緩沖液(3％明膠、Tris-Hcl，pH7.5、0.15MNacl)中封閉，并切成小條，再將小條在1％BSA緩沖液(1％BSA、50mM磷酸鈉，pH6.5、0.5MNacl、0.05％Tween-20)中4℃下與稀釋的抗血清或雜交瘤上清液反應12小時。在PBS(pH7.4，0.05％Tween-20)中洗滌小條，并用過氧化物酶結合的抗小鼠抗體檢測特異性結合的抗體。通過加入底物溶液[4-氯-1-萘酚(30mg溶于10ml冰冷的甲醇和50mlTris-Hcl，pH7.5中)、0。15M Nacl、終濃度為0.015％的H2O2]，在室溫下保溫30分鐘，即可看見結合抗體。反應通過用蒸瘤水充分洗滌而終止。
在子孢子ELISA分析中呈現陽性的那些抗體中，有160個抗體在利用溶解出的子孢子蛋白進行的Western吸印分析中，也呈現陽性。
Western吸印分析(見圖2)表明單克隆抗體的反應方式有以下三種(a)與單個的艾美球蟲蛋白結合(例如，11A1和11D1)，(b)與2個或3個蛋白結合(例如，6A5和20C6)，(c)與多個蛋白結合(例如，11A5、13A6、和14B5)。
利用禽艾美球蟲殖子和堆型艾美球蟲蛋白進行Western吸印分析(圖3)，進一步鑒定抗體的特征。一些抗體，包括3A5、13A6、7D1和20C6，可識別從禽艾美球蟲和堆型艾美球蟲的子孢子和禽艾美球蟲的裂殖子中分離出來的蛋白。另一些抗體如6A5，表現出種和階段的特異性，只結合禽艾美球蟲子孢子蛋白。
從一些抗體得到的結果概括于表1，其中抗體的特異性以兩種方式表示(a)凝膠中被抗體結合的蛋白的來源和大小，(b)被抗體沉淀的125I標記的禽艾美球蟲蛋白的大小(右欄)。表中還以同型物進一步給出了抗體的特征。
表1Western吸印分析艾美球蟲蛋白(以kd表示凝膠中大小)被沉淀的抗體同型物 禽 堆型百型 蛋白的大小SpzMrz Spz Spz (kd)7B2 G2a＞200 - - - -7D4 G1120120 120 - 1107D1 G1120120 120 N.D.11020C6 G1120120 120 N.D.1103A5 M 120120 120 17 12019D6 G3180180- - 1208A2 G2a37 37 - - 376A5 G2b28/26 - - - 2514B5 N.D. ＞150N.D. N.D.15B3 N.D. ＞150N.D. N.D.14B1 G36 6 - - 24/1712B2 G328/26 - - - 24/1715A3 G128/6- - - 17/15/615C4 M 28/26 - - - 105/15/612C3 G328 - N.D.N.D. 255B6 G3- N.D. 63C4 M m m m - 7016D2 M m m m - 70/8513A6 M m m m - 11011B6 G3m m m - 10512A3 G3m m m - 24/1712D4 G1m N.D. N.D.Spz和Mrz分別為子孢子和裂殖子的縮寫。G和M分別代表IgG和IgM。m表示抗體與多個蛋白結合，蛋白大小為24到大于200kd。N.D表示的值未確定。
1.6、125I標記的子孢子表面蛋白的免疫沉淀反應利用IODOGEN方法(Pierce化學公司)或利用IODOBEADS(Pierce化學公司)，將純化的子孢子表面蛋白用125I標記。對后一種方法而言，將4IODOBEADS用0.2M磷酸鈉(pH7.5)洗滌3次，加入1～3mCi的125I～Na，室溫下保溫5分鐘。向反應瓶中加入200μl含有純化子孢子(3×108)的PBS(pH7.0)，繼續(xù)保溫15分鐘。保溫結束時，加入苯甲磺酰氟(PMSF)至終濃度為0.5mM。
在12,000Xg下離心30秒，回收保溫混合物中的子孢子，并溶解于1ml含有2％十二烷基硫酸鈉(SDS)或1％Triton X-100的PBS(pH7.0)中。在12,000Xg下離心3分鐘而除去不溶物。利用截止分子量為3,500的濾膜，將溶解的子孢子蛋白在4℃下對3升PBS(pH7.0)透析以除去殘余的游離125I。使用前，將125I標記的子孢子蛋白(典型的是將1.5×108cpm摻入蛋白)在4℃下貯存。可被TDA沉淀的放射性一般超過總放射性的95％。125I標記的子孢子蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析示于圖4的左圖。
通過向250μl含有125I標記的子孢子蛋白(1×105cpm)的緩沖液I(0.25％NP-40，10mM Tris-HCL，pH7.5，0.15MNaCl.)中加入300μl雜交瘤上清液或稀釋的抗血清，而進行免疫沉淀反應。在4℃下保溫16小時后，加入100-200μl50％的偶聯到瓊脂糖(Sigma化學公司)上的山羊抗小鼠IgG懸浮液。將混合物在一旋轉混合器上室溫下保溫2小時。通過在12,000Xg下離心1分鐘而沉淀瓊脂糖珠，并用洗滌緩沖液(0.1％SDS、0.5％NP-40、0.2％脫氧膽酸鈉、10mM PMSF、10mM Tris-HCl、pH8.5、0.15M NaCl)洗滌3次。
通過加入60μl2×Laemmli樣品緩沖液并在95℃下加熱3分鐘而將結合在固相抗體上的125I標記的蛋白釋放和變性。通過在12.5％凝膠中進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳而分離免疫沉淀的125I標記的子孢子蛋白，并通過放射自顯影而觀察。
用免疫小鼠血清進行的免疫沉淀分析的結果示于圖4的右圖。在子孢子ELISA分析中表現陽性的那些雜交瘤抗體中，有74個在免疫沉淀分析中也表現為陽性。如圖5所示，雜交瘤抗體分成兩類，一類是僅沉淀單個蛋白(如3C4、6A5、7D4、8A2、11D2和20C6)，另一類是沉淀2個或更多個蛋白(如12B2、15A3、15C4和19D6)。
1.7、用純化的子孢子進行免疫熒光測定將PBS(pH7.0)中的子孢子(1×105)加到有8個小室的載玻片(LabTek)上，在37℃下空氣干燥12小時。用10％正常山羊血清于37℃下封閉載片2小時。向每個小室中加入稀釋的抗血清或雜交瘤上清液，并在室溫下保溫2小時。洗滌載玻片，加入若丹明結合的抗小鼠抗體(在PBS，pH7.0，0.3％Triton X-100中稀釋)，室溫下放置1小時。洗滌載玻片后，利用熒光觀察結合的抗體。
大多數抗體對空氣干燥的子孢子表面膜和/或折射體表現出特異的免疫熒光(圖6的圖A和B)。一些抗體在子孢子的頂端強列著色，而在其余的子孢子表面只輕度著色(圖6C)。代表性的空氣干燥的純化子孢子見于圖6A、B、C和D的左邊。純化的子孢子是完整的、長形的，表現出明顯的較大的后折射體(PRB)和較小的前折射體(ARB)。子孢子的頂端(A)與后折射體相對。在制備物中仍有完整孢子囊(圖B的左邊)和破碎的孢子束膜的輕度污染。
1.8、ELISA.Western吸印、免疫沉淀及免疫熒光分析結果的總結對55個單克隆抗體進行上述分析，其結果概括于表2。
表2單克隆抗體分析的概括WESTERN 吸印抗體禽艾美球蟲低量堆型艾美球蟲禽艾美球蟲 IFAe免疫沉淀fSpz.aSpz.bSpz.cMz.d3C4 M1- 60-8011B6 M1+++ 1，2，410512A5 M1---1 -14D4 M1+++ 1，3，46615B6 M11，4，720-2417A5 M1++1 150/8318B6 M1+++-
l9C6 M1+++ 1，2 25/2020A2 M1+++5 66/6020B4 M1+++ 1，4 86/6011C4 M2+- 1，6 -12A3 M2--- 1，4，722/2413A6 M2+++ 1，5 11014B6 M21，4，7105-12014Dl M2- 1209B2 M3+++5 66/4512B1 M3+--6 26-2814C6 M3---10515C4 M3+--6 105L6D2 M3- 60-8020C3 M3+++3 14-173A5 120 +++3 -6A4 120 - -7D1 120++ 1，2，41107D4 120++ 5，1 11010A6 120 +-- 1，2，610511D2 120 --- 4，1，210514A1 120 --- 6，1 11017B6 120 --- l，6，712017C6 120-- 8，1 10519D6 120 +--3 12020C6 120 +++ 1，2 110
表2(續(xù))單克隆抗體分析的概括Wesstern吸 印抗體 禽艾美球蟲 低量 堆型艾美球蟲 禽艾美球蟲免疫沉淀fSpz.aSpz.bSpz.cMz.dIFAe10A5＞150- - 7.5 10511A6＞150 - - - 3-7B2 ＞200 + -＞20011B1＞150，200 - - - 1，7，6 2711D4120/24 + - - 12711D6120/24 + - - 2-12C3120/24 + - - 1，8，2 2515B2120/24 + + + 3-15A390/10-14 + - - 1，6 28/14-1714C360 - - - 1，4 614A5120/6 - - - 1，3，6 68A2 37 + + - 1，4 376A5 28，10-14 + - - 1，6 25-2811A124 + - - 1，6 -11C124 + - - --12B224 + - - 1，5 24/12012C624 + - - --16B124 + - - 1，4 6/14-1718D524 + - - 1，6 48/25/620C424 1，3 5/14-1714B1＜6+ - - 1，6 20-2410A2- - 1，2，4 6/1055B6 - 1，6 6/17/15a、所給出的值為Western吸印分析中被抗體識別的禽艾美球蟲子孢子(Spz)蛋白的分子量或分子量為40-150kd(M1)、120和80-150kd(M2)以及25和40-150kd(M3)的各組被識別蛋白的分子量。
b、用禽艾美球蟲子孢子蛋白常量的1/5進行Western吸印分析。因而，顯示陽性反應的抗體具有更高的親和性。
c、Western吸印反應活性以對堆型艾美球蟲子孢子(Spz)蛋白的活性表示。
d、Western吸印反應活性以對禽艾美球蟲裂殖子(Mz)蛋白的活性表示。
e、對空氣干燥的禽艾美球蟲子孢子進行間接檢測而得到的免疫熒光檢測(IFA)染色圖型總結為以下部位的染色(1)表面，(2)頂端，(3)不完整表面，(4)明亮表面，(5)亮表面，(6)擴散表面，(7)折射體，(8)點狀染色。
f、給出的是在免疫沉淀(Immunoppt.)測定中被抗體捕獲的125I標記的禽艾美球蟲子孢子蛋白的分子量。
優(yōu)選的單克隆抗體7D4、7D1、20C6、8A2、6A5和7B2已經按照《布達佩斯條約》的有關條款，以分泌這些單克隆抗體的雜交瘤細胞形式保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland，U.S.A.)指定的登記號分別為HB9707、HB9708、HB9709、HB9710、HB9711和HB9712。
1.9、體外感染測定按Doran等人的方法(Doran等人，J.Protozool.25544，1978)建立初生雞腎上皮細胞，并在四室的Lab-Tek載玻片上培養(yǎng)到40～50％匯合。也可用MDBK(Madin-Darby牛腎)細胞(ATTC-CCL22)代替雞腎上皮細胞。
用50,000個或200,000個純化的子孢子接種細胞。感染16小時后，將細胞單層洗滌幾次，以除去未進入細胞的所有子孢子。在感染后3、16、24、48、64、96和120小時時，分別用100％的甲醇固定有代表性的接種細胞培養(yǎng)物(室溫下5分鐘)。將固定后的載玻片于4℃下貯存于含1％BSA的PBS(pH7.0)中，直到進行上述的免疫熒光測定前進行處理。用各種抗體得到的染色結果示于圖7。
感染后的3-24小時之間，固定的培養(yǎng)物顯示了細胞內的子孢子(圖7，3小時時的7D4，19小時時的8A2)。后來，子孢子解體，只剩下折射體(7D4，60小時)。細胞內子孢子的表面和頂端被抗體7D4明亮染色(圖7，7D4，3小時)，但該抗體不染色感染細胞。
24小時后，子孢子開始解體并發(fā)育或裂殖體，裂殖體在隨后的48小時內成熟?？贵w7D4繼續(xù)與解體的子孢子反應，但不與未成熟的裂殖體反應(圖7，7D4，60小時)。但隨著裂殖體成熟，7D4開始與裂殖體內的結構反應(圖7，7D4，100小時)。這些結構為發(fā)育中的裂殖子，抗體7D4繼續(xù)與釋放出的成熟裂殖子的表面抗原反應。(圖7，7D4，120小時)。
因此，7D4鑒定出一個120kd的膜抗原，它存在于禽艾美球蟲子孢子和裂殖子的表面。該抗原在寄生蟲發(fā)育的裂殖體階段不表達，直到在裂殖體中發(fā)育出未成熟的裂殖子。
抗體14B1的反應方式與抗體7D4相同，即對細胞內子孢子的表面和頂端染色(圖8，14B1，16小時)，并擴散染色細胞內子孢子附近的細胞質。被14B1識別的抗體存在于成熟裂殖體中的未成熟裂殖子的頂端(圖8，14B1，100小時)，和成熟的釋放的裂殖子的頂端(圖8，14B1、120小時)。抗體7D4和14B1呈現的染色圖型是相似的，但被這兩個抗體識別的蛋白的分子量相去甚遠，分別為120kd和6kd。
雖然抗體7D4和14B1與寄生蟲的大部分發(fā)育階段反應，但其它抗體只與細胞內子孢子的表面抗原(圖7，15A3)或折射體(圖7，7A2)反應，而不與寄生蟲的裂殖體或裂殖子階段反應。
通過感染測定，鑒定出兩個特殊的抗體8A2和19D6?？贵w8A2與一37kd蛋白反應，該蛋白存在于子孢子表面(圖7C，8A2，19小時)、發(fā)育中的裂殖體的所有階段(圖7C、8A2、120小時)，以及釋放的裂殖子表面(圖7C，8A2，120小時)。與被抗體7D4和14B1所識別的蛋白不同的是，37kd蛋白的合成貫穿于寄生蟲的細胞內發(fā)育中。
抗體19D6不僅與-180kd子孢子表面蛋白反應，還與子孢子感染細胞的細胞質中的一種蛋白反應(圖8，19D6，3小時)。被抗體19D6識別的細胞質蛋白可能是細胞感染后由子孢子排出的蛋白，因為該蛋白在未成熟裂殖體發(fā)育過程中消失，在成熟的裂殖體和釋放出的裂殖子中又出現。
得自用禽艾美球蟲感染后存活的小雞的血清抗體，以與抗體7D4相似的染色方式對細胞內子孢子的頂端和表面染色(圖8B，免疫雞血清，3小時)，但不染色細胞內子孢子的折射體。
用子孢子感染的雞腎細胞進行免疫熒光實驗，鑒定出這樣一些抗原(a)特異于子孢子(如，分別被抗體7B2和6A5識別的大于200kd的蛋白和28kd的蛋白)，(b)見于細胞內寄生蟲的所有階段(如，被8A2識別的37kd的蛋白)，(c)特異于子孢子和裂殖子，但不特異于裂殖體(如，分別被抗體7D4和14B1識別的120kd和6kd的蛋白)。1.10體外子孢子中和測定在一種修改的Schmatz等人的方法(J.Protozool.33109，1986)中，將MDBK細胞用胰酶處理，然后以7.5×104個細胞/ml的密度懸浮于加有1％FBS的最低必需培養(yǎng)基(Gibco)中。向微量滴定板(經組織培養(yǎng)處理，96孔)的每個小孔中加入1.5×104個細胞，于40℃下培養(yǎng)48小時。純化的子孢子或者在40℃下用抗體預處理1小時，或著在感染細胞單層前不處理。使用前，將抗體(組織培養(yǎng)上清液、腹水液或抗血清)對PBS(pH7.0)充分透析，在56℃下加熱30分鐘使之失活，并過濾滅菌。
感染后，立即向每個小井中加入[5，6]-3H-尿嘧啶，至終濃度的5μci/ml。感染19小時后，除去培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)物用PBS洗滌一次。用胰酶-EDTA在40℃下釋放細胞15分鐘，并用玻璃纖維濾膜收集。將濾膜干燥，置于閃爍液(READY-SOLV，New England Nuclear)中，對結合的放射性進行計數。通過摻入用未處理的子孢子感染的細胞中的放射性活性，與摻入用抗體處理的子孢子感染的細胞中的放射活性進行比較來確定抗體抑制子孢子穿入和/或發(fā)育的能力。
將子孢子也與對照抗體，緩沖液或拉沙里菌素(一種抑球蟲劑)一起預保溫。拉沙里菌素在MDBK細胞中完全阻斷子孢子的發(fā)育，大大地減少了3H-尿嘧啶的摻入。
結果示于圖9，可以看見抗體7D4(□)、8A2(○)和14B1(●)明顯地抑制了3H-尿嘧啶摻入感染的MDBK培養(yǎng)物?？贵w6A5(■)效果小些，但也表現出一定的抑制作用。在用緩沖液(△)和對照抗體(X)處理時，無抑制作用，而拉沙里菌素 幾乎產生完全的抑制。
2.cDNA表達文庫的梅建2.1、生成孢子的卵束的制備以50,000個禽艾美球蟲/雞進行口服接種，7天后，從3周齡的小雞(Hubbard Cross；Avian Services，Frenchtown，New Jersey，U.S.A)體內摘除盲腸，在勻漿器(Waring blander)中用蒸餾水研磨一分鐘。用蒸餾水將體積調至1升，加入胃蛋白酶(Sigma化學公司，St.Louis，Missouri，U.S.A)至3g/l。用濃Hcl將pH調至2.0，并將混合物在39℃下攪拌保溫2～3小時，或保溫至觀察到單個卵束的懸浮液。消化后，用10N NaOH將pH調至8.0，再加人3升蒸餾水。將混合物靜置過夜。然后除去上清液，用水洗滌沉淀，直至上清液清徹。通過在室溫下向蒸餾水懸浮液中吹入氣泡而使卵束生成孢子。24小時后終止孢子生成作用，進行RNA的制備。
2.2、生成孢子的卵束的mRNA的分離利用Maniatis等人(同上196頁)描述的胍鹽/氯化銫方法的修改方法制備總RNA。將卵束用PBS(0.15M Nacl、20mM磷酸鈉，pH7.9)洗滌，并通過小心渦流混合再懸浮于10ml溶液中(pH7.4)中，該溶液含有5M異硫氰酸胍，50mM Tris-Hcl、10mM EBTA、0.5％Sarkosyl(N-月桂酰肌氨酸鈉，Sigma化學公司)和0.1Mβ-巰基乙醇，溶液中最好加有5μl防泡劑A(Union Carbide，Danbury，Connecticut，U.S.A)或其它防泡劑。將細胞懸浮液勻漿，直到在顯微鏡下觀察到卵束已基本破裂。
通過低速離心除去不溶的細胞碎片，并將勻漿液分成4份，鋪在12ml聚碳酸酯離心管中的1.2ml 5.7MCsCL、0.1MEDTA(pH7.5)上。在15℃下，將離心管在Beckman SW 50.1轉子中以40,000rpm離心17小時。棄去上清液，將管壁干燥，將沉淀再懸浮于加有200μg/ml蛋白酶K(Boehringer-Mannheim)的1.25ml 10mM Tris-HCL、1mM EDTA、1％十二烷基硫酸鈉(pH7.5)中。在37℃下保溫30分鐘后，用苯酚提取溶液三次。將最終的水相中的RNA用乙醇沉淀3次，然后溶于1ml水中。
聚腺苷酸化[多聚(A)+]的制備，利用Maniatis等人(同上，197頁)的方法將約2mg總RNA通過一寡聚(dT)纖維素柱(Pharmacia FineChemicals)兩次而完成。將多聚(A)+RNA用乙醇沉淀兩次，并溶于200μl水中。由260nm處的光密度值算出，產生約26μg的產物。
2.3、裂殖子的制備以50,000個上述生成孢子的卵束/雞感染小雞，5天后，從50只感染小雞(3周齡，Hubbard Clss；Avian Services Frenehtown，NJ)的盲腸中收集禽艾美球蟲的裂殖子。將盲腸摘除，并在磁力攪拌器上用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)洗滌15分鐘。通過低速離心(50xg)部分地除去上皮細胞碎片，通過在4℃以2,000xg離心10分鐘而收集粗提的裂殖子。將沉淀再懸浮于溶解緩沖液(8.29g/l NH4CL、0.372g/l Na2DETA、1.0g/l KCO3，pH7.6)中，并在冰上保溫30分鐘。通過離心收集裂殖子，在PBS中洗滌一次，并在分液漏斗中通過一個含有1.0g紡制尼龍纖維(Scrub Nylon Fiber，Fenwall Laboratories，Deerfield，Illinois，U.S.A)的柱。如上所述離心收集裂殖子，并在干冰上冰凍以分離RNA或在二乙胺乙基纖維素(DEAE，Whatman DE52，Whatman，Clifton，NewJersey，U.S.A)上進一步純化以進行Western吸印分析。
為了在DEAE纖維素上進行純化，將大約1×109個裂殖子(在PBS中)加到10ml床體積的柱上，并用PBS洗脫。在頭100ml流出液中回收裂殖子，這些裂殖子基本上去除了紅血細胞和其它細胞碎片。
2.4、裂殖子mRNA的分離將含有1×109至1×1010個有機體的冰凍裂殖子沉淀融于10ml含有1mM二硫蘇糖醇(DTT)和300單位RNA酶抑制劑(Promega Biotec，Madison，Wisconsin，U.S.A)的TEL/SDS緩沖液(0.2M Tris-HCL，0.1MLicl，25mM EDTA，1％(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)，pH8.8)中，并在特氟龍包被的組織勻漿器中勻漿10～12次。通過在3,000xg下冷凍離心而分離不溶性碎片。用TEL緩沖液平衡的苯酚∶氯仿∶異戊醇(24∶24∶1，V/V)將上清液提取兩次。
將水相用100μg/ml蛋白酶K在37℃下消化30分鐘，再用等體積的苯酚∶氯仿(1∶1)提取，將核酸用兩倍體積的乙醇在干冰上沉淀1小時，或者在-20℃下沉淀過夜。在10,000g下離心1小時后，將沉淀再懸浮于TE(10mM Tris，pH7.5，2mMEDTA)中，并在15℃，150,000xg下離心通過4ml的CsCL層(5.7MCsCl，0.1M EDTA)。用2.5倍體積的乙醇將RNA沉淀從0.2M乙酸鉀中再沉淀。利用Maniatis所述的方法(同上，197頁)，將此總RNA通過寡聚(dT)纖維素一次。以富集多聚(A)+RNA。從5×109個裂殖子產生的1.9mg總RNA中一般含有約20μg多聚(A)+RNA。
2.5、卵束和裂殖子cDNA的合成及插入噬菌體載體利用Gubler等人(Gene25263，1983)所述的方法，由6μg生成孢子的卵束的多聚(A)+RNA合成雙鏈cDNA，利用反轉錄酶(BRL)延長寡聚(dT)引物，利用RNA酶H(BRL)和大腸桿菌DNA聚合酶I(New EnglandBiolabs)合成互補鏈。然后用T4DNA聚合酶(BRL)將雙鏈cDNA消化成平末端，根據廠商的方法，用EcoRI甲基化酶(New England Biolabs)處理后，加入EcoRI連接子(GGAATTCC，Collaborative Research)。
用EcoRI消化上面制備的cDNA之后，利用Huynh等人所述的方法(Huynh et al.，Approach，1985，IRL Press，Washington，D.C.，pp.49-78)，在λgt11(Stratagene Cloning Systems，San Diego，California，U.S.A)中制備一個文庫。根據廠商的方法，將EcoRIcDNA片段連接到EcoRI消化的脫磷酸化的γgt11臂(StratageneCloning Systems)上，并用Gigapack藥盒(Stratagene CloningSystems)將所得DNA包入噬菌體。
用所得文庫涂布Y1088宿主細胞(ATCC No.37195)進行擴增。從在異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，Sigma化學公司)存在下X-gal平板上蘭色噬菌斑與無色噬菌斑的比例，估計重組體的百分比約為90％。
裂殖子多聚(A)+RNA的雙鏈cDNA拷貝基本上按上述方法合成。通過在變性凝膠中的遷移率(Bailey et al.，Anal.Biochem.7075，1976)判斷出用于構建文庫的雙鏈cDNA含有約200到4,500個堿基對(bP)。
如上所述，將裂殖子cDNA甲基化，并連接到EcoRI連接子上，但用cCGAATTCGG連接子(Collaborative Research)。用EcoRI消化后，利用Huynh等人所述的方法(同上)將cDNA在Biogel A-50M柱上進行分級分離，以除去過量的連接子分子和小于約300bp的cDNA。
如上所述，將cDNA連到λgt11臂上，并將DNA包入噬菌體。用所得的含有約50,000個噬菌體的文庫涂布Y1088宿主細胞進行擴增。在IPTG存在下的X-gal平板上的噬菌斑分析，表明重組體約為90％。
3.cDNA文庫的免疫篩選以約10,000個噬菌斑/150mm平板的密度用λgt11裂殖子cDNA表達文庫涂布Y1090細胞(ATCC No.37197)。將六塊上述平板在42℃下培養(yǎng)3.5小時，用預先在10mM IPTG中浸泡過的硝酸纖維素濾膜覆蓋，以誘導β-半乳糖苷酶融合蛋白的表達，并在37℃下再培養(yǎng)4-5小時至過夜。從平板上取下濾膜，用TBS(20mM Tris，pH8.0，0.15M NaCl)分批洗滌幾次。通過在一旋轉搖床上于4℃下在含有20％胎牛血清(FCS)的TBS中保溫2-4小時，而阻斷非特異性蛋白結合位點。
收集含有已知可與裂殖子抗原反應的九個單克隆抗體(7D4、7D1、20C6、13A6、20C1、11B6、3A5、13A1和15B2)的腹水液，調至20％FCS、0.15M NaCl，終體積為100ml，再加到培養(yǎng)皿中的每塊濾膜上，(每個培養(yǎng)皿兩塊濾膜)。將濾膜在一旋轉搖床上4℃下用初級單克隆抗體庫保溫過夜。未結合的抗體通過在室溫下用TBS洗滌濾膜5-6次而除去。結合的抗體如Hawkes等人所述(Anal.Biochem.119142，1982)，通過下述方法檢測，即將濾膜與山羊抗小鼠辣根過氧化物酶(HPOD)結合物(Boehringer-Mannheim)保溫，然后利用3mg/ml4-氯-1-萘酚(BioRad)和0.018％H2O2顯色。
將最初高密度篩選中鑒定出的陽性噬菌斑利用同樣的單克隆抗體庫進行次級篩選，從而進行噬菌斑純化。將陽性斑涂布在許多方格陣中，每個陽性斑都用IPTG誘導，然后轉移到硝酸纖維素濾膜上，并用庫中的一個單克隆抗體與之保溫，這樣，每個陽性斑都被指定與庫中的一個單克隆抗體反應。鑒定出一個定名為λm2-4的陽性噬菌體，它被庫中8個抗體中的三個抗體(抗體7D1、7D4和20C6)識別。
用同樣的方法篩選生成孢子的卵束cDNA文庫，但用含有抗體6A5、7B2、15A3和20C6的單克隆抗體庫進行第一次篩選；用7B2、15A3、20C6和8A2進行第二次篩選；和15A3、7B2和20C6進行第三次篩選；并且在保溫緩沖液中還含有0.05％Tween-20[聚氧乙烯(20)山梨糖單月桂酸酯]。這樣，便從卵束cDNA文庫中鑒定出定名為λS1-3、λS1-4和λS1-7的噬菌斑、定名為λS2-1、λS2-4和λS2-5的噬菌斑以及定名為λS3-1的噬菌斑，它們分別由單克隆抗體6A5、8A2和7B2識別。由噬菌體得到的DNA產生可與6A5抗體反應的蛋白，將該DNA通過用EooRI消化以及在瓊脂糖凝膠中電泳而進行分析(Maniatis等人，同上，150頁)。于是發(fā)現三個不同的插入片段，其大小分別約為1150、890和615bp。
4.艾美球蟲基團在大腸桿菌中的表達分別從噬菌體λS1-7和λS1-3中分離1.1kb和0.9kb的EccRIDNA分子，并插入三個可變讀碼框表達載體(pEV-vrf1、pEV-vrf2和pEV-vrf3)每一個的EcoRI位點，這三個載體如Crowl等人所述方法(Gene 3831，1985)進行構建。利用Mandel等人[J.Mol.Biol.53159(1970)]所述的方法，將含有兩種可能取向的插入片段的質粒轉化入大腸桿菌MC1061菌株中，如Bernard等人所述[Methods inEnzymology 68482(1979)]，該菌株含有相容性質粒pRK248 cIts。MC1061菌株和質粒pRK248 cIts已保藏于美典型培養(yǎng)物保藏中心，指定的登記號分別為ATCC 33766和53338。
將細菌轉化體在含有0.5％葡萄糖和0.5％酪蛋白氨基酸的M9培養(yǎng)基(Maniatis等人，同上，68頁)中30℃下培養(yǎng)，并如Crowl等人所述，在O.D.(550mμ)為0.5時，將溫度升到42℃以誘導λPL啟動子的轉錄。保溫2-3小時后，取出1ml樣品，離心收集樣品中的細胞。如Crowl等人(同上)所述處理細胞沉淀，并如Laemmli所述[Nature227680(1970)]將溶菌物進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將凝膠中的蛋白或用考馬斯亮藍染色，或轉移到硝酸纖維素濾膜上進行Western吸印分析[Towbin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 764350(1979)；Burnetti，Anal.Biochem.112195(1981)]，利用6A5單克隆抗體和山羊抗小鼠HPOD結合物進行檢測。
上面的分析表明，在載體pEV-vrf1中一種取向的0.9kb cDNA分子產生能與6A5抗體反應的20kd蛋白。未觀察到1.1kb分子的表達，這可能是因為它含有5′非編碼順序。為了盡可能增加上述蛋白的產量，用各種表達介質進行觀察，發(fā)現優(yōu)選的表達介質為每升(±10％)含有6.0gKH2PO4，4.0gK2HPO45.0g(NH4)2SO4、3.5gMgSO4-7H2O，21.0g酵母提取液，3.5g細胞胰化胨、1.0ml LB625防泡劑。25g葡萄糖。70mg硫胺素-HCL。2.5ml維生素溶液[GIBCO MEM(100X)維生素溶液]及1.0ml微量元素。LB625防泡劑是聯合碳化物公司的一種產品，它是乙烯和聚環(huán)氧丙烯的線性聚合物，它在37.8℃下的粘度為625賽氏通用粘度秒。
每升發(fā)酵液中所含的維生素包括D-泛酸鈣。氯化膽堿、葉酸、煙酰胺、吡哆醛-HCL、和另加的硫胺素-HCL各0.25mg；0.50mg異肌醇；0.025mg核黃素。每升發(fā)酵液中所含的微量元素包括2.7mgFecl36H2O；ZnSO4-7H2O和CuSO4-5H2O各0.8mg；CoCL2-6H2O和Na2MoO4-2H2O各0.7mg；0.2mg H3BO3；以及0.5mg MnSO4-H2O。
首先在一種溶素原中研究噬菌體λm2-4所表達的有免疫活性的蛋白的本質，該溶素原是從感染的Y1090細胞通過在允許溫度(30℃)和不允許溫度(42℃)下進行差級生長而分離出來的。為了對該溶素原合成的蛋白進行Western吸印分析，將50ml培養(yǎng)物在LB培養(yǎng)基[Maniatis等人，同上，69頁]中30℃下培養(yǎng)，直到O.D.(550mμ)為0.5小時，將溫度升至42℃，以誘導噬菌體的復制。在42℃下保溫15分鐘后，加入IPTG到10mM，繼續(xù)在37℃下保溫30分鐘。在4℃下離心收集細胞，并通過在Laemmli樣品緩沖液(0.125M Tris，pH6.8，1％(w/v)，SDS，14M-巰基乙醇，0.01％澳酚蘭(W/V)20％(V/V)甘油)中煮沸5分鐘而使細胞溶解。
通過在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，使相當于1.0ml的培養(yǎng)物分離，然后電泳轉移到硝酸纖維素濾膜上，如上所述用鑒定λm2-4噬菌體的三個單克隆抗體(7D1、7D4和20C6)的抗體庫進行探測。Western印跡的顯色揭示出一個大于150kd的融合蛋白，它存在于誘導出的溶素原中(圖10B，第2泳道)將異于β-半乳糖苷酶的抗體也與這個高分子量的蛋白反應，并且與一個大約為114kd的蛋白反應，這是預期的β-半乳糖苷酶的大小(見圖10A，第2泳道)。
用EcoRI消化噬菌體λm2-4，產生一個1.7kb的DNA分子。將此分子亞克隆入一個經EcoRI線性化的含有質粒pEV-VRF1、2和3的質粒庫(Crowl等人，同上)中，并如上所述，轉化入含有質粒pRK248cIts的大腸桿菌MC1061菌株中。利用在λm2-4溶素原中可與融合蛋白反應的三個單克隆抗體，篩選可在溫度誘導時表達有免疫活性蛋白的轉化體。利用庫中三個單克隆抗體之一的7D4，通過對大腸桿菌溶解物的Western吸印分析，進一步鑒定有免疫活性的重組蛋白的特征。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析測定，每發(fā)現一個陽性克隆都含有帶有預期的1.7kb插入片段的質粒DNA，并且一經誘導便可指導合成大約65kd的蛋白。
發(fā)現該65kd的蛋白的表達，對生長介質和誘導方法的變化較不敏感。在細胞沉淀的超聲波破碎后，定量回收上清液中的該蛋白。
將含有1.7kb插入片段的表達質粒用于后續(xù)的制備重組蛋白步驟，該質粒圖示于圖11。將該質粒在對λcI857具有溶原性的MC1061宿主細胞中30℃下進行增殖(利用Arber等人所述的產生入噬菌體溶素原的標準方法制備宿主細胞(Arber et al.，in Cold Spring HarborMonograph，Lambda II，1983，Hendrix et al.，Eds.，Cold SpringHarbor Laboratories，Cold Spring Harbor，P.450)，以保持質粒中的PL啟動子處于阻遏狀態(tài)。
利用同樣的方法，表達28kd的蛋白，它是由約1.1kb的生成孢子的卵束cDNA片段所編碼的。該蛋白特異性地與單克隆抗體8A2結合。同樣進行了45kd蛋白的表達，它是由約1.2kb的生成孢子的卵束cDNA編碼的。該蛋白特異性地與單克隆抗體7B2結合。
5、DNA順序分析一般利用Birnboim等人(Nucleic Acids Research 71513，1979)的方法，從1ml飽和的過夜培養(yǎng)物中小規(guī)模地分離質粒DNA。該方法可以從細菌菌落中分離少量的DNA，用于分析。較大量的質粒DNA的制備，根據標準方案，利用1升培養(yǎng)物進行氯化銫離心(Maniatis等人，同上，93頁)。
利用Maxam等人的化學斷裂法(Methods in Enzymology 65499，1980)和Sanger等人的鏈終止法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463，1977)，以及Smith等人(Cell 16753，1979)和Wallace等人(Gene1621，1981)對雙鏈質粒DNA修改的方法，測定得自形成孢子卵束的基因文庫的cDNA的DNA順序。在鏈終止法中，用7-脫氮-dGTP(Barr etal，Bio Techniques 4428，1986)代替dGTP，以消除G-C擠壓現象。
為了便于順序分析，將得自λS1-7的1.1kb EcoRI分子轉入質粒DEV3-SEQ(圖12)，該質粒在DEV-vrf3的EcoRI位點旁有一個多連接子。用該多連接子使質粒在BamHI和KpnI位點線性化，以便用核酸外切酶III產生單向缺失(Henikoff，Gene 28351，1984)。用多連接子的XbaI位點進行3′-末端標記，以對缺失產物進行Maxam-Gilbert測序，用引物CGGTCGACTCGAGCCA進行Sanger測序。如Maniatis等人所述(同上，122頁)，利用[γ-32P]ATP(ICN)和多核苷酸激酶標記引物的5′端。
圖13顯示了用于Maxam-Gilbert測序的1.1kb EcoRI分子中的限制位點。也顯示了0.9kb分子中的EcoRI位點的位置，因為也用了這些位點。還顯示了核酸外切酶III造成的缺失的端點。進行這些測序時或是利用Maxam-Gilbert方法從pEV3-SEQ多連接子的XbaI位點開始，或者利用Sanger法，用一引物延伸而進行(圖12)。將整個cDNA的兩條鏈利用上述的一種或二種方法同時進行測序。由于DNA中G-C含量高，Maxam-Gilbert反應物通常在8％和15％的聚丙烯酰胺—脲凝膠中進行分級分離。
引物的延伸通過下述方法進行將1.5μg多聚(A)+RNA在一緩沖液中與2微微摩爾5′端標記的合成寡核苷酸引物GAGGTCTGCCATTTTGC在42℃下保溫60分鐘，所述緩沖液為50mM Tris-HCL(pH8.0)8mM MgSO4、0.1M NaCl、2mM二硫蘇糖醇、每種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP，PharmaciaFine Chemicals)各2mM、20單位RNA酶抑制劑(Promega BiotecMadison，WI)和20單位AMV逆轉錄酶(Pharmacia，Piscataway，NJ，FPLC純)。將所得產物在用于順序分析的8％聚丙烯酰胺—脲凝膠中進行分析，用32P-標記的經HpaII消化的pBR322 DNA作為分子量標記。
為了進行順序分析，從凝膠上洗脫初級產物，并利用Maxam等人的化學斷裂法(同上)進行分析，或將ddNTP用于延伸反應(Tolan etal.，J.Biol.Chem.2591127，1984；Graves et al.，J.Biol.Chem.26111409，1986)。反應物在8％的聚丙烯酰胺-脲凝膠中進行分析。
1.1kb cDNA分子的核苷酸順序示于圖14。在這個較大的分子中，0.9kb分子的順序從堿基188延伸至堿基1082。由該核苷酸順序的開放讀碼分析推測的氨基酸順序示于圖15。圖15所示的推測氨基酸順序的正確性證實如下。
制備其氨基酸順序相應于圖15中41-54和145-164殘基的合成多肽。將針對這兩種多肽而制備的免抗血清用于子孢子總蛋白和表達0.9kbcDNA的大腸桿菌轉化體之溶解物的Western吸印分析。在這兩個Western吸印分析中，針對兩個多肽的抗體都與蛋白結合。
利用同樣的方法，測定噬菌體λm2-4中編碼65kd蛋白的1.7kb插入片段的核苷酸順序，其結果示于圖16。所推測的由該DNA頁序編碼的蛋白的氨基酸順序示于圖17。如下所述，通過對所表達的65kd蛋白進行胰酶消化而產生的多肽進行氨基酸順序分析而證實上述順序。
奇怪的是，預期1.7kb分子的DNA順序開放讀碼編碼一個約33,349道爾頓的蛋白。然而，該DNA片段的表達產物在SDS凝膠中遷移的表觀分子量約為65kd。預期的和所觀察的蛋白分子量之間的差別的原因還不清楚。該蛋白在此稱為“65kd”蛋白。
以同樣的方式，測定編碼由單克隆抗體8A2識別的28kd蛋白的cDNA分子的核苷酸順序和推測的氨基酸順序，結果分別示于圖18和19。
同樣測定1.2kb7B2 cDNA的核苷酸順序和推測的氨基酸順序。因為發(fā)現了一個連續(xù)的開放讀碼，并且通過免疫沉淀從子孢子中分離出的蛋白大于200kd，所以利用1.2kb cDNA作為探針篩選基因文庫，以選擇更大的cDNA。于是得到一3.2kb的cDNA，其核苷酸順序和所推測的氨基酸順序分別示于圖20和21。
6、65kd蛋白的純化與特征鑒定6.1、蛋白純化在10升的發(fā)酵罐中，將含有pEV/2-4表達質粒的大腸桿菌MC1061(pRK248cIts)在1.5XM-9培養(yǎng)基中進行高細胞密度發(fā)酵，在允許溫度下生長約4小時后，如上所述，利用溫度誘導的標準方法進行發(fā)酵。誘導5小時后收集細胞群，得到500克細胞沉淀。
將50克大腸桿菌細胞沉淀均勻地懸浮于500ml 10mM Tris-HCL(pH8.0)、5mM EDTA中，并在2-8℃下攪拌2小時。將懸浮液在7000磅/平方英寸下通過Gaulin勻漿器(APV Gaulin，Everett，Massachusetts，U.S.A)兩至三次。將細胞溶解物在Sorvall RC-5離心機中24,000xg下離心1小時，棄去沉淀。向上清液中加入固體硫酸銨終濃度為80％。在4℃下靜置2小時在24000xg下離心1小時將沉淀溶于20mM磷酸鉀(pH68)中，離心后將上清液以20mM磷酸鉀(pH6.8)透析。
將一Pharmacia出品的玻璃柱(5cm直徑×10cm長度)裝上NuGelP-DE200(200埃，40-60μm，弱陰離子交換，SeparationIndustries，Metuchen，N3)硅膠載體。用20mM磷酸鉀(pH6.8)平衡凝膠。上樣(10ml/分)，用平衡緩沖液洗滌，用含有0.4M Nacl(pH6.8)的20mM磷酸鉀洗脫。柱級分用抗體7D4進行Western吸印分析而檢測65kd蛋白。
用免疫親和柱進一步純化65kd蛋白。該柱所用的吸附劑通過在將單克隆抗體7D4固定在NuGel ρ-聚醛(500埃，40-60μm，Separation Indust ries，Metuchen，New Jersey，U.S.A硅膠載體上而制備。固定方法如下將10克聚醛載體懸浮，并用0.1M磷酸鉀、0.1M NaCl(pH6.8)洗滌，然后定量移入錐形瓶中，該瓶中含有20ml蛋白濃度為8mg/ml的單克隆抗體7D4。然后向懸浮液中加入氰氫硼化鈉(4mg)。在4℃下輕輕震蕩混合物16小時。將凝膠過濾，并用0.1M磷酸鉀、0.1M NaCl(pH6.8)洗滌。檢查合并的濾液中未結合的抗體。結合密度為8mg/g載體。未偶聯的活化位點通過將凝膠懸浮于20ml 1M乙醇胺(pH7.5)中而阻斷。向懸浮液中加入氰氫硼化鈉(4mg)，然后在4℃下攪拌16小時。收集凝膠，并用冷的偶聯緩沖液徹底洗滌。
為了進行免疫親和層析，用固定的7D4抗體裝柱(1cm×10cm)，并用含有0.1％Triton x-100的冷的砱酸緩沖鹽(PBS)平衡。從NuGelP-DE200柱上洗下的含有65kd蛋白的級份的合并物，用含有0.1％Triton X-100的PBS稀釋兩倍，并上樣到一個流速為10ml/分的柱上。上樣后，用PBS洗滌凝膠，以除去未吸附的物質。吸附的免疫活性物質用0.3M乙酸、0.1M NaCl緩沖液(pH2.7)洗脫。然后利用YM10膜(Amicon，Div.W.R、Grace & Co、Danvers，Massachusetts，U.S.A)在Amicon Stircell裝置中濃縮蛋白。
如Laemmli所述(Nature 227680，1970)。利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白的純度。凝膠用考馬斯亮藍染色。還利用7D4單克隆抗體與山羊抗小鼠辣根過氧化物酶的結合物，進行Western吸印分析。結果示于圖22。泳道2、3、4和5含有從兩種制備物中純化出的蛋白。泳道1和6含有分子量標記蛋白的混合物，其分子量示于圖的左邊和右邊。每個泳道中加10μg蛋白進行電泳。
在圖22中可以看見，純化的蛋白在SDS凝膠中以一個表觀分子量約為65kd的主要條帶而遷移，次要條帶的移動比較高或較低。
6.2、等電點的測定將10μg純化的65kd蛋白在預制的等電聚焦凝膠(得自LKBInsfruments，Gaifhersburg，Mart，yland，U.S.A)中進行等電聚焦。將已知等電點的標準蛋白的混合物同時進行電泳。按照廠商的說明，利用3.5-9.5pH梯度，在50mA、1,500V下電泳約2小時。
等電聚焦完成后，用考馬斯亮藍染料染色凝膠，檢測蛋白帶。然后，通過測量pH梯度中條帶的位置與標準蛋白的位置進行比較，確定純化蛋白的等電點。由此測出的蛋白等電點為4.6。
6.3、氨基酸組成分析如Pan等人所述(Methods of Protein Microcharacterization，1986，Shively，ed，The Humana Press，pp.105-119)，利用與熒光胺的柱后反應進行氨基酸組成分析。將含有3μg 65kd蛋白的樣品在含有4％巰基乙酸的6N HCL中于110℃下真空水解20-40小時，將10％的水解產物用于分析。過甲酸氧化后，測定半胱氨酸值。結果示于表3。
表365kd蛋白的氨基酸組成分析氨基酸摩爾百分比Asp6.06Thr6.07Ser7.27Glu18.24Pro5.35Gly16.76Ala11.71Cys4.45Val4.88Met2.08Ile2.17Leu3.22Tyr2.20Phe2.13His1.07Lys2.72Arg3.61TrpNDND＝未確定6.4、N末端和C末端順序分析取200微微摩爾蛋白(通過氨基酸組成分析測定)，利用Hewick等人的方法(J.Biol.Chem.2567990，1981)和Applied Biosystems470A型測序儀(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，California，U.S.A)進行N末端分析。由此測得的N末端順序為M-N-K-N-S- -L-G-G-F- -S-M-Q-E-S-P-P-P-。用問號標明的位置上為何種氨基酸尚不確定，因為PTH-Cys的回收率低，并且半胱氨酸有可能參與形成二硫鍵(Hewick et al.，J.Biol.Chem.2567990，1981)。
如Hayashi所述(Meth.Enzymol.4784，1977)，通過羧肽酶Y的時程消化對1200微微摩爾的65kd蛋白進行C末端分析。羧肽酶Y(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)是溶解在0.05M乙酸鈉緩沖液(pH5.9)中，使用時濃度為0.8μg/350μl。在0、2、5、10、20和30分鐘后取等分試樣進行分析。將各等分樣品用鹽酸酸化以停止進一步的反應，然后如上述進行氨基酸分析。這一分析表明，C末端氨基酸順序可能是(Met，Trp)-Ala-Ser。觀察到色氨酸與甲硫氨酸同時增加，但Trp難以用熒光胺分析儀定量，因為它與熒光胺的反應性低。所以，Trp和Met的相對位置不能用這種分析方法確切地測定。
6.5、胰蛋白酶肽分析部分是為了確認由編碼65kd蛋白的cDNA核苷酸順序推測的氨基酸順序，取一些該蛋白用胰蛋白酶(Cooper Biomedical，Philadelphia，Pennsylvania，U.S.A.)消化，所得的肽如下述進行順序測定。
于37℃，在0.2M碳酸氫銨(pH8)中對148μg蛋白進行胰酶消化過夜，所采用的酶與底物的比例為1∶30(以重量或摩爾數計)。所產生的肽以Waters HPLC系統用Altex ultrasphere 250×4.6mm C-18柱(Beckman Instruments，Fullerton，CA)進行分離，用濃度逐漸升高(0-55％)的乙腈在0.1％(基礎)三氟乙酸中的溶液進行梯度洗脫。在進行HPLC分離前，將消化產物于37℃下用β-巰基乙醇還原30分鐘，以斷裂這些肽中所有的二硫鍵。用實驗室數據控制檢測儀(LaboratorgData Control，Rivera Beach，florida，U.S.A.)于215nm處監(jiān)測柱流出液。HPLC柱分辯出8個主峰，如圖23A所示。
首先如上所述對每個峰進行氨基酸分析，以測定這些肽的量和組成。然后用Applied Biosystems 470型氣相測序儀，通過自動Edman降解測定得自HPLC柱的大部分肽峰的順序。乙內酰苯硫脲(PTH)氨基酸衍生物的鑒定，是如Hawke等人(Anal.Biochem.120302(1982)所述用Waters HPLC系統并采用Altex ultrasphere C-18柱，或用Applied Biosystems 120型聯機PTH氨基酸分析儀進行的。
圖17在畫下線的區(qū)域下部，給出了上述肽中某些肽的氨基酸順序。每個肽的編號(相應于HPLC峰號)在相應的順序旁邊用畫圈的數字給出。在這些肽順序中不確定的某些殘基，在這些位置上用問號標明，但這些肽的氨基酸組成分析表明，在已推測出的順序的相應位置上標明的氨基酸存在于這些肽中。肽中的某些殘基不確定是由于色氨酸與熒光胺的反應性低。
相應于完整65kd蛋白N-末端的肽6，在N末端含有4個由表達質粒中的某些核苷酸編碼的殘基。對肽8進行分析得到的氨基酸順序與肽3相似，但沒有C末端的4個殘基，表明這可能是胰酶消化不完全的結果。肽5未進行順序測定，因為該肽的氨基酸組成分析表明，它與肽6相同，只是缺少N末端的頭3個氨基酸殘基。
如上所述對胰酶消化產物進行HPLC分析，但預先不用巰基乙醇還原，所得到的洗脫曲線中沒有峰4、7和8(圖23B)。這一結果提示，這些含半胱氨酸的肽在未還原的蛋白中可能參與了二硫鍵的形成。
7、家禽的免疫7.1、使用65kd抗原為了確定施用純化的重組65kd蛋白是否能夠預防小雞受生成孢子的禽美球蟲卵囊的侵襲，進行了一系列免疫實驗。在這些實驗中，取1日齡至3周齡的來航雞(Avian Services，Frenchtown，New Jersey，U.S.A.)，放在潔凈的房間里，由未曾接觸過其它家禽的飼養(yǎng)員來喂養(yǎng)，直到進行免疫時。將這些雞放在電熱育雛籠中，待它們長至3或4周齡后，再移入拉架籠內。
在整個實驗中，不限量供給未加藥的童子雞幼雛飼料和水。在用卵囊進行免疫時，把這些雞移到另一個建筑物中，并且一直到實驗結束都放在那里。免疫前，每周至少檢查動物臨床癥狀3次，免疫后則每天檢查一次。在雞長至3或4周齡，隨機分成各試驗組之前，用翅號分別給每只雞做上記號。
用各批如上所述免疫親和層析純化出的65kd蛋白作為免疫原。這幾批免疫原含有細菌內毒素活性，活性范圍為每μg蛋白約0.3至約50內毒素單位，這個活性按1985年第21次修訂版的《美國藥典》第1165-1167頁(United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockvill Md.)所述進行測定和定義、使用前將蛋白溶于0.02M K2HPO4緩沖液(pH6.8)中，用同樣的緩沖液根據需要進行稀釋。
用牛血清清蛋白(BSA，Pentex)作為對照。由于所用的免疫原中有熱原活性，所以在所有BSA對照中都加入了大致等量的熱原活性，以便將這種活性可能引起的任何非特異性效應考慮在內。這種熱原活性是以未轉化的大腸桿菌的溶菌產物的形式加到BSA中的，這種溶菌產物的制備方法是利用超聲處理破碎大腸桿菌，然后用0.45μ濾膜(Millipore)過濾該材料。
將稀釋的對照BSA或艾美球蟲抗原樣品與等體積的佐劑合并，用帶有18號針頭的玻璃注射器充分混合，然后再施用。分別用弗氏完全佐劑和不完全佐劑進行初次免疫和加強免疫。這兩種佐劑都得自GIBCO(Grand Island，New York，U.S.A.)。
在小雞長至4周齡時，在雞體后部的頸基部進行初次皮下免疫。有些雞還在6周齡時接受加強免疫。所注射物質的體積為約0.4至2.4ml。如果體積較大，則將此劑量分兩次注射。最后一次接種2或3周后，給小雞口服施用25,000或50,000個生成孢子的禽艾美球蟲卵囊。感染7天后，處死存活的小雞，解剖后對總損傷計分。對所有在實驗過程中死亡的雞也進行解剖。診斷后如下對腸損傷計分0＝正常；1＝輕度感染；2＝中度感染；3＝嚴重感染；4＝死亡。所得讀數總結為每組雞感染程度的平均值。在感染時和感7天后稱重這些雞。有些雞沒有用BSA或球蟲抗原接種，但也作為感染或未感染的未接種對照進行處理。
兩個這樣的實驗的結果示于表4。
表4用純化的重組65kd抗原接種一次或二次而對小雞進行皮下免疫的作用不同周齡的小雞編號處理a劑量(μg)損傷計分b增重/減重c(g)4周 6周實驗110IUC -- 2.8 -258 抗原 3.15 - 2.4 -4410抗原 12.25 - 2.5 -106 BSA 17.5 - 3.0 +4010UUC -- 0 +10710IUC -- 2.9 -408 抗原 3.15 1.6 2.0e -1510抗原 17.5 13.2 1.8e +58 BSA 12.2513.2 2.5 -1310UUC -- 0 +87實驗2a-IUC、抗原、BSA和UUC分別指(用卵囊)感染的未免疫對照、純化的65kd蛋白、牛血清清蛋白和未感染的未免疫對照。
b-在實驗1中，一次免疫3周后，用50,000個生成孢子的禽艾美球蟲卵囊對雞進行免疫；加強接種2周后，對這些雞用25,000個卵囊進行免疫。在實驗2中，卵囊免疫的時間相同，但對只接種一次和經過加強接種的雞都給予25,000個卵囊。每個實驗都保留感染的未免疫對照，在同樣的周齡時給予同樣數目的生成孢子的卵囊，7天后處死。結果以如上文所述的0-4計分表示。
c-所示數值為感染時體重與感染7天后體重之差。
d-這一組原有9只雞，但有一只在1周后死亡。
e-與IUC相比P≤0.05。
表4的數據表明，用65kd蛋白接種所產生的損傷計分，一般比感染但未免疫的對照要低。實驗1中進行加強接種的兩組雞(在表中用上標e表示)表現出具有統計意義的損傷計分降低。在另一些情況下，損傷計分降低的程度沒有這么大，但接種雞的增重量一般都提高了。
為了確定第三次接種是否能進一步增強預防作用，進行了一個實驗，在該實驗中，以8只雞為一組，在3和5周齡或3、5或7周齡時作為感染或未感染的未接種對照，或用BSA或裂殖子蛋白接種的雞進行處理。頭兩次接種用弗氏完全佐劑進行。如果進行第三次接種，則此次接種用弗氏不完全佐劑進行。接種操作如上述在皮下進行。
最后一次接種兩周后，對每只雞口服給予25,000個生成孢子的禽艾美球蟲卵囊進行感染。在感時和感染7天后測量體重，最后一次測量體重后將雞處死，對盲腸損傷評分。結果示于表5。
表5用純化的65kd抗原進行二或三次接種而對雞進行皮下免疫的作用處理a不同周齡的劑量(μg)損傷計分b增重/減重c(g)3周5周7周IUC - - - 2.13 +59抗原 4 4 - 1.75 +122抗原 4 4 - 2.88 +128原抗 20 20 - 1.88 +87抗原 20 20 - 1.88 +69BSA 20 20 - 3.13 +106BSA 20 20 - 2.38 +131UUC - - - 0 +131IUC - - - 2.25 +23抗原 4 4 4 2.25 +91抗原 20 20 20 2.25 +86BSA 20 20 20 1.75 +78a-IUC、抗原、BSA和UUC分別指(用卵囊)感染的未免疫對照、純化的65kd蛋白、牛血清清蛋白和未感染的未免疫對照。
b-小雞在最后一次接種2周后用25,000個生成孢子的禽艾美球蟲卵囊感染，對感染的未免疫對照來說是在處死的前7天進行感染。這些用于雙次免疫和三次免疫實驗的對照，在感染時為7和9周齡。結果以如上文所述的0-4的計分表示。
c-所示數值為感染時體重與感染7天后體重之差。
表5的數據表明，進行第三次接種并未改善免疫效果。與未經處理的感染對照或用BSA接種的雞相比，抗原提供了較強的預防作用，這是由盲腸損傷計分降低證明的。
為了確定除皮下注射以外的施用途徑是否會產生更好的效果，以8只3周齡來航雞為一組，利用皮內、皮下、肌肉內、口服和肛門施用途徑，給各組雞施用兩個劑量水平的65kd蛋白，共施用三次，每次間隔兩周。最后一次施用免疫原兩周后，給這些雞口服25,000個生成孢子的禽艾美球蟲卵囊進行感染。感染一周后將雞處死，確定盲腸損傷計分。
如上所述進行皮下注射。在左腿外側進行深度肌肉內注射。在右翅前側進行皮內注射。用5cm長的18號圓尖針頭進行口服施用，使接種物沉積到雞嗉囊內。用一根5cm長的18號橄欖尖針頭進行肛門施用，將針頭伸入泄殖孔內達最大長度。在口服和肛門施用，分別使雞站立和倒置幾分鐘，避免可能發(fā)生的接種物逐出。
皮下注射的劑型如上所述，初次注射時使用弗氏完全佐劑，加強注射時使用弗氏不完全佐劑。用于其它施途徑的劑型含有指定濃度的蛋白和0.02M K2HPO4緩沖液(pH6.8)。
該實驗的結果示于表6。
表6各種施用途徑對用65kd抗原接種雞的影響處理/途經a不同周齡的劑量(μg)損傷計分b增重/減重c(g)3周5周 7周IUC - - - 2.9 +58抗原 /SC5 5 5 2.3 +66抗原 /SC25 25 25 2.8 +68SSA/SC 25 25 25 2.8 +47抗原 /IM5 5 5 2.3 +33抗原 /IM25 25 25 2.3 +72抗原 /A 5 5 5 2.5 +53抗原 /A 25 25 25 2.6 +50抗原 /O 5 5 5 1.8d+67抗原 /O 25 25 25 2.5 +87抗原 /ID5 5 5 2.1 +26抗原 /ID25 25 25 1.9d+114UUC - - - 0+114a-IUC、抗原、BSA和UUC分別指(用卵囊)感染的未免疫對照，純化的65kd蛋白、牛血清清蛋白和未感染的未免疫對照。SC、IM、A、O和ID分別提指皮下、肌肉內、肛門、口服和皮內施用途徑。
b-小雞在最后一次接種2周后，用25,000個生成孢子的禽艾美球蟲卵囊進行感染，對感染的未免疫對照來說是在處死前7天進行感染。這些對照在感染時為9周齡。結果以如上所述的0-4的計分表示。
c-所示數值為感染時體重與感染7天后體重之差。
d-與IUC比較，P＜0.05。
表6表明，在小雞用5μg抗原以口服途徑免疫，和用25μg抗原以皮內途徑免疫時，觀察到的盲腸損傷計分最低。這些結果具有統計意義。對其它施途徑和其它劑量水平觀察到損傷計分的數值較低，表明它們具有預防傾向。但這些計分與IUC雞的計分之差不具有統計意義。
在上述實驗中沒有觀察到線性劑量反應，這可能是由于65kd抗原的各種制備物中痕量污染物和/或熱原含量不同或其它因素。
7.2、牛痘載體接種為得到用本發(fā)明的禽艾美球蟲抗原免疫小雞的更有效手段，將編碼由單克隆抗體6A5識別的20kd蛋白的1.1kb cDNA(圖14)和編碼由單克隆抗體8A2別的28kd蛋白的1.1kb cDNA分子(圖18)，克隆到牛痘病毒中，并如下所述用來接種小雞。
7.2.1、載體的制備所制得的所有重組體都是通過用Mackett等人所述的方法(Proc.Natl.Sci.AcadUSA797415，1982)同源重組到病毒胸苷激酶(TK)座位而得到的?，F已在牛痘病毒(VV)的HindIII J片段上畫出了TK座位的圖譜(Hruby et al.，J.Virol.43403，1982)，此片段的部分順序已進行了測定(Weir et al.，J.Virol.46530，1983)。
為構建一個重組載體，將VV HindIII J片段亞克隆到pUC8中(圖24a)。用HpaII切割此構建體。所得片段用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段(Klenow)處理，用HindIII再切割，用低熔點瓊脂糖分離出含有病毒TK基因的片段。將分離出的片段連入pUC8載體的HindIII和平末端(S1處理)EcoRI位點中(圖24b有)。接著，用Klenow處理經HindIII消化的DNA，并再連接該載體片段，從而去掉HindIII位點。為插入VV啟動子(定名為7.5K啟動子)，用ClaI和EcoRI切割該載體。
VV 7.5K啟動子位于該病毒最小的SalI片段之一中(Venkatesanet al.，Cell 25805，1981)。將相應的片段克隆到M13mp8中。選擇出一個克隆，其中的轉錄方向朝向M13mp8的EcoRI位點(圖24a，左)。用ScaI和SmaI切割該DNA，加入BglII連接子，再連接該DNA(圖24b)。從該M13構建體中分離出含病毒啟動子片段的EcoRI-AccI片段，將其連入上述pUC8-TK片段中，產生載體pUC-TK-7.5K*。用BglII和EcoRI消化這個新載體。
為了得到帶有多具克隆位點的載體，將一個適當的多連接子引入上述構建體。為此選擇了M13tg131(Amersham)中所含的多連接子(圖24d)。通過用BglII和EcoRI消化噬菌體DNA，分離出多連接子片段，將該片段插入到pUC8-TK7.5K*構建體中，產生用于將外源抗原重組到VV中的最終基本載體(圖24c)，即PUC8-TK-7.5K。
編碼能與單克隆抗體8A2結合的28kd蛋白的EcoRI片段，并不含有編碼該蛋白N末端部分的順序。因此該蛋白的原有起始密碼子和先導順序都缺失了。
為補償這些缺失區(qū)，制備了兩個不同的構建體，并檢驗了其表達情況。在第一個構建體中，通過缺失基本表達載體PUC8-TK-7.5K(圖24d)中多連接子的一部分而產生了一個讀碼內起始密碼子。用EcoRV和SmaI消化此載體而缺失部分多連接子(圖24d)，然后再連接。通過這一操作，SphI限制位點中所含的ATG密碼子被置于EcoRI片段上的卵囊蛋白編碼區(qū)的正確讀碼內。測定新多連接子的順序，證實了操作是成功的。由此構建體編碼的蛋白，其推測的N末端氨基酸順序示于圖25A。
為了在該DNA順序中不僅補償起始密碼子，而且補償缺失的先導順序，將EcoRI片段置于一種瘧蟲抗原的先導順序之后的正確讀碼內。用于分離該先導順序的瘧蟲抗原為被稱為Ro-33的190kd蛋白(Certaet al.，EMBO J.64137，1987)。但必須指出，其它先導順序，如球蟲先導順序，也可用于同樣的目的。
為分離含有先導順序的DNA片段，用DraI消化Ro-33 DNA。分離出含有限制酶PvuII和HindIII識別位點的片段，并用HindIII消化。將原始載體構建體PUC8-TK-7.5K(圖24c)用SalI切割，用Klenow處理，然后用HindIII消化。在此載體片段中克隆所分離的DraI-HindIII瘧蟲抗原先導片段。用此構建體來表達一種融合蛋白，即惡性瘧蟲的190kd蛋白與由抗體8A2識別并由EcoRI片段編碼的禽艾美球蟲抗原之間的融合蛋白。此融合蛋白的推測N末端氨基酸順序示于圖25B。
將編碼28kd蛋白的EcoRI片段克隆到基本載體(圖24c)中所含的多連接子的EcoRI位點中。繁殖以正確取向含有上述片段的構建體，并用來重組到牛痘病毒中。
由于上述片段的翻譯起始位點插入基本載體(見上)的方式不同，重組牛痘病毒所要表達的基因可能有兩種不同的N末端順序(圖25)。在第一個構建體中只另入了3個額外的氨基酸(Met、Arg和Trp)(圖25A)，而在第二個構建體中，總共有47個得自190kd瘧蟲抗原先導順序的氨基酸與由單克隆抗體8A2識別的多肽的N末端融合(圖25B)。在該先導順序的潛在切割位點處進行加工后，除去了19個額外的氨基酸，從而產生一個以Val、Thr、His起始的成熟蛋白。
編碼由單克隆抗體6A5識別的20kd蛋白的EcoRI片段含有整個順序。不經進一步加工而將此片段如上所述克隆到VV載體的EcoRI位點中。
利用選擇重組病毒的兩步法，將上述編碼球蟲抗原的基因重組到牛痘病毒WR株中。
第一步是用培養(yǎng)基I[Eagle氏最低必需培養(yǎng)基(MEM)，5％胎牛血清(FCS；得自Amimed)，青霉素/鏈霉素(分別為100單位/ml和100μg/ml)，2mM谷氨酰胺；所有試劑都得自Gibco]在8cm2培養(yǎng)皿中培養(yǎng)CV1猴細胞至80～90％匯合。除去培養(yǎng)基，換用0.2ml含有溫度敏感性牛痘病毒tsN7株(Drillen et al.，Virology 131385，1983)的病毒懸浮液，其濃度為0.1噬菌斑形成單位(pfu)/細胞。將培養(yǎng)皿在室溫下放置1小時，然后每皿加入2ml培養(yǎng)基I，將培養(yǎng)皿放在CO2培養(yǎng)箱中于33℃(允許該病毒生長的溫度)下培養(yǎng)2小時(Kieny et al.，Nature 312163，1984)。
在結束上述培養(yǎng)一個半小時前，制備含DNA的磷酸鈣沉淀。此沉淀含有HeBS緩沖液(280mM NaCL、1.5mM磷酸氫鈉、50mM HEPES)、200ng純化的牛痘WR株病毒DNA和200ng含質粒DNA的純化球蟲抗原基因，總體積為0.55ml。每種DNA都是以1μl TE緩沖液(10mM Tris-HCL，PH7.5，1mM EDTA)加入。向此溶液中滴加0.55ml 250mN氯化鈣溶液并伴以輕輕旋轉。將此混合液于室溫下放置20分鐘。
培養(yǎng)2小時后，從培養(yǎng)皿中吸出培養(yǎng)基，換用0.25ml上述含DNA的磷酸鈣沉淀，并于室溫下放置1小時。然后每皿加入2ml培養(yǎng)基I，將培養(yǎng)皿放在5％CO2培養(yǎng)箱中于39.5℃下培養(yǎng)2小時(Kieny et al.，同上)。在此溫度下，ts N7病毒不能復制，因而便選擇出了至少在ts7座位中已經重組的病毒。因為磷酸鈣最終將對細胞生長產生抑制作用，所以在上述培養(yǎng)2小時后除去培養(yǎng)基，并在輕輕旋轉下將細胞用1ml PBS洗三次。吸出最后一次的PBS溶液，每皿加入2ml培養(yǎng)基I。繼續(xù)于39.5℃下在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。
經過兩天的培養(yǎng)后，將含有培養(yǎng)基和細胞的培養(yǎng)皿短時間放置于-30℃下，然后融化，從皿底刮下仍然附著的細胞，將該懸浮液如上所述進行超聲處理。將此勻漿液用于第二個選擇步驟。
在這一步驟中，從生長在8cm2培養(yǎng)皿中的L143B TK細胞(ATCCCRL 8303)的幾乎匯合的細胞苔中除去培養(yǎng)基，換用0.2ml末稀釋的勻漿液或用PBS以1∶5或1∶30(V/V)稀釋的勻漿液。使TK-細胞的感染在室溫下進行1小時。
培養(yǎng)后，向細胞中加入2ml含有0.1mg/ml溴代脫氧尿苷(BUdR，Sigman Chemical Co.)的半固體培養(yǎng)基II(培養(yǎng)基I加非必需氨基酸(GIBCO；序號043-1140)、必需維生素(GIBCO；序號042-1120)和1％瓊脂糖)。然后把培養(yǎng)皿放在CO2培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)16-24小時。在細胞上鋪上第二層除上述成分外還含有0.2％中性紅的半固體培養(yǎng)基II，把培養(yǎng)皿再培養(yǎng)16-24小時。出現了清晰可見的無色噬斑，用巴氏吸管穿破噬斑區(qū)，以單個的克隆回收病毒(噬斑純化)。將以這種方式回收的病毒如上所述培養(yǎng)在CV1細胞上，并在143B TK-細胞上進行第二輪和第三輪噬斑純化。如上所述培養(yǎng)和純化這些由噬斑純化的病毒。
為檢驗該重組病毒表達球蟲抗原的情況，將用重組病毒感染的CV1細胞用臺式離心機沉降(Hettich Mikrorapid K，于20℃下以100％離心3分鐘)，沉淀用PBS洗兩次，再離心后再懸浮于PBS中。細胞懸浮液加到玻璃顯微鏡載片(Flow)上，使其干燥。第二種方法包括，在顯微鏡載片(Miles Lab-Tek 4808)上直接培養(yǎng)CV1細胞，用病毒感染細胞，培養(yǎng)1-2天。然后用PBS洗去細胞上的生長培養(yǎng)基，于室溫下使細胞在載片上干燥。為固定細胞，將載片于-30℃下浸在丙酮中至少一小時，使其在室溫下干燥。將用PBS稀釋的小鼠抗球蟲抗原單克隆抗體鋪在顯微鏡載片上，使液體均勻地蓋在細胞上。把載片放在37℃的潮濕培養(yǎng)箱中1小時，然后用PBS洗滌幾次。無需使載片干燥，將也用PBS稀釋的第二抗體(FITC標記的羊抗小鼠IgG，Nordic)鋪在載片上，把載片放在37℃的濕潤培養(yǎng)箱中1小時，使抗體起反應。用PBS洗滌幾次后，使載片完全干燥。將幾滴20％(V/V)甘油水溶液吸到載片上，在上面放一張蓋玻片(Menzel24×60)。然后用顯微鏡(Zeiss ICM 405、F10或Planapo 63物鏡)在紫外光下觀察細胞制備物的熒光。
WR株病毒可以在幾乎所有類型的細胞中繁殖(Drillen et al.，J.Virology 28843，1978)，其繁殖可通過空斑的形成而直接觀察到。但在多數情況下都是用雞胚成纖維(CEF)細胞來制備大量的病毒。
為得到CEF細胞，從卵中分離出11日齡的胚，剔除其四肢，將其切成小片并于室溫下在0.25％胰蛋白酶溶液(Difco)中再懸浮2小時。用1倍體積的培養(yǎng)基I稀釋此懸浮液，用細胞篩(Bellco，150目)過濾，然后沉降細胞(Hermie臺式離心機，5分鐘，2,000rpm，室溫)。將細胞沉淀再懸浮于1/4原體積的培養(yǎng)基I中，將此CEF細胞懸液接種到細胞培養(yǎng)皿中。根據細胞的起始密度，使培養(yǎng)物生長1-2天，直接用于感染或在再傳代1-2次后用于感染。有關建立這種初級培養(yǎng)物的簡要介紹可見Frehney的《動物細胞培養(yǎng)》一書的第11章99頁(Culture ofAnimal Cells，Alan R.Liss Verlag，New York 1983)。
為進行感染，從生長在175cm培養(yǎng)瓶(Falcon 3028)中的80-90％匯合的CEF細胞中除去培養(yǎng)基，于室溫120℃下在含有病毒(0.1pfu/細胞，0.01ml/cm2)的PBS溶液中培養(yǎng)細胞1小時(PBS/Dulbecco，Amimed)然后加入培養(yǎng)基I(0.2ml/cm2)，將培養(yǎng)瓶于37℃下培養(yǎng)2-3天，直到約80％的細胞溶解。所得的母液直接與細胞和原始培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基一起于-30℃下貯存，準備用于病毒純化。
利用下列純化步驟來得到去除了所有宿主細胞特有成分的病毒制備物。將貯存于-30℃下的感染細胞培養(yǎng)物融化，振蕩成刮下培養(yǎng)瓶表面殘留的細胞。從培養(yǎng)基中離心出細胞和病毒(Sorvall離心機，GSA轉子，于10℃下以5,000rpm離心1小時)。將細胞和病毒顆粒的沉淀再懸浮于PBS(體積為沉淀的10-20倍)中，并如上所述再次離心。然后將此沉淀再懸浮于10倍體積的RSB緩沖液中(10mM Tris-HCL，pH8.0，10mM KCL，1mM MgCL2)。
為了溶解其余的完整細胞，并從細胞膜中除去病毒，對上述懸浮液進行超聲處理(兩次，每次以60瓦處理10秒，室溫，帶有4mm探針的Labsonic 1510)。然后在10℃下將該混合物用Sorval GSA轉子以3,000rpm離心3分鐘。這樣便得到了沒有細胞核和大的細胞碎片的病毒懸浮液。小心除去上清液，將沉淀再懸浮于RSB緩沖液中，再進行超聲處理并如上所述進行離心。
將第二次上清液與第一次上清液合并，鋪在10ml 35％蔗糖層(Fluka，在10mM Tris-HCL，pH8.0中)上，于10℃下以14,000rpm在KontronTST 28.38/17轉子(類似于Bekman SW27)中離心90分鐘。倒出上清液，將病毒顆粒沉淀再懸浮于10ml 10mM Tris-HCL(pH8.0)中，進行超聲處理以勻漿該混合液(如上所述勻漿2次，每次10秒)，然后加到加階式梯度上進行進一步的純化。
階式梯度由蔗糖在10mM Tris-HCL.(pH8.0)中的不同濃度的溶液各5ml構成，其濃度如下20％、25％、30％、35％和40％。于10℃下，將此梯度置于Kontron TST 28.38/17轉子中以14,000rpm離心35分鐘。在30％～40％蔗糖區(qū)內可見若干條含病毒顆粒的條帶。移出該梯度的這一區(qū)域(10ml)，用PBS(20ml)稀釋蔗糖溶液，并沉降病毒顆粒(Kontron轉子，10℃下以14,000rpm離心90分鐘)。沉淀中幾乎只含有病毒顆料(通過O.D.測量結果與空斑檢測結果的比較而作出判斷，見下文)。將此沉淀再懸浮于PBS中，使病毒濃度平均為1-5×109pfu/ml。此病毒貯備物或者直接使用，或者用PBS稀釋后使用。
采用兩種方法來確定病毒濃度和病毒貯備物的純度。簡便的是，用分光光度計(Uvikon 860)測量貯液在260nm處的光密度(OD/260)，得到病毒顆粒的絕對濃度，其中10D/260大約相當于1.2×1010個顆粒/ml(Joklik，virology 189，1962)。此外還通過在細胞上測定病毒的效價(空斑檢測)而得到病毒濃度，假定60個病毒顆粒中只有一個能感染細胞。
為在培養(yǎng)細胞上確定病毒濃度，用培養(yǎng)基I在8cm2塑料培養(yǎng)皿(Falcon3001)上培養(yǎng)CEF細胞。當細胞生長至80-90％匯合時，除去培養(yǎng)基，換用0.2ml稀釋的病毒在PBS中的溶液，于室溫下放置1小時。將病毒貯液進行10倍依次稀釋。室溫培養(yǎng)后，在每個平皿中加入2ml半固體培養(yǎng)基I(培養(yǎng)基I+1％瓊脂糖)，并將平皿在CO2培養(yǎng)箱中放置16-24小時。然后鋪上2ml含0.2％中性紅(Fluka 72210)的半固體培養(yǎng)基I，以染色活細胞，將平皿再培養(yǎng)16-24小時。然后在顯微鏡下計數無色空斑。
7.2.2、小雞免疫進行下列試驗以確定一些牛痘病毒載體是否能預防小雞受致病性禽艾美球蟲品系(T2-750/7、T7-776/1或T6-771品系)生成孢子的卵囊的感染，這些載體所攜有的基因編碼能與單克隆抗體8A2和6A5特異結合的禽艾美球蟲蛋白。
所有試驗都使用由孵化場(E.Wuthrich，Belp，Switzerland)供應的產蛋品種(Warren)的小公雞進行。將日齡小雞飼養(yǎng)在加熱電池孵化器中，直至指定的日齡，然后把它們分成各個不同的試驗組，并放在鐵絲籠中使其不受球蟲病感染。在整個試驗過程中，喂之以玉米、小麥和大豆粉(粗蛋白21.7％)為主的生長(broiler-grower)飼料。
在第一個試驗中，在第42天將等重的小雞隨機分成三組，每組6只雞。3天后，用重組型或野生型牛痘病毒對小雞進行免疫，免疫時在右翅膀下進行兩次皮下注射，每次注射50μl病毒懸浮液(1010pfu/ml，在PBS中)。使用了兩種重組牛痘病毒，它們都含有編碼能與抗體8A2特異結合的禽艾美球蟲蛋白的DNA。其中一種病毒(定名為37K M3)含有190kd瘧蟲抗原的先導順序；另一種病毒(定名為37K K3)則缺少這個先導順序。用野生型牛痘病毒WR株作為陰性對照。
第一次注射1周后，在同樣的條件下進行一次加強注射，此次注射用前一次所用相同類型的牛痘病毒在小雞的左翅膀下進行。加強注射1周后(第59天)，從所有小雞體內各取2ml血樣，利用ELISA法檢測血清中是否存在特異性抗體。簡言之，在一塊微量滴定板(NUNCImmunoplate F96)和各小孔中涂上禽艾美球蟲子孢子的懸浮液(10,000個細胞/ml)，并與稀釋倍數逐漸增加的雞血清一起保溫。所用的檢測試劑為與辣根過氧化物酶結合的羊抗雞免疫球蛋白(Dirkegaard andPerry Laboratory，Gaithersburg，U.S.A.)并同時使用四甲基聯苯胺作為其底物。效價定義為給出至少雙倍于背景值光密度的血清稀釋度的倒數值(表7)。
第一次注射四周后(第73天)，用50,000個生成孢子的卵囊感染小雞。將懸浮于1ml生理鹽水中的球蟲接種物利用一個帶有純針頭的帶刻度注射器經口施用于小雞的嗉囊中。第80天，處死所有小雞，解剖后，對盲腸總損傷計分(0＝正常，1＝輕度感染，2＝中度感染，3＝嚴重損傷，4＝小雞死于球蟲病)。在感染周期的最后兩天內，定量收集糞便，測定有代表性的糞便樣品中所有排泄出的卵囊的數目。結果示于表7。
表7用表達28kd蛋白的牛痘病毒接種45日齡的小雞病毒a小雞數抗體效價盲腸損傷計分卵囊日排泄量/雞(×10-6)37K3 6430 1.3314937M3 6b1360 1.50107野生型 6200 2.60271a-病毒37M3含有190kd瘧蟲抗原的先導順序，而病毒37K3不含此順序。野生型病毒為牛痘病毒WR株。
b-有兩只雞在感染球蟲病前死亡。
表7表明，與野生型對照病毒相比，兩種含有編碼28kd蛋白的DNA的病毒，都誘導特異于寄生蟲的抗體的產生，并賦予某種預防卵囊感染的作用，這都是根據盲腸損傷計分的下降和卵囊排泄量減少來判斷的。就預防球蟲病而言，這兩種病毒是等效的，但是，帶有瘧蟲先導順序(37M3)的構建體在雞體內產生的抗子孢子抗原的抗體效價比標準病毒構建體(37K3)要高，這表明，融合構建體有一定的優(yōu)點。
在第二個試驗中，如上所述飼養(yǎng)并免疫小公雞，但從第22天開始。此時施用2×106pfu的病毒劑量(在100mlPBS中)。所用的病毒來自不同的牛痘病毒制備物，病毒中含有編碼28kd蛋白的DNA，該蛋白不帶有(定名為37KS)或帶有(定名為37M19)瘧蟲先導順序。用同樣的野生型WR株病毒作對照。在第一次注射1或2周后，以同樣的劑量在右翅膀下進行加強注射。
第57天(第一次注射5周后)，用50,000個生成孢子的卵囊感染所有小雞。一周后，如上所述將雞處死，解剖并計分。還測定感染后的日增重和最后兩天期間的卵囊日排泄量。結果示于表8。
表8用表達28kd蛋白的牛痘病毒接種22日齡的小雞卵囊日排泄量病毒a加強時間(周)小雞數日增重(g)盲腸損傷計分 雞(×10-5)37K5 1811.45 2.38 21.037M19 1815.61 2.13 24.0野生型188.77 2.50 33.137K5 285.14 2.25 22.337M19 2811.79 2.13 32.7野生型288.34 2.63 37.0a-病毒37M19含有190kd瘧蟲抗原的先導順序。病毒37KS不含此順序。野生型病毒為牛痘病毒WR株。
表8表明，與野生型對照病毒相比，兩種含有球蟲DNA的病毒都賦予針對致病性卵囊感染的某種預防作用，這是根據增重量、盲腸損傷計分和卵囊排泄量來判斷的。這兩種病毒大致等效。在初次注射一周后進行加強注射，使增重量略高，卵囊排泄量略低，但盲腸損傷計分對這兩個加強計劃來說大致相同。
在第三個試驗中，考察了三次接種的效應。給21日齡的小雞注射(右翅膀)兩份50μl(3×109pfu/ml)的病毒懸浮液，該病毒為野生型牛痘病毒或含有編碼20kd蛋白的DNA的病毒，所述蛋白能與單克隆抗體6A5特異結合。在第28天，所有小雞都在左翅膀下進行相同劑量的加強注射。有些雞還在第35天在翅膀兩側再進行一次同樣劑量的加強注射。其它小雞未再接種，而作為進一步的對照。
第42天，從所有小雞體內取血樣，如前所述用ELISA法檢測是否存在針對寄生蟲的子孢子階段的特異抗體。第49天(第一次注射4周后)，用50,000個生成孢子的卵囊感染所有的小雞。一周后，如上所述處死這些小雞，解剖后對總的盲腸損傷計分。每周記錄體重以計算日增重量，在感染周期的最后兩天內收集糞便，以測定卵囊排泄量。結果示于表9。
表9用表達20kd蛋白的牛痘病毒接種21日齡的小雞卵囊排泄量/gVV注射次數 小雞數 抗體效價 日增重(g) 盲腸損傷計分 糞便(×10-3)rVV 2 6210 2.9 2.33 1.69rVV 3 67200 4.2 1.67 1.32WT3 6560 -4.12.67 2.09N-60 -3.82.83 1.75
rVV 含有球蟲DNAWT 野生型N無表9的數據表明，注射三次時，產生球蟲抗原的病毒產生特異于子孢子蛋白的高效價抗體。此外。用這種類型的重組病毒進行的兩組處理，都產生了針對卵囊感染的某種預防作用，這是根據增重量提高、盲腸損傷計分下降、和卵囊排泄量降低來判斷的。比較用來接種的對照得到的結果，表明野生型牛痘病毒接種不賦予預防作用。因此，由攜有球蟲DNA的病毒賦予的保護作用是特異性的，并不是由于與牛痘病毒本身接觸而引起的一般性免疫刺激。三次接種比兩次接種更為有效。
可對本發(fā)明進行許多修改和變化而不偏離其要旨和范圍，這對本領域專業(yè)人員來說是顯而易見的。給出此處所述的具體實施方案只是舉例，本發(fā)明僅由所附的權利要求書來限定。
權利要求
1.一種用于對家禽進行抗球蟲病免疫的疫苗的制備方法，該方法包括，將一種蛋白與一種藥學上可接受的載體混合，所述蛋白具有圖15、17、19或21所示的氨基酸順序之一或是其功能等價物。
全文摘要
本發(fā)明提供編碼艾美球蟲表面抗原的DNA順序、含有這些DNA順序的重組載體、含有這些載體的轉化宿主生物、以及利用轉化的微生物制備抗原的方法。還提供了用艾美球蟲表面抗原預防家禽球蟲病的方法。施用這些表面抗原進行預防時,該抗原可以是純化的蛋白,也可以是編碼這些蛋白的DNA形式,該DNA位于合適的病毒載體如牛痘病毒中。
文檔編號A61K39/00GK1186695SQ97118698
公開日1998年7月8日 申請日期1997年9月22日 優(yōu)先權日1988年6月3日
發(fā)明者沃納·阿爾滕貝格, 瑪麗·海倫·賓格, 理查德·安東尼·奇宗奈特, 理查德·艾倫·克蘭馬, 彼得·托馬斯·隆梅迪科, 斯蒂芬·J·麥安德魯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司