專利名稱：rDSPAαI的產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離和純化重組圓形葉口蝠(Desmondus rotundus)唾液纖溶酶原活化物(rDSPAα1)的方法、通過這種方法純化的rDSPAα1、含有如此純化的rDSPAα1的藥物組合物以及使用如此純化的rDSPAα1進(jìn)行治療的方法。
背景技術(shù)：
由于在血管中形成血塊，從而導(dǎo)致血栓形成。人們區(qū)別了靜脈血栓形成(包括肺部栓塞)和動(dòng)脈血栓形成(包括急性心肌梗塞)。肺部栓塞和心臟梗塞是威脅生命的主要疾病，需要馬上進(jìn)行醫(yī)學(xué)治療。
對(duì)于這種動(dòng)脈和靜脈血栓形成的普通治療形式是使用纖溶酶原活化物進(jìn)行酶促溶栓(Collen等，醫(yī)學(xué)年度綜述，39:405-423,(1988))。這些物質(zhì)稱為溶栓劑，它們能把纖溶酶原(血液的纖溶系統(tǒng)的失活酶原)轉(zhuǎn)化成為活性蛋白酶、纖溶酶。接下來，纖溶酶溶解實(shí)質(zhì)上是血塊組分的纖維物質(zhì)血纖蛋白，這就打通了阻塞的血管并恢復(fù)了血液流動(dòng)。然而，因?yàn)槔w溶酶相對(duì)來說是非特異性的蛋白酶，它可以通過蛋白酶解作用破壞血液中不可缺少的用于無傷止血的組分(例如血纖蛋白原)，因此增加了出血的危險(xiǎn)性。
第一種酶促溶栓劑、鏈激酶和尿激酶是復(fù)合物，就一旦被注射到血液循環(huán)中，其能在全身把纖溶酶原轉(zhuǎn)化成為纖溶酶，從而引起全身性的蛋白酶解。因此，使用這種組合物的溶栓療法會(huì)出現(xiàn)與出血相關(guān)的復(fù)雜情況。已經(jīng)研究出了較新的溶栓療法，它以使用通常稱為t-PA的組織類型的纖溶酶原活化物為基礎(chǔ)，但是這種療法也存在一些弊端，這包括嚴(yán)重的復(fù)雜性傷流、比較頻繁的再阻塞、不能達(dá)到均一有效的治療效果以及可能被易感性的纖溶酶原活化物抑制劑(例如1型纖溶酶原活化物抑制劑(PAⅠ-1)(Loskutoff，血栓癥和止血法的相同之處，Vol.14,No.1(1988))滅活等。
前不久，已經(jīng)從吸血蝙蝠(圓形葉口蝠)唾液和唾液腺(歐洲公開專利申請(qǐng)O383417(Baldus等)；歐洲公開專利申請(qǐng)O352119(Duong等))中純化得到了纖溶酶原活化物蛋白質(zhì)。這些纖溶酶原活化物(稱為DSPA)是絲氨酸蛋白酶，它能催化纖溶酶原轉(zhuǎn)變成為纖溶酶，但它們對(duì)結(jié)合血纖蛋白的纖溶酶原表現(xiàn)出很高的選擇性，因此當(dāng)其用于溶栓治療時(shí)，可能減少出血的嚴(yán)重程度和頻率。而且DSPA也不易被血漿抑制劑(例如PAⅠ-1)滅活，因此可能降低再阻塞的頻率。
在蝙蝠唾液中可以發(fā)現(xiàn)兩種高分子量形式的DSPA(命名為α1和α2)，二者都由幾個(gè)區(qū)組成(包括蛋白酶區(qū))，并且二者在血纖蛋白的存在下都能緊密地結(jié)合到纖溶酶原上。通過重組技術(shù)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中已產(chǎn)生各種形式的DSPA(Karitzschmer等，基因，105:229-237(1991)；歐洲公開專利申請(qǐng)0352119(Duong等))，并且已經(jīng)有人描述了小規(guī)模純化重組產(chǎn)生的DSPA(rDSPA)的方法(Witt等，血液(1992),79:1213-1217)。然而，還沒有人公開過商業(yè)規(guī)模的和純度適合用于藥物制劑的rDSPA的分離和純化方法。
本申請(qǐng)涉及以商業(yè)規(guī)模分離和純化重組DSPAα1(rDSPAα1)的方法。所描述的本發(fā)明產(chǎn)生了純度和穩(wěn)定性足以適于市售和臨床使用的rDSPAα1。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了以商業(yè)規(guī)模分離和純化rDSPAα1，并產(chǎn)生適合于臨床使用的產(chǎn)品的方法。
因此，本發(fā)明的一方面涉及從生物培養(yǎng)基中純化rDSPAα1的方法，所說的方法包括下列步驟(a)在導(dǎo)致rDSPAα1和陽離子交換樹脂選擇性結(jié)合的裝載條件下將培養(yǎng)基加入到陽離子交換樹脂上；(b)可以洗滌也可以不洗滌陽離子交換樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(c)從陽離子交換樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(d)在導(dǎo)致rDSPAα1和疏水相互作用樹脂選擇性地結(jié)合的裝載條件下將步驟(c)中的含有rDSPAα1的洗脫液加入到疏水作用樹脂上；
(e)可以洗滌也可以不洗滌疏水作用樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(f)從疏水作用樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(g)在導(dǎo)致rDSPAα1和親和層析樹脂選擇性地結(jié)合的裝載條件下將步驟(f)中的含有rDSPAα1的洗脫液加入到親和層析樹脂上；(h)可以洗滌也可以不洗滌親和層析樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(ⅰ)從親和層析樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1，以產(chǎn)生水溶液形式的純化的rDSPAα1。
本發(fā)明的另一方面是通過本申請(qǐng)的方法分離和純化的rDSPAα1蛋白。
發(fā)明的另一方面涉及含有通過本申請(qǐng)的方法分離和純化的rDSPAα1和藥學(xué)上的可接受的賦形劑的藥物組合物。
本發(fā)明的另一方面是使用通過本申請(qǐng)的方法分離和純化的rDSPAα1治療患有動(dòng)脈或者靜脈血栓形成的患者的方法。
本發(fā)明的詳細(xì)描述在說明書和附加的權(quán)利要求書中，除非特別規(guī)定，下列術(shù)語具有如下的意義＂生物培養(yǎng)基＂是指用于在培養(yǎng)中繁殖細(xì)胞的鹽和營養(yǎng)物質(zhì)的精確配方。
＂條件培養(yǎng)基＂是指細(xì)胞在其中已經(jīng)生長(zhǎng)的生物培養(yǎng)基。因此這種培養(yǎng)基已經(jīng)適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)并含有在細(xì)胞生長(zhǎng)期間分泌的產(chǎn)物。這些物質(zhì)可以是在細(xì)胞生長(zhǎng)期間產(chǎn)生的無用的產(chǎn)物或在細(xì)胞生長(zhǎng)期間產(chǎn)生并分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)。
＂陽離子交換樹脂＂是指通常為固體的天然或人造物質(zhì)，其能使周圍的液體基質(zhì)的離子交換結(jié)合的離子。陽離子交換樹脂具有陰性功能性固定的離子并交換陽性反離子。
市售的陽離子交換劑的錨基團(tuán)(活性交換組分)通常為C6H5O-、SO3-、COO-、PO3-或AsO3-。弱陽離子交換樹脂是那些和陽離子結(jié)合力不高的樹脂，如那些具有羧基或者羧烷基官能團(tuán)的陽離子交換樹脂。而且弱陽離子交換樹脂一般不能全部溶解在酸性pH中。在本發(fā)明中使用的一種特殊的弱陽離子交換樹脂是由共價(jià)結(jié)合到多亞乙基二胺硅烷上的硅微粒的基質(zhì)組成，其中多亞乙基二胺的氨基基團(tuán)已用羧基基團(tuán)衍生化?？梢詮腏.T.Baker買到這種樹脂，商品名為Widepore CBX層析樹脂。
＂疏水作用樹脂＂指通常為固體的天然或人造物質(zhì)，在其中含有不帶電荷的基團(tuán)，例如甲基、乙基或者其它烷基基團(tuán)。這些基團(tuán)和通過樹脂的蛋白質(zhì)部分的基團(tuán)形成疏水鍵，結(jié)果通過蛋白質(zhì)和樹脂之間的相互作用的強(qiáng)度分離了蛋白質(zhì)。一種特殊的疏水作用樹脂由乙二醇和異丁烯酸型聚合物(用丁基基團(tuán)衍生化的)的共聚合反應(yīng)合成的半剛性球形珠組成，可以從Toso-Haas買到這種樹脂，商品名為Toyo-Pearl650M C4。
＂親和層析樹脂＂指通常為固體的天然或人造物質(zhì)，其用于蛋白質(zhì)的純化。這種樹脂基于親和性分離蛋白質(zhì)，所說的親和性發(fā)生在樹脂的基團(tuán)和蛋白質(zhì)的基團(tuán)之間。在本發(fā)明中，用作為親和層析樹脂的樹脂通常用為篩析樹脂以按照大小來分離蛋白質(zhì)。一種特殊的親和層析樹脂是烯丙基葡聚糖和N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)聚合物，其能分級(jí)分離20,000和8,000,000 kDa之間的球狀蛋白，可以從Pharmacia買到這種樹脂，商品名為SephacrylS-400。
＂烷基＂是指只由碳和氫組成的直鏈或支鏈單價(jià)基團(tuán)，其不含有任何不飽和鍵，具有一至十八個(gè)碳原子(優(yōu)選的一至六個(gè)碳原子)，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基(1-甲基亞乙基)、正丁基、叔丁基(1,1-二甲基乙基)、仲丁基(1-甲丙基)、正戊基、正己基等。
用來說明按照本申請(qǐng)描述的純化方案純化的rDSPAα1的純度的＂實(shí)質(zhì)上純化的＂是指在最終純化產(chǎn)物中的大于80％的總蛋白質(zhì)是rDSPAα1，優(yōu)選的大于90％的總蛋白質(zhì)是rDSPAα1，更優(yōu)選的大于98％的總蛋白質(zhì)是rDSPAα1。蛋白質(zhì)含量和純度是基于反相HPLC和SDS-page凝膠分析。
＂非rDSPAα1蛋白質(zhì)和非蛋白雜質(zhì)＂是指在用于純化rDPSA al的生物培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的除了rDSPAα1之外的所有物質(zhì)。
“藥學(xué)上可接受的賦形劑”是指一種可接受的載體，和所需要的與生理?xiàng)l件相容的任何藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，這種物質(zhì)應(yīng)該無毒，并不能逆向影響懸浮或包含于其中的藥物組合物的生物活性。合適的賦形劑可以是，例如甘露糖醇、琥珀酸、甘氨酸或者血清白蛋白。
“治療有效量”是指當(dāng)施用給需要藥物的人時(shí)，能夠有效地治療具有血栓癥病癥(下文有所描述)的rDSPAα1的量。構(gòu)成“治療有效量”的化合物的量將取決于化合物、病癥和嚴(yán)重程度，但是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)自己的知識(shí)和本文公開的內(nèi)容可以按常規(guī)確定。
本文所使用的＂治療＂是指對(duì)具有血栓癥病癥的人的治療，這種治療包括(ⅰ)預(yù)防病人病癥的發(fā)生，特別當(dāng)人預(yù)先有病癥但還沒有確診患有此病時(shí)；(ⅱ)抑制病癥，即阻止其發(fā)展；或者(ⅲ)解除病癥，即使病癥消退。
＂可以也可以不＂是指其后描述的事情可以發(fā)生，也可以不發(fā)生，也指描述包括所說的事件或情形發(fā)生的實(shí)例和不發(fā)生的的實(shí)例。
優(yōu)選的實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及用于分離和純化具有商業(yè)規(guī)模和適合用于藥物制劑中的rDSPAα1的方法。通過培養(yǎng)能夠?qū)DSPAα1產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系來產(chǎn)生rDSPAα1。收集條件培養(yǎng)基(例如，從含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的生物反應(yīng)器中所獲得的培養(yǎng)基)，通過一系列層析步驟(首先使用陽離子交換樹脂，然后選擇性地洗脫樹脂)使rDSPAα1與其它蛋白質(zhì)和雜質(zhì)分離。然后將經(jīng)陽離子交換樹脂選擇性洗脫而獲得的rDSPAα1組分加入到疏水作用樹脂上，其中從所述基質(zhì)的選擇性洗脫給出第二次純化，接著將洗脫的rDSPAα1組分加入到親和層析樹脂上，其中選擇性洗脫提供了進(jìn)一步的純化。然后通過常規(guī)的技術(shù)(例如超濾)將純化的rDSPAα1濃縮，然后凍干。
具體地說，按照如下方式實(shí)施本發(fā)明。
A．分離和純化1．培養(yǎng)基和細(xì)胞系培養(yǎng)基含有適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基，如DMEM或者Ham’s F12。一種特殊培養(yǎng)基是William′s E培養(yǎng)基(William′s,G.M.和Gunn,J.M.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究，(1974)89；139)。在接種生長(zhǎng)階段，通常向培養(yǎng)基添加血清(典型的是牛血清(BS)及新出生的小牛血清(CS))，濃度大約為0.1％-10％(重量)，通常的濃度為大約1％-5％(重量)?？梢约尤肫渌纳L(zhǎng)因子或者緩沖液，例如HEPES。在灌流生長(zhǎng)期間，將血清水平通常保持在同一濃度，一般大約為3％-8％，通常大約為5％。
適合在本發(fā)明中使用的細(xì)胞系包括能夠貼壁生長(zhǎng)在懸浮培養(yǎng)物和/或貼壁生長(zhǎng)在微載體珠上的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。滿足這種需求的特殊細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、BHK細(xì)胞系或者HEK293細(xì)胞系(Kratzschmer等，基因，(1991)116:281-284；生物技術(shù)，(1995)39:75-83)。
一種特別優(yōu)選的CHO細(xì)胞系是Urtaub G.和Chasin,L.A.(美國科學(xué)院學(xué)報(bào)(1980)77:4216-4220)描述的DXB11，這些細(xì)胞已經(jīng)使用表達(dá)載體pSVPA11和pUDHFR1(分別含有DSPAα1的編碼序列和小鼠二氫葉酸還原酶的編碼序列(Petri,T.ibid))共轉(zhuǎn)染。把用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞系命名為CD16，并保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，馬里蘭(ATCC)，保藏號(hào)為ATCC#CRL12023。
2．培養(yǎng)物的擴(kuò)展和產(chǎn)生階段在接種鋪滿旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)物或者其它的生物反應(yīng)器培養(yǎng)物的部分后，將細(xì)胞培養(yǎng)物擴(kuò)展到生產(chǎn)密度，一般為大約1-40×106細(xì)胞/ml。
在達(dá)到微載體珠上所需的細(xì)胞密度后，進(jìn)行新鮮培養(yǎng)基(添加了血清)的灌流。另外，可以將細(xì)胞培養(yǎng)在懸浮培養(yǎng)物中。一般地，新鮮培養(yǎng)基中的血清濃度大約為2％-10％(重量比)，更典型的濃度大約為3％-8％(重量比)，更常用的濃度為5％(重量比)。最初，灌流率在大約0.25-0-75培養(yǎng)體積/天，一般大約為0.5培養(yǎng)體積/天。隨著細(xì)胞生長(zhǎng)的增加，灌流率也增加，至最終濃度為大約1.5-2.5培養(yǎng)體積/天，一般超過2-10天。在擴(kuò)展期間，將無菌、預(yù)先平衡的微載體珠加入到反應(yīng)器中以便保持微載體珠和細(xì)胞密度的比在0.5-1.0g微載體珠109個(gè)細(xì)胞的范圍內(nèi)，使用吸收器通過樣品線將微載體珠加入到反應(yīng)器中。
在細(xì)胞密度達(dá)到生產(chǎn)水平后，減少新鮮培養(yǎng)基中的血清添加物，通常濃度減少到大約0.1-2.0％(重量比)，一般減少到1％。
在產(chǎn)生階段的培養(yǎng)需要注意多種發(fā)酵參數(shù)每天監(jiān)測(cè)溫度、pH以及溶解氧的水平。當(dāng)供應(yīng)物耗盡時(shí)，需要提供另外的培養(yǎng)基、血清和堿。按照慣例至少每隔2天分析條件培養(yǎng)基(定義為含有產(chǎn)物的培養(yǎng)基)的樣品以確保生產(chǎn)而不被污染。
從生物反應(yīng)器中收集條件培養(yǎng)的方法最大限度地減少了使用大約100-150微米孔徑的篩選膜收獲細(xì)胞。在懸浮培養(yǎng)中使用旋渦流濾膜以保持生物反應(yīng)器中的細(xì)胞。收獲是在無菌容器中進(jìn)行的，在進(jìn)一步處理前貯存38天。在生物反應(yīng)器中收獲的rDSPAα1是由CHO細(xì)胞分泌的，形成的rDSPAα1具有全部生物活性并易于純化。
3．陽離子交換樹脂層析在將pH調(diào)整到4-6(優(yōu)選的大約為5)后，在選擇性地使rDSPAα1實(shí)質(zhì)上全部結(jié)合到基質(zhì)上的條件下，將條件培養(yǎng)基中的rDSPAα1加入到陽離子交換樹脂(通常包裝成柱的形式)上。其他的蛋白質(zhì)也結(jié)合到基質(zhì)上，由于條件培養(yǎng)基中一些不需要的或者雜質(zhì)蛋白和其它的化合物(苯酚紅)不能結(jié)合到基質(zhì)中，從而由基質(zhì)中流出，因此，開始的結(jié)合階段提供了第一次分離。通過從基質(zhì)中選擇性地洗脫進(jìn)一步純化rDSPAα1，可以通過分段洗脫或能夠增加緩沖液中陰離子強(qiáng)度的線型梯度洗脫來進(jìn)行上述的洗脫。不論哪一種形式，收集rDSPAα1以用于下文描述的進(jìn)一步純化。
合適的樹脂包括許多能夠結(jié)合rDSPAα1的用陽離子官能團(tuán)衍生化的樹脂。優(yōu)選的是合成樹脂，例如那些由硅凝膠微粒、交聯(lián)瓊脂糖或者交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯聚合物(用陽離子官能團(tuán)，例如羧基或者羧烷基基團(tuán)衍生化的)組成。特別有用的是那些相對(duì)較弱的樹脂，例如那些具有羧基或羧甲基官能團(tuán)(如羧甲基或羧乙基)的樹脂。一種特別優(yōu)選的樹脂由共價(jià)結(jié)合到多亞乙基二胺硅烷上的硅微粒的基質(zhì)組成，其中多亞乙基二胺硅烷的氨基基團(tuán)己用羧基基團(tuán)衍生化。這種樹脂為Widepore CBX(45mm珠大小)，可以從J.T.Baker買到這種樹脂。
結(jié)合和洗脫條件將隨著陽離子樹脂的結(jié)合強(qiáng)度變化而變化。對(duì)于弱陽離子樹脂(例如J.T.Baker的Widepore CBX)，可以在低的離子強(qiáng)度、弱酸條件(一般為pH4-7，優(yōu)選的大約pH5)下進(jìn)行結(jié)合。在洗滌基質(zhì)后，通過將基質(zhì)與流動(dòng)相(具有提高的離子強(qiáng)度)接觸并使用線性或者分段洗脫可以選擇性地洗脫rDSPAα1。如果使用J.T.Baker的Widepore CBX樹脂，在pH大約為7.5和鹽濃度大約為100mM和500mM NaCl時(shí)洗脫rDSPAα1。然后將柱清理和再生以便以后使用。
在使用J.T.Baker的Widepore CBX基質(zhì)時(shí)，優(yōu)選地，首先將樹脂用100mM乙酸鈉的緩沖液(pH5)平衡。以0.2-2.0柱體積/分鐘的流速將緩沖液加入到柱中，直到流出物的pH穩(wěn)定到5為止。使用1.2um的濾器把含有rDSPAα1的條件培養(yǎng)基過濾，然后使用冰醋酸以小于2.0柱體積/分鐘的流速滴定到pH4-7(更優(yōu)選的為5)。然后，加入到柱上，典型地采用齒輪泵，以不大于2.0柱體積/分鐘的流速進(jìn)行過濾，以除去可以塞住柱基質(zhì)的微粒。然后用乙酸平衡緩沖液重新平衡柱基質(zhì)，直到pH穩(wěn)定到5，這個(gè)過程一般需要大約2-7柱體積。以大約0.1-0.2柱體積/分鐘的流速將含有50mM磷酸鈉的洗脫緩沖液(pH7.5)加入到柱中，直到流出物的pH穩(wěn)定到7.5。然后使用含有50mM磷酸鈉、500mM氯化鈉的洗脫緩沖液(pH7.5)從柱中洗脫rDSPAα1。洗脫一直進(jìn)行到柱的流出物中不再有蛋白質(zhì)為止。然后將含有2.0M乙酸鈉的清理(stripping)緩沖液加入到柱中，以便使基質(zhì)再生。貯存緩沖液含有10％乙酸和45％乙醇。
4．疏水作用層析接下來把從陽離子交換樹脂中收集的rDSPAα1組分在允許rDSPAα1結(jié)合到基質(zhì)上的條件(一般為高的離子強(qiáng)度和低的pH)下加入到疏水作用基質(zhì)(一般使用柱)上，然后通過增加加入到柱的流動(dòng)相的有機(jī)溶劑的濃度和使用線型或者分段梯度來選擇性地洗脫rDSPAα1。收集rDSPAα1組分以用于進(jìn)一步純化。這一步驟減少了100-1000倍的DNA雜質(zhì)和滅活的潛在的病毒雜質(zhì)。
合適的疏水作用基質(zhì)包括具有共價(jià)結(jié)合的疏水基團(tuán)(例如丙基、丁基、辛基、苯基等)的各種不帶電荷的樹脂。這種樹脂可以是交聯(lián)有機(jī)聚合物，例如苯乙烯-二乙烯基苯、硅石、瓊脂糖、聚甲基丙烯酸酯或者任何一種其它的適合的顆粒支持體。一種特別優(yōu)選的樹脂由乙二醇和異丁烯酸型聚合物(用丁基基團(tuán)衍生化的)的共聚合反應(yīng)合成的半剛性球形珠組成。這種樹脂是Toyo-Pearl650M(40-90μm珠)，可以從Toso-Haas賣到這種樹脂。
在高離子強(qiáng)度(一般為酸性pH3-5，更通常的是大約4)的條件下進(jìn)行疏水作用柱結(jié)合。實(shí)質(zhì)上含有從陽離子交換樹脂中洗脫的rDSPAα1組分的蛋白質(zhì)都結(jié)合到疏水作用柱中。基于與基質(zhì)的疏水基團(tuán)(為了增加蛋白質(zhì)的疏水性)的不同疏水作用強(qiáng)度可以選擇性地洗脫各種蛋白質(zhì)?？梢允褂梅侄位蛘呔€型梯度進(jìn)行洗脫，一般使用醇洗脫劑，例如乙醇和異丙醇。特別優(yōu)選的醇是乙醇。
當(dāng)使用Toyo-Pearl C4基質(zhì)時(shí)，可以優(yōu)選地使用含有50mM乙酸鈉、500mM氯化鈉的平衡緩沖液(pH4)進(jìn)行平衡。在將從離子交換柱洗脫的rDSPAα1組分滴定到pH4后，將所說的組分加入到C4基質(zhì)上，然后用上述平衡緩沖液重新平衡基質(zhì)。然后按照如下所述將此柱依次用兩種緩沖液洗滌。第一次洗滌(洗滌1)使用至少兩倍柱體積的含有20mM HCl的緩沖液。洗滌進(jìn)行到流出物不含蛋白質(zhì)為止，這可以通過穩(wěn)定的UV吸收來證明。然后使用不少于10倍柱體積的緩沖液洗滌(洗滌2)，所說的緩沖液含有19％乙醇、20mM HCl，使用分別含有20.5％乙醇、20mM HCl的緩沖液繼續(xù)洗滌，直到流出物不含蛋白質(zhì)為止。使用分別含有29％乙醇、20mM HCl的緩沖液(pH2.5)洗脫rDSPAα1產(chǎn)物。在洗脫產(chǎn)物后，使用大于2倍柱體積含有100mM NaOH的緩沖液清理柱。將基質(zhì)保存在洗滌1緩沖液中。
5．親和層析把從疏水作用樹脂中收集的rDSPAα1組分在允許rDSPAα1結(jié)合到基質(zhì)上的條件(一般為高的離子強(qiáng)度和低的pH)下加入到親和基質(zhì)(一般使用柱)上，rDSPAα1仍然結(jié)合到柱上，通過使用2-3倍柱體積的20mM HCl洗滌柱來洗脫雜質(zhì)。這個(gè)步驟有利于緩沖交換以形成藥物制劑和增加藥物的溶解性，并有助于滅活/或除去潛在的病毒雜質(zhì)。優(yōu)選地使用2.5倍柱體積的緩沖液。然后使用含有200mM甘氨酸、不含堿的緩沖液在pH4-5下選擇性地洗脫rDSPAα1。收集rDSPAα1組分以用于濃縮。
在本發(fā)明中，用作為親和樹脂的樹脂是那種一般用作為篩析樹脂的樹脂。合適的親和樹脂包括由烯丙基葡聚糖和N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)聚合物組成的樹脂。一種特別優(yōu)選的樹脂是聚丙烯酰胺葡聚糖S-400，可以從Pharmacia買到這種樹脂，這種樹脂能分級(jí)分離20,000和8,000,000kDa之間的球狀蛋白。
在低的離子強(qiáng)度和低pH條件下進(jìn)行rDSPAα1和親和樹脂的結(jié)合。實(shí)質(zhì)上從疏水作用樹脂收集的全部rDSPAα1都結(jié)合到柱上。通過提高pH和/或離子強(qiáng)度選擇性地洗脫rDSPAα1?？梢允褂梅侄位蛘呔€型梯度(通常使用含有200mM甘氨酸、不含堿的洗脫液)進(jìn)行洗脫，當(dāng)使用聚丙烯酰胺葡聚糖S-400基質(zhì)時(shí)，優(yōu)選地使用含有19％乙醇、20mM HCl的緩沖液來平衡，一直到洗脫物的pH仍保持不變。將從疏水作用樹脂柱中的rDSPAα1組分上樣到基質(zhì)上，然后使用含有20mMHCl的緩沖液洗滌，一直到流出物的UV信號(hào)達(dá)到穩(wěn)定。使用含有200mM甘氨酸的緩沖液洗脫結(jié)合的rDSPAα1。在洗脫產(chǎn)物后，使用不少于2倍柱體積的含有100mM NaOH的緩沖液清理柱。使用至少2倍柱體積的洗滌緩沖液(20mM HCl)洗滌基質(zhì)，并將基質(zhì)保存在這種緩沖液中。
6．濃縮然后，一般可以通過過濾等濃縮本發(fā)明的純化的蛋白質(zhì)，最后冷凍干燥或滲入到常規(guī)的藥物制劑中。在科學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)很好地描述了有用的濃縮和冷凍干燥的方法。
B．制劑1.藥物組合物本發(fā)明提供了具有顯著治療價(jià)值的試劑。通過上述的方法純化的rDSPAα1在治療動(dòng)脈和靜脈血栓形成中是有用的。
可以給患者施用通過本文的描述純化的重組rDSPAα1，這種試劑可以和其它成分(例如常規(guī)的藥學(xué)上可接受的載體或者稀釋液以及生理上無毒的穩(wěn)定劑和賦形劑)組合使用來治療疾病。可以將這些組合物進(jìn)行無菌過濾，在藥瓶中凍干以制成藥劑或以穩(wěn)定的含水制劑形式貯存起來。
有效的治療所需劑量取決于許多不同的因素，包括施用的方式、患者的生理狀態(tài)以及施用的其它藥物。因此，應(yīng)該確定治療劑量以保證安全性和有效性。一般來說，體外施用這種試劑的劑量可以對(duì)原位施用的量提供有用的幫助。用于治療的有效量的動(dòng)物試驗(yàn)將進(jìn)一步提供對(duì)人的施用劑量的預(yù)測(cè)性指標(biāo)。例如Gilman等(1990)編輯的Goodman和Gilman的治療的藥物基礎(chǔ)，第8版Pergamon出版社；和Remington的藥物科學(xué)，第8版(1990),Mack出版公司，Easton,Penn．(本文一并參考)對(duì)各種情況進(jìn)行了描述。在下文中討論了施用方法，例如口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或者肌內(nèi)施用、經(jīng)眼擴(kuò)散等。藥學(xué)上可接受的載體包括水、鹽水、緩沖液和Merck手冊(cè)(Merck & Co.,Rahway,New Jersey)中描述的其它化合物。在所說的其他的纖溶酶原激活物的基礎(chǔ)上，期望需要的總劑量在80-110mg(醫(yī)生手冊(cè)，第49版(1995)，醫(yī)用經(jīng)濟(jì)數(shù)據(jù)出版公司，pp1083-1085)。
可以以任何常規(guī)劑量的制劑施用用于治療的制劑。單獨(dú)地施用活性成分是可行的，但是優(yōu)選的是這種活性成分作為藥物制劑形式存在。制劑至少包括上述提及的活性成分以及一種或多種可接受的載體。每個(gè)載體必須是藥學(xué)上和生理上可接受的，且能和其他成分相容，并不對(duì)患者產(chǎn)生損害。所說的制劑包括那些口服或胃腸外(包括皮下，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)以及眼內(nèi))施用的制劑。所說的制劑可以通常以單位劑量的形式存在，并可以通過藥學(xué)領(lǐng)域人員熟知的方法制備。參見Gilman等，同上和Remington同上。
概括地說，本發(fā)明概述中描述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案如下從生物培養(yǎng)基中分離和純化rDSPAα1的方法，該方法包括下列步驟(a)在pH5時(shí)將培養(yǎng)基加入到陽離子交換樹脂上，所說的陽離子樹脂由共價(jià)結(jié)合到多亞乙基二胺硅烷上的硅微粒的基質(zhì)組成，其中多亞乙基二胺硅烷的氨基基團(tuán)用羧基基團(tuán)衍生化，這使得rDSPAα1選擇性地結(jié)合到陽離子交換樹脂上；(b)在pH5時(shí)使用100mM NaOAc和在pH7.5時(shí)使用50mM NaPO4洗滌陽離子交換樹脂以除去非rDSPAα1蛋白質(zhì)和非蛋白雜質(zhì)；(c)在pH7.5時(shí)使用含有50mM磷酸鈉和500mM氯化鈉的緩沖液從陽離子交換樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(d)在pH4把步驟(c)的含有rDSPAα1的洗脫液加入到疏水作用樹脂上，所說的疏水作用樹脂由乙二醇和異丁烯酸型聚合物(用丁基基團(tuán)衍生化的)的共聚合反應(yīng)合成的半剛性球形珠組成，這使得rDSPAα1選擇性地結(jié)合到疏水作用樹脂上；(e)先使用20mM HCl，然后使用含有19％EtOH的20mM HCl洗滌疏水作用樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(f)使用含有29％乙醇和20mM鹽酸的緩沖液(pH2.5)從疏水作用樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(g)在pH2.5時(shí)將步驟(f)的含有rDSPAα1的洗脫液加入到親和層析樹脂上。所說的親和層析樹脂由烯丙基葡聚糖和N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)聚合物組成，其能分級(jí)分離20,000和8,000,000kDa之間的球狀蛋白，這使得親和層析樹脂選擇性地結(jié)合rDSPAα1；(h)使用20mM HCl洗滌親和層析樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(ⅰ)使用含有200mM甘氨酸的緩沖液(pH4-5)從親和層析樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1，以便產(chǎn)生水溶液形式的實(shí)質(zhì)上純化的rDSPAα1。
提供下面的特定的制劑和實(shí)施例目的是指導(dǎo)實(shí)施本發(fā)明，而無意于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。
實(shí)施例1通過細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生rDSPAα1將來自DSPA工作細(xì)胞庫的小瓶解凍，并接種在含有5％胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(WEC5.0培養(yǎng)基，Williams E制造)的一個(gè)搖瓶中。在兩周的時(shí)間內(nèi)，將這些細(xì)胞擴(kuò)展到4個(gè)搖瓶中，使用胰蛋白酶處理搖瓶中的細(xì)胞，并接種到4個(gè)1升的旋轉(zhuǎn)燒瓶中，其中1升生長(zhǎng)培養(yǎng)基中含有4×108個(gè)細(xì)胞。4天后，用4個(gè)旋轉(zhuǎn)燒瓶中的培養(yǎng)物接種10升的生物反應(yīng)器。在接種的當(dāng)天向生物反應(yīng)器中另外加入1升的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。第二天，使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基將生物反應(yīng)器中的液體加至10升。之后在加入和不加入微載體珠的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)基的pH控制在7.0-7.4，在任何時(shí)候通過噴灑系統(tǒng)保持氧合作用。溫度保持在34-39℃。
接種當(dāng)天生物反應(yīng)器中的細(xì)胞密度是8.1×105個(gè)細(xì)胞/毫升，2天后，細(xì)胞密度加倍，此時(shí)的灌注速率為每天0.5培養(yǎng)物體積(cv/天)。灌注速度隨細(xì)胞密度增加，這樣在接種生物反應(yīng)器9天后，細(xì)胞密度達(dá)到6.2×106個(gè)細(xì)胞/毫升，灌注速度增加到2cv/天。
然后生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)換成為生產(chǎn)培養(yǎng)基(在WEC5.0培養(yǎng)基中含有1％胎牛血清)，2天后，開始收集生產(chǎn)的產(chǎn)物，持續(xù)到10周。在此生產(chǎn)階段，平均細(xì)胞密度是15×106/毫升，其中大約有75％有生存力。平均rDSPAα1產(chǎn)量是每升40毫克rDSPAα1，平均比生產(chǎn)速率是每天每細(xì)胞6微微克rDSPAα1。
通過將反應(yīng)器中一半的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到新的容器中，來擴(kuò)展發(fā)酵體積。將2個(gè)生物反應(yīng)器都放進(jìn)生產(chǎn)培養(yǎng)基，灌注速率為2cv/天，立即進(jìn)行產(chǎn)物的收獲。
實(shí)施例2rDSPAα1的純化1．陽離子交換樹脂層析(柱A)。將生物反應(yīng)器的收獲物貯存在環(huán)境溫度(15-25℃)下。然后在加入到陽離子交換樹脂上之前，將其通過0.45微米濾膜過濾。使用由J.T.Baker制造的CBX樹脂通過層析步驟(柱A)對(duì)收獲物開始進(jìn)行純化。此步驟對(duì)所說的蛋白質(zhì)的純化具有重要意義。
柱A緩沖液包括緩沖液A1(平衡緩沖液(50mM NaoAc,pH5.0))、緩沖液A2(洗滌緩沖液(50mM NaPO4,pH7.5))、緩沖液A3(洗脫緩沖液(50mMNaPO4,500mM NaCl,pH7.5))、緩沖液A4(汽提緩沖液(2M NaAc,pH8.0))、緩沖液A5(貯存緩沖液(45％EtOH,10％HoAc))。
下列柱操作參數(shù)適合于裝載6kg樹脂，柱體積為5升的柱。每次跑柱可以裝載不超過4.5克的rDSPAα1。以不超過2升/分鐘的流速和不超過20psi的柱壓裝載此柱。在每次跑柱之前檢查此柱和檢測(cè)器的狀況。使用前，通過噴灑氦來除去裝載材料和層析緩沖液中的氣體。
使用1.2mM濾膜過濾生物反應(yīng)器的產(chǎn)物，然后使用冰醋酸滴定到pH為5.00(±0.10)。裝載前，用不少于30升的緩沖液A1平衡此柱，直到流出物的pH為5.00(±0.20)。柱平衡后，將收獲物裝載到此柱上。使用不少于80升的緩沖液A1對(duì)此柱進(jìn)行預(yù)平衡。將此柱預(yù)平衡到流出物的pH為5.00(±0.20)并達(dá)到穩(wěn)定的UV基線時(shí)。使用不少于145升的緩沖液A2洗滌此柱。將此柱洗滌到流出物的pH為7.50(±0.20)并達(dá)到穩(wěn)定的UV基線時(shí)。
使用不少于30升的緩沖液A3從此柱中洗脫產(chǎn)物，并收集到分離的容器中。當(dāng)達(dá)到穩(wěn)定的UV基線時(shí)，洗脫達(dá)到完全的純度。洗脫完產(chǎn)物后，使用不少于30升的緩沖液A4清理此柱直到達(dá)到穩(wěn)定的UV基線時(shí)。然后洗凈此柱，以便再用(不要超過50個(gè)使用循環(huán))。將柱A產(chǎn)物(或洗脫物)貯存在2-8℃。洗脫物的平均回收率為93％，平均蛋白質(zhì)純度為81％。
2．疏水作用層析(柱B)。在CBX樹脂上層析后，使用C4疏水作用樹脂(Toso-Haas)(柱B)對(duì)rDSPAα1產(chǎn)物進(jìn)行層析。此步驟能夠有力地除去非蛋白雜質(zhì)，并有助于滅活/除去可能的病毒雜質(zhì)。柱B緩沖液包括緩沖液B1(平衡緩沖液(50mM NaoAc,500mM NaCl,pH4.0))、緩沖液B2(洗滌和貯存緩沖液(20mM HCl)、緩沖液B3(洗滌緩沖液(20mM HCl,19％EtOH))、緩沖液B4(洗滌緩沖液(20mM HCl,20.5％EtOH))、緩沖液B5(洗脫緩沖液(20mM HCl,29.5％EtOH)、緩沖液B6(清理緩沖液(0.1NNaOH))。下列柱操作參數(shù)適合于15升的柱體積。每次跑柱可以裝載不超過9克的rDSPAα1。以不超過2升/分鐘的流速和不超過20psi的柱壓裝載此柱。在每次跑柱之前檢查此柱和檢測(cè)器的狀況。
裝載前，平衡此柱直到流出物的pH為4.00(±0.20)。使用冰乙酸滴定柱A的洗脫物至pH為4.00(±0.10)，脫氣并裝載。使用不少于30升的緩沖液B1預(yù)平衡此柱，直到流出物的pH為4.00(±0.20)，并且達(dá)到穩(wěn)定的UV基線。使用3種緩沖液洗滌此柱。第一種緩沖液是不少于45升的緩沖液B2。一直洗滌到流出物的pH為1.90(±0.20)并達(dá)到穩(wěn)定的UV基線。第二次洗滌使用不少于145升的緩沖液B3，直到達(dá)到穩(wěn)定的UV基線。第三次洗滌使用不少于30升的緩沖液B4，直到達(dá)到穩(wěn)定的UV基線。
使用不少于30升的緩沖液B5從此柱中洗脫rDSPAα1，并收集在分離的容器中。洗脫持續(xù)到達(dá)到穩(wěn)定的UV基線。然后清洗此柱以便再利用(使用不要超過50個(gè)循環(huán))。進(jìn)一步處理前將柱B產(chǎn)物(或洗脫物)貯存在2-8℃，不要超過15天。洗脫物的平均回收率為91％，平均蛋白質(zhì)純度為97％。
3．親和層析(柱C)。使用聚丙烯酰胺葡聚糖S-400(Phamracia)(柱C)將柱B產(chǎn)物進(jìn)一步層析。此步驟有利于緩沖液與輔助制劑交換，另外有助于滅活/除去病毒雜質(zhì)。柱C緩沖液包括緩沖液C1(平衡緩沖液(20mMHCl,19％EtOH))、緩沖液C2(洗滌緩沖液(20mM HCl))、緩沖液C3(洗滌和貯存緩沖液(200mM甘氨酸，無菌過濾))、緩沖液C4(清理緩沖液(0.1NNaOH))。下列柱操作參數(shù)適合于10升柱體積。每次跑柱可以裝載不超過20克的rDSPAα1。以不超過0.5升/分鐘的流速和不超過15psi的柱壓裝載此柱。將一個(gè)或多個(gè)柱B的洗脫物合并，然后用一份緩沖液C2和兩份緩沖液5洗脫物稀釋。最后的乙醇濃度為大約19％。
裝載前，將此柱用不少于15升的緩沖液C1平衡直到流出物的pH為1.80(±0.20)。裝載后，用不少于30升的緩沖液C2洗滌此柱。將此柱洗滌到UV信號(hào)穩(wěn)定。使用不少于20升的緩沖液C3將所說的產(chǎn)物從柱中洗脫下來，并收集在分離的容器中。洗脫持續(xù)到UV基線穩(wěn)定。
所說的產(chǎn)物洗脫后，使用不少于12升的緩沖液C4清理此柱，并貯存起來，直到使用20次為止。用緩沖液C3將柱C產(chǎn)物(洗脫物)稀釋到濃度小于1mg/ml，并在進(jìn)一步處理前貯存在2-8℃。rDSPAα1的平均回收率為97％，洗脫物平均蛋白質(zhì)純度為98％。
在完成上述的純化過程后，對(duì)S-400親和柱洗脫物進(jìn)行濃縮和配制，這種洗脫物貯存不超過70天。將柱C洗脫物合并，并通過能夠除去低分子量物質(zhì)的螺旋卷超濾膜(30,000道爾頓截?cái)嘀?濃縮所說的洗脫物。將所得的產(chǎn)物以高于8mg/ml的濃度收集在無致熱物的容器中。加入甘露糖醇，使之終濃度為4％。
加入最終制劑緩沖液(200mM甘氨酸，4％甘露糖醇(w/v)，使大量配制的產(chǎn)物的終濃度為7.5mg/ml。然后將大量配制的產(chǎn)物進(jìn)行過濾滅菌，分裝在藥水瓶中并凍干。
參照本發(fā)明的特定實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)地描述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改良，在不偏離本發(fā)明的宗旨和范圍的情況下可以取代本發(fā)明的等同部分。此外，在不偏離本發(fā)明的宗旨和范圍的情況下可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行很多改良，并取代本發(fā)明的等同部分。此外，也可以進(jìn)行很多改良以便使特定的條件、物質(zhì)、物質(zhì)的組合、方法、某個(gè)加工步驟或多個(gè)加工步驟適應(yīng)于本發(fā)明的目的、宗旨和范圍。所有這些改良都應(yīng)該在本文所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種從生物培養(yǎng)基中純化rDSPAα1的方法，該方法包括下列步驟(a)在導(dǎo)致rDSPAα1和陽離子交換樹脂選擇性地結(jié)合的裝載條件下將培養(yǎng)基加入到陽離子交換樹脂上；(b)可以洗滌也可以不洗滌陽離子交換樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(c)從陽離子交換樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(d)在導(dǎo)致rDSPAα1和疏水作用樹脂選擇性地結(jié)合的裝載條件下將步驟(c)中的含有rDSPAα1的洗脫液加入到疏水作用樹脂上；(e)可以洗滌也可以不洗滌疏水作用樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(f)從疏水作用樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(g)在導(dǎo)致rDSPAα1和親和層析樹脂選擇性結(jié)合的裝載條件下將步驟(f)中的含有rDSPAα1的洗脫液加入到親和層析樹脂上；(h)可以洗滌也可以不洗滌親和層析樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(ⅰ)從親和層析樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1，以產(chǎn)生水溶液形式的實(shí)質(zhì)上純化的rDSPAα1。
2．權(quán)利要求1的方法，其中的生物培養(yǎng)基是條件培養(yǎng)基。
3．權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(a)中的陽離子交換樹脂由用羧基或者羧烷基基團(tuán)衍生的硅凝膠微粒、交聯(lián)瓊脂糖或者交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯聚合物組成。
4．權(quán)利要求3的方法，其中的陽離子交換樹脂由共價(jià)結(jié)合到多亞乙基二胺硅烷上的硅微粒的基質(zhì)組成，其中多亞乙基二胺硅烷的氨基基團(tuán)已用羧基基團(tuán)衍生化。
5．權(quán)利要求3的方法，其中在步驟(a)中的裝載條件包括在pH4-7之間使用培養(yǎng)基。
6．權(quán)利要求4的方法，其中使用含有50mM NaPhos和100mM-500mM NaCl的緩沖液和相同離子強(qiáng)度的緩沖液進(jìn)行步驟(c)中的rDSPAα1洗脫。
7．權(quán)利要求1的方法，其中在(d)步驟中的疏水作用樹脂是一種不帶電荷的的樹脂，其用長(zhǎng)度為1-10個(gè)碳原子的烷基鏈或者芳香基-烷基基團(tuán)衍生化。
8．權(quán)利要求7的方法，其中不帶電荷的的樹脂由硅凝膠微粒、交聯(lián)瓊脂糖或者交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯聚合物組成。
9．權(quán)利要求7的方法，其中不帶電荷的的樹脂由乙二醇和異丁烯酸型聚合物(用丁基基團(tuán)衍生化的)的共聚合反應(yīng)合成的半剛性球形珠組成。
10．權(quán)利要求9的方法，其中在步驟(d)中的裝載的條件包括在pH3-5之間使用步驟(c)的洗脫液。
11．權(quán)利要求9的方法，其中在步驟(d)中的裝載的條件包括在含有50mM NaPhos和500mM NaCl(用磷酸將pH調(diào)節(jié)到4)或相同離子強(qiáng)度的緩沖液進(jìn)行步驟(c)中的洗脫。
12．權(quán)利要求9的方法，其中在步驟(f)中的洗脫是使用含有20mMHCl并具有大于25％的乙醇濃度的緩沖液來完成的。
13．權(quán)利要求12的方法，其中乙醇濃度在28.5％和30％之間。
14．權(quán)利要求12的方法，其中乙醇濃度是29％。
15．權(quán)利要求1的方法，其中步驟(g)中的親和層析樹脂由以直徑為25-75μm的珠的形式的烯丙基葡聚糖和N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物組成。
16．權(quán)利要求15的方法，其中所說的珠能夠分級(jí)分離20,000-8,000,000kDa的球狀蛋白。
17．權(quán)利要求15的方法，其中所說的步驟(g)中的裝載條件包括在pH1-4時(shí)使用步驟(f)的洗脫液。
18．權(quán)利要求15的方法，其中所說的步驟(ⅰ)中的洗脫是使用含有200mM甘氨酸的緩沖液(pH3-6)或具有相等離子強(qiáng)度的緩沖液來完成的。
19．權(quán)利要求1的方法，該方法還包括濃縮rDSPAα1的水溶液。
20．權(quán)利要求19的方法，該方法還包括冷凍干燥濃縮的rDSPAα1溶液。
21．權(quán)利要求1的方法，該方法還包括濃縮rDSPAα1的水溶液和冷凍干燥濃縮的rDSPAα1溶液。
22．權(quán)利要求1的方法，其中所說的方法包括下列步驟(a)在pH4-7時(shí)將培養(yǎng)基加入到陽離子交換樹脂上，所說的樹脂由用羧基或者羧烷基基團(tuán)衍生化的硅凝膠微粒、交聯(lián)瓊脂糖或者交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯聚合物組成，這使得rDSPAα1選擇性地結(jié)合到陽離子交換樹脂上。(b)可以洗滌也可以不洗滌陽離子交換樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(c)使用含有50mM磷酸鈉和100mM-500mM NaCl的緩沖液或相同離子強(qiáng)度的緩沖液從陽離子交換樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1。(d)在pH3-5時(shí)將步驟(c)中的含有rDSPAα1的洗脫液加入到疏水作用樹脂上，所說的疏水作用樹脂由硅膠微粒、交聯(lián)瓊脂糖或者交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯聚合物組成，這使得rDSPAα1選擇性地結(jié)合到疏水作用樹脂上；(e)洗滌疏水作用樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(f)使用含有20mM HCl并具有大于25％的乙醇濃度的緩沖液從疏水作用樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(g)在pH1-4之間將步驟(f)中的含有rDSPAα1的洗脫液加入到親和層析樹脂上，所說的親和層析樹脂由以直徑為25-75μm的珠形式的烯丙基葡聚糖和N,N ′-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物組成，這使得rDSPAα1選擇性地結(jié)合到親和層析樹脂上；(h)可以洗滌也可以不洗滌親和層析樹脂以除去非rDSPAα1蛋白質(zhì)和非蛋白雜質(zhì)；(ⅰ)使用含有200mM甘氨酸的緩沖液(pH3-6)或具有相同離子強(qiáng)度的緩沖液從親和層析樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1，以便產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上純化的水溶液形式的rDSPAα1。
23．一種從生物培養(yǎng)基中分離和純化rDSPAα1的方法，該方法包括下列步驟(a)在pH5時(shí)將培養(yǎng)基加入到陽離子交換樹脂上，所說的陽離子樹脂由共價(jià)結(jié)合到多亞乙基二胺硅烷上的硅微粒的基質(zhì)組成，其中的氨基基團(tuán)已由羧基基團(tuán)衍生化，這使得rDSPAα1選擇性地結(jié)合到陽離子交換樹脂上；(b)在pH5時(shí)使用100mMNaOAc和在pH7.5時(shí)使用50mM NaPO4洗滌陽離子交換樹脂以除去非rDSPAα1蛋白質(zhì)和非蛋白雜質(zhì)；(c)在pH7.5時(shí)使用含有50mM磷酸鈉和500mM氯化鈉的緩沖液從陽離子交換樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(d)在pH4將含有rDSPAα1的洗脫液加入到疏水作用樹脂上，所說的疏水作用樹脂由乙二醇和異丁烯酸型聚合物(用丁基基團(tuán)衍生化的)的共聚合反應(yīng)合成的半剛性球形珠組成，這使得rDSPAα1選擇性地結(jié)合到疏水作用樹脂上；(e)先使用20mM HCl，然后使用含有19％EtOH的20mM HCl洗滌疏水作用樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(f)使用含有29％乙醇和20mM鹽酸的緩沖液(pH2.5)從疏水作用樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(g)在pH2.5時(shí)將步驟(f)的含有rDSPAα1的洗脫液加入到親和層析樹脂上，所說的親和層析樹脂由烯丙基葡聚糖和N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)聚合物組成，其能分級(jí)分離20,000和8,000,000kDa之間的球狀蛋白，這使得親和層析樹脂選擇性地結(jié)合rDSPAα1。(h)使用20mMHCl洗滌親和層析樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(ⅰ)使用含有200mM甘氨酸的緩沖液(pH4-5)從親和層析樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1，以便產(chǎn)生水溶液形式的實(shí)質(zhì)上純化的rDSPAα1。
24．重組DSPAα1，其中所說的rDSPAα1是通過包括下列步驟的方法純化的(a)在導(dǎo)致rDSPAα1和陽離子交換樹脂選擇性地結(jié)合的裝載條件下將培養(yǎng)基加入到陽離子交換樹脂上；(b)可以洗滌也可以不洗滌陽離子交換樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(c)從陽離子交換樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(d)在導(dǎo)致rDSPAα1和疏水相互作用樹脂選擇性地結(jié)合的裝載條件下將步驟(c)中的含有rDSPAα1的洗脫液加入到疏水作用樹脂上；(e)可以洗滌也可以不洗滌疏水作用樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(f)從疏水作用樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(g)在導(dǎo)致rDSPAα1和親和層析樹脂選擇性地結(jié)合的裝載條件下將步驟(f)中的含有rDSPAα1的洗脫液加入到親和層析樹脂上；(h)可以洗滌也可以不洗滌親和層析樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(ⅰ)從親和層析樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1，以產(chǎn)生水溶液形式的實(shí)質(zhì)上純化的rDSPAα1。
25．權(quán)利要求24的重組DSPAα1，其中所說的rDSPAα1是通過包括下列步驟的方法純化的(a)在pH5時(shí)將培養(yǎng)基加入到陽離子交換樹脂上，所說的陽離子樹脂由共價(jià)結(jié)合到多亞乙基二胺硅烷上的硅微粒的基質(zhì)構(gòu)成，其中的氨基基團(tuán)已用羧基基團(tuán)衍生化，這使得rDSPAα1選擇性地結(jié)合到陽離子交換樹脂上；(b)在pH5時(shí)使用100mMNaOAc和在pH7.5時(shí)使用50mM NaPO4洗滌陽離子交換樹脂以除去非rDSPAα1蛋白質(zhì)和非蛋白雜質(zhì)；(c)在pH7.5時(shí)使用含有50mM磷酸鈉和500mM氮化鈉的緩沖液從陽離子交換樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(d)在pH4將步驟(c)的含有rDSPAα1的洗脫液加入到疏水作用樹脂上，所說的疏水作用樹脂由乙二醇和異丁烯酸型聚合物(用丁基基團(tuán)衍生化的)的共聚合反應(yīng)合成的半剛性球形珠組成，這使得rDSPAα1選擇性地結(jié)合到疏水作用樹脂上；(e)先使用20mM HCl，然后使用含有19％EtOH的20mM HCl洗滌疏水作用樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(f)使用含有29％乙醇和20mM鹽酸的緩沖液(pH2.5)從疏水作用樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(g)在pH2.5時(shí)將步驟(f)的含有rDSPAα1的洗脫液加入到親和層析樹脂上，所說的親和層析樹脂由烯丙基葡聚糖和N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)聚合物組成，其能分級(jí)分離20,000和8,000,000kDa之間的球狀蛋白，這使得親和層析樹脂選擇性地結(jié)合rDSPAα1。(h)使用20mM HCl洗滌親和層析樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(ⅰ)使用含有200mM甘氨酸的緩沖液(pH4-5)從親和層析樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1，以便產(chǎn)生水溶液形式的實(shí)質(zhì)上純化的rDSPAα1。
26．一種含有rDSPAα1的藥物組合物，其中所說的rDSPAα1是通過包括下列步驟的方法純化的(a)在導(dǎo)致rDSPAα1和陽離子交換樹脂選擇性地結(jié)合的裝載條件下將培養(yǎng)基加入到陽離子交換樹脂上；(b)可以洗滌也可以不洗滌陽離子交換樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(c)從陽離子交換樹脂中選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(d)在導(dǎo)致rDSPAα1和疏水相互作用樹脂選擇性地結(jié)合的裝載條件下將步驟(c)中的含有rDSPAα1的洗脫液加入到疏水作用樹脂上；(e)可以洗滌也可以不洗滌疏水作用樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(f)從疏水作用樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(g)在導(dǎo)致rDSPAα1和親和層析樹脂選擇性地結(jié)合的裝載條件下將步驟(f)中的含有rDSPAα1的洗脫液加入到親和層析樹脂上；(h)可以洗滌也可以不洗滌親和層析樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(ⅰ)從親和層析樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1，以產(chǎn)生水溶液形式的實(shí)質(zhì)上純化的rDSPAα1。
27．權(quán)利要求26的藥物組合物，在其中加入了藥學(xué)上可接受的賦形劑。
28．權(quán)利要求27的藥物組合物，其中的賦形劑是甘露糖醇。
29．權(quán)利要求26的藥物組合物，其中所說的rDSPAα1是通過包括下列步驟的方法純化的(a)在pH5時(shí)將培養(yǎng)基加入到陽離子交換樹脂上，所說的陽離子樹脂由共價(jià)結(jié)合到多亞乙基二胺硅烷的硅微粒上的基質(zhì)組成，其中的氨基硅烷已用羧基基團(tuán)衍生化，這使得rDSPAα1選擇性地結(jié)合到陽離子交換樹脂上；(b)在pH5時(shí)使用100mM NaOAc和在pH7.5時(shí)使用50mM NaPO4洗滌陽離子交換樹脂以除去非rDSPAα1蛋白質(zhì)和非蛋白雜質(zhì)；(c)在pH7.5時(shí)使用含有50mM磷酸鈉和500mM氯化鈉的緩沖液從陽離子交換樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(d)在pH4將步驟(c)的含有rDSPAα1的洗脫液加入到疏水作用樹脂上，所說的疏水作用樹脂由乙二醇和異丁烯酸型聚合物(用丁基基團(tuán)衍生化的)共聚合反應(yīng)合成的半剛性球形珠組成，這使得rDSPAα1選擇性地結(jié)合到疏水作用樹脂上；(e)先使用20mMHCl，然后使用含有19％EtOH的20mMHCl洗滌疏水作用樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(f)使用含有29％乙醇和20mM鹽酸的緩沖液(pH2.5)從疏水作用樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(g)在pH2.5時(shí)將步驟(f)的含有rDSPAα1的洗脫液加入到親和層析樹脂上，所說的親和層析樹脂由烯丙基葡聚糖和N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)聚合物組成，其能分級(jí)分離20,000和8,000,000kDa之間的球狀蛋白，這使得親和層析樹脂選擇性地結(jié)合rDSPAα1。(h)使用20mM HCl洗滌親和層析樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(ⅰ)使用含有200mM甘氨酸的緩沖液(pH4-5)從親和層析樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1，以便產(chǎn)生水溶液形式的實(shí)質(zhì)上純化的rDSPAα1。
30．權(quán)利要求29的藥物組合物，在其中加入了藥學(xué)上的可接受的賦形劑。
31．權(quán)利要求30的藥物組合物，其中的賦形劑是甘露糖醇。
32．一種治療患有動(dòng)脈或者靜脈血栓形成的患者的方法，該方法包括施用治療有效量的rDSPAα1，其中所說的rDSPAα1是通過包括下列步驟的方法純化的(a)在導(dǎo)致rDSPAα1和陽離子交換樹脂選擇性地結(jié)合的裝載條件下將培養(yǎng)基加入到陽離子交換樹脂上；(b)可以洗滌也可以不洗滌陽離子交換樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(c)從陽離子交換樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(d)在導(dǎo)致rDSPAα1和疏水相互作用樹脂選擇性地結(jié)合的裝載條件下將步驟(c)中的含有rDSPAα1的洗脫液加入到疏水作用樹脂上；(e)可以洗滌也可以不洗滌疏水作用樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(f)從疏水作用樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(g)在導(dǎo)致rDSPAα1和親和層析樹脂選擇性結(jié)合的裝載條件下將步驟(f)中的含有rDSPAα1的洗脫液加入到親和層析樹脂上；(h)可以洗滌也可以不洗滌親和層析樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(i)從親和層析樹脂選擇性地洗脫結(jié)合的rDSPAα1，以產(chǎn)生水溶液形式的實(shí)質(zhì)上純化的rDSPAα1。
33．權(quán)利要求32的方法，在其中加入了藥學(xué)上的可接受的賦形劑。
34．權(quán)利要求33的藥物組合物，其中的賦形劑是甘露糖醇。
35．權(quán)利要求32的方法，其中所說的rDSPAα1是通過包括下列步驟的方法純化的(a)在pH5時(shí)將培養(yǎng)基加入到陽離子交換樹脂上，所說的陽離子樹脂由共價(jià)結(jié)合到多亞乙基二胺硅烷上的硅微粒的基質(zhì)組成，其中的氨基基團(tuán)已用羧基基團(tuán)衍生化，這使得rDSPAα1選擇性地結(jié)合到陽離子交換樹脂上；(b)在pH5時(shí)使用100mM NaOAc和在pH7.5時(shí)使用50mM NaPO4洗滌陽離子交換樹脂以除去非rDSPAα1蛋白質(zhì)和非蛋白雜質(zhì)；(c)在pH7.5時(shí)使用含有50mM磷酸鈉和500mM氯化鈉的緩沖液從陽離子交換樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(d)在pH4將步驟(c)的含有rDSPAα1的洗脫液加入到疏水作用樹脂上，所說的疏水作用樹脂由乙二醇和異丁烯酸型聚合物(用丁基基團(tuán)衍生化的)的共聚合反應(yīng)合成的半剛性球形珠組成，這使得rDSPAα1選擇性地結(jié)合到疏水作用樹脂上；(e)先使用20mM HCl，然后使用含有19％EtOH的20mM HCl洗滌疏水作用樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(f)使用含有29％乙醇和20mM鹽酸的緩沖液(pH2.5)從疏水作用樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1；(g)在pH2.5時(shí)將步驟(f)的含有rDSPAα1的洗脫液加入到親和層析樹脂上，所說的親和層析樹脂由烯丙基葡聚糖和N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)聚合物組成，其能分級(jí)分離20,000和8,000,000kDa之間的球狀蛋白，這使得親和層析樹脂選擇性地結(jié)合rDSPAα1。(h)使用20mM HCl洗滌親和層析樹脂以除去非rDSPAα1蛋白和非蛋白雜質(zhì)；(ⅰ)使用含有200mM甘氨酸的緩沖液(pH4-5)從親和層析樹脂洗脫結(jié)合的rDSPAα1，以便產(chǎn)生水溶液形式的實(shí)質(zhì)上純化的rDSPAα1。
36．權(quán)利要求35的方法，在其中加入了藥學(xué)上可接受的賦形劑。
37．權(quán)利要求36的方法，其中的賦形劑是甘露糖醇。
全文摘要
以商業(yè)量和符合臨床標(biāo)準(zhǔn)的純度產(chǎn)生了rDSPAα1。該產(chǎn)生方法使用了一系列層析步驟:陽離子交換層析,其后為疏水作用層析,最后為親和層析。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1210559SQ97192081
公開日1999年3月10日 申請(qǐng)日期1997年1月31日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月5日
發(fā)明者M·麥克曼, E·龐戈, C·索德斯, M·P·譚 申請(qǐng)人:舍林股份公司