專利名稱：治療前列腺癌的TNF－β－樣蛋白,相關(guān)的核酸分子,藥物組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于治療患有雄激素非依賴型前列腺癌受試者的蛋白質(zhì)，本發(fā)明還涉及用于治療患有此病的受試者的核酸分子，藥物組合物和方法。發(fā)明背景在本申請(qǐng)上下文中，提到多篇文獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)所公開的內(nèi)容通過參考文獻(xiàn)引入本文以更完整地描述本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)。
前列腺癌是最常見的惡性腫瘤類型之一，50歲或50歲以上的男人中，30％人的前列腺中具有癌癥的病灶，但每年僅有1％患此病的男人被正確地診斷為前列腺癌，尸檢時(shí)揭示出的高發(fā)病率和臨床上揭示出的很低的發(fā)病率相比顯示出鮮明的差異。1992年，美國(guó)有134,000個(gè)男人被診斷為前列腺癌，32,000的患者死于此病。在臨床上被診斷為此病的所有男人中，盡管接受了治療，但一半以上在10年內(nèi)死亡，三分之二以上遭受局部或全身性的病痛折磨。最近，對(duì)血清中前列腺-特異性抗原(PSA)的檢測(cè)能做到較早地測(cè)定，但仍不清楚PSA升高但無大腫瘤負(fù)擔(dān)的患者中該疾病的自然進(jìn)程如何。
對(duì)于局限于前列腺的癌癥而言，初級(jí)放射療法或徹底地切除術(shù)的效力大致相當(dāng)。對(duì)于初期外科手術(shù)而言，放射療法可治療疾病的復(fù)發(fā)，而對(duì)于初級(jí)放射療法而言，用外科手術(shù)治療疾病的復(fù)發(fā)較困難。前列腺損害大多轉(zhuǎn)移至骨，通過降低受試者的雄激素水平可治療這種轉(zhuǎn)移。通過用藥物阻斷腎上腺和性腺雄激素的產(chǎn)生可在化學(xué)上做到這一點(diǎn)，或通過去勢(shì)(摘除睪丸，實(shí)際上未阻斷腎上腺產(chǎn)生)可在外科手術(shù)上做到這一點(diǎn)?；颊邔?duì)這種激素處理僅反應(yīng)6個(gè)月左右然后即惡化的事實(shí)表明轉(zhuǎn)移的前列腺損害可能變?yōu)樾奂に?非依賴型的。經(jīng)培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞系中含有混合克隆這一發(fā)現(xiàn)支持了上述觀點(diǎn)。這些混合的克隆有3種類型雄激素-依賴型，僅在外源雄激素的存在下存活；雄激素-敏感型，在無雄激素時(shí)可存活，但需有雄激素的存在才能增殖；和雄激素-非依賴型，在缺乏雄激素時(shí)可存活也可增殖。
在患有前列腺癌的受試者中，不少群體在臨床上顯示出雄激素非依賴性，即甚至在治療除去雄激素之后仍可繼續(xù)增殖的前列腺癌細(xì)胞的存在。除去前列腺腫瘤塊的外科手術(shù)經(jīng)常導(dǎo)致雄激素非依賴型細(xì)胞以及其它類型的細(xì)胞的去除。然而，在此方面僅靠外科手術(shù)很少有效，因?yàn)橹辽儆行┬奂に匾蕾囆图?xì)胞仍然存在。因此，存在一個(gè)強(qiáng)烈的(和不合適的)需求，即需要使用特異性抑制雄激素非依賴型癌細(xì)胞增殖的藥劑來治療前列腺癌的方法。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了重組蛋白質(zhì)和分離的蛋白質(zhì)，當(dāng)它們?cè)谶m當(dāng)條件下與雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞接觸時(shí)，可選擇性地抑制所述細(xì)胞的增殖，其氨基酸序列含有圖2所示的氨基酸序列或其功能衍生物。
本發(fā)明還提供了治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的藥物組合物，所述組合物含有本發(fā)明蛋白質(zhì)之一和藥物可接受的載體。
本發(fā)明還提供了基本上由編碼圖4之氨基酸序列的核酸序列或其功能衍生物組成的核酸分子，所述分子包括但不限于適用于治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的基因療法的核酸分子。
本發(fā)明還提供了治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的藥物組合物，所述組合物含有適于用作基因療法之載體的本發(fā)明的核酸分子和藥物可接受的載體。
本發(fā)明提供了當(dāng)在適當(dāng)條件下與雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞接觸時(shí)，可選擇性地殺死所述細(xì)胞的物質(zhì)組合(composition of matter)，該物質(zhì)組合含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)和能有效地與之粘附的毒性組分。
本發(fā)明也提供了治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的藥物組合物，所述組合物含有本發(fā)明的物質(zhì)組合和藥物可接受的載體。
最后，本發(fā)明提供了治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的方法，所述方法包括給受試者施用治療有效量的一種本發(fā)明的藥物組合物。附圖簡(jiǎn)述

圖1描述了GF-2H的DNA序列。
圖2A描述了成熟的GF-2H蛋白(被鑒定為“ACTIVE2H2”)的氨基酸序列和TGF-β家族其它成員之氨基酸序列之間的比較。
圖2B描述了未成熟的GF-2H蛋白的氨基酸序列。
圖3A描述了GF-2H的純化方案。
圖3B描述了rGF-2H的純化方案。
圖4描述了成熟的GF-2H的氨基酸序列。
圖5描述了編碼GF-2H的mRNA在不同組織中的表達(dá)。
圖6描述了成熟的GF-2H對(duì)前列腺癌細(xì)胞系PC-3的調(diào)節(jié)。
圖7描述了成熟的TGF-β對(duì)前列腺癌細(xì)胞系PC-3的調(diào)節(jié)。發(fā)明詳述β型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)是具有多種活性的多功能因子大家族的代表。TGF-β是生長(zhǎng)，分化和形態(tài)發(fā)生因子超家族的原型，所述因子如抑制素，活化素，穆勒氏抑制物，decapentaplegic產(chǎn)物，和TGF-β2，這些因子在結(jié)構(gòu)上都與TGF-β相關(guān)。另外，這些因子和與TGF-β相關(guān)的其它因子似乎參與組織發(fā)育和修復(fù)的很多過程(J.Massague,Ann.Rev.Cell.Biol.,1990,6:597-641)。
由于這些多種多樣的作用，一組TGF-β-樣蛋白可能具有用作特別地治療增殖性疾病之治療劑的潛力。然而，缺乏進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)資料，不可能預(yù)測(cè)具有已知氨基酸序列的TGF-β-樣蛋白是否對(duì)導(dǎo)致特殊疾病的增殖中的細(xì)胞具有抑制作用，同時(shí)在臨床上也不會(huì)導(dǎo)致不可接受的副作用。本發(fā)明的蛋白質(zhì)根據(jù)其一級(jí)結(jié)構(gòu)為TGF-β-樣蛋白，它能特異性地抑制雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞的增殖。然而，在缺乏進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)資料的情況下，僅根據(jù)氨基酸序列不能預(yù)測(cè)這種特異性。因此，本發(fā)明TGF-β-樣蛋白特異性的抗前列腺癌的活性是最出乎意料的。
更具體地，本發(fā)明提供了當(dāng)在適當(dāng)條件下與雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞接觸時(shí)，可選擇性地抑制所述細(xì)胞增殖的重組蛋白質(zhì)，其氨基酸序列含有圖4所示的氨基酸序列或其功能衍生物(“第一蛋白質(zhì)”)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一蛋白質(zhì)選自下文討論的，被稱為“rGF-2H”，“重組GF-2H”，或“重組的成熟GF-2H”的蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一蛋白質(zhì)是成熟的GF-2H。
本發(fā)明還提供了當(dāng)在適當(dāng)條件下與雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞接觸時(shí)，可選擇性地抑制所述細(xì)胞增殖的分離的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列由圖4所示的氨基酸序列或其功能衍生物組成(“第二蛋白質(zhì)”)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二蛋白質(zhì)選自下文討論的“GF-2H”和“成熟的GF-2H”。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二蛋白質(zhì)是成熟的GF-2H。
本文所用的重組蛋白質(zhì)是通過使用重組的核酸技術(shù)得到的蛋白質(zhì)。這種重組蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)可以與其天然形式的一級(jí)結(jié)構(gòu)相同，或可含有另外的氨基酸殘基。另外的殘基可存在于例如蛋白質(zhì)的N-末端和/或C-末端。分離的蛋白質(zhì)是指具有含50％以下蛋白質(zhì)雜質(zhì)之化學(xué)環(huán)境的任何蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的蛋白質(zhì)具有含10％以下蛋白質(zhì)雜質(zhì)的化學(xué)環(huán)境，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的蛋白質(zhì)具有含1％以下蛋白質(zhì)雜質(zhì)的化學(xué)環(huán)境。
在本文中，序列如圖4所示的蛋白質(zhì)的“功能衍生物”蛋白質(zhì)，是與序列如圖4所示的蛋白質(zhì)具有結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)和功能(即選擇性抑制雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞增殖)上的相似性的蛋白質(zhì)。結(jié)構(gòu)上相似的蛋白質(zhì)包括例如通過基本上不消除蛋白質(zhì)選擇性抑制雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞增殖之能力的氨基酸殘基缺失，插入或保守的取代而與圖4之蛋白質(zhì)有所不同的蛋白質(zhì)。保守氨基酸取代的例子是用亮氨酸殘基取代異亮氨酸殘基。
本文所用的“雄激素非依賴型”前列腺癌細(xì)胞是可在缺乏雄激素時(shí)存活以及增殖的前列腺癌細(xì)胞。本文所用的“增殖”指的是細(xì)胞群體通過細(xì)胞分裂而生長(zhǎng)，“選擇性抑制”雄激素非依賴型細(xì)胞增殖指的是在飽和條件下，并如在適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)(如與本發(fā)明蛋白質(zhì)最初接觸72小時(shí)之后)所測(cè)定，將雄激素非依賴型細(xì)胞增殖的體外速率至少降低50％，而未將HeLa細(xì)胞增殖的體外速率降低20％以上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將雄激素非依賴型細(xì)胞增殖的體外速率至少降低90％，而未將HeLa細(xì)胞增殖的體外速率降低10％以上。使用已知方法可容易地測(cè)定細(xì)胞增殖的速率，所述方法如下文所述的經(jīng)標(biāo)記胸苷摻入法。
第一和第二蛋白質(zhì)當(dāng)與雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞接觸時(shí)選擇性抑制所述細(xì)胞增殖的適當(dāng)條件是生理?xiàng)l件，即雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞周圍的化學(xué)環(huán)境，該環(huán)境可使雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞表面受體與其相應(yīng)的天然配體結(jié)合。根據(jù)已知方法易于在體外復(fù)制這種條件。
本發(fā)明另外還提供了治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的藥物組合物，所述組合物含有第一或第二蛋白質(zhì)和藥物可接受的載體(“第一藥物組合物”)。
藥物可接受的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，它包括但不限于0.01-0.1M，優(yōu)選為0.05M的磷酸鹽緩沖液或0.8％的鹽水。另外，這種藥物可接受的載體可以是含水或不含水的溶液，懸浮液和乳狀液。不含水的溶劑的例子是丙二醇，聚乙二醇，如橄欖油的植物油和如油酸乙酯的可注射用有機(jī)酯。含水的載體包括水，醇/水溶液，含有鹽水和緩沖介質(zhì)的乳狀液或懸浮液。非腸道用的載體包括氯化鈉溶液，林格葡萄糖，葡萄糖和氯化鈉，乳酸化的林格油或固定油。靜脈內(nèi)載體包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物，電解質(zhì)補(bǔ)充物，如基于林格葡萄糖的那些電解質(zhì)補(bǔ)充物等等。防腐劑和其它添加劑也可以存在，例如抗微生物劑，抗氧化劑，螯合劑，惰性氣體等等。
本文所用“受試者”指的是能發(fā)育或維持前列腺癌的任何動(dòng)物或人工修飾的動(dòng)物。人工修飾的動(dòng)物包括但不限于小鼠，大鼠，狗，豚鼠，雪貂，兔和靈長(zhǎng)類動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，人工修飾的動(dòng)物是患有誘導(dǎo)性前列腺癌的小鼠。這種動(dòng)物的例子是本領(lǐng)域中已知的(N.M.Greenberg等，P.N.A S.美國(guó)，92:3439-3443(1995)；T.C.Thompson等，癌癥71:1165-1171(1993))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者是人。
本發(fā)明另外還提供了治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的方法，所述方法包括給受試者施用治療有效量的第一藥物組合物。
本文所用的施用可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法中的任一種來實(shí)現(xiàn)或進(jìn)行。施用包括靜脈內(nèi)施用，肌內(nèi)施用和皮下施用。
第一藥物組合物的治療有效量是足以選擇性抑制患病受試者之雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞增殖的劑量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)患病受試者的治療包括在一段時(shí)間內(nèi)施用多份治療有效劑量。通過已知方法可確定劑量和時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效量為0.1μg/kg至1mg/kg，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療有效量為1μg/kg至100μg/kg。
本發(fā)明另外還提供了基本上由編碼圖4之氨基酸序列的核酸序列或其功能衍生物組成的核酸分子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子是RNA分子，在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子是DNA分子(如cDNA或基因組DNA),DNA分子可含有圖1所示的核苷酸序列。
在另外的實(shí)施方案中，核酸分子是表達(dá)載體。可使用多種表達(dá)載體。這樣的載體，包括質(zhì)粒載體，粘粒載體，噬菌體載體和其它病毒，是本領(lǐng)域已知的。例如，一類載體利用得自動(dòng)物病毒的DNA元件，所述動(dòng)物病毒如牛乳頭瘤病毒，多瘤病毒，腺病毒，痘苗病毒，桿狀病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒(RSV,MMTV或MoMLV)，塞姆利基森林病毒或SV40病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體是pCI。另外，適用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞，調(diào)節(jié)元件和轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域中已知的。
在另外的實(shí)施方案中，核酸分子是適用于治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的基因療法的載體?；虔煼ǖ妮d體和傳遞所述載體的方法是本領(lǐng)域中已知的，這種傳遞方法包括但不限于經(jīng)由腺病毒和陽(yáng)離子脂質(zhì)體以及經(jīng)由裸露的DNA的傳遞。另外，本發(fā)明的載體可以被導(dǎo)入來自體內(nèi)(ex vivo)的適當(dāng)細(xì)胞中(如外周血單核細(xì)胞(PBMNC))，然后再被導(dǎo)入患病的受試者體內(nèi)，這種來自體內(nèi)的方法是本領(lǐng)域中已知的。
本發(fā)明另外還提供了治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的藥物組合物，所述組合物含有本發(fā)明適用于基因療法的核酸分子和藥物可接受的載體(“第二藥物組合物”)。
本發(fā)明另外還提供了治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的方法，所述方法包括給受試者施用治療有效量的第二藥物組合物。
第二藥物組合物的治療有效量是能有效導(dǎo)致受試者的細(xì)胞產(chǎn)生和分泌由其中的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的劑量，所述蛋白質(zhì)反過來選擇性抑制患病受試者之雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞的增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)患病受試者的治療包括在一段時(shí)間內(nèi)施用多份治療有效劑量。通過已知方法可確定劑量和時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二藥物組合物的治療有效量為每個(gè)受試者104至1011個(gè)DNA分子，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療有效量為每個(gè)受試者105至1010個(gè)DNA分子。
本發(fā)明也提供了當(dāng)在適當(dāng)條件下與雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞接觸時(shí)，可選擇性地殺死所述細(xì)胞的物質(zhì)組合，該物質(zhì)組合含有第一或第二蛋白質(zhì)和有效地與之粘附的毒性組分。
毒性組分可以是蛋白質(zhì)類的毒素，在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)類的毒素選自蓖麻毒蛋白，破傷風(fēng)毒素，白喉毒素及其亞單位和片段。毒性組分也可以是放射性核素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，毒性組分是放射α射線或β射線的放射性核素，包括但不限于125I,131I,90Y,212Bi。將毒性組分與蛋白質(zhì)有效粘附的方法是本領(lǐng)域中已知的。
本發(fā)明也提供了治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的藥物組合物，所述組合物含有本發(fā)明的物質(zhì)組合和藥物可接受的載體(“第三藥物組合物”)。
本發(fā)明另外還提供了治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的方法，所述方法包括給受試者施用治療有效量的第三藥物組合物。
本文所用“選擇性殺死”雄激素非依賴型細(xì)胞指的是在飽和條件下，并如在適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)(如與本發(fā)明組合物最初接觸72小時(shí)之后)所測(cè)定，在體外至少殺死50％雄激素非依賴型細(xì)胞，而不會(huì)在體外殺死20％以上的HeLa細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物在體外至少殺死90％雄激素非依賴型細(xì)胞，而不會(huì)在體外殺死10％以上的HeLa細(xì)胞。使用包括例如臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)的已知方法可容易地測(cè)定細(xì)胞死亡。
第三藥物組合物的治療有效量是足以選擇性殺死患病受試者之雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞的劑量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)患病受試者的治療包括在一段時(shí)間內(nèi)施用多份治療有效劑量。通過已知方法可確定劑量和時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效量為0.1μg/kg至1mg/kg，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療有效量為1μg/kg至100μg/kg。
參照下文實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)將能更好地理解本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得詳細(xì)描述的具體實(shí)驗(yàn)僅是為了闡明本發(fā)明，在下文的權(quán)利要求書中更完整地描述了本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)材料和方法rIFN-γ購(gòu)自Boehringer和Mannheim(＞2×107個(gè)單位/mg)。表達(dá)載體pCI,pcDNA3和pSV2-dhfr分別得自Promega,Invitrogen和美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。細(xì)胞培養(yǎng)基得自GIBCO和BioWhittaker，胎牛血清得自Hyclone，重組的人TGF-β得自R&D系統(tǒng)，[3H]胸苷得自DuPont NEN,S100SartoBind陽(yáng)離子膜吸附器得自Sartorius，層析柱和樹脂得自Pharmcia，化學(xué)藥品得自Fish和Sigma。細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)所有細(xì)胞系都得自ATCC,HeLa細(xì)胞在添加有5％FBS的MEM培養(yǎng)基中維持，PC-3和LNCaP細(xì)胞在添加有5％FBS的RPMI-1640中維持，DU145在添加有10％FBS的EMEM中維持，HEL細(xì)胞在添加有10％FBS的RPMI中維持，HepG2細(xì)胞在添加有10％FBS和1×非必需氨基酸的MEM中維持，BHK細(xì)胞在添加有5％FBS的DMEM中維持。在所有細(xì)胞系的培養(yǎng)基中加入抗生素(終濃度為50μg/ml的青霉素和50μg/ml的鏈霉素)?？鄢齝DNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選在添加有10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，50u/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM；GibcoBRL)中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞(ATCCCCL185)。用濃度為2500單位/ml的重組人γ-干擾素(IFN-γ)(Boehringer Mannheim)將HeLa細(xì)胞處理48小時(shí)。根據(jù)廠商的方案，從模擬試驗(yàn)和經(jīng)FIN-γ處理的HeLa細(xì)胞中分離出總RNA(RNAzol；Tell-Test)和poly(A)-被選定的RNA(FastTrack；Invitrogen)。
為了單向cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，將由未經(jīng)處理和經(jīng)IFN-γ處理(處理48小時(shí))的HeLa細(xì)胞的2微克poly(A)RNA合成的cDNA分別定向克隆至質(zhì)粒pGEM11Zf(Promega)和pT7T3D18U(Pharmacia)中。根據(jù)已知方法(Usui等，J.Neurosci,14(8):4915-4926,1994)進(jìn)行扣除雜交，或更具體地，進(jìn)行有義鏈cRNA和反義cDNA合成，雜交，通過羥基磷灰石柱從雙鏈cDNA/RNA雜合體中分離單鏈cDNA，和PCR擴(kuò)增，接著進(jìn)行扣除文庫(kù)的構(gòu)建。經(jīng)PCR擴(kuò)增的扣除cDNA被定向克隆至pT7T3D(Pharmacia)。
為了篩選扣除的cDNA文庫(kù)，隨機(jī)地從此文庫(kù)中挑選1000個(gè)cDNA并進(jìn)行測(cè)序(見下文)?？寺?15558(aka2H)被發(fā)現(xiàn)6次(每1000個(gè)被分析的cDNA中)，因此被認(rèn)為是由IFN-γ推定差異調(diào)節(jié)的cDNA?？寺?，DNA測(cè)序和計(jì)算機(jī)分析在Applied Biosystems373或377DNA測(cè)序儀上，根據(jù)廠商的方案，以使用T7引物的單次操作進(jìn)行所有的測(cè)序。在使用測(cè)序程序(Gene Codes公司)分析之前除去載體序列。經(jīng)由Blast(Altschul等，分子生物學(xué)雜志，215:40,1990)將大于20bp的插入物與GenBank(版本為92)相比較以用于基因鑒定，并經(jīng)由FastA(Pearson&Lipman,PNAS,85:2444,1988)將大于20bp的插入物互相比較以計(jì)算cDNA在扣除cDNA文庫(kù)中出現(xiàn)的頻率。從分析中排除含有Alu元件的序列。對(duì)2H(克隆#15558)的Blast分析顯示出與TGF-β超家族的幾個(gè)成員有顯著的同源性?？寺?15558不是全長(zhǎng)的(即它不含有完整的編碼區(qū))，因此，使用2微克poly(A)RNA提取自用IFN-γ處理48小時(shí)的HeLa細(xì)胞(為cDNA模板合成的來源來完成錨式PCR(Frohman等，PNAS85:8998-9002；1988)。完成了兩個(gè)獨(dú)立的錨式PCR，隨后對(duì)cDNA進(jìn)行克隆和測(cè)序。發(fā)現(xiàn)開放閱讀框架在此ATG的上游有終止密碼子，這表明已得到全長(zhǎng)的克隆。Northern印跡分析為了進(jìn)行RNA印跡，將2微克提取自HeLa細(xì)胞(模擬對(duì)照和用IFN-γ處理48小時(shí)的HeLa細(xì)胞)的poly(A)RNA上樣于每條泳道，隨后，通過在1.2％的瓊脂糖，1.2M甲醛凝膠上電泳分辨之，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，并與全長(zhǎng)的32P標(biāo)記的2H cDNA探針雜交。另外，將此32P標(biāo)記的探針與人組織RNA印跡(Clontech)雜交。rGF-2H的表達(dá)將GF-2H cDNA的完整編碼區(qū)亞克隆至哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCI(Promega)的EcoRⅠ位點(diǎn)以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pCI-2H，該質(zhì)粒在緊接起始密碼子ATG的上游具有Kozak共有序列。通過經(jīng)改進(jìn)的磷酸鈣沉淀法(Graham和van der Eb，病毒學(xué)，52:456(1973))進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)染。為了得到氨甲碟呤(MTX))抗性，以1比4的比例將質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCC No.37146；S.Subramani等，分子和細(xì)胞生物學(xué)，1981-9,p854-864)或pZem229(歐洲專利申請(qǐng)0319944A2,1988年7月12日提交)與pCI-2H共轉(zhuǎn)染，為了得到G418抗性，以1比4的比例將質(zhì)粒pcDNA3(Invitrogen,#V790-20)與pCI-2H共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，在培養(yǎng)基中加入MTX(終濃度為1μM或G418(最終的活性濃度為1mg/ml)。10天后，隨機(jī)選擇抗性集落，收集無血清條件培養(yǎng)基和選定克隆的細(xì)胞裂解物，對(duì)它們進(jìn)行Western印跡以分析rGF-2H的表達(dá)和分泌。建立生產(chǎn)細(xì)胞系并在1μM MTX或1mg/ml G418中維持所述細(xì)胞系。對(duì)一些MTX-抗性細(xì)胞系使用20μM MTX以進(jìn)一步擴(kuò)增被轉(zhuǎn)染的基因。將分離得到的產(chǎn)量最高的克隆稱為BHK-GF-2H#17并用于生產(chǎn)rGF-2H。重組成熟GF-2H的純化收集得自BHK-GF-2H#17的無血清條件培養(yǎng)基，以下列濃度1mMPMSF,1μg/ml亮抑蛋白酶肽，2μg/ml胃酶抑制劑，1μg/ml抑蛋白酶肽和1mMEDTA加入蛋白酶抑制劑，于4℃,9000rpm下離心20分鐘以除去細(xì)胞碎片后，于4℃，用乙酸(終濃度為0.2M)將上清液酸化過夜。
然后將上清液上樣于預(yù)先用25mM磷酸鈉pH4.0(緩沖液A)平衡的S100SartoBind陽(yáng)離子膜吸附器(Sartorius,#S100X)上。用緩沖液A，接著用含有300mMNaCl的緩沖液A洗滌膜吸附器。用含有500mM NaCl和蛋白酶抑制劑(1mMPMSF,1μg/ml亮抑蛋白酶肽，2μg/ml胃酶抑制劑，1μg/ml抑蛋白酶肽和1mMEDTA)的25mM磷酸鈉pH4.0從膜吸附器上洗脫rGF-2H。
加入飽和的硫酸銨至終濃度為1M之后，將收集物上樣于用含有1M NaCl和1M硫酸銨的25mM NaPO4pH7.0預(yù)平衡過的8ml丁基Sepharose柱上，然后用相同緩沖液洗滌柱，并用含NaCl和硫酸銨的25mMNaPO4pH7.0的線性1-0M的梯度洗脫。收集含有rGF-2H的級(jí)分并使用Centriprep-10(Millipore)濃縮之。
將經(jīng)濃縮的收集物上樣于Superdex-75FPLC柱(Pharmacia)。用20mMTris-HCl,pH7.0,100mMKCl平衡并洗脫柱。
將含有rGF-2H的級(jí)分上樣于Vydac C18 HPLC柱(10μm顆粒大小，4.6×250mm)，該柱已用90％溶劑A和10％溶劑B(溶劑A含有0.1％三氟乙酸和水，溶劑B由0.1％三氟乙酸和乙腈組成)平衡過。用10％至90％的溶劑B線性梯度洗脫柱。將含有純r(jià)GF-2H的級(jí)分凍干并重新懸浮于25mM NaPO4pH7.0中，并以小的等分試樣儲(chǔ)存于-70℃中。針對(duì)GF-2H的多克隆抗體合成對(duì)應(yīng)于pre-pro-GF-2H之殘基253至273的肽MHAQIKTSLHRLKPDTVPAPC，將所述肽與匙孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)，在弗氏佐劑中乳化，并注射給兔。通過ELISA用肽滴定兔抗血清。凝膠電泳和Western印跡分析根據(jù)Laemmli,U.K.自然，227:680(1970)的方法進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過銀染料或考馬斯亮藍(lán)R-250對(duì)凝膠進(jìn)行染色。按Towbin等，PNAS,76,4350(1979)所述進(jìn)行Western轉(zhuǎn)移。使用兔抗GF-2H肽的抗體和與辣根過氧化物酶-綴合的抗兔抗體(Bio-Rad)進(jìn)行免疫染色。N-末端氨基酸和質(zhì)譜分析使用Applied Biosystems470A蛋白質(zhì)測(cè)序儀進(jìn)行N-末端序列分析，所述測(cè)序儀上裝配有在線式乙內(nèi)酰苯硫脲分析儀(120A型)。在Lumonics NAG激光被調(diào)至355nm的Vestec2000MALDI-TOF-MS上，使用基質(zhì)輔助的激光解吸電離質(zhì)譜儀(MALDI-MS)進(jìn)行質(zhì)譜分析。細(xì)胞增殖試驗(yàn)以5000至10000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種于每孔含100μl相應(yīng)的完全培養(yǎng)基的96孔平底培養(yǎng)板中。于37℃,5％CO2下保溫過夜之后，用100μl添加有1％或5％含有指定濃度的rGF-2H或TGF-β的新鮮培養(yǎng)基替代用過的培養(yǎng)基，于37℃,5％CO2下再保溫指定的時(shí)間之后，于37℃,5％CO2下用[3H]胸苷(1μCi/孔)將細(xì)胞標(biāo)記5小時(shí)。保溫結(jié)束時(shí)，除去標(biāo)記介質(zhì)，用PBS洗滌細(xì)胞，并于37℃同100μl胰蛋白酶-EDTA一起保溫10分鐘。然后使用細(xì)胞收集器將細(xì)胞從培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)移至96孔玻璃纖維板(Unifilter板，Parkard)上。洗滌纖維板，于55℃干燥30分鐘，用40μl閃爍(MicroScin-20,Parkard)將每個(gè)孔弄濕，使用96孔培養(yǎng)板計(jì)數(shù)器(TopCount,Parkard)進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果從HeLa細(xì)胞中克隆IFN-γ-誘導(dǎo)的基因編碼GF-2H之DNA的全長(zhǎng)克隆跨越1122個(gè)堿基對(duì)(圖1)，通過下列標(biāo)準(zhǔn)鑒定起始的甲硫氨酸(堿基對(duì)35-37)(a)在此甲硫氨酸上游有一個(gè)框內(nèi)的終止密碼子(堿基對(duì)14-16)；(b)氨基酸序列與Kozak共有序列(Kozak，生物化學(xué)雜志，第266卷，No.30,1986-19870(1991))一致；和(c)緊接此甲硫氨酸之后的是推定的信號(hào)肽。
在堿基對(duì)959-961處發(fā)現(xiàn)了終止密碼子，這表明開放閱讀框架的終止(圖1)，這相當(dāng)于927個(gè)堿基對(duì)的開放閱讀框架。3’非編碼區(qū)含有聚腺苷酸化信號(hào)AATAAA(堿基對(duì)1100-1105)，在短命的mRNA的3’非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)不穩(wěn)定的基元ATTTA(堿基對(duì)1075-1079)。GF-2H mRNA的表達(dá)進(jìn)行Northern印跡分析以測(cè)定GF-2H轉(zhuǎn)錄物的大致長(zhǎng)度并顯示mRNA組織表達(dá)的模式。使用1.2kb的片段作為探針進(jìn)行Northern印跡，雜交顯示出僅在用IFN-γ處理過的HeLa細(xì)胞中有約1.4kb的主要轉(zhuǎn)錄物，而在未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞中沒有這種轉(zhuǎn)錄物(圖3A)。對(duì)不同組織的篩選顯示出在胎盤，前列腺，肝臟，腎臟，胎兒肺和胎兒腎臟中可檢測(cè)到GF-2H mRNA圖3B)。胎盤和前列腺中的mRNA相對(duì)量大于其它組織中的量(圖3B)。推定GF-2H蛋白的分析推測(cè)的GF-2H基因產(chǎn)物為308個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)，其計(jì)算分子量為34.1kDa。已將GF-2H的核苷酸和推定蛋白質(zhì)序列與序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行了比較。對(duì)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast檢索揭示出推定GF-2H蛋白與TGF-β超家族之間顯著水平的同源性。完整的GF-2H蛋白顯示出與人Gdf1的前體形式有28.2％相同，而GF-2H蛋白C-末端三分之一顯示出與果蠅dpp蛋白的成熟形式有30.4％相同。當(dāng)使用PILEUP程序?qū)F-2H蛋白C-末端三分之一的序列與TGF-β超家族成員排列在一起以尋找最大相似性時(shí)，觀察到TGF-β蛋白中所有9個(gè)保守的半胱氨酸殘基以及一些其它的保守殘基(Hosaka等，生物化學(xué)雜志，第266卷，p12127-12130(1991))存在于GF-2H蛋白C-末端三分之一中。
與TGF-β超家族大多數(shù)成員一樣，GF-2H蛋白含有N-末端的信號(hào)序列和N-聯(lián)和O-聯(lián)糖基化的潛在位點(diǎn)。有一簇堿性殘基可提供潛在的裂解位點(diǎn)，從而由前體產(chǎn)生成熟的形式(Hosaka等，1991)。圖2A顯示出未成熟GF-2H蛋白的氨基酸序列。圖2B顯示出成熟GF-2H蛋白和TGF-β家族其它成員之氨基酸序列之間的比較。重組GF-2H蛋白的表達(dá)為了表達(dá)重組GF-2H，將GF-2H cDNA的整個(gè)編碼區(qū)插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCI中以產(chǎn)生pCI-2H。通過用質(zhì)粒pCI-2H和含有小鼠DHFR表達(dá)單位，允許用MTX選擇轉(zhuǎn)染子的pSV2-dhfr或pZem229共轉(zhuǎn)染BHK tk-ts13細(xì)胞得到穩(wěn)定的被轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞系。通過使用抗-GF-2H肽抗體的Western印跡分析檢查這些細(xì)胞系中GF-2H的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。使用這些細(xì)胞系中的一個(gè)，即BHK-2H-#17進(jìn)一步鑒定rGF-2H的表達(dá)。
當(dāng)條件培養(yǎng)基在還原條件下的SDS-PAGE上被分級(jí)分離并用抗-GF-2H肽抗體印跡時(shí)，在BHK-2H-#17細(xì)胞中觀察到表觀分子量為13kd的帶(圖4，泳道5)，在對(duì)照BHK細(xì)胞中未觀察到此帶(圖4，泳道4)。在一些情況下，在BHK-2H-#17細(xì)胞中也觀察到表觀分子量為39kd的另一條帶，而在對(duì)照BHK細(xì)胞中未觀察到此帶(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)條件培養(yǎng)基在非還原條件下的SDS-PAGE上被分級(jí)分離并用抗-GF-2H肽抗體印跡時(shí)，在BHK-2H-#17細(xì)胞中觀察到表觀分子量為25kd的帶(圖4，泳道3)，在對(duì)照BHK細(xì)胞中未觀察到此帶(圖4，泳道2)。這些結(jié)果表明BHK-2H-#17細(xì)胞表達(dá)了GF-2H并將它加工至較小的形式，分泌至培養(yǎng)基中。分泌出的GF-2H最有可能是13kd蛋白質(zhì)的二硫鍵連接的二聚體(25kDa)。39kd的形式最有可能是具有一些翻譯后修飾，如糖基化的全長(zhǎng)GF-2H，因?yàn)槿L(zhǎng)GF-2H的推測(cè)分子量是34kd。重組GF-2H的純化和鑒定通過具體針對(duì)rGF-2H開發(fā)的四步純化法(見上文的討論)，使用得自BHK-2H-17的條件培養(yǎng)基純化經(jīng)加工的成熟形式的rGF-2H。使用此方法，成熟rGF-2H純化后的純度經(jīng)SDS-PAGE和銀染分析判斷為大于95％(數(shù)據(jù)未顯示)。
當(dāng)通過還原條件下的SDS-PAGE分析時(shí)，純化的重組的成熟GF-2H被測(cè)定為13kd的帶，而當(dāng)通過非還原條件下的SDS-PAGE分析時(shí)，純化的重組的成熟GF-2H被測(cè)定為25kd的帶(圖5)。通過質(zhì)譜分析也將成熟rGF-2H的分子量測(cè)定為25kd(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)純化的重組的成熟GF-2H的N-末端氨基酸序列的分析表明成熟rGF-2H序列始于全長(zhǎng)GF-2H的殘基197(圖6)。從全長(zhǎng)rGF-2H之殘基197至308的多肽的計(jì)算分子量是12.3kd。這些結(jié)果表明成熟rGF-2H含有通過二硫鍵連接在一起的全長(zhǎng)rGF-2H之C-末端部分，殘基197至308。rGF-2H對(duì)細(xì)胞增殖的影響對(duì)多種人細(xì)胞系試驗(yàn)純化的rGF-2H以檢查它對(duì)細(xì)胞增殖的影響。如上文所述，將細(xì)胞平鋪，與多種濃度的rGF-2H一起保溫24至96小時(shí)，并用[3H]胸苷標(biāo)記。與rGF-2H平行檢測(cè)人TGF-β2對(duì)這些細(xì)胞系的細(xì)胞增殖的影響以將此影響與rGF-2H的相比較。
對(duì)雄激素-非依賴型前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞而言，重組GF-2H顯示出對(duì)[3H]胸苷摻入的劑量和時(shí)間依賴性抑制作用。在保溫48小時(shí)之后最初觀察到這種抑制作用(圖6)，保溫96小時(shí)之后仍可看到這種抑制作用，此時(shí)，開始出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡。與1.4×10-11M rGF-2H保溫72小時(shí)后觀察到與對(duì)照(無rGF-2h)相比為最大的抑制作用約90％(圖6)。當(dāng)在相同條件下對(duì)PC-3細(xì)胞檢測(cè)TGF-β時(shí)，也觀察到與rGF-2H類似的劑量和時(shí)間依賴性抑制作用。然而，當(dāng)與對(duì)照相比時(shí)，用TGF-β觀察到的最大抑制作用僅為52％(圖7)。與PC-3細(xì)胞類似，對(duì)于另一個(gè)雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞系DU145細(xì)胞，也觀察到rGF-2H和TGF-β對(duì)[3H]胸苷摻入的劑量和時(shí)間依賴性抑制作用(表1)。與對(duì)照相比，rGF-2H和TGF-β的最大抑制作用分別為60％和80％(數(shù)據(jù)未顯示)。
表1GF-2H對(duì)選定人細(xì)胞系增殖的影響細(xì)胞系 rGF-2H TNF-βPC-3(雄激素非依賴型前列腺癌)抑制抑制DU145(雄激素非依賴型前列腺癌) 抑制抑制LNCaP(雄激素依賴型前列腺癌) 無影響 抑制HepG2(肝癌) 無影響 抑制HEL(紅白血病) 無影響 抑制HeLa(子宮頸上皮癌) 無影響 輕微抑制CaoV-3(卵巢腺瘤)無影響 無影響如表1所概括，rGF-2H對(duì)LNCaP,HepG2或HEL細(xì)胞[3H]胸苷摻入沒有影響，與之形成對(duì)照的是TNF-β抑制這些細(xì)胞的[3H]胸苷摻入。rGF-2H或TNF-β對(duì)HeLa和Caov-3細(xì)胞的[3H]胸苷摻入都未顯示出顯著的影響。簡(jiǎn)單地說，rGF-2H顯示出可特異性地抑制雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞的增殖，與之不同的是TNF-β對(duì)其它細(xì)胞系顯示出抑制作用。
權(quán)利要求
1．重組蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)當(dāng)在適當(dāng)條件下與雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞接觸時(shí)可選擇性地抑制所述細(xì)胞的增殖，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列含有圖4所示氨基酸序列或其功能衍生物。
2．分離的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)當(dāng)在適當(dāng)條件下與雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞接觸時(shí)可選擇性地抑制所述細(xì)胞的增殖，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列由圖4所示氨基酸序列或其功能衍生物組成。
3．治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的藥物組合物，所述組合物含有權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)和藥物可接受的載體。
4．治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的方法，所述方法包括給受試者施用治療有效量的權(quán)利要求3的藥物組合物。
5．權(quán)利要求4的方法，其中受試者是人。
6．核酸分子，所述分子基本上由編碼圖4之氨基酸序列的核酸序列或其功能衍生物組成。
7．權(quán)利要求6的核酸分子，其中核酸分子是RNA分子。
8．權(quán)利要求6的核酸分子，其中核酸分子是DNA分子。
9．權(quán)利要求8的核酸分子，其中DNA分子含有圖1所示的核苷酸序列。
10．權(quán)利要求7的核酸分子，其中核酸分子是表達(dá)載體。
11．權(quán)利要求10的表達(dá)載體，其中表達(dá)載體是被稱為pCI的載體。
12．權(quán)利要求7或8的核酸分子，其中分子是適用于治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的基因療法的載體。
13．治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的藥物組合物，所述組合物含有權(quán)利要求12的核酸分子和藥物可接受的載體。
14．治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的方法，所述方法包括給受試者施用治療有效量的權(quán)利要求13的藥物組合物。
15．權(quán)利要求14的方法，其中受試者是人。
16．物質(zhì)組合，所述物質(zhì)組合當(dāng)在適當(dāng)條件下與雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞接觸時(shí)可選擇性地殺死所述細(xì)胞，所述物質(zhì)組合含有權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)和與其有效粘附的毒性組分。
17．權(quán)利要求16的物質(zhì)組合，其中毒性組分是選自蓖麻毒蛋白，破傷風(fēng)毒素，白喉毒素及其亞單位和片段的蛋白質(zhì)類毒素。
18．權(quán)利要求16的物質(zhì)組合，其中毒性組分是選自125I,131I,90Y,212Bi的放射性核素。
19．治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的藥物組合物，所述組合物含有權(quán)利要求16的物質(zhì)組合和藥物可接受的載體。
20．治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的方法，所述方法包括給受試者施用治療有效量的權(quán)利要求19的藥物組合物。
21．權(quán)利要求20的方法，其中受試者是人。
全文摘要
本發(fā)明提供了可選擇性地抑制雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì),本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸分子,所述核酸分子包括適用于治療患有雄激素非依賴型前列腺癌之受試者的基因療法的核酸分子。本發(fā)明還提供了選擇性地殺死雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞的物質(zhì)組合,所述物質(zhì)組合含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)和與之有效粘附的毒性組分,最后,本發(fā)明還提供了相關(guān)的藥物組合物和治療雄激素非依賴型前列腺癌的方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1233289SQ97197712
公開日1999年10月27日 申請(qǐng)日期1997年9月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月11日
發(fā)明者M·埃蘭德, S·M·黃, M·杰克森, P·彼德森 申請(qǐng)人:奧索·麥克尼爾藥品公司