專利名稱：醫(yī)用膠原蛋白海綿及其制造工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)療器械敷料類，具體地說就是以膠原蛋白制成海綿狀物，應(yīng)用于臨床用以止血和促進(jìn)傷口愈合。
膠原蛋白是生物體內(nèi)最豐富，廣泛存在的一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，它存在于結(jié)締組織中，是皮膚、骨骼、肌腱的主要組成成份。各種組織中分離出來的膠原蛋白的分子量約為283000，它由二個(gè)相同的含1056個(gè)α-氨基酸殘基的α1亞基和一個(gè)含1029個(gè)α-氨基酸殘基的α2亞基所組成，構(gòu)成三螺旋的基本結(jié)構(gòu)，它們?cè)诮M織中以纖維狀態(tài)存在，起著支架作用。在進(jìn)化上，膠原蛋白是十分保守的，種屬間差異很小，因而免疫源性極低。所以從動(dòng)物組織中(如牛跟腱)提取出來的膠原蛋白可作為被人體接受的植入原料。利用膠原蛋白的理化特性，生物學(xué)特性、免疫學(xué)特性及機(jī)械物理方面的特性；利用它的易被修飾和可塑性；制造成膠原蛋白海綿，應(yīng)用于臨床醫(yī)療。
目前以膠原蛋白為基楚的醫(yī)療產(chǎn)品研究和開發(fā)正方興未艾。近十余年來膠原蛋白在生物醫(yī)學(xué)上的運(yùn)用已經(jīng)進(jìn)入一個(gè)新時(shí)代，隨著科學(xué)的進(jìn)步膠原蛋白材料在醫(yī)學(xué)上潛在的功能和作用不斷被發(fā)現(xiàn)，必將加速膠原蛋白在醫(yī)藥科學(xué)方面的發(fā)展。我查閱和檢索了四十年至今的膠原蛋白國內(nèi)外研究文獻(xiàn)和發(fā)明專利，供鑒前人經(jīng)驗(yàn)，積多年知識(shí)積累，完成本專利的研制。
在臨床止血材料的研究中，曾有以多糖類、膠原蛋白等為主要原料，制成各種形式膜，或者海綿狀物，作為止血材料。或?qū)⒛z原蛋白經(jīng)過浸泡止血?jiǎng)?，以增?qiáng)止血作用(US-4.606910)?？捎膳；蜇i來源的生物材料，經(jīng)過酸、堿分離純化，溶脹、粉碎、稀釋和冷凍干燥生產(chǎn)細(xì)孔的膠原蛋白海綿應(yīng)用于臨床止血。(DE-3203-957)。有用酸處理的動(dòng)物結(jié)締組織(真皮、肌腱)再經(jīng)冷凍干燥制造出多孔的膠原片材料。(US-4,412,947)90年代初開始分別以酸，堿處理，濃縮，洗滌、脫水干燥等方法生產(chǎn)具有天然結(jié)構(gòu)的醫(yī)藥膠原膜。具有止血、保護(hù)創(chuàng)面、促進(jìn)傷口愈合功效。(US-5,028,695)。提取膠原蛋白的原材料由動(dòng)物的結(jié)締組織進(jìn)展到人體組織上來，利用胎盤、胎膜、臍帶提取人體膠原蛋白制成膜，更降低了免疫源性，增加了臨床應(yīng)用的安全性(JP特開平5-56987)。近幾年來膠原蛋白提取制備技術(shù)趨向完善，經(jīng)酸、堿、鹽、酶解、冷凍干燥技術(shù)處理制成海綿狀物，廣泛應(yīng)用于臨床。(RU-2039766)。94年進(jìn)入我國醫(yī)藥市場的歐洲科研大藥廠生產(chǎn)的解爾分恩片(GELIX)就屬上述類型產(chǎn)品。國內(nèi)關(guān)于膠原蛋白制備技術(shù)也有報(bào)道，將膠原蛋白制備成膜，用以止備和覆蓋燒傷創(chuàng)面，已收到一定療效，(醫(yī)用膠原蛋白和膠原膜研制及臨床應(yīng)用。中華創(chuàng)傷雜志95.11(3)-149-150)。
本發(fā)明的目的在于公布一種醫(yī)用膠原蛋白海綿及其制造工藝。本發(fā)明的醫(yī)用膠原蛋白海綿具有良好的止血效果，尤其對(duì)組織滲血，實(shí)質(zhì)臟器出血效果更佳。它能促進(jìn)纖維母細(xì)胞、毛細(xì)血管的生長，具有促進(jìn)傷口愈合的作用，用膠原蛋白海綿覆蓋燒傷創(chuàng)面有防止感染，減少分泌物，減少疤痕組織作用，有促進(jìn)皮膚潰爛、瘺管、竇道及褥瘡愈合作用。
現(xiàn)將本

發(fā)明內(nèi)容
說明如下1．從肉聯(lián)廠購買新鮮牛跟腱，剔出跟腱外殼，肌肉、脂肪組織及其他雜質(zhì)，自來水沖洗三遍，去離子水沖洗三遍。
2．75％酒精浸泡5分鐘消毒處理，再用無菌水沖洗后冷凍8小時(shí)，然后取出切成厚為1mm片或勻漿。
3．將牛跟腱片(或勻漿液)以50～60倍體積，稀堿液(NaOH、KOH、NaHCO3、CaCO3)PH8.5浸泡過液，充分溶脹。在10℃條件下，用堿性蛋白酶水解96小時(shí)，酶量按1∶500～1000加入，將酶解液離心4000rpm 20分鐘，保留沉淀1，收集上清夜1，向上清液中加入有機(jī)溶劑0.25～25％(W/W)(甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇)混勻過夜，離心12000rpm 30分鐘，棄上清液2，保留沉淀2(即膠原蛋白)。
4．將上述沉淀用無菌水稀釋5倍，用酸調(diào)PH至2.0±0.5(甲酸、乙酸、丙二酸、檸檬酸)，加蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶)按1∶500～1000(V/V)，在10℃條件下水解96小時(shí)，離心4000rpm 20分鐘，棄沉淀3留取上清夜3，加入有機(jī)溶劑0.25～25％(V/V)，(甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇)充分混勻。離心12000rpm 30分鐘，棄上清液4，留取沉淀4(即膠原蛋白)。
5．將兩次沉淀(膠原蛋白)裝入透析袋透析至無有機(jī)溶劑為止。
6．收集透析后的膠原蛋白，以0.05～15％(V/V)的交聯(lián)劑(甲醛、乙醛、戊二醛)交聯(lián)2小時(shí)，加入凝血酶。
7．將交聯(lián)的膠原蛋白裝在特制的模型中，進(jìn)行冷凍干燥24～32小時(shí)，溫度變化-40℃～35℃，升溫1～2℃/小時(shí)，真空度6～4Pa。
8．最后將制得的膠原蛋白海綿包裝，用CO60照射后入庫。
本發(fā)明與現(xiàn)有的醫(yī)用膠原蛋白生產(chǎn)技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)1．現(xiàn)有的醫(yī)用膠原蛋白產(chǎn)品制造過程中，共同的缺點(diǎn)是缺少除脂肪工藝過程，所以在他們的產(chǎn)品中都含有一定量的脂肪。由于脂肪的存在大大降低了膠原蛋白的生物功能，影響膠原蛋白制品的保存時(shí)間。因?yàn)橹舅嵩谘醴肿拥淖饔孟庐a(chǎn)生酸敗反應(yīng)，釋放超氧陰離子(過氧化脂質(zhì))，它對(duì)全身和局部傷口都將產(chǎn)生損害作用，而且這種酸敗反應(yīng)隨著時(shí)同推移會(huì)加重。所以目前進(jìn)口同類產(chǎn)品五年有效期是不夠安全的，(如歐洲科研大藥廠生產(chǎn)的解爾分思片[GELIX]中含有脂肪酸，有效期五年)，因?yàn)橛行陂L短決定于留樣觀察實(shí)驗(yàn)，而留樣觀察實(shí)驗(yàn)沒有注意到從分子水平上觀察膠原蛋白中所含脂肪酸的變化情況。本發(fā)明彌補(bǔ)了上述的不足，在制造過程中增加了除脂肪的工藝步驟。這樣本發(fā)明產(chǎn)品五年有效期內(nèi)，相對(duì)比進(jìn)口產(chǎn)品安全系數(shù)大。
2．本發(fā)明增添了凝血因子。所以凝血效果甚佳，并有良好的粘附性和組織相溶性，易被組織吸收，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察證明四周后本發(fā)明醫(yī)用膠原蛋白海綿可被完全吸收。
3．本發(fā)明在提取膠原蛋白過程中是在低溫情況下，使用微量蛋白酶水解得到的膠原蛋白具有生物活性，因此制成醫(yī)用膠原蛋白海綿臨床應(yīng)用效果顯著。
4．原材料廣泛、成本低，生產(chǎn)工藝先進(jìn)，設(shè)備簡單。
本人認(rèn)為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明最好方式，最快捷徑是在原藥廠的基楚之上，有萬級(jí)潔凈區(qū)，有低溫高速冷凍離心機(jī)和冷凍干燥機(jī)等主要設(shè)備就可以建立一條醫(yī)用膠原蛋白海綿生產(chǎn)線。
實(shí)例稱取牛跟腱5Kg，用自來水清洗，剔除跟腱外殼，脂肪，肌肉等雜質(zhì)，自來水再?zèng)_洗三遍，去離子水沖洗三遍，浸泡在75％酒精5分鐘，取出用無菌水沖洗后冷凍8小時(shí)，取出切片厚度1mm，加無菌水300L配成稀堿液PH8.5浸泡過夜，加入堿性蛋白酶10g、在10℃條件下酶解反應(yīng)96小時(shí)，取出反應(yīng)液離心4000rpm 20分鐘，得沉淀約50L，(留作下步處理)上清夜約250L，丙酮20L，離心12000rpm 30分鐘，棄上清夜得膠原蛋白顯重約8Kg，將上步留下的50L沉淀，加無菌水250L，用丙二酸調(diào)PH至2.5，加木瓜蛋白酶20g水解96小時(shí)，離心4000rpm 20分鐘，棄沉淀，留上清夜約250L，加20L丙酮，靜置4小時(shí)后離心12000rpm 30分鐘。棄上清，得膠原蛋白8Kg，將兩次獲得膠原蛋白透析至中性。取出后用2.5％戊二醛交聯(lián)，裝模型5×5×0.4方盤中進(jìn)行冷凍干燥，可得1350片膠原蛋白海綿，經(jīng)內(nèi)外包裝后經(jīng)CO60照射消毒即可入庫。
權(quán)利要求
1．醫(yī)用膠原蛋白海綿及其制造工藝，是以牛跟腱為原料，經(jīng)過精選剔出雜質(zhì)、脂肪和肌肉組織后清洗、消毒、經(jīng)酶解、酸、堿和有機(jī)溶劑處理，獲得膠原蛋白純品，經(jīng)交聯(lián)劑交聯(lián)再經(jīng)冷凍干燥制成醫(yī)用膠原蛋白海綿，應(yīng)用臨床有止血和促進(jìn)傷口愈合的功效。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述醫(yī)用膠原蛋白海綿及其制造工藝特征之一在于以牛跟腱為原料，因?yàn)榕８熘泻z原蛋白Ⅰ型，含量高易提純。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述醫(yī)用膠原蛋白海綿及其制造工藝特征之四是堿處理，要求保護(hù)使用堿的種類NaOH、KOH、NaHCO3、Na2CO3。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述醫(yī)用膠原蛋白海綿及其制造工藝特征之三是用酸處理，要求保護(hù)使用酸的種類甲酸、乙酸、丙二酸、檸檬酸。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述醫(yī)用膠原蛋白海綿及其制造工藝其特征之二是以微量蛋白酶，低溫限制性水解牛跟腱的膠原蛋白、所獲膠原蛋白具有生物活性，要求保護(hù)酶的種類胃蛋白酶，木瓜蛋酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶及酶的用量1∶500-1000(v/v)。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述醫(yī)用膠原蛋白海綿及其制造工藝，特征之五使用有機(jī)溶劑處理，要求保護(hù)有機(jī)溶劑種類甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇及濃度0.25～25％(V/V)。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述醫(yī)用膠原蛋白海綿及其制造工藝特征之六，使用交聯(lián)劑，要求保護(hù)交聯(lián)劑種類甲醛、乙醛戊二醛及濃度0.05～15％。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述醫(yī)用膠原蛋白海綿及其制造工藝特征之七冷凍干燥24～32小時(shí)，溫度變化-40℃～35℃，升溫1～2℃/小時(shí)，真空度6～4Pa。
全文摘要
醫(yī)用膠原蛋白海綿及其制造工藝,屬醫(yī)療器械敷科類,利用生物材料—牛跟腱提取膠原蛋白。經(jīng)過酸、堿、有機(jī)溶劑處理后獲得純凈膠原蛋白,再經(jīng)交聯(lián)冷凍干燥后制成細(xì)孔海綿狀物。臨床治療用以止血(滲血)和實(shí)質(zhì)臟器出血,促進(jìn)傷口愈合,覆蓋燒傷創(chuàng)面、防止感染、減少滲出、減少疤痕。用以治療慢性皮膚潰爛、褥瘡、瘺管、竇道等。
文檔編號(hào)A61L15/32GK1210019SQ9811776
公開日1999年3月10日 申請(qǐng)日期1998年9月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月10日
發(fā)明者戰(zhàn)麗芬 申請(qǐng)人:戰(zhàn)麗芬