高純度膠原蛋白海綿的制備方法
【專利摘要】高純度膠原蛋白海綿的制備方法。它涉及膠原蛋白海綿的制備方法。它要解決現(xiàn)有方法制備的膠原蛋白海綿存在生產(chǎn)周期長、產(chǎn)率低、純度低以及止血性能差的問題。方法：一、新鮮的牛跟腱預(yù)處理；二、膠原蛋白的提?。蝗?、離心；四、鹽析；五、溶解；六、梯度透析；七、預(yù)凍；八、冷凍干燥；九、滅菌。本發(fā)明制備所得最終產(chǎn)品表面光滑平整，海綿孔徑分布均一，產(chǎn)品止血性能較好。產(chǎn)品純度較高（氨基酸總量高達(dá)97.73%），止血效果明顯，無異味，安全無毒，產(chǎn)率高，時間短，清液無雜質(zhì)，縮短了生產(chǎn)周期；整個制備過程都是在室溫以下進(jìn)行的，保持了膠原蛋白的生物活性，提高了臨床中的應(yīng)用。
【專利說明】高純度膠原蛋白海綿的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及膠原蛋白海綿的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]13父原蛋白是哺乳動物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)，占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%~30%,相當(dāng)于體重的6%，存在于幾乎所有組織中，是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，以不溶纖維形式存在，具高度抗張能力，對動物和人體皮膚、血管、骨骼、筋骨、軟骨的形成十分重要，是結(jié)締組織的重要物質(zhì)，是決定結(jié)締組織韌性的主要因素。膠原蛋白是一類結(jié)構(gòu)上既有共同特點又有差異的蛋白質(zhì)家族，目前已發(fā)現(xiàn)有27種不同類型的膠原，按照被發(fā)現(xiàn)的先后順序分別稱為I型膠原、II型膠原、III型膠原等，用大寫的羅馬數(shù)字來進(jìn)行命名。膠原蛋白和其他蛋白一樣也是由氨基酸組成的，但在其組成中甘氨酸幾乎占到了 1/3，并且脯氨酸和羥脯氨酸是各類蛋白質(zhì)中最聞的，正因為氣基酸的組成特點，股原蛋白在空間中以穩(wěn)定的二螺旋結(jié)構(gòu)存在。膠原蛋白具有諸多優(yōu)異的生物學(xué)性質(zhì)，如低免疫性:膠原分子結(jié)構(gòu)中的重復(fù)性單元大，免疫原性非常低，對機(jī)體無排異反應(yīng)，親和性好，一般生物機(jī)體不會對其產(chǎn)生慢性的排斥現(xiàn)象。
[0003]各種類型的膠原蛋白廣泛分布于機(jī)體的所有組織中，不同類型的膠原因分布和含量不同在機(jī)體中具有不同的功能。I型膠原蛋白是動物體內(nèi)含量最多的一類膠原，是脊椎動物結(jié)締組織中最重要和最常見的的膠原類型。I型膠原蛋白目前在組織工程中大量使用，使得從動物組織中提取I型膠原蛋白成為了近年來研究的熱點。雖然I型膠原蛋白能從動物的許多的組織中提取，但選取適當(dāng)?shù)慕M織材料是提取膠原蛋白的首要條件。目前已知動物的跟腱和骨骼的纖維幾乎都是I型膠原蛋白，因此選擇動物跟腱組織為原料提取并制得的膠原蛋白海綿是I型膠原蛋白為主的，可以減少高純度膠原蛋白海綿制備過程中的提純工藝。
[0004]目前從動物組織中提取膠原蛋白一般有兩種方法:使用溶劑的化學(xué)法和使用酶的生物化學(xué)法。選擇提取膠原的`組織材料后要進(jìn)行預(yù)處理，去掉上面的非膠原成分，特別是要用有機(jī)溶劑抽提出其中的脂肪組織。由于使用溶劑的化學(xué)法容易造成肽鍵的水解，得到的膠原蛋白相對分子質(zhì)量較低，因此在制備膠原蛋白時通常是使用酶的生物化學(xué)法。該法常用于提取膠原蛋白的溶劑有中性鹽和酸性溶劑:中性鹽主要采用Tris-HCl，氯化鈉、檸檬酸鹽等，在中性條件下，膠原蛋白不能溶解在低濃度的鹽溶液中，當(dāng)鹽的濃度達(dá)到一定量時，膠原就會發(fā)生溶解，中性鹽做溶劑提取膠原蛋白工藝不穩(wěn)定是其主要缺點；酸性溶劑多采用弱酸如醋酸、檸檬酸等溶液，主要通過低離子濃度及酸性條件破壞膠原蛋白分子間的鹽鍵和Schiff鍵，引起膠原纖維膨脹、溶解，從而達(dá)到提取的目的。酸性溶劑提取膠原蛋白具有水解反應(yīng)快，無污染，提取的膠原蛋白物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點。一般是在酸性溶劑中，胃蛋白酶催化水解膠原的端肽非螺旋區(qū)，對螺旋區(qū)無作用，這樣溶解的膠原具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，更降低了膠原蛋白的抗原性，適用于做生物醫(yī)用材料。每種方法提取的膠原蛋白都有雜質(zhì)，為了分離非膠原物質(zhì)，在膠原粗提液中加入較多的粉狀鹽將全部膠原沉析出來，進(jìn)行粗提純，再將沉淀溶解在中性鹽溶液中，進(jìn)行透析，除去小分子的鹽類雜質(zhì)，從而得到純度較高的膠原蛋白海綿。
[0005]目前市場上已有幾種膠原蛋白海綿應(yīng)用于臨床，做為組織工程材料和止血材料使用。該類膠原蛋白產(chǎn)品主要是采用酸性溶劑酶的生物化學(xué)法進(jìn)行提取，最后經(jīng)過鹽析、透析工藝得到膠原蛋白海綿。通過對其產(chǎn)品進(jìn)行微觀孔形貌和氨基酸分析，電鏡下能明顯看到膠原蛋白產(chǎn)品上吸附一些沒有除去的小分子鹽類，而且氨基酸分析結(jié)果顯示，該方法得到的膠原蛋白純度較低。低純度的膠原蛋白海綿，做為止血材料，具有一定止血功能，但作用時間較慢，不具有快速止血的效果。目前的工藝得不到高純度的膠原蛋白海綿主要是由于在透析過程中，采用的是一步透析法，一步法透析過程中小分子鹽類雜質(zhì)不能完全去除干凈，影響了最后得到的膠原蛋白海綿產(chǎn)品的純度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有方法制備的膠原蛋白海綿存在生產(chǎn)周期長、產(chǎn)率低、純度低以及止血性能差的問題，而提供了高純度膠原蛋白海綿的制備方法。
[0007]高純度膠原蛋白海綿的制備方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0008]一、新鮮的牛跟腱預(yù)處理:將100~250g新鮮的牛跟腱去除筋膜、油脂后，洗凈切成0.5cmX 0.5cm的小塊放入組織搗碎機(jī)中,加入300~500ml蒸懼水,開機(jī)搗碎，然后用蒸餾水洗滌，再用1000ml質(zhì)量濃度為0.05%~3%的碳酸鈉溶液浸泡10~24h，過濾，將沉淀在自然狀態(tài)下干燥；
[0009]二、膠原蛋白的提取:將5~50g干燥后的牛跟腱置于三口燒瓶中，加入500~1500ml質(zhì)量濃度為0.1%~5%的乙酸，攪拌使其溶解，然后加入100~500ml含有0.5~5g胃蛋白酶或者無花果蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.1%~5%的乙酸，再置于5°C的恒溫水槽中均勻間歇攪拌并提取2~4天，獲得提取液；
`[0010]三、離心:將提取液進(jìn)行冷凍離心，離心機(jī)溫度為-5~5°C，轉(zhuǎn)速為10000~15000轉(zhuǎn)/分，離心20~30min，取離心的上層清液；
[0011]四、鹽析:將離心后的清液邊攪拌邊加入質(zhì)量濃度為5%~15%的檸檬酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5~8.0,攪拌均勻，然后加入NaCl粉末進(jìn)行鹽析，使NaCl的濃度為1.5~5mol/l，邊加邊攪拌，膠原蛋白完全析出后置于4°C冰箱中靜置12~24h，獲得膠原混合液；
[0012]五、溶解:將膠原混合液過濾，然后用蒸餾水清洗沉淀3~5次，再向過濾出的膠原沉淀中加入300~500ml的Tris-HCl緩沖溶液，邊加邊攪拌至膠原蛋白完全溶解，然后置于4°C冰箱中靜置24~48h，獲得溶解的膠原溶液；
[0013]六、梯度透析:①將溶解的膠原溶液裝入截留分子量為五萬的透析袋中，在磁力攪拌下首先用質(zhì)量濃度為1.5%~3%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后換一次透析外液；其次用質(zhì)量濃度為0.3%~1.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后換一次透析外液；最后用質(zhì)量濃度為0.08%~0.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h換一次透析外液；
[0014]②將透析完的膠原溶液取出裝入截留分子量為一萬的透析袋中，在磁力攪拌下用蒸餾水做透析外液，每12h換一次蒸餾水，直至透析外液用硝酸銀溶液檢測沒有沉淀產(chǎn)生為止，獲得透析好的膠原溶液，整個透析過程都在室溫下進(jìn)行，透析外液的體積為內(nèi)液的8~12倍；[0015]七、預(yù)凍:將透析好的膠原溶液注入不銹鋼盤模具中，然后室溫下靜置脫泡5~IOh,再放入低溫冰箱中采用程序降溫，降溫速度為10°C /h,從常溫降溫至-50°C~_80°C并預(yù)凍12~24h，獲得預(yù)凍好的膠原溶液；
[0016]八、冷凍干燥:將預(yù)凍好的膠原溶液放入冷凍真空干燥機(jī)中，真空干燥36~72h，獲得冷凍干燥成型的高純度膠原蛋白海綿；
[0017]九、滅菌:將冷凍干燥成型的高純度膠原蛋白海綿裝入鋁箔袋中，用封口機(jī)封口，然后用6tlCo進(jìn)行輻照滅菌，即完成高純度膠原蛋白海綿的制備；
[0018]其中步驟二中均勻間歇攪拌為每攪拌IOh后停止0.5~lh。
[0019]本發(fā)明中制備的膠原蛋白海綿的特點是針對目前高純產(chǎn)品制備過程中的工藝不足，采用兩步的梯度透析法，并在透析過程中不斷攪拌，攪拌下兩步梯度透析法的優(yōu)點是能夠高效快速的除去雜質(zhì)，最終得到高純度的膠原蛋白海綿。本發(fā)明以檢驗免疫過的新鮮牛跟腱為原料，以溶解胃蛋白酶的低濃度的乙酸溶液為溶劑進(jìn)行提取膠原，離心粗提液，調(diào)節(jié)PH進(jìn)行鹽析除雜質(zhì)，再將沉淀溶解在中性鹽溶液中采取兩步法的梯度透析并攪拌，最后經(jīng)靜置脫泡冷凍干燥得到高純度的膠原蛋白海綿。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0021]1、新鮮的牛跟腱在使用前要除油脂和除腥，現(xiàn)有方法中采用NaCl溶液浸泡除脂和除腥，而本發(fā)明采用的是Na2CO3溶液，它是強(qiáng)堿弱酸鹽，不僅具有鹽的性質(zhì)，而且使溶液顯堿性，它的一個重要用途是洗滌劑，因此本發(fā)明選用Na2CO3溶液，它相比于NaCl溶液能夠更好地去除牛腱上殘留的脂肪和腥味，使得最終產(chǎn)品的純度較高，無異味。
[0022]2、本發(fā)明在提取過程中使用了胃蛋白酶或者無花果蛋白酶，相比于胃蛋白酶，無花果蛋白酶來源于植物，生`物安全性能更高，避免了從動物組織提取的胃蛋白酶引入的病菌。同時無花果蛋白酶酶的活力較高，膠原蛋白提取產(chǎn)率高。
[0023]3、本發(fā)明對提取液進(jìn)行冷凍離心處理，現(xiàn)有方法采用的是過濾，因為提取液濃度較大，過濾時間長，過濾不完全，易將雜質(zhì)引入濾液中。因此本發(fā)明提出了離心法，采用冷凍離心，不僅保持了膠原的活性，而且時間短，清液無雜質(zhì)，提高了產(chǎn)品的純度，縮短了生產(chǎn)周期。
[0024]4、本發(fā)明在鹽析過程中，選用的是檸檬酸鈉溶液來調(diào)節(jié)pH值，相比于現(xiàn)有方法中采用的NaOH，NaOH堿性強(qiáng)，通過加入NaOH調(diào)解pH值，不易控制NaOH加入量，同時容易破壞產(chǎn)品膠原蛋白的生物活性。而檸檬酸鈉堿性較弱，通過它調(diào)解，容易控制溶液的PH值，其安全無毒，作為食品添加劑使用，不會對膠原的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。
[0025]5、在膠原蛋白的溶解過程中，現(xiàn)有方法采用乙酸作溶液，乙酸酸性強(qiáng)，酸味較濃，最終得到的產(chǎn)品中酸味不能夠完全出去，細(xì)胞毒性大，影響了膠原蛋白作為體內(nèi)植入材料的使用，本發(fā)明中采用的Tris-HCl緩沖溶液是中性鹽溶液，是蛋白質(zhì)的常用溶劑，可以溶解膠原蛋白，相比于乙酸,對膠原溶液的pH值影響較小,使膠原能夠最大程度的溶解,對最終產(chǎn)品的性能無影響，產(chǎn)品無酸性味道。
[0026]6、本發(fā)明中首次提出了梯度透稀法；膠原的純度影響它的止血效果，因此純度很重要。本發(fā)明采用梯度透析法，并在透析過程中不斷攪拌，攪拌下梯度透析法相比于現(xiàn)有方法中的一步透析法的優(yōu)點是在透析過程中利用不同分子量的透析袋能夠高效的除去膠原中雜質(zhì)，透析時間快，即縮短了生產(chǎn)周期，最終得到高純度的膠原蛋白海綿。[0027]7、本發(fā)明在海綿冷凍之前，首次采用程序降溫工藝，從常溫到_80°C的每小時IO0C的降溫速度進(jìn)行預(yù)凍，程序降溫相比于驟冷，最終得到產(chǎn)品表面光滑平整，海綿孔徑分布均一，產(chǎn)品止血性能較好。
[0028]8、本發(fā)明所制備的膠原蛋白海綿采用梯度透析法，純度較高(氨基酸總量高達(dá)97.73%)，止血效果明顯；制備過程中沒有使用有毒的化學(xué)試劑，膠原蛋白海綿產(chǎn)品安全性能好；整個制備過程都是在室溫以下進(jìn)行的，保持了膠原蛋白的生物活性，提高了臨床中的應(yīng)用。
【具體實施方式】
[0029]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0030]【具體實施方式】一:本實施方式高純度膠原蛋白海綿的制備方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0031]一、新鮮的牛跟腱預(yù)處理:將100~250g新鮮的牛跟腱去除筋膜、油脂后，洗凈切成0.5cmX 0.5cm的小塊放入組織搗碎機(jī)中,加入300~500ml蒸懼水,開機(jī)搗碎，然后用蒸餾水洗滌，再用1000ml質(zhì)量濃度為0.05%~3%的碳酸鈉溶液浸泡10~24h，過濾，將沉淀在自然狀態(tài)下干燥；
[0032]二、膠原蛋白的提取:將5~50g干燥后的牛跟腱置于三口燒瓶中，加入500~1500ml質(zhì)量濃度為0.1%~5%的乙酸，攪拌使其溶解，然后加入100~500ml含有0.5~5g胃蛋白酶或者無花果蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.1%~5%的乙酸，再置于5°C的恒溫水槽中均勻間歇攪拌并提取2~4天，獲得提取液；
[0033]三、離心:將提`取液進(jìn)行冷凍離心，離心機(jī)溫度為-5~5°C，轉(zhuǎn)速為10000~15000轉(zhuǎn)/分，離心20~30min，取離心的上層清液；
[0034]四、鹽析:將離心后的清液邊攪拌邊加入質(zhì)量濃度為5%~15%的檸檬酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5~8.0,攪拌均勻，然后加入NaCl粉末進(jìn)行鹽析，使NaCl的濃度為1.5~5mol/l，邊加邊攪拌，膠原蛋白完全析出后置于4°C冰箱中靜置12~24h，獲得膠原混合液；
[0035]五、溶解:將膠原混合液過濾，然后用蒸餾水清洗沉淀3~5次，再向過濾出的膠原沉淀中加入300~500ml的Tris-HCl緩沖溶液，邊加邊攪拌至膠原蛋白完全溶解，然后置于4°C冰箱中靜置24~48h，獲得溶解的膠原溶液；
[0036]六、梯度透析:①將溶解的膠原溶液裝入截留分子量為五萬的透析袋中，在磁力攪拌下首先用質(zhì)量濃度為1.5%~3%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后換一次透析外液；其次用質(zhì)量濃度為0.3%~1.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后換一次透析外液；最后用質(zhì)量濃度為0.08%~0.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h換一次透析外液；
[0037]②將透析完的膠原溶液取出裝入截留分子量為一萬的透析袋中，在磁力攪拌下用蒸餾水做透析外液，每12h換一次蒸餾水，直至透析外液用硝酸銀溶液檢測沒有沉淀產(chǎn)生為止，獲得透析好的膠原溶液，整個透析過程都在室溫下進(jìn)行，透析外液的體積為內(nèi)液的8~12倍；
[0038]七、預(yù)凍:將透析好的膠原溶液注入不銹鋼盤模具中，然后室溫下靜置脫泡5~IOh,再放入低溫冰箱中采用程序降溫，降溫速度為10°c /h,從常溫降溫至-50°c~-80°c并預(yù)凍12~24h，獲得預(yù)凍好的膠原溶液；
[0039]八、冷凍干燥:將預(yù)凍好的膠原溶液放入冷凍真空干燥機(jī)中，真空干燥36~72h，獲得冷凍干燥成型的高純度膠原蛋白海綿；
[0040]九、滅菌:將冷凍干燥成型的高純度膠原蛋白海綿裝入鋁箔袋中，用封口機(jī)封口，然后用6tlCo進(jìn)行輻照滅菌，即完成高純度膠原蛋白海綿的制備；
[0041]其中步驟二中均勻間歇攪拌為每攪拌IOh后停止0.5~lh。
[0042]本實施方式步驟一中將沉淀在自然狀態(tài)下干燥目的是除去腥味。
[0043]本實施方式步驟四中NaCl粉末是將NaCl顆粒研磨成粉末。
[0044]本實施方式步驟七中不銹鋼盤模具的規(guī)格的選取，由實際生產(chǎn)中所需要的膠原蛋白海綿的大小來決定。
[0045]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是步驟一中用1000ml質(zhì)量濃度為0.8%的碳酸鈉溶液浸泡12h。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一相同。
[0046]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二不同的是步驟二中將25g干燥后的牛跟腱置于三口燒瓶中，加入800ml質(zhì)量濃度為1.2%的乙酸,攪拌使其溶解,然后加入500ml含有3.5g胃蛋白酶或者無花果蛋白酶的質(zhì)量濃度為1.2%的乙酸，再置于5°C的恒溫水槽中均勻間歇攪拌并提取3.5天。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一或二相同。
[0047]【具體實施方式】`四:本實施方式本實施方式與【具體實施方式】一至三之一不同的是步驟三中將提取液進(jìn)行冷凍離心，離心機(jī)溫度為_2°C，轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分，離心30min。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至三之一相同。
[0048]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一至四之一不同的是步驟四中將離心后的清液邊攪拌邊加入質(zhì)量濃度為10%的檸檬酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至四之一相同。
[0049]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一至五之一不同的是步驟四中加入NaCl粉末進(jìn)行鹽析，使NaCl的濃度為2mol/l，邊加邊攪拌，膠原蛋白完全析出后置于4°C冰箱中靜置16h。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至五之一相同。
[0050]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一至六之一不同的是步驟五中將膠原混合液過濾，然后用蒸餾水清洗沉淀4次，再向過濾出的膠原沉淀中加入400ml的Tris-HCl緩沖溶液。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至六之一相同。
[0051]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一至七之一不同的是步驟六中在磁力攪拌下首先用質(zhì)量濃度為1.5%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后換一次透析外液；其次用質(zhì)量濃度為0.5%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后換一次透析外液；最后用質(zhì)量濃度為0.1%的乙酸做透析外液，透析24h，12h換一次透析外液。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至七之一相同。
[0052]【具體實施方式】九:本實施方式與【具體實施方式】一至八之一不同的是步驟六中透析外液的體積為內(nèi)液的10倍。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至八之一相同。
[0053]【具體實施方式】十:本實施方式與【具體實施方式】一至九之一不同的是步驟七中室溫下靜置脫泡8h，再放入低溫冰箱中采用程序降溫，降溫速度為10°C /h,從常溫降溫至_70°C并預(yù)凍12h。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至九之一相同。[0054]【具體實施方式】十一:本實施方式與【具體實施方式】一至十之一不同的是步驟八中真空干燥48h。其它步驟及參數(shù)與【具體實施方式】一至十之一相同。
[0055]采用以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果:
[0056]實施例1:
[0057]高純度膠原蛋白海綿的制備方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0058]一、新鮮的牛跟腱預(yù)處理:將100g新鮮的牛跟腱去除筋膜、油脂后，洗凈切成
0.5cmX0.5cm的小塊放入組織搗碎機(jī)中，加入300ml蒸餾水，開機(jī)搗碎，然后用蒸餾水洗滌，再用1000ml質(zhì)量濃度為0.8%的碳酸鈉溶液浸泡12h，過濾，將沉淀在自然狀態(tài)下干燥；
[0059]二、膠原蛋白的提取:將25g干燥后的牛跟腱置于三口燒瓶中，加入800ml質(zhì)量濃度為1.2%的乙酸，攪拌使其溶解，然后加入500ml含有3.5g胃蛋白酶的質(zhì)量濃度為1.2%的乙酸，再置于5°C的恒溫水槽中均勻間歇攪拌并提取3.5天，獲得提取液；
[0060]三、離心:將提取液進(jìn)行冷凍離心，離心機(jī)溫度為-2V，轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分，離心30min,取離心的上層清液；
[0061]四、鹽析:將離心后的清液邊攪拌邊加入質(zhì)量濃度為10%的檸檬酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0,攪拌均勻，然后加入NaCl粉末進(jìn)行鹽析，使NaCl的濃度為2mol/L，邊加邊攪拌，膠原蛋白完全析出后置于4°C冰箱中靜置12h，獲得膠原混合液；
[0062]五、溶解:將膠原混合液過濾，然后用蒸餾水清洗沉淀3次，再向過濾出的膠原沉淀中加入500ml的Tris-HCl緩沖溶液，邊加邊攪拌至膠原蛋白完全溶解，然后置于4°C冰箱中靜置24h，獲得溶解的膠`原溶液；
[0063]六、梯度透析:①將溶解的膠原溶液裝入截留分子量為五萬的透析袋中，在磁力攪拌下首先用質(zhì)量濃度為1.5%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后換一次透析外液；其次用質(zhì)量濃度為0.5%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后換一次透析外液；最后用質(zhì)量濃度為
0.1%的乙酸做透析外液，透析24h，12h換一次透析外液；
[0064]②將透析完的膠原溶液取出裝入截留分子量為一萬的透析袋中，在磁力攪拌下用蒸餾水做透析外液，每12h換一次蒸餾水，直至透析外液用硝酸銀溶液檢測沒有沉淀產(chǎn)生為止，獲得透析好的膠原溶液，整個透析過程都在室溫下進(jìn)行，透析外液的體積為內(nèi)液的10倍;
[0065]七、預(yù)凍:將透析好的膠原溶液注入規(guī)格為50X50X20mm的不銹鋼盤模具中，然后室溫下靜置脫泡8h，再放入低溫冰箱中采用程序降溫，降溫速度為10°C /h，從常溫降溫至-80°C并預(yù)凍12h，獲得預(yù)凍好的膠原溶液；
[0066]八、冷凍干燥:將預(yù)凍好的膠原溶液放入冷凍真空干燥機(jī)中，真空干燥72h，獲得冷凍干燥成型的高純度膠原蛋白海綿；
[0067]九、滅菌:將冷凍干燥成型的高純度膠原蛋白海綿裝入鋁箔袋中，用封口機(jī)封口，然后用6tlCo進(jìn)行輻照滅菌，即完成高純度膠原蛋白海綿的制備；
[0068]其中步驟二中均勻間歇攪拌為每攪拌IOh后停止0.5h。
[0069]本實施例步驟一中將沉淀在自然狀態(tài)下干燥目的是除去腥味。
[0070]本實施例步驟四中NaCl粉末是將NaCl顆粒研磨成粉末。
[0071]本實施例步驟七中每個不銹鋼盤模具中注入30ml透析好的膠原溶液。
[0072]本實施例中制備所得高純度膠原蛋白海綿的氨基酸分析結(jié)果如表1所示，可見本實施例中制備的膠原蛋白海綿的純度比現(xiàn)有商品膠原蛋白海綿的純度高。
[0073]本實施例中制備所得高純度膠原蛋白海綿的動物止血實驗結(jié)果如表2所示，可見
本實施例中制備的膠原蛋白海綿的止血時間比現(xiàn)有商品膠原蛋白海綿的止血時間縮短很
多，止血效果更好。
[0074]表1
【權(quán)利要求】
1.高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于它按以下步驟進(jìn)行: 一、新鮮的牛跟腱預(yù)處理:將100~250g新鮮的牛跟腱去除筋膜、油脂后，洗凈切成0.5cmX0.5cm的小塊放入組織搗碎機(jī)中，加入300~500ml蒸餾水，開機(jī)搗碎，然后用蒸餾水洗滌，再用1000ml質(zhì)量濃度為0.05%~3%的碳酸鈉溶液浸泡10~24h，過濾，將沉淀在自然狀態(tài)下干燥； 二、膠原蛋白的提取:將5~50g干燥后的牛跟腱置于三口燒瓶中，加入500~1500ml質(zhì)量濃度為0.1%~5%的乙酸，攪拌使其溶解，然后加入100~500ml含有0.5~5g胃蛋白酶或者無花果蛋白酶的質(zhì)量濃度為0.1%~5%的乙酸，再置于5°C的恒溫水槽中均勻間歇攪拌并提取2~4天，獲得提取液； 三、離心:將提取液進(jìn)行冷凍離心，離心機(jī)溫度為-5~5°C，轉(zhuǎn)速為10000~15000轉(zhuǎn)/分,離心20~30min,取離心的上層清液； 四、鹽析:將離心后的清液邊攪拌邊加入質(zhì)量濃度為5%~15%的檸檬酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5~8.0，攪拌均勻，然后加入NaCl粉末進(jìn)行鹽析，使NaCl的濃度為1.5~5mol/l，邊加邊攪拌，膠原蛋白完全析出后置于4°C冰箱中靜置12~24h，獲得膠原混合液； 五、溶解:將膠原混合液過濾，然后用蒸餾水清洗沉淀3~5次，再向過濾出的膠原沉淀中加入300~500ml的Tris-HCl緩沖溶液，邊加邊攪拌至膠原蛋白完全溶解，然后置于4°C冰箱中靜置24~48h，獲得溶解的膠原溶液； 六、梯度透析:①將溶解的膠原溶液裝入截留分子量為五萬的透析袋中，在磁力攪拌下首先用質(zhì)量濃度為1.5%~3%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后換一次透析外液；其次用質(zhì)量濃度為0.3%~1.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后換一次透析外液；最后用質(zhì)量濃度為0.08%~0.2%的乙酸`做透析外液，透析24h，12h換一次透析外液； ②將透析完的膠原溶液取出裝入截留分子量為一萬的透析袋中，在磁力攪拌下用蒸餾水做透析外液，每12h換一次蒸餾水，直至透析外液用硝酸銀溶液檢測沒有沉淀產(chǎn)生為止，獲得透析好的膠原溶液，整個透析過程都在室溫下進(jìn)行，透析外液的體積為內(nèi)液的8~12倍; 七、預(yù)凍:將透析好的膠原溶液注入不銹鋼盤模具中，然后室溫下靜置脫泡5~10h，再放入低溫冰箱中采用程序降溫，降溫速度為10°C /h，從常溫降溫至-50°C~-80°C并預(yù)凍12~24h，獲得預(yù)凍好的膠原溶液； 八、冷凍干燥:將預(yù)凍好的膠原溶液放入冷凍真空干燥機(jī)中，真空干燥36~72h，獲得冷凍干燥成型的高純度膠原蛋白海綿； 九、滅菌:將冷凍干燥成型的高純度膠原蛋白海綿裝入鋁箔袋中，用封口機(jī)封口，然后用6tlCo進(jìn)行輻照滅菌，即完成高純度膠原蛋白海綿的制備； 其中步驟二中均勻間歇攪拌為每攪拌IOh后停止0.5~lh。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟一中用1000ml質(zhì)量濃度為0.8%的碳酸鈉溶液浸泡12h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟二中將25g干燥后的牛跟腱置于三口燒瓶中，加入800ml質(zhì)量濃度為1.2%的乙酸，攪拌使其溶解，然后加入500ml含有3.5g胃蛋白酶或者無花果蛋白酶的質(zhì)量濃度為1.2%的乙酸，再置于5°C的恒溫水槽中均勻間歇攪拌并提取3.5天。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟三中將提取液進(jìn)行冷凍離心，離心機(jī)溫度為-2V，轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分，離心30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟四中將離心后的清液邊攪拌邊加入質(zhì)量濃度為10%的檸檬酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟四中加入NaCl粉末進(jìn)行鹽析，使NaCl的濃度為2mol/l，邊加邊攪拌，膠原蛋白完全析出后置于4°C冰箱中靜置16h。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟五中將膠原混合液過濾，然后用蒸餾水清洗沉淀4次，再向過濾出的膠原沉淀中加入400ml的Tris-HCl緩沖溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟六中在磁力攪拌下首先用質(zhì)量濃度為1.5%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后換一次透析外液；其次用質(zhì)量濃度為0.5%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后換一次透析外液；最后用質(zhì)量濃度為0.1%的乙酸做透析外液，透析24h，12h換一次透析外液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟六中透析外液的體積為內(nèi)液的10倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的高純度膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于步驟七中室溫下靜置脫泡8h，再放入低溫冰箱中采用程序降溫，降溫速度為10°C /h，從常溫降溫至-70°C并預(yù)凍12h。`
【文檔編號】C07K14/78GK103772734SQ201410022396
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】黃玉東, 李大龍, 賀金梅, 程瑋璐, 吳亞東, 王承旭 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)