專利名稱：脂質(zhì)體組合物和喹諾酮的給藥方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及供給予用于治療細(xì)菌感染的喹諾酮的組合物，更具體的是本發(fā)明涉及供給予與氨基酸共價(jià)連接的喹諾酮的藥物-結(jié)合物的脂質(zhì)體組合物。
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背景技術(shù)：
人們已提出將脂質(zhì)體作為許多治療劑的載體。使用脂質(zhì)體的藥物釋放系統(tǒng)提供了有效的改善釋放性質(zhì)，包括增加血液循環(huán)時(shí)間、減少細(xì)胞毒性，延緩藥物的釋放，對(duì)選定的組織靶向釋放。
在應(yīng)用脂質(zhì)體供藥物釋放中，通常需要將脂質(zhì)體負(fù)載到高膠囊化的藥物濃度上。藥物從脂質(zhì)體的泄漏速率也是低的，以保存包封在脂質(zhì)體里的藥物釋放優(yōu)點(diǎn)。
對(duì)于制備具有包封藥物的脂質(zhì)體有許多負(fù)載藥物的方法。對(duì)于許多親脂藥物，這樣得到有效的藥物包封制備形成囊泡的類脂和藥物混合物，如，為干燥膜形式，水化混合物形成脂質(zhì)體，藥物主要包封在其囊泡的類脂雙層相里。假定藥物的分配系數(shù)更利于類脂相，可得到高承載效率和穩(wěn)定的藥物保留力。
也可使用相同類型的被動(dòng)承載以制備具有包封的親水化合物的脂質(zhì)體。在此情況下，藥物通常溶于用來(lái)使形成囊泡的類脂的類脂膜水合的水介質(zhì)。根據(jù)水合條件和藥物的性質(zhì)，典型地可得到在約5-20％之間的膠囊化效率，剩余的藥物在大量的水相里。通常也需要另外的加工步驟以除去未膠囊化的藥物。
業(yè)已報(bào)道了用于使親水性藥物膠囊化更有效的方法，涉及從有機(jī)溶劑中反相蒸發(fā)(Szoka等，1980)。在此方法中，親水藥物和形成囊泡的類脂的混合物在油包水的乳劑里乳化，然后除去溶劑，形成不穩(wěn)定的類脂-單層凝膠。攪動(dòng)凝膠時(shí)，典型的是在加入的水相存在下攪拌時(shí)，凝膠崩潰，形成了具有高的藥物膠囊化(可達(dá)50％)的少薄片(oligolamellar)的脂質(zhì)體。
對(duì)于可離子化的親水或兩性藥物，通過(guò)將藥物反跨膜離子梯度地負(fù)載到脂質(zhì)體里可得到更大的藥物承載效率(Nichols等，1976；Cramer等，1977)。該負(fù)載方法通常地稱為遠(yuǎn)程負(fù)載，典型地涉及具有可離子化的胺基團(tuán)的藥物，通過(guò)將它加入脂質(zhì)體的懸浮液進(jìn)行負(fù)載，所述的脂質(zhì)體懸浮液具有較低的內(nèi)部/較高的外部離子梯度，通常是pH梯度。
但是，遠(yuǎn)程負(fù)載值得注意的一個(gè)問(wèn)題是并非所有的離子化藥物對(duì)離子梯度反應(yīng)聚集在脂質(zhì)體上(Chakrabarti等，1995；Madden等，1990)。另一個(gè)問(wèn)題是一些聚集在脂質(zhì)體里的試劑聚集后馬上釋放。再一個(gè)問(wèn)題是在體外成功地負(fù)載并保留在脂質(zhì)體里的一些試劑從在體內(nèi)的脂質(zhì)體里泄漏出來(lái)的泄漏率很高，這消除了包封形式的脂質(zhì)體試劑給藥的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面包括一種用于治療細(xì)菌感染的組合物。該組合物包括由形成囊泡的類脂和1-20摩爾％用親水聚合物衍生的類脂組成的脂質(zhì)體，和包封在脂質(zhì)體里的藥物-結(jié)合物，所述的藥物-結(jié)合物具有抗菌活性，由與氨基酸共價(jià)連接的喹諾酮化合物組成。該氨基酸相對(duì)于脂質(zhì)體里只有喹諾酮化合物的保留能力而言，能有效地增加脂質(zhì)體里藥物-結(jié)合物的保留能力。
在一個(gè)實(shí)施方案里，喹諾酮化合物是氟喹諾酮，在另一個(gè)實(shí)施方案里，喹諾酮化合物是6-氟喹諾酮。在另一個(gè)實(shí)施方案里，6-氟喹諾酮選自環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、sparfloxacin、lomefloxacin、氟羅沙星、培氟沙星和amifloxacin。
在一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。
在優(yōu)選的實(shí)施方案里，喹諾酮是環(huán)丙沙星，氨基酸與環(huán)丙沙星的哌嗪環(huán)共價(jià)連接。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在脂質(zhì)體組合物中的親水性聚合物是分子量在1,000-5,000道爾頓的聚乙二醇。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括制備上述脂質(zhì)體組合物的方法。該方法包括制備脂質(zhì)體，使其包含具有第一種離子濃度的內(nèi)部水相，在有比第一種離子濃度高的第二種離子濃度的整體相介質(zhì)里培養(yǎng)脂質(zhì)體，整體相介質(zhì)包括藥物-結(jié)合物。
在一個(gè)實(shí)施方案里，第一種較低離子濃度和所述的第二種較高離子濃度是氫離子濃度，它們依次限定了第一和第二pH值，其中第一pH為約4.5-7.5，比外部的整體相介質(zhì)的第二pH低至少2個(gè)pH單位。
在另一個(gè)實(shí)施方案里，主要形成的脂質(zhì)體的類脂的相轉(zhuǎn)變溫度在約37℃以上，在明顯高于形成脂質(zhì)體的類脂的相轉(zhuǎn)變溫度下對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)。
在另一個(gè)實(shí)施方案里，第一和第二pH值限定了pH梯度，它是由于較高的內(nèi)部/較低的外部銨離子梯度產(chǎn)生的。
在另一個(gè)實(shí)施方案里，通過(guò)有相反離子的銨鹽產(chǎn)生梯度，它能有效地降低藥物-結(jié)合物在內(nèi)部的水相里的溶解度。
當(dāng)本發(fā)明下列詳述結(jié)合附圖來(lái)閱讀時(shí)能更完全地理解本發(fā)明的這些和其它目的和特征。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A顯示喹諾酮抗生素化合物的一般結(jié)構(gòu)；圖1B顯示6-氟-喹諾酮化合物的一般結(jié)構(gòu)；圖1C顯示6-氟-喹諾酮環(huán)丙沙星的結(jié)構(gòu)；圖2A-2D顯示適用于本發(fā)明的其它6-氟-喹諾酮類；圖3是制備環(huán)丙沙星氨基酸酰胺的一般反應(yīng)流程；圖4A-4D顯示在本發(fā)明基礎(chǔ)上例舉性的環(huán)丙沙星-氨基酸結(jié)合物，包括環(huán)丙沙星-甘氨酸(圖4A)、環(huán)丙沙星-賴氨酸(圖4B)、環(huán)丙沙星-蘇氨酸(圖4C)和環(huán)丙沙星-亮氨酸(圖4D)；圖5A-5B顯示α-氨基己?；h(huán)丙沙星(圖5A)和ε-氨基己?；h(huán)丙沙星(圖5B)；圖6顯示環(huán)丙沙星-氨基酸結(jié)合物相反離子梯度負(fù)載到脂質(zhì)體上的離子化結(jié)果；和圖7顯示大鼠用脂質(zhì)體包封的甘氨?；?環(huán)丙沙星(口)、脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星(口)和游離的甘氨?；?環(huán)丙沙星(◇)和游離的環(huán)丙沙星(▲)給藥后血漿中剩余的藥物百分?jǐn)?shù)。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明提供了一種有環(huán)丙沙星-氨基酸結(jié)合物包封于其中的脂質(zhì)體組合物。下面第Ⅰ節(jié)闡述了例舉性的結(jié)合物和它們的制備，第Ⅱ節(jié)闡述了脂質(zhì)體的制備和結(jié)合物負(fù)載入脂質(zhì)體。第Ⅲ節(jié)里，體外和體內(nèi)的含有兩個(gè)例舉的結(jié)合物的脂質(zhì)體。
Ⅰ.喹諾酮-氨基酸結(jié)合物喹諾酮是一類如圖1A所示的4-吡啶酮-3-羧酸一般結(jié)構(gòu)的合成的抗微生物劑。在附圖顯示的一般結(jié)構(gòu)里，X是N或C，R1、R2、R5、R6、R7和R8可為任何基團(tuán)。一些喹諾酮類藥物，如萘啶酸是多年來(lái)已知的。近來(lái)的結(jié)構(gòu)活性相關(guān)性導(dǎo)致了人們合成了許多有抗菌活性的喹諾酮(Culbertson等，1990；Domagala等，1986；Hagen等，1990，1991；Klopman等，1993；Sanchez等，1998)，本技術(shù)領(lǐng)域的人員能很容易地合成這類化合物。
作為這些結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)性的部分，業(yè)已介紹了氟代-喹諾酮類，這些衍生物在早期喹諾酮類物質(zhì)的基礎(chǔ)上提供了治療益處，如氟代劑具有寬的抗微生物活性，口服后能有效地治療各種感染疾病。該類化合物的副作用也相對(duì)少，不會(huì)迅速形成微生物對(duì)它們作用的耐藥性。6-氟代-喹諾酮的一般結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1B。
已廣泛地研究了6-氟代-喹諾酮，已知許多結(jié)構(gòu)變化，它們中的許多適用于本發(fā)明。繼續(xù)參見(jiàn)圖1B，6-氟-喹諾酮類典型的是其中R1是C1到C3烷基，如甲基、乙基、丙基或環(huán)丙基，它在一個(gè)或多個(gè)位置被F、Cl或Br取代；R7是直鏈、支鏈或環(huán)狀的含氮烷烴，優(yōu)選地含有一個(gè)可離子化的氨基；例舉性的R7取代基包括環(huán)結(jié)構(gòu)，如1-氮雜環(huán)丁烷基(azetidyl)、1-哌嗪基、4-甲基-1-哌嗪基、4-乙基-1-哌嗪基、2-哌嗪基、1-吡咯烷基，每個(gè)基團(tuán)可被NH2、NHCH3、N(CH3)2、2-氨乙基、乙基氨基甲基、1-吡咯烷基或氨乙基氨甲基所取代，其它例舉性的飽和和不飽和氮雜環(huán)包括單環(huán)雜環(huán)，如咪唑、咪唑啉、二氫吡咯、1,2,3,6-四氫吡啶、1,4,5,6-四氫嘧啶、吡咯烷、嗎啉、哌啶、哌嗪、1,3,5-三嗪和雙環(huán)雜環(huán)，如全氫化吲哚、全氫化喹啉、全氫化異喹啉、全氫化-7-氮雜吲哚、全氫化-4-氮雜苯并咪唑、1,5-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬烯(DBN)、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.5.0]十一烯(DBU)、1,5-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬烷、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.5.0]十一碳烷、1,4-二氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛烷(三亞乙基二胺)、3-氮雜雙環(huán)[3.2.2]壬烷、3-氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬烷、3-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛烷、2,8-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬烷、5-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬烷、1,5,7-三氮雜雙環(huán)[4.4.0]十二-5-烯、2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷；X是N或C，結(jié)果當(dāng)X是N時(shí)，沒(méi)有R8，當(dāng)X是C時(shí)，R8是H、F、Cl或CF3、OCH3或OCH2CH3，或R1和R8都是2個(gè)或3個(gè)原子的烷基或烷氧基，與在喹諾酮環(huán)里1-8個(gè)環(huán)中原子橋鍵連接，依次形成5或6元環(huán)。預(yù)期可能存在順-和反-立體異構(gòu)體，當(dāng)不對(duì)稱手性中心存在時(shí)，化合物可包括單個(gè)立體異構(gòu)體或混合物，典型的是立體異構(gòu)體的外消旋混合物。圖5A-5D顯示了本發(fā)明里使用的一些例舉性的6-氟-喹諾酮。
一些更加公知的6-氟-喹諾酮類包括環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、斯巴沙星(sparfloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、氟羅沙星、培氟沙星和氨氟沙星(amifloxacin)。在這之中，環(huán)丙沙星(1-環(huán)丙基-6-氟-1,4-二氫-4-氧基-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸)是最有效的一個(gè)，其結(jié)構(gòu)如圖1C所示。像其它喹諾酮一樣，環(huán)丙沙星通過(guò)抑制細(xì)菌的DNA復(fù)制來(lái)作用。藥物與DNA促旋酶的β-亞單位結(jié)合，并有效地抑制其活性，所述的DNA促旋酶是讓超螺旋釋放并重構(gòu)的DNA復(fù)制中必不可少的酶(Salyers等，1994)。環(huán)丙沙星包括在R1處的環(huán)丙基環(huán)和在R7處的哌嗪環(huán)，它包括可離子化的胺，其pKa約8.7。藥物對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性菌和一些革蘭氏陽(yáng)性菌的致病細(xì)菌有效。但是，抗菌的和許多其它喹諾酮化合物的治療有效性被其消除半衰期短至4小時(shí)所限制，這使它難以在血液中維持治療濃度。
如上所述，藥物包封于脂質(zhì)體是改進(jìn)藥物治療有效性的一個(gè)途徑，已揭示了將環(huán)丙沙星包封(Ryan等，1991；Wong等，1995，Hope等，1996)。但是，脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星在脂質(zhì)體里的保留時(shí)間不足以使有親水聚合物鏈的表面包衣的、長(zhǎng)-循環(huán)的脂質(zhì)體達(dá)到體內(nèi)生物分布的程度。這在對(duì)比實(shí)施例1顯示，對(duì)比實(shí)施例1揭示了通過(guò)遠(yuǎn)程負(fù)載來(lái)制備有聚乙二醇鏈表面包衣的脂質(zhì)體，并將環(huán)丙沙星包封入脂質(zhì)體。體外測(cè)量含環(huán)丙沙星的脂質(zhì)體中從脂質(zhì)體釋放到血漿里的環(huán)丙沙星量(對(duì)比實(shí)施例lB)。發(fā)現(xiàn)在37℃下在血漿里培養(yǎng)24小時(shí)后85％藥物從脂質(zhì)體里泄漏出來(lái)，40％的藥物在1小時(shí)里釋放。
長(zhǎng)-循環(huán)的脂質(zhì)體在血流中保留最多達(dá)24小時(shí)。本文使用的“長(zhǎng)-循環(huán)”脂質(zhì)體指有親水聚合物鏈表面包衣的脂質(zhì)體，如美國(guó)專利5,013,556揭示的聚乙二醇包衣的脂質(zhì)體。在注射后24小時(shí)，最多達(dá)10％注射劑量的長(zhǎng)-循環(huán)的脂質(zhì)體保留在血流中，這與常規(guī)的脂質(zhì)體，如沒(méi)有聚合物鏈包衣的脂質(zhì)體相反，常規(guī)的脂質(zhì)體在數(shù)小時(shí)后即從血流里廓清。因此，長(zhǎng)-循環(huán)脂質(zhì)體在體內(nèi)包括器官和組織，進(jìn)行生物分布，而不同于常規(guī)脂質(zhì)體在給藥后迅速積聚于那些單核噬菌細(xì)胞系統(tǒng)或網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)(Paphadjopoulos等，1991)。很清楚，在數(shù)小時(shí)里由于藥物跨越脂質(zhì)體的雙層而泄漏使超過(guò)半數(shù)負(fù)載的環(huán)丙沙星釋放的環(huán)丙沙星脂質(zhì)體組合物不具有長(zhǎng)-循環(huán)脂質(zhì)體的長(zhǎng)循環(huán)壽命和良好生物分布的優(yōu)點(diǎn)。
申請(qǐng)人業(yè)已發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙沙星與氨基酸結(jié)合時(shí)可被負(fù)載進(jìn)入脂質(zhì)體，并在脂質(zhì)體里逗留比環(huán)丙沙星的逗留時(shí)間長(zhǎng)。這樣，本發(fā)明提供了包括環(huán)丙沙星結(jié)合物的脂質(zhì)體組合物，它具有長(zhǎng)時(shí)間血循環(huán)壽命，以得到良好的生物分布和使包封的化合物緩釋的優(yōu)點(diǎn)。
圖3顯示了制備以環(huán)丙沙星-氨基酸結(jié)合物為例的喹諾酮-氨基酸結(jié)合物的合成反應(yīng)流程，并在實(shí)施例2里進(jìn)行揭示。一般來(lái)說(shuō)，喹諾酮的3-羧酸基團(tuán)能被本技術(shù)領(lǐng)域已知的任何羧基保護(hù)基團(tuán)所保護(hù)(Greene等，1991)，圖3顯示的是叔丁基酯。被保護(hù)的喹諾酮然后與N-保護(hù)的堿性氨基酸在縮合劑存在下反應(yīng)，以通過(guò)酰胺連接使喹諾酮里的伯氨基或仲氨基，如環(huán)丙沙星哌嗪環(huán)的仲氨基與堿性氨基酸的α-羧基結(jié)合。所得的保護(hù)酰胺結(jié)合物然后在負(fù)載入脂質(zhì)體前去保護(hù)。酰胺連接是化學(xué)穩(wěn)定的，脂質(zhì)體被巨噬細(xì)胞攝入后可在體內(nèi)通過(guò)溶菌酶裂解。
在研究中，環(huán)丙沙星根據(jù)圖3的流程，與下列氨基酸結(jié)合甘氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和亮氨酸。這些環(huán)丙沙星-氨基酸結(jié)合物的結(jié)構(gòu)如圖4A-4D所示，其中圖4A顯示了環(huán)丙沙星-甘氨酸，圖4B顯示了環(huán)丙沙星-賴氨酸，圖4C顯示了環(huán)丙沙星-蘇氨酸，圖4D顯示了環(huán)丙沙星-亮氨酸。如下所述，甘氨?；?環(huán)丙沙星和賴氨?；?環(huán)丙沙星被包封入脂質(zhì)體，測(cè)試其體外血漿里的泄漏和體內(nèi)血液循環(huán)壽命。
如上所述，本發(fā)明設(shè)想使用任何氨基酸與任何喹諾酮化合物組合，只要結(jié)合物以脂質(zhì)體包封形式給藥時(shí)能保留一定量的適合治療的抗菌活性量即可。在一個(gè)實(shí)施方案里，優(yōu)選的氨基酸是有直鏈和支鏈R基團(tuán)的氨基酸，如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案里，優(yōu)選的是pKa在9.0以上的氨基酸。例如，與甘氨酸、丙氨酸和亮氨酸相關(guān)的pKa值依次是9.6，9.7和9.6。賴氨酸和精氨酸是三元的，在R基團(tuán)里有第二個(gè)氨基。賴氨酸里的氨基的pKa是8.95和10.53，精氨酸的是9.04和12.48(Lehninger)。
應(yīng)當(dāng)了解，本發(fā)明總的概念是提供穩(wěn)定地包封于脂質(zhì)體的喹諾酮，并根據(jù)脂質(zhì)體的生物分布保留足以進(jìn)行生物分布的時(shí)間，對(duì)任何喹諾酮化合物都是可用的，如上述以環(huán)丙沙星為例的研究，任何pKa值大于約9.0的喹諾酮或6-氟-喹諾酮是適合使用的，應(yīng)當(dāng)了解喹諾酮可包括pKa大于9.0的部分，或如上所述，用氨基酸或其它化合物對(duì)現(xiàn)存的化合物進(jìn)行修飾，以包括pKa大于9.0的部分。
也應(yīng)當(dāng)知道，喹諾酮化合物可用氨基酸以外的配位體修飾，得到所需的增加的脂質(zhì)體保持力。例如，環(huán)丙沙星可用α-氨基己酸(pKa9.6)和ε-氨基己酸(pKa10.5)修飾得到α-氨基己?；?環(huán)丙沙星(圖5A)和ε-氨基己酰基-環(huán)丙沙星(圖5B)。
Ⅱ．脂質(zhì)體組合物上述的環(huán)丙沙星-氨基酸結(jié)合物被包封于脂質(zhì)體，其中“包封”指化合物被隔絕在脂質(zhì)體的中央水層，它在脂質(zhì)體類脂雙層之間的水空間或在其雙層里。該部分揭示了通過(guò)遠(yuǎn)程負(fù)載用于將藥物結(jié)合物包封的脂質(zhì)體的制備。
A．脂質(zhì)體組分本發(fā)明的脂質(zhì)體由形成囊泡的類脂組成，通常包括有疏水尾部基團(tuán)和極性頭部基團(tuán)的兩性類脂。形成囊泡的類脂的特征是它能(a)在水里同時(shí)形成雙層囊泡，如磷脂的例子，或(b)能穩(wěn)定地?fù)饺腩愔p層，疏水部分與內(nèi)部的雙層膜的疏水區(qū)域接觸，極性頭部基團(tuán)向外界，膜的極性表面定向。用于本發(fā)明的形成囊泡的類脂是具有上述特征之一的任何常規(guī)的類脂。
該類型形成囊泡的類脂優(yōu)選的是有兩個(gè)烴尾部或鏈，典型的是酰基，和一個(gè)極性頭部基團(tuán)的類脂。包括在該類里的類脂是磷脂，如磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇(PI)，其中兩個(gè)烴鏈典型的長(zhǎng)度在約14-22個(gè)碳原子之間，有多種不飽和的程度。優(yōu)選的磷脂包括PE和PC。例舉性的PC是氫化的大豆磷脂酰膽堿(HSPC)。也可使用單鏈類脂，如鞘磷脂(SM)。
可以市售得到，或根據(jù)公開(kāi)的方法制備上述類脂和磷脂中?；溇哂懈鞣N飽和程度的類脂和磷脂。其它可包含于本發(fā)明的類脂是糖脂。本文的術(shù)語(yǔ)“糖脂”包括有兩個(gè)烴鏈的類脂和一個(gè)或多個(gè)的糖殘基，烴鏈中的一個(gè)是鞘氨醇的烴鏈。
用于本發(fā)明的類脂可為相對(duì)“液體”類脂，表示類脂相有相對(duì)低的類脂熔融溫度，如在室溫或低于室溫下熔融，或者為相對(duì)“剛硬”的類脂，表示類脂的熔點(diǎn)相對(duì)較高，如在直至50℃熔融。作為一個(gè)通則，越剛硬，即越飽和的類脂使類脂的雙層結(jié)構(gòu)膜的堅(jiān)硬度越大，因此使活性藥物負(fù)載后藥物的保持力更穩(wěn)定。該類型優(yōu)選的類脂的相轉(zhuǎn)變溫度在約37℃以上。
脂質(zhì)體可進(jìn)一步包括能穩(wěn)定囊泡的類脂或主要由磷脂構(gòu)成的脂質(zhì)體。最常用的類脂是膽甾醇，其含量水平為25-45摩爾％。
用于本發(fā)明的脂質(zhì)體，以摩爾百分?jǐn)?shù)為基表達(dá)，優(yōu)選地含30-75％磷脂，優(yōu)選的是磷脂酰膽堿(PC)、25-45％膽甾醇和1-20％聚合物衍生的類脂。一個(gè)例舉性的脂質(zhì)體制劑含有50摩爾％磷脂酰膽堿和45摩爾％膽甾醇和5摩爾％聚合物衍生的類脂，mPEG-DSPE。
本發(fā)明的脂質(zhì)體包括親水聚合物鏈的表面包衣?！氨砻姘隆敝冈谥|(zhì)體表面上的任何親水聚合物包衣。這樣將親水聚合物包含于脂質(zhì)體將一種或多種用親水聚合物鏈衍生的、形成囊泡的類脂包含于脂質(zhì)體組合物?？杀皇褂玫男纬赡遗莸念愔巧鲜龅谝环N形成囊泡類脂的任一，但是，優(yōu)選的是具有二?；湹男纬赡遗莸念愔?，如磷脂。一個(gè)優(yōu)選的磷脂是磷脂酰乙醇胺(PE)，它含有反應(yīng)性氨基供與活化的聚合物偶合。PE的一個(gè)例子是二硬脂?；鵓E(DSPE)。
用于與形成囊泡類脂偶合的優(yōu)選的親水聚合物是聚乙二醇(PEG)，優(yōu)選的是分子量為1,000-10,000道爾頓，更優(yōu)選是1,000-5,000道爾頓的PEG鏈。
其它合適的親水聚合物包括聚乳酸、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺和衍生的纖維素，如羥甲基纖維素或羥乙基纖維素。
業(yè)已闡述了含這些聚合物的類脂-聚合物結(jié)合物與合適的類脂，如PE，連接，例如參見(jiàn)美國(guó)專利5,395619,和Zalipsky,STEALTH LIPOSOMES(1995)，在此并入供參考。典型的是，在脂質(zhì)體形成期間，約1-20摩爾％聚合物衍生的類脂包含于形成脂質(zhì)體的組分中。
親水聚合物鏈提供了親水鏈的表面包衣，它能延長(zhǎng)沒(méi)有這類包衣的脂質(zhì)體的血液循環(huán)時(shí)間。血液循環(huán)時(shí)間的增加程度是沒(méi)有聚合物包衣時(shí)的數(shù)倍，這在共同擁有的美國(guó)專利5,013,556中已加以揭示，在此并入供參考。
進(jìn)一步的是，可制備含有表面基團(tuán)的脂質(zhì)體，所述的表面基團(tuán)可為如抗體或抗體片段、用于與細(xì)胞表面受體相互作用的小效應(yīng)體分子、抗原和其它用于得到對(duì)特定細(xì)胞群有所需靶向連接性質(zhì)的化合物。這里，在脂質(zhì)體里的類脂組分包括衍生自靶分子的類脂，或有極性頭部化學(xué)基團(tuán)、可根據(jù)已知的方法用靶分子衍生的類脂。
B．制備離子梯度脂質(zhì)體如上所討論的，具有高內(nèi)部濃度藥物的脂質(zhì)體可通過(guò)遠(yuǎn)程負(fù)載進(jìn)行制備。在該技術(shù)中，藥物針對(duì)離子梯度(典型的是跨越脂質(zhì)體雙層的pH梯度)的反應(yīng)，在脂質(zhì)體中心室里積聚。本節(jié)討論有pH梯度脂質(zhì)體的制備和藥物的負(fù)載。
具有所需離子梯度的脂質(zhì)體可通過(guò)各種技術(shù)制備。在一個(gè)典型的方法中，形成脂質(zhì)體的類脂混合物溶于合適的有機(jī)溶劑，在燒瓶里蒸發(fā)，形成薄膜。在最后的脂質(zhì)體制備中，如上所討論的，然后用含在脂質(zhì)體內(nèi)部形成水相的溶質(zhì)的水介質(zhì)覆蓋膜。脂質(zhì)體膜水合，形成多薄層狀的囊泡(MLV)，典型的多種尺寸為約0.1-10微米。
脂質(zhì)體形成后，根據(jù)已知方法篩分囊泡，使脂質(zhì)體的大小分布在選定的范圍里。脂質(zhì)體優(yōu)選的是大小均勻，其范圍0.04-0.25微米，小的單層囊泡(SUV)典型地在0.04-0.08微米之間，它們可通過(guò)對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行廣泛的聲波處理或均質(zhì)化來(lái)制備(Martin等，1990)。
可通過(guò)聚碳酸酯膜或其它限定孔徑為0.03-0.5微米，典型的是0.05，0.08，0.1或0.2微米的膜擠出，產(chǎn)生直徑在約0.08-0.4微米的均勻的脂質(zhì)體。膜的孔徑大致相當(dāng)于通過(guò)膜擠出產(chǎn)生的脂質(zhì)體的最大粒徑，特別是在通過(guò)相同的膜擠出兩次或多次的場(chǎng)合里更是這樣。
優(yōu)選地在開(kāi)始的類脂-水合緩沖液里進(jìn)行篩分，結(jié)果在開(kāi)始脂質(zhì)體加工步驟的整個(gè)過(guò)程中該介質(zhì)都在脂質(zhì)體內(nèi)部空間里。
篩分后，處理脂質(zhì)體的外部介質(zhì)以產(chǎn)生跨越脂質(zhì)體膜的離子梯度，典型的是較低的內(nèi)部/較高的外部濃度梯度。這可由各種方式進(jìn)行，如(ⅰ)稀釋外部介質(zhì)，(ⅱ)對(duì)所需的最終介質(zhì)進(jìn)行滲析，(ⅲ)對(duì)所需的介質(zhì)進(jìn)行分子篩層析，如用Sephadex G-50，或(ⅳ)高速離心并將已成小球的脂質(zhì)體再懸浮于所需的最終介質(zhì)里。
外部介質(zhì)的選擇根據(jù)梯度形成機(jī)構(gòu)和所需的外部pH而定。
在最簡(jiǎn)單的產(chǎn)生pH梯度方法里，水合篩分的脂質(zhì)體有選定的內(nèi)部介質(zhì)pH。滴定脂質(zhì)體的懸浮液，直至達(dá)到所需最終的pH，或如上述處理，用一種有所需外部pH的物質(zhì)交換外界相緩沖液。例如，在選定的緩沖液里，如在谷氨酸鹽或磷酸鹽緩沖液里，原始介質(zhì)的pH可為5.5，在相同或不同的緩沖液里，最終外部介質(zhì)的pH可為8.5。如，通過(guò)適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)緩沖液、鹽或低分子量溶質(zhì)(如蔗糖)的濃度，使內(nèi)部和外部介質(zhì)優(yōu)選地含有大致相同的克分子滲透濃度。
在另一個(gè)一般方法中，在脂質(zhì)體里包含選定的離子載體來(lái)產(chǎn)生梯度。為了闡述，在鉀鹽緩沖液里制備將真菌霉素包含于脂質(zhì)體雙層里的脂質(zhì)體，篩分，然后用鈉緩沖液交換，產(chǎn)生鉀鹽內(nèi)部/鈉鹽外部梯度。鉀離子在內(nèi)-到-外方向的移動(dòng)中產(chǎn)生了低的內(nèi)/高的外部pH梯度，推定為由于質(zhì)子移動(dòng)進(jìn)入脂質(zhì)體作為對(duì)跨越脂質(zhì)體膜凈負(fù)電荷的反應(yīng)。(Deamer等，1972)。
在另一個(gè)更優(yōu)選的方法里，用于藥物負(fù)載的質(zhì)子梯度通過(guò)制造跨越脂質(zhì)體膜的銨離子梯度來(lái)產(chǎn)生，例如參見(jiàn)美國(guó)專利5,192,549。在此脂質(zhì)體在含銨鹽，典型的是0.1-0.3M銨鹽，如硫酸銨的水性緩沖液里，在合適的pH，如5.5-7.5下制備。脂質(zhì)體形成和篩分后，對(duì)于缺乏銨離子的外部介質(zhì)進(jìn)行交換，如相同的緩沖液，但一種緩沖液中的硫酸銨被使脂質(zhì)體內(nèi)部和外部的克分子滲透濃度相同的NaCl或糖替代。
脂質(zhì)體形成后，用氨和質(zhì)子平衡脂質(zhì)體內(nèi)部的銨離子。氨能滲透進(jìn)入脂質(zhì)體雙層，并從脂質(zhì)體內(nèi)部逃逸。氨的連續(xù)逸出使脂質(zhì)體里的平衡向右移動(dòng)，產(chǎn)生了質(zhì)子。
銨離子梯度在上述另兩個(gè)途徑的活性藥物負(fù)載里有許多優(yōu)點(diǎn)。它們是?。撓到y(tǒng)能產(chǎn)生質(zhì)子作為對(duì)藥物負(fù)載的反應(yīng)，結(jié)果負(fù)載藥物的能力不被質(zhì)子或開(kāi)始的pH梯度所限制。即，由于非質(zhì)子形式的藥物分子被攝入脂質(zhì)體，并在其中質(zhì)子化，質(zhì)子在脂質(zhì)體里的缺失使銨/氨平衡向氨移動(dòng)，并產(chǎn)生質(zhì)子，使質(zhì)子的濃度保持相對(duì)恒定的水平，不受藥物負(fù)載量的約束。唯一的要求是在脂質(zhì)體里原始的銨離子濃度的摩爾數(shù)超過(guò)最終負(fù)載的藥物濃度。
ⅱ．在脂質(zhì)體貯存期間該系統(tǒng)能像電池那樣作用，擴(kuò)散出膜的所損失的質(zhì)子被新產(chǎn)生的質(zhì)子替代，這與銨/氨平衡向產(chǎn)生氨移動(dòng)一樣。
ⅲ．銨鹽的相反離子，如硫酸鹽相反離子，可通過(guò)與被負(fù)載的藥物形成沉淀或不溶絡(luò)合物而進(jìn)一步增加藥物負(fù)載。
C．脂質(zhì)體負(fù)載上述形成的脂質(zhì)體被用于負(fù)載本發(fā)明的環(huán)丙沙星-氨基酸化合物。在該方法里，化合物被加到pH梯度脂質(zhì)體的懸浮液里，在足以讓化合物從外部介質(zhì)進(jìn)入脂質(zhì)體的條件下處理懸浮液。適合藥物負(fù)載的培養(yǎng)條件是(ⅰ)讓衍生的化合物以不帶電荷的形式擴(kuò)散入脂質(zhì)體，和(ⅱ)優(yōu)選地產(chǎn)生高的藥物負(fù)載濃度，如50-200mM藥物被膠囊化。
優(yōu)選地在脂質(zhì)體類脂的相轉(zhuǎn)變溫度以上進(jìn)行負(fù)載。因此，對(duì)于主要形成飽和磷脂的脂質(zhì)體來(lái)說(shuō)，負(fù)載溫度可高達(dá)60℃或更高。負(fù)載時(shí)間典型地為15-120分鐘，根據(jù)衍生的藥物向脂質(zhì)體雙層膜的滲透性、溫度和脂質(zhì)體類脂與藥物的相對(duì)濃度而定。
圖6顯示了藥物負(fù)載進(jìn)入有離子梯度的脂質(zhì)體的機(jī)理。該圖顯示，脂質(zhì)體10有雙層膜12和依靠較高的內(nèi)部/較低的外部銨離子濃度有較低內(nèi)部/較高外部pH梯度。
在外部脂質(zhì)體環(huán)境，如脂質(zhì)體懸浮液介質(zhì)或整體相介質(zhì)里，藥物-結(jié)合物(稱為Q-NH2)與它可質(zhì)子化氨基形式平衡，根據(jù)選定的外部pH達(dá)成了平衡。典型的是，內(nèi)部pH為4.5-7.5，比外部pH約低2個(gè)pH單位，外部pH約為6.5-9.5。
藥物的中性形式在脂質(zhì)體負(fù)載期間，在培養(yǎng)條件下能透入脂質(zhì)體雙層，脂質(zhì)體外不帶電荷的藥物與脂質(zhì)體內(nèi)部不帶電荷的藥物平衡。當(dāng)中性藥物滲透入脂質(zhì)體雙層時(shí)，它質(zhì)子化作為對(duì)積聚在脂質(zhì)體內(nèi)部過(guò)量質(zhì)子的反應(yīng)。質(zhì)子化、帶有電荷的藥物不能容易地透過(guò)脂質(zhì)體雙層，因此，藥物積聚在脂質(zhì)體里。
應(yīng)當(dāng)明白，在脂質(zhì)體內(nèi)部質(zhì)子化形式的藥物會(huì)與相反離子，如銨鹽里的硫酸鹽相反離子形成絡(luò)合物或沉淀。在此情況下，化合物進(jìn)一步向包封的狀態(tài)發(fā)展，被包封化合物的濃度和藥物包封的穩(wěn)定性增加。在各種銨鹽相反離子里衍生的化合物的溶解度可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，目的是選定一種導(dǎo)致絡(luò)合物形成的相反離子。
合適地選擇脂質(zhì)體濃度、加入化合物的外部濃度和pH梯度后，基本上所有化合物可被負(fù)載入脂質(zhì)體。例如，當(dāng)pH梯度為3個(gè)單位(或這類梯度的電勢(shì)使用銨離子梯度)，最終的藥物內(nèi)部濃度外部濃度為約1000∶1。已知計(jì)算出的內(nèi)部脂質(zhì)體體積和負(fù)載藥物的最大濃度，人們可選定基本上完全負(fù)載入脂質(zhì)體的藥物在外部介質(zhì)里的用量。
或者，若藥物負(fù)載不足以基本上耗盡外部介質(zhì)里游離的藥物，在藥物負(fù)載后可處理脂質(zhì)體懸浮液，以除去未包封的藥物。例如，可通過(guò)分子篩色譜、滲析或離心除去游離藥物。
Ⅲ．脂質(zhì)體組合物的特征如上所述，實(shí)施例2A-2B揭示了甘氨酰-環(huán)丙沙星的制備，實(shí)施例2C揭示了試驗(yàn)得到的體外抗微生物活性。測(cè)定藥物對(duì)細(xì)菌菌株S.pyrogenes，E.faecalis，金黃色葡萄球菌(S.aureus)，大腸桿菌(E.coli)和綠膿假單孢菌(P.aeruginosa)的最小抑制濃度。結(jié)果如表1所示，并與環(huán)丙沙星比較。
表1環(huán)丙沙星和甘氨?；?環(huán)丙沙星的活性
用甘氨酸衍生的環(huán)丙沙星使藥物失去了一些效力，其證據(jù)是甘氨?；?環(huán)丙沙星的MIC較高。但是，失去的效力通過(guò)長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體提供的較好的生物分布加以彌補(bǔ)，因此，較低劑量藥物產(chǎn)生了等價(jià)的效率。
實(shí)施例2D測(cè)定了脂質(zhì)體包封的甘氨酰-環(huán)丙沙星和賴氨?；?環(huán)丙沙星在體外血漿里的泄漏。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在37℃下使含甘氨酰-環(huán)丙沙星和賴氨酰-環(huán)丙沙星的脂質(zhì)體在大鼠血漿里培養(yǎng)24小時(shí)。在24小時(shí)培養(yǎng)末，分析血漿中游離藥物的存在。對(duì)于脂質(zhì)體包封的賴氨酰-環(huán)丙沙星或脂質(zhì)體包封的甘氨酰-環(huán)丙沙星來(lái)說(shuō)，血漿里沒(méi)有檢測(cè)到游離藥物。藥物從脂質(zhì)體組分里的回收百分?jǐn)?shù)對(duì)于脂質(zhì)體包封的賴氨酰-環(huán)丙沙星為93％，對(duì)于脂質(zhì)體包封的甘氨酰-環(huán)丙沙星來(lái)說(shuō)為100％。
相反的是，如對(duì)比實(shí)施例1所述，在24小時(shí)培養(yǎng)后，純凈的環(huán)丙沙星從脂質(zhì)體里泄漏，血漿里85％的藥物得以回收。很顯然，對(duì)環(huán)丙沙星的氨基酸修飾能有效地增加藥物在脂質(zhì)體里的留存。
對(duì)大鼠測(cè)定脂質(zhì)體包封的甘氨酰-環(huán)丙基沙星的體內(nèi)血液循環(huán)壽命，并與脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星和游離的甘氨酰-環(huán)丙沙星和游離的環(huán)丙沙星比較。如實(shí)施例2E所述，16個(gè)大鼠分成4個(gè)試驗(yàn)組，對(duì)每組4個(gè)動(dòng)物靜脈注射含30μM/kg藥物的前述制劑之一。測(cè)定血漿中的藥物濃度，時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的函數(shù)如圖7所示。
從圖中可見(jiàn)，給予脂質(zhì)體包封的甘氨酰-環(huán)丙沙星后在血漿里剩余的藥物百分?jǐn)?shù)(口)明顯大于脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星給藥后血漿里藥物的百分?jǐn)?shù)(口)。給予脂質(zhì)體包封的甘氨酰-環(huán)丙沙星24小時(shí)后，大于30％的藥物劑量殘留在血漿里。相反的是，對(duì)于脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星，4小時(shí)后，幾乎所有的藥物從血液里廓清。游離的甘氨酰-環(huán)丙沙星(◇)和游離的環(huán)丙沙星(▲)從血液里廓清的時(shí)間少于1小時(shí)。
測(cè)定包封在有表面PEG包衣的脂質(zhì)體里的甘氨酰-環(huán)丙沙星的血漿半衰期為約24小時(shí)。這大致與脂質(zhì)體本身相等，這表明藥物在體內(nèi)保留在脂質(zhì)體里。它進(jìn)一步被這樣的事實(shí)支持游離的甘氨酰-環(huán)丙沙星在約30分鐘后從血液里廓清。相反的是，包封在有PEG表面包衣的脂質(zhì)體里的環(huán)丙沙星的血液循環(huán)半衰期約為1小時(shí)。游離的環(huán)丙沙星在約30分鐘后廓清。在此情況下，當(dāng)脂質(zhì)體能保留在循環(huán)里長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)時(shí)，環(huán)丙沙星廓清得更迅速，表明藥物在體內(nèi)從脂質(zhì)體里泄漏出來(lái)。
這些觀察表明，通過(guò)合適地修飾喹諾酮，如通過(guò)用氨基酸衍生化或通過(guò)仔細(xì)選擇有所需pKa值的喹諾酮來(lái)增加喹諾酮的胺強(qiáng)度，或通過(guò)合成新的喹諾酮藥物或類似物，可以改進(jìn)藥物在脂質(zhì)體里的留存。
進(jìn)一步應(yīng)當(dāng)知道的是，喹諾酮的pKa值可與選定的喹諾酮的其它特征，如化合物的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)，配合，以增加在脂質(zhì)體的留存。
本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物可用于治療各種細(xì)菌感染，包括治療分支桿菌屬感染，特別是結(jié)核分支桿菌、堪薩斯分支桿菌(M.kansasil)、蟾分支桿菌(M.Xenopi)、偶發(fā)分支桿菌(M.fortuitum)和烏分支桿菌(M.avium)-M.胞內(nèi)(intracellular)復(fù)合物。
其它可用脂質(zhì)體包封的喹諾酮化合物治療的疾病包括慢性皮膚感染，如褥瘡潰瘍、或褥瘡。給予脂質(zhì)體包封形式的優(yōu)點(diǎn)在于脂質(zhì)體的循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)使攜帶藥物的脂質(zhì)體積聚在感染和發(fā)炎部位。
多藥物耐藥性的結(jié)核桿菌是另一個(gè)用喹諾酮制劑治療的疾病，它可從給予脂質(zhì)體包封形式中得到好處。這是由于結(jié)核桿菌常常存在于活性地?cái)z入PEG-包衣的脂質(zhì)體的巨噬細(xì)胞里，引起感染部位藥物濃集。
其它疾病包括由革蘭氏陰性假單孢菌屬(Pseudomonas)引起的肺部感染、慢性骨感染和涉及寄居了分支桿菌的巨噬細(xì)胞的疾病。
Ⅳ．實(shí)施例下列對(duì)比實(shí)施例和實(shí)施例揭示了脂質(zhì)體的制備、環(huán)丙沙星-氨基酸結(jié)合物的制備和結(jié)合物進(jìn)入脂質(zhì)體的負(fù)載。實(shí)施例并非用來(lái)限定范圍。
對(duì)比實(shí)施例1含環(huán)丙沙星脂質(zhì)體的制備和特征A．脂質(zhì)體制備和負(fù)載在250毫升圓底燒瓶里，通過(guò)將661.1毫克氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、220.5毫克膽甾醇和220.5毫克聚乙二醇衍生的二硬脂?；字Ｒ掖及?PEG-DSPE)溶于10毫升氯仿來(lái)制備有聚乙二醇包衣表面的脂質(zhì)體。在減壓下用閃蒸蒸發(fā)器除去氯仿直至干燥。向在燒瓶表面上的類脂薄層加入15毫升250mM硫酸銨溶液(pH5.5)，通過(guò)在60℃下劇烈振搖約30分鐘，使類脂分散在溶液里。在200-400psig壓力下，用不銹鋼擠出室使所得的多層囊泡通過(guò)0.4微米孔徑的Nucleopore的聚碳酸酯濾膜擠出6次，通過(guò)0.1微米的聚碳酸酯濾膜達(dá)6次，通過(guò)0.05微米聚碳酸酯濾膜達(dá)3次。擠出過(guò)程在60℃下進(jìn)行。擠出過(guò)程后的脂質(zhì)體的平均直徑為100±30nm。然后在4℃下，脂質(zhì)體對(duì)4升10％蔗糖滲析過(guò)夜，以除去外部的硫酸銨。
通過(guò)將環(huán)丙沙星HCl粉末溶于10％蔗糖水溶液制備40毫克/毫升的環(huán)丙沙星貯存溶液。通過(guò)使等體積上述制備的脂質(zhì)體以總類脂濃度80毫克/毫升與40、20、10或5毫克/毫升的環(huán)丙沙星溶液混合使活性藥物負(fù)載。使混合物在60℃下培育30分鐘。培育后，使混合物馬上在冰浴里冷卻。取出等分的樣品，用Sephadex G-50柱(1.0×19厘米)測(cè)定藥物負(fù)載的百分?jǐn)?shù)。類脂/藥物比為2、4、8和16的脂質(zhì)體制劑中藥物負(fù)載的百分?jǐn)?shù)分別為49％、75％、90％和91％。
B．體外釋放環(huán)丙沙星進(jìn)入血漿用大鼠血漿將類脂/藥物比為8、環(huán)丙沙星負(fù)載75％(脂質(zhì)體里約75毫克/毫升)的脂質(zhì)體制劑稀釋1/50，在37℃下培育24小時(shí)。在培育結(jié)束時(shí)，0.5毫升血漿負(fù)載到Sepharose CL-4B柱上。收集約45 1-ml組分，匯集脂質(zhì)體和游離藥物組分。匯集的組分用甲醇和1N HCl溶劑(9∶1v/v)以1∶4稀釋度進(jìn)行萃取。接著離心，沉淀下血漿蛋白，通過(guò)反相HPLC，用C-19柱分析上清液。HPLC流動(dòng)相是85％25mM磷酸鈉緩沖液，pH2.3和15％乙腈。
在24小時(shí)內(nèi)泄漏出脂質(zhì)體的環(huán)丙沙星百分?jǐn)?shù)為85％。
實(shí)施例2制備甘氨酰-環(huán)丙沙星和賴氨酰-環(huán)丙沙星A．合成甘氨酰-環(huán)丙沙星和賴氨酰-環(huán)丙沙星N-TBOC保護(hù)的氨基酸是市售的。使化合物與等摩爾量N-羥基琥珀酰胺和10％過(guò)量二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)在二氯甲烷里反應(yīng)，形成N-羥基琥珀酰胺酯。
酯與2摩爾三乙胺和1摩爾無(wú)水羧基-保護(hù)的環(huán)丙沙星HCl在無(wú)水溶劑里反應(yīng)，形成TBOC保護(hù)的氨基酸的環(huán)丙沙星酰胺。
環(huán)丙沙星-酰胺用三氟乙酸去保護(hù)，然后用適合于產(chǎn)物的物理和化學(xué)性質(zhì)的方法進(jìn)行分離。例如，通過(guò)將水懸浮液的pH調(diào)節(jié)到7使結(jié)晶的結(jié)合物分離來(lái)回收L-蘇氨酸-環(huán)丙沙星。通過(guò)用1-丁醇萃取pH7-8水溶液，然后用甲醇重結(jié)晶，回收L-亮氨酸-環(huán)丙沙星結(jié)合物。通過(guò)用磷鎢酸和氫氧化鋇處理L-賴氨酸-環(huán)丙沙星衍生物轉(zhuǎn)化為磷鎢酸鹽，然后用稀硫酸處理而轉(zhuǎn)化為它的硫酸鹽。
回收的產(chǎn)物用質(zhì)子NMR光譜識(shí)別證實(shí)。
B．脂質(zhì)體制備和負(fù)載。
如對(duì)比實(shí)施例1所述，通過(guò)使585毫克氫化的大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、261毫克膽甾醇和210毫克PEG-DSPE(如Zalipsky(1995)里揭示的那樣制備)溶解，形成具有下列組成的脂質(zhì)體50％HSPC、45％膽甾醇和5％mPEG-DSPE。
環(huán)丙沙星-甘氨酸和環(huán)丙沙星-賴氨酸藥物結(jié)合物通過(guò)上述的遠(yuǎn)程負(fù)載以下列濃度負(fù)載入脂質(zhì)體。
C．抗微生物活性測(cè)定環(huán)丙沙星、甘氨酸-環(huán)丙沙星和賴氨酸-環(huán)丙沙星對(duì)S.pyrogenes、E.faecalis、S.aureus、E.coli和P.aeruginosa的抗微生物活性。通過(guò)按照國(guó)家委員會(huì)的臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)指南(NCCLS文件M7-A，National Committee forLaboratory Standards，美國(guó)賓夕法尼亞，作為“用于需氧生長(zhǎng)細(xì)菌的抗微生物易感性試驗(yàn)的稀釋方法”的1994許可的標(biāo)準(zhǔn))的肉湯微稀釋技術(shù)測(cè)定最小抑制濃度，其起始接種為5×105CFU/ml。環(huán)丙沙星和甘氨酰-環(huán)丙沙星的結(jié)果如表1所示。
D．體外的血漿泄漏率用大鼠血漿將含賴氨酰-環(huán)丙沙星和甘氨酰-環(huán)丙沙星的脂質(zhì)體各自稀釋1/10和1/100，在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。用上述對(duì)比實(shí)施例1B的方法測(cè)量藥物-結(jié)合物的泄漏，在培養(yǎng)24小時(shí)末，在血漿中沒(méi)有檢測(cè)到脂質(zhì)體包封的賴氨酰-環(huán)丙沙星或脂質(zhì)體包封的甘氨酰-環(huán)丙沙星的游離藥物。藥物從脂質(zhì)體組分的回收百分?jǐn)?shù)對(duì)于脂質(zhì)體包封的賴氨酰-環(huán)丙沙星為93％，對(duì)于脂質(zhì)體包封的甘氨酰-環(huán)丙沙星為100％。
E．體內(nèi)血液循環(huán)壽命測(cè)定大鼠血漿內(nèi)脂質(zhì)體包封的甘氨酰-環(huán)丙沙星和脂質(zhì)體-包封的環(huán)丙沙星的留存時(shí)間，16個(gè)大鼠劃分成四組，對(duì)每組4個(gè)動(dòng)物靜脈注射含30μM/kg藥物的脂質(zhì)體包封的甘氨酰-環(huán)丙沙星或脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星或游離的甘氨酰-環(huán)丙沙星或游離的環(huán)丙沙星。
從尾部靜脈取出血樣，通過(guò)甲醇萃取，然后HPLC分析測(cè)量藥物在血漿里的濃度。結(jié)果如圖7所示。
雖然本發(fā)明已根據(jù)特定的技術(shù)方案作了闡述，應(yīng)當(dāng)明白本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員能作出各種改變和修飾而不背離本發(fā)明。
權(quán)利要求
1．一種用于治療細(xì)菌感染的組合物，包括由形成囊泡的類脂和1-20摩爾％用親水聚合物衍生的類脂構(gòu)成的脂質(zhì)體，將藥物-結(jié)合物包封于脂質(zhì)體里，所述的藥物-結(jié)合物由與氨基酸共價(jià)連接的喹諾酮化合物組成，相對(duì)于脂質(zhì)體里喹諾酮化合物的留存，所述的氨基酸有效地增加藥物-結(jié)合物在脂質(zhì)體里的留存。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中喹諾酮化合物是氟代喹諾酮。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中喹諾酮化合物是6-氟喹諾酮。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中6-氟喹諾酮選自環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、斯巴沙星(sparfloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、氟羅沙星、培氟沙星和氨氟沙星(amifloxacin)。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的氨基酸選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中喹諾酮化合物是環(huán)丙沙星。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述的氨基酸被共價(jià)連接到環(huán)丙沙星的哌嗪環(huán)。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的親水聚合物是聚乙二醇，其分子量為1,000-5,000道爾頓。
9．一種制備如權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體方法，包括制備具有第一離子濃度的內(nèi)部水相的脂質(zhì)體；和在有比所述第一濃度高的第二離子濃度整體相介質(zhì)里培養(yǎng)脂質(zhì)體，所述的整體相介質(zhì)包括所述的藥物-結(jié)合物。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的第一較低離子濃度和所述的第二較高離子濃度是氫離子濃度，它限定了第一pH值和第二pH值，其中第一pH為約4.5-7.5，比外部整體相介質(zhì)的第二pH低至少2個(gè)pH單位。
11．根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中脂質(zhì)體是主要形成囊泡的類脂，其相轉(zhuǎn)變溫度約高于37℃，所述的培養(yǎng)在基本上高于形成囊泡的類脂的相轉(zhuǎn)變溫度下進(jìn)行。
12．根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的第一和第二pH值限定了pH梯度，它是由于較高的內(nèi)部/較低的外部銨離子梯度產(chǎn)生的。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的梯度通過(guò)有相反離子的銨鹽產(chǎn)生，相反離子能有效地降低內(nèi)部水相中藥物-結(jié)合物的溶解度。
全文摘要
本發(fā)明揭示了一種用于治療細(xì)菌感染的脂質(zhì)體組合物。該組合物包括有親水聚合物鏈表面包衣的脂質(zhì)體和由與氨基酸結(jié)合的喹諾酮化合物組成的被包封的藥物－結(jié)合物。
文檔編號(hào)A61K41/00GK1295465SQ99804655
公開(kāi)日2001年5月16日 申請(qǐng)日期1999年3月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月2日
發(fā)明者L·S·S·郭, J·吉特勒曼, S·扎利普斯基, F·J·馬丁 申請(qǐng)人:阿爾扎有限公司