專利名稱：含有人參皂甙Rb的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用作細(xì)胞保護(hù)(cytoprotective)劑的人參皂甙Rb1或其鹽。更具體地說，本發(fā)明涉及用于抑制編程性細(xì)胞死亡或類編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞死亡的含有人參皂甙Rb1或其鹽的藥物組合物，或用于促進(jìn)細(xì)胞死亡抑制性或抗編程性細(xì)胞死亡的基因產(chǎn)物Bc1-xL的表達(dá)的藥物組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及適合于靜脈內(nèi)用藥的，含有人參皂甙Rb1或其鹽的藥物組合物。
背景技術(shù)：
最初，腦中風(fēng)(大腦血管疾病)的治療方法不同于腦梗塞、腦栓塞、腦出血、短暫局部缺血發(fā)作和蛛網(wǎng)膜下腔出血的治療，嚴(yán)格地說，除了進(jìn)行腦CT檢查之外，沒有有效的對(duì)策。例如，只有在發(fā)生腦梗塞和腦栓塞時(shí)可使用血栓溶解劑，以及在治療腦出血時(shí)需要注意禁忌癥。但是，如果不盡可能在早期對(duì)損害部位進(jìn)行保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)元的治療，腦中風(fēng)是可能導(dǎo)致更高級(jí)功能性活動(dòng)永久性障礙的嚴(yán)重疾病，或者會(huì)威脅患者的生命。因此，不能有片刻的遲緩，應(yīng)該立即開始治療。甚至進(jìn)行CT檢查的時(shí)間也是腦中風(fēng)患者恢復(fù)的可能性減少的一個(gè)重要的因素。的確，急性腦中風(fēng)的治療不僅是與腦中風(fēng)損傷的斗爭，而且由發(fā)病開始也是與時(shí)間的競(jìng)賽。不幸的是，目前不論是哪種類型的腦中風(fēng)(腦梗塞、腦出血、腦栓塞、蛛網(wǎng)膜下腔出血和短暫大腦缺血發(fā)作)，如果在腦中風(fēng)發(fā)作后及時(shí)給藥，已知也沒有多少藥物對(duì)急性癥狀有效。
人參皂甙Rb1是具有下式化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物 人參皂甙Rb1是已知的化合物，例如參見Shibata等人文獻(xiàn)(Shibata等人，經(jīng)濟(jì)和藥用植物研究，世界科學(xué)(World Scientific)，Philadelphia，pp.217-284，1985)。
人參皂甙Rb1經(jīng)腹膜內(nèi)給藥已有報(bào)道，它具有使腦鎮(zhèn)靜的作用(Yoshimura H.等人，歐洲藥理學(xué)學(xué)報(bào)(Eur.J.Pharmacol.)，146，291-197，1988)，但沒有說明作用機(jī)制。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，人參皂甙Rb1和人參皂甙Rg1的混合物(或人參皂甙Rb1或人參皂甙Rg1在細(xì)胞外的濃度為10-6M-10-7M)有可能提高其對(duì)阿爾茨海默氏癥的某些作用，其結(jié)果是激活含乙酰膽堿的神經(jīng)細(xì)胞(USP5,137,878治療老年癡呆的組合物和方法)。但因?yàn)椴荒苷J(rèn)為阿爾茨海默氏癥的主要原因是含乙酰膽堿的神經(jīng)細(xì)胞有功能障礙，這種假設(shè)還存在許多需要解決的問題。
此外，在我們研究人參皂甙Rb1的應(yīng)用之前，沒有人提到過單獨(dú)使用人參皂甙Rb1時(shí)具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)或神經(jīng)保護(hù)作用。到目前為止我們的研究指出，在沙鼠前腦暫時(shí)缺血模型里，人參皂甙Rb1對(duì)不是含乙酰膽堿的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。這就證明了在此前腦暫時(shí)缺血的動(dòng)物模型里，頸總動(dòng)脈雙邊阻塞3-5分鐘，同時(shí)保持腦溫37℃時(shí)，根據(jù)損傷時(shí)間的不同在缺血一周內(nèi)會(huì)導(dǎo)致海馬CA1錐體細(xì)胞(不含乙酰膽堿)的神經(jīng)元損傷(此事件被稱為延遲的神經(jīng)元死亡)，缺血?jiǎng)游锏膶W(xué)習(xí)行為功能受到破壞(Wen T.-C.等人，神經(jīng)病理學(xué)學(xué)報(bào)(ActaNeuropathol.)，91，15-22，1996)。這些事實(shí)說明在沙鼠前腦暫時(shí)缺血模型里反映了人的暫時(shí)缺血發(fā)作(TIA)所出現(xiàn)的病理癥狀。
我們還證明了給沙鼠腹膜腔每天一次施用人參皂甙Rb1(10mg/kg或20mg/kg)，共施用一周時(shí)，可明顯預(yù)防由于頸總動(dòng)脈阻塞5分鐘所引起的延遲的神經(jīng)元死亡和學(xué)習(xí)能力缺失(Wen T.-C.等人，神經(jīng)病理學(xué)學(xué)報(bào)(Acta Neuropathol.)，91，15-22，1996)。但是，在頸總動(dòng)脈發(fā)生阻塞3或5分鐘后在腹膜內(nèi)施用人參皂甙Rb1沒有作用(Wen T.-C.等人，神經(jīng)病理學(xué)學(xué)報(bào)(Acta Neuropathol.)，91，15-22，1996；Lim J.-H.等人，神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)研究(Neurosci.Res.)，28，191-200，1997)。由于在腦的外圍(腹膜內(nèi))施用人參皂甙Rb1后轉(zhuǎn)移的速度和后送的速度非常慢，因此，在此階段就保護(hù)海馬CA1錐體細(xì)胞神經(jīng)元而言，人參皂甙Rb1沒有臨床應(yīng)用價(jià)值。
有報(bào)道說，在頸總動(dòng)脈發(fā)生阻塞3或5分鐘后立即開始在腦室內(nèi)灌輸人參皂甙Rb1，而不是如上文所述由外圍(腹膜內(nèi))給藥，可抑制延遲的神經(jīng)元死亡和學(xué)習(xí)能力缺失(Lim J.-H.等人，神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)研究(Neurosci.Res.)，28，191-200，1997)。進(jìn)一步的，給左大腦中動(dòng)脈(MCA)皮質(zhì)分支發(fā)生阻塞的自發(fā)高血壓腦中風(fēng)(SH-SP)大鼠在發(fā)生MAC永久阻塞后立即由腦室內(nèi)灌輸人參皂甙Rb1，可大大減少大腦皮質(zhì)上的梗塞面積，并可改善由缺血引起動(dòng)物的位置導(dǎo)向失能(Zhang B.等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)。
即使由腦室內(nèi)灌輸人參皂甙Rb1時(shí)是有效的，但似乎也不可能用人參皂甙Rb1治療人的暫時(shí)大腦缺血發(fā)作(TIA)和腦梗塞，和其它肽生長因子類似，這是因?yàn)榻o藥途徑的問題(Sakanaka M.等人，美國國家科學(xué)會(huì)學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95，4635-4640，1998；Wen T.-C.等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)，188，635-649，1998)。
關(guān)于由外圍(腹膜內(nèi))給藥人參皂甙Rb1的神經(jīng)保護(hù)機(jī)理，我們的報(bào)告提到在與低濃度(1-100fg/ml)的人參皂甙Rb1混合前，培養(yǎng)介質(zhì)可減少由羥基自由基誘導(dǎo)劑(硫酸亞鐵)引起的神經(jīng)元壞死(Lim J.-H.等人，神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)研究(Neurosci.Res.)，28，191-200，1997；Zhang B.等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)。我們推測(cè)人參皂甙Rb1可減少細(xì)胞膜脂過氧化物，其結(jié)果可排除羥基自由基，以保護(hù)培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，但是至今這一假設(shè)沒有得到證實(shí)。
某些人報(bào)道了在培養(yǎng)試驗(yàn)中人參皂甙Rb1具有神經(jīng)保護(hù)作用。例如，高濃度(0.11-11μg/ml)人參皂甙Rb1可減少谷氨酸鹽介導(dǎo)的神經(jīng)毒性，從而可防止神經(jīng)元細(xì)胞死亡(Kim Y.-C.，等人，神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)研究雜志(J.Neurosci.Res.)，53，426-432，1998)，500μM左右的高濃度(550μg/ml)人參皂甙Rb1能夠防止類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)細(xì)胞死亡(Tanaka T.等人，人參綜述(The Ginseng Review)，24，61-65，1998)。但是，按照我們的培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果，高濃度的人參皂甙Rb1顯示出神經(jīng)毒性提高(Lim J.-H.等人，Neurosci.Res.，28，191-200，1997；Zhang B.等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)。
另外，還不了解體內(nèi)細(xì)胞外液中這些高濃度的人參皂甙Rb1，據(jù)我們推論給體內(nèi)大量的人參皂甙Rb1以保持細(xì)胞外的高人參皂甙Rb1濃度不可能有多大價(jià)值和不利效果。實(shí)際上，由我們的試驗(yàn)結(jié)果看，高劑量的人參皂甙Rb1并不是總能夠得到較好的效力和有效性(ZhangB.等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)。
結(jié)論是，還不能闡明人參皂甙Rb1的神經(jīng)保護(hù)機(jī)理。如果人參皂甙Rb1的作用機(jī)理是清楚的，就可發(fā)現(xiàn)新功能和有實(shí)用價(jià)值的相同藥劑。更進(jìn)一步的，還不能闡明人參皂甙Rb1實(shí)際上是否可在低濃度抑制類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)細(xì)胞死亡。
在世界范圍內(nèi)從未報(bào)道過我們所發(fā)現(xiàn)的，以如1fg/ml-100fg/ml這樣低的濃度范圍，通過提高抑制細(xì)胞死亡的基因產(chǎn)物Bc1-xL的表達(dá)抑制類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)細(xì)胞死亡。也就是說，在本發(fā)明中我們發(fā)現(xiàn)了人參皂甙Rb1是世界上僅有的非肽類Bc1-xL表達(dá)促進(jìn)劑。雖然濃度為100fg/ml的人參皂甙Rb1對(duì)脂質(zhì)體過氧化物的形成略有抑制作用，但是在較低濃度范圍內(nèi)沒有觀察到這種作用。因此，此前所提出的有關(guān)人參皂甙Rb1作用機(jī)理的假設(shè)是不適當(dāng)?shù)?。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rb1可抑制體內(nèi)的類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)細(xì)胞死亡，從而完成了本發(fā)明。
也就是說，我們發(fā)現(xiàn)將人參皂甙Rb1經(jīng)靜脈內(nèi)給藥對(duì)腦梗塞顯示了沒有想到的優(yōu)異效果，并可改善由梗塞所引起的失能。
本發(fā)明的目的是提供對(duì)患有腦梗塞的患者具有優(yōu)異治療效果、對(duì)腦血管性癡呆有抑制作用、以及通過促進(jìn)抑制細(xì)胞死亡的基因產(chǎn)物Bc1-xL的表達(dá)保護(hù)細(xì)胞的藥物或藥物組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供能夠有效地將人參皂甙Rb1或其鹽作為細(xì)胞保護(hù)劑用藥的制劑。
更具體地說，本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供了用于抑制編程性細(xì)胞死亡或類編程性細(xì)胞死亡的、含有人參皂甙Rb1或其鹽的藥物組合物，或用于促進(jìn)細(xì)胞死亡抑制性基因產(chǎn)物Bc1-xL的表達(dá)的、含有人參皂甙Rb1或其鹽的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供了用于治療、預(yù)防和處理腦和神經(jīng)疾病的，適合于靜脈內(nèi)給藥的，含有人參皂甙Rb1或其鹽的制劑。
發(fā)明的公開本發(fā)明涉及用于抑制編程性細(xì)胞死亡或類編程性細(xì)胞死亡的，含有低濃度人參皂甙Rb1或其鹽的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及含有低濃度人參皂甙Rb1或其鹽的，用于促進(jìn)細(xì)胞死亡抑制性基因產(chǎn)物Bc1-xL表達(dá)的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供了用于治療、預(yù)防和處理腦和神經(jīng)疾病的，適合于靜脈內(nèi)給藥的，含有人參皂甙Rb1或其鹽的制劑。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選是用于靜脈內(nèi)的制劑，但是也可選擇使用其它用藥途徑。
本發(fā)明還涉及含有人參皂甙Rb1或其鹽，優(yōu)選在損傷處為低細(xì)胞外濃度的人參皂甙Rb1或其鹽的藥物組合物，該組合物用于治療、預(yù)防或處理腦和神經(jīng)疾??；更優(yōu)選的，本發(fā)明涉及用于治療、預(yù)防和處理上述疾病的，適合于靜脈內(nèi)給藥的，含有人參皂甙Rb1或其鹽的制劑。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及用于治療、預(yù)防和處理腦和神經(jīng)疾病，適合于靜脈內(nèi)給藥的上述制劑，涉及腦細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)劑或制劑，涉及治療或預(yù)防這些腦疾病的方法，以及人參皂甙Rb1或其鹽在制備這些藥物組合物中的應(yīng)用。


圖1說明了水迷宮試驗(yàn)的結(jié)果。圖1的左圖說明了MCA阻塞第二周的水迷宮試驗(yàn)結(jié)果；圖1的右圖說明了MCA阻塞第四周的水迷宮試驗(yàn)結(jié)果。圖1中，實(shí)心圈(●)表示大鼠假性操作的結(jié)果；空心圈(○)表示MCA阻塞的大鼠僅用生理鹽水灌輸?shù)慕Y(jié)果；實(shí)心方塊(■)表示每天以6μg劑量的人參皂甙Rb1灌輸?shù)腗CA阻塞大鼠的試驗(yàn)結(jié)果；空心方塊(□)表示每天以60μg劑量的人參皂甙Rb1灌輸?shù)腗CA阻塞大鼠的試驗(yàn)結(jié)果。
圖2是大腦皮質(zhì)梗塞比例的圖示。
圖3是說明大腦皮質(zhì)梗塞損傷的照片。A用生理鹽水灌輸?shù)腗CA-梗塞大鼠；和B每天以6μg劑量的人參皂甙Rb1灌輸?shù)腗CA阻塞大鼠。
圖4是綜合下文實(shí)施例1試驗(yàn)結(jié)果的圖示。
圖5說明了人參皂甙Rb1對(duì)膜脂過氧化作用只有很小的防治作用。
圖6說明了人參皂甙Rb1對(duì)硝普鈉鹽(SNP)引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡(編程性細(xì)胞死亡)的抑制作用。圖6的左圖中是沒有進(jìn)行SNP處理的結(jié)果，右圖是經(jīng)過SNP處理的結(jié)果。實(shí)心柱說明了在SNP處理前和后都加入人參皂甙Rb1的結(jié)果；斜線柱說明了在SNP處理后加入人參皂甙Rb1的結(jié)果。
圖7是照片，而不是圖片，說明了人參皂甙Rb1上調(diào)Bc1-xLmRNA的表達(dá)。
圖8是照片，而不是圖片，說明了用人參皂甙Rb1處理的神經(jīng)元中Bc1-xL蛋白的免疫印跡。
圖9是用人參皂甙Rb1處理的神經(jīng)元中Bc1-xL蛋白的免疫印跡法的定量分析結(jié)果圖。
圖10(A)，(B)and(C)是顯微照片，而不是圖片，說明了在成熟的腦中，人參皂甙Rb1對(duì)病態(tài)類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)元死亡的抑制作用。圖10(D)是上述結(jié)果的定量圖示。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明的人參皂甙Rb1是上文通式表示的化合物。用Shibata等人所述的方法(Shibata等人，Economic and medicinal plant research，世界科學(xué)(World Scientific)，Philadelphia，pp.217-284，1985)可分離或純化人參皂甙Rb1。用此方法純化的人參皂甙Rb1的純度大于98％，可用薄層色譜或核磁共振譜確認(rèn)(Kawashima Y.and Samukawa K.，醫(yī)學(xué)藥理學(xué)雜志(J.Med.Pharmacol.Soc.)，Wakan-Yaku，3，235-236，1986)。優(yōu)選使用本發(fā)明高純的人參皂甙Rb1，但也可使用由天然產(chǎn)物或天然植物如含有人參皂甙Rb1的藥用人參萃取得到的混合物。
本發(fā)明的人參皂甙Rb1可以其游離的形式使用，也可以其適當(dāng)?shù)柠}的形式使用。也可使用其溶劑化物如水合物。
本發(fā)明使用的人參皂甙Rb1的濃度優(yōu)選的是低濃度，更具體地，在損傷處細(xì)胞外液中的濃度是1ng/ml或更低，優(yōu)選1pg/ml或更低，更優(yōu)選100fg/ml或更低。優(yōu)選對(duì)本發(fā)明人參皂甙Rb1的靜脈用制劑進(jìn)行調(diào)節(jié)以使人參皂甙Rb1在患者損傷組織的細(xì)胞外液中的濃度保持在上述濃度范圍內(nèi)。本發(fā)明藥物組合物或制劑在患者損傷組織的細(xì)胞外液中的濃度即使只有1-100fg/ml，也足以能夠達(dá)到很好的效果。本發(fā)明的一個(gè)特征是人參皂甙Rb1在患者損傷組織細(xì)胞外液中的濃度優(yōu)選是低濃度的。
本發(fā)明的另一特征是人參皂甙Rb1是以靜脈內(nèi)給藥制劑的形式使用的。令人十分驚奇的是，在將人參皂甙Rb1以靜脈內(nèi)給藥時(shí)不同于由外圍(腹膜內(nèi))給藥人參皂甙Rb1，它可快速轉(zhuǎn)移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本發(fā)明的靜脈內(nèi)給藥制劑可以直接用于血管內(nèi)，優(yōu)選用于靜脈內(nèi)，并可選擇一次性靜脈輸液，或連續(xù)的靜脈輸液。也可以制成制劑加入靜脈給藥制劑如滴注輸液的組合物。
與非用藥的對(duì)照組相比，本發(fā)明人參皂甙Rb1的靜脈內(nèi)給藥可將腦中風(fēng)面積減少大約1/4，并且具有獨(dú)特的作用機(jī)理，可提高細(xì)胞死亡抑制因子Bc1-xL的表達(dá)，也可保護(hù)腦神經(jīng)或神經(jīng)元。因此，可用作神經(jīng)保護(hù)劑，不僅可用于急性或慢性的腦中風(fēng)，而且可用于急性或慢性的腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦栓塞或短暫大腦缺血發(fā)作(TIA)。
也就是說，本發(fā)明的人參皂甙Rb1是可以靜脈內(nèi)給藥的藥物或藥物組合物，可在救護(hù)車中給疑有腦中風(fēng)的患者滴注。已知腦缺血的病理癥狀不僅是由腦梗塞引起的，還可能由心臟衰竭、嚴(yán)重的貧血、呼吸功能失調(diào)、心臟停搏和心室纖顫引起，為了保護(hù)腦不受上述疾病的危害和改進(jìn)患有上述疾病的患者的預(yù)后狀況，含有人參皂甙Rb1的藥物組合物是十分有效的。
在伴隨有類編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞死亡的原發(fā)或繼發(fā)神經(jīng)變性疾病(阿爾茨海默氏癥、Pick病、脊髓小腦的退化、帕金森癥、舞蹈癥、青光眼、老年性黃斑變性、肌萎縮側(cè)索硬化、AIDS性腦病、肝性腦病、腦炎、大腦性癱瘓、視網(wǎng)膜色素退化、頭(腦)損傷、脊髓損傷、一氧化碳中毒、視網(wǎng)膜脫離、新生兒窒息、糖尿病性視網(wǎng)膜炎、周圍神經(jīng)疾病等)的治療中，預(yù)期本發(fā)明含有人參皂甙Rb1的藥物組合物具有通過Bc1-xL蛋白表達(dá)顯示出有效性。
進(jìn)一步的，不應(yīng)忽略的是，本發(fā)明含有人參皂甙Rb1的藥物制劑的特定特征是沒有任何副作用。例如，即使把人參皂甙Rb1加入沒有經(jīng)過氧化氮(NO)供體硝普鈉鹽(SNP)處理的正常培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)元中，它對(duì)神經(jīng)元的代謝活性也沒有影響。而且，在低細(xì)胞外濃度(1-100fg/ml)下的人參皂甙Rb1僅僅保護(hù)由于SNP處理所損傷的神經(jīng)細(xì)胞(參見實(shí)施例3)。因此人參皂甙Rb1不會(huì)影響正常神經(jīng)元的功能，但可對(duì)損傷組織有良好的效果。在目前開發(fā)的神經(jīng)保護(hù)劑中，這一點(diǎn)是人參皂甙Rb1比谷氨酸鹽受體拮抗劑更值得強(qiáng)調(diào)的優(yōu)異特性。
還有報(bào)告說，據(jù)觀察人參皂甙Rb1的腦室內(nèi)用藥不會(huì)影響腦溫、腦血流和腦壓(Lim J.-H.等人，神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)研究(Neurosci.Res.)，28，191-200，1998)。在對(duì)使用了本發(fā)明人參皂甙Rb1的動(dòng)物進(jìn)行仔細(xì)觀察的過程中沒有發(fā)現(xiàn)有副作用。
在以每天6μg或60μg給發(fā)生MCA永久阻塞的大鼠(體重大約為300g)使用本發(fā)明的人參皂甙Rb1時(shí)，結(jié)果是減少了腦梗塞面積和改善了由于缺血引起的失能(腦血管癡呆)。以這些試驗(yàn)為基礎(chǔ)，計(jì)算出患有腦中風(fēng)的人類患者(體重60kg)的劑量為1.2 mg-12mg/天。但是，通常由于動(dòng)物體重的增加，單位體重所需要的劑量減少，所以，劑量為1.2mg或更少時(shí)就可產(chǎn)生足夠的效果。根據(jù)個(gè)體的差異和患者疾病的狀況，本發(fā)明藥物組合物的日劑量是0.1mg或更多，優(yōu)選1mg或更多，更優(yōu)選10mg或更多。因?yàn)楸景l(fā)明藥物組合物只有很小的副作用，因此可以其劑量的上限大劑量給藥，劑量的上限是每天1g或更少，優(yōu)選0.1g或更少。
本發(fā)明藥物組合物的給藥方法優(yōu)選的是靜脈內(nèi)給藥，上文所述的給藥量可以是連續(xù)的或是多次的。本發(fā)明的活性組分人參皂甙Rb1是一種皂甙，可用常規(guī)方法制藥。例如，本發(fā)明含水的藥物組合物可以通過將凍干的結(jié)晶溶解于生理鹽水、蒸餾水、磷酸鹽緩沖溶液或葡萄糖溶液制劑成靜脈內(nèi)給藥制劑。也可使用脂質(zhì)微球或微脂粒制劑。除了在特別高的情況下，靜脈內(nèi)使用的制劑中人參皂甙Rb1或其鹽的濃度可以調(diào)節(jié)至例如0.01-10mg/ml，優(yōu)選0.1-1mg/ml。
在本發(fā)明的動(dòng)物試驗(yàn)中，在動(dòng)物發(fā)生左大腦中動(dòng)脈的皮質(zhì)分枝的永久阻塞(MCA)之后，連續(xù)經(jīng)靜脈內(nèi)給藥28天。在急性期，根據(jù)腦中風(fēng)的實(shí)際狀況，在中風(fēng)發(fā)生后二周內(nèi)腦損傷常常會(huì)惡化，至少是在此期間內(nèi)希望施用的人參皂甙Rb1有足夠的作用。應(yīng)用人參皂甙Rb1的實(shí)際效果是可用于腦血管的復(fù)原和擴(kuò)大再灌輸手術(shù)。
本發(fā)明試圖揭示編程性細(xì)胞死亡或類編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞死亡的抑制作用，其結(jié)果是促進(jìn)了在損傷組織中低細(xì)胞外濃度的人參皂甙Rb1對(duì)Bc1-xL蛋白的表達(dá)，這在過去是未知的。在損傷組織中低細(xì)胞外濃度的人參皂甙Rb1通過上調(diào)Bc1-xL蛋白的表達(dá)，可抑制編程性細(xì)胞死亡或類編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞死亡，上述事實(shí)說明人參皂甙Rb1不僅對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病有效，而且對(duì)伴隨有編程性細(xì)胞死亡的外周組織疾病(例如，器官移植后的排斥，心臟、肺和腎缺血的再灌輸損傷，心肌梗塞，外周動(dòng)脈阻塞，周圍循環(huán)衰竭，褥瘡，自身免疫疾病和免疫缺陷)有效。而且，為了治療外周組織疾病，比腦疾病治療用量更少的人參皂甙Rb1就可提供足夠的效果和效力。
下面將詳細(xì)解釋本發(fā)明低濃度人參皂甙Rb1的作用。
首先，測(cè)試了靜脈灌輸人參皂甙Rb1的作用。例如，為達(dá)到此目的，使用12-13周齡的，體重為250-300g的雄性SH-SP大鼠。將動(dòng)物養(yǎng)育在有空調(diào)的室內(nèi)，進(jìn)行1212小時(shí)的亮-暗循環(huán)，隨意供應(yīng)水和食物。使左大腦中動(dòng)脈(MCA)的皮質(zhì)分支凝固，切下。在MCA發(fā)生阻塞后立即將溶于生理鹽水的人參皂甙Rb1一次靜脈內(nèi)給藥(6μg或60μg)，隨后，使用Alza小型滲透泵繼續(xù)靜脈內(nèi)給藥人參皂甙Rb1(每天6μg或60μg)，共28天。
MCA發(fā)生阻塞的對(duì)照動(dòng)物(缺血對(duì)照動(dòng)物)和假性操作動(dòng)物施用相同量的生理鹽水。
在MCA發(fā)生阻塞之后，按照常規(guī)方法(Zhang B.等人，J.StrokeCerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)，在第2周和第4周分別進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)各4天，測(cè)試SH-SP大鼠的位置導(dǎo)向能力。
結(jié)果如圖1所示。圖1的左圖是永久MCA阻塞后第二周的試驗(yàn)結(jié)果；右圖是MCA阻塞后第四周的試驗(yàn)結(jié)果。圖1中，實(shí)心圈(●)表示大鼠假性操作的結(jié)果；空心圈(○)表示MCA阻塞大鼠僅施用生理鹽水的結(jié)果；實(shí)心方塊(■)表示每天給MCA阻塞大鼠以6μg劑量施用人參皂甙Rb1的試驗(yàn)結(jié)果；空心方塊(□)表示每天給MCA阻塞大鼠以60μg劑量施用人參皂甙Rb1的試驗(yàn)結(jié)果。
如圖1所示，與僅施用生理鹽水的腦梗塞組相比，由于輸入了人參皂甙Rb1，永久MCA阻塞后(腦梗塞之后)的位置導(dǎo)向失能(placenavigation disability)得到顯著改善。特別是在MCA阻塞后第2周和第4周進(jìn)行的水迷宮試驗(yàn)中，低人參皂甙Rb1劑量組在MCA阻塞后的第3天和第4天，高人參皂甙Rb1劑量組在第2周的第3天和第4周的第3和第4天顯著改善學(xué)習(xí)失能。高劑量和低劑量組在第4周的第1天各自都有顯著的影響。在SH-SP大鼠的游泳速度試驗(yàn)中，四個(gè)組沒有顯著差別。
在水迷宮實(shí)驗(yàn)的第4周，將SH-SP大鼠用水合氯醛麻醉，用含有4％多聚甲醛的0.1mol磷酸鹽緩沖溶液穿心灌輸和固定，切下腦，并將發(fā)生梗塞的腦皮質(zhì)部分照相。用圖象分析儀測(cè)量照片上的左大腦半球的面積和左腦皮質(zhì)梗塞的損傷面積。左腦皮質(zhì)梗塞面積除以左大腦半球面積，可計(jì)算出腦皮質(zhì)梗塞的比率(％)。結(jié)果如圖2所示。
如圖2所示，將靜脈給藥人參皂甙Rb1的腦梗塞組和只給生理鹽水的腦梗塞組相比，前者腦梗塞的比率顯著降低。由于腦皮質(zhì)梗塞的比率是以梗塞面積為基礎(chǔ)進(jìn)行計(jì)算的，與只給生理鹽水的試驗(yàn)組相比，使用靜脈給藥人參皂甙Rb1的試驗(yàn)組梗塞比率的平均值減少到50％或更低，靜脈給藥人參皂甙Rb1的試驗(yàn)組梗塞實(shí)際體積的減少大約是1/4。
圖3A和圖3B分別給出了施用生理鹽水的試驗(yàn)組，和施用人參皂甙Rb1(6μg/天)的試驗(yàn)組的腦梗塞的實(shí)際情況。
圖4是歸納了本發(fā)明試驗(yàn)結(jié)果的圖示。施用生理鹽水的大鼠，殘留的梗塞面積大，在水迷宮試驗(yàn)中大鼠逃逸到終點(diǎn)平臺(tái)上需要較長時(shí)間。相反，在給以本發(fā)明人參皂甙Rb1的試驗(yàn)組，梗塞的面積可以復(fù)原或減少，其結(jié)果是，在水迷宮試驗(yàn)中僅用短時(shí)間大鼠就可逃逸至終點(diǎn)平臺(tái)。
根據(jù)本發(fā)明人以前的報(bào)告，用沙鼠的短暫前腦缺血模型(Wen T.-C.，等人，神經(jīng)病理學(xué)學(xué)報(bào)(Acta Neuropathol.)，91，15-22，1996)，即使是在缺血之前用人參皂甙Rb1腹膜內(nèi)給藥(10 mg/kg/天或20 mg/kg/天)，也只有大約30％的海馬CA1錐體神經(jīng)元能夠免除傷害。另外，在缺血發(fā)生后將人參皂甙Rb1腹膜內(nèi)給藥沒有效果。而且，根據(jù)沙鼠體重(大約70g)進(jìn)行測(cè)量，經(jīng)腹膜內(nèi)聯(lián)合給藥人參皂甙Rb1時(shí)的日劑量可高達(dá)0.7mg-1.4mg，從人參皂甙Rb1給藥的效力和效果的觀點(diǎn)考慮，與腹膜內(nèi)用藥相比，將人參皂甙Rb1由靜脈內(nèi)給藥是最好的方法，并且很容易給人實(shí)施。正如我們所知道的，腹膜內(nèi)用藥并不是常常給人使用的方法，只有少數(shù)除外(如腹膜灌洗等)。
本發(fā)明實(shí)施例中所使用的永久性MCA阻塞動(dòng)物(腦梗塞大鼠)比短暫前腦缺血的沙鼠模型顯然更為嚴(yán)格，它們提供了更接近人類腦梗塞疾病的模型。因此，在腦血管阻塞后開始靜脈灌注人參皂甙Rb1，對(duì)永久性MCA阻塞大鼠顯示出顯著的優(yōu)異效果，這清楚地說明了以低劑量靜脈灌注人參皂甙Rb1具有有效、便利和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。
另一方面，在前述的報(bào)告中，人參皂甙Rb1可直接注入永久性MCA阻塞動(dòng)物的腦室(Zhang B.，等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)，在永久性MCA阻塞發(fā)生后，只有以每天0.6μg的劑量連續(xù)注入腦室才能觀察到對(duì)腦梗塞有明顯的抑制作用；與本發(fā)明實(shí)施例中所述的靜脈內(nèi)給藥人參皂甙Rb1的作用相等或略小。在前述將人參皂甙Rb1在腦室內(nèi)用藥的報(bào)告中，在永久性MCA阻塞發(fā)生后，以另外劑量(每天6μg或0.06μg)人參皂甙Rb1連續(xù)注入腦室，沒有觀察到治愈的效果。因此，在腦室內(nèi)施用人參皂甙Rb1的有效劑量范圍很窄，其實(shí)際臨床應(yīng)用很困難。而且，將危險(xiǎn)性和所能得到的利益綜合考慮，將人參皂甙Rb1注入腦室的方法似乎也不可能用于人。
一般來說，將藥物直接用于腦室或用于腦主質(zhì)時(shí)神經(jīng)保護(hù)因子或藥劑有最好的效果，而在靜脈或腹膜內(nèi)用藥時(shí)，由于阻止神經(jīng)保護(hù)劑進(jìn)入腦主質(zhì)的血腦屏障的作用，其效果和效力大大減少或完全消失。因此，基于腹膜內(nèi)或腦室內(nèi)施用人參皂甙Rb1的試驗(yàn)結(jié)果，在靜脈內(nèi)施用人參皂甙Rb1的效果和效力是完全無法預(yù)料的。
但正如本發(fā)明所闡明的，在靜脈內(nèi)施用人參皂甙Rb1可有效地減少永久性MCA阻塞大鼠的腦梗塞的面積，其劑量范圍比在腦室內(nèi)用藥時(shí)更寬，并可改善MCA阻塞動(dòng)物的學(xué)習(xí)功能。人參皂甙Rb1是純化的皂甙，含于藥用人參，但是由于其口服用藥后無法由血液中測(cè)出，人參皂甙Rb1的藥物作用基本是被否定的。但是，按照本發(fā)明的實(shí)例，清楚地說明了在靜脈內(nèi)施用人參皂甙Rb1是有效的，其效力和應(yīng)用不依賴于藥用人參。
下面，用試驗(yàn)測(cè)定人參皂甙Rb1對(duì)神經(jīng)細(xì)胞膜脂過氧化的預(yù)防作用。
按照Peng等人的方法(Peng H.等人，腦血液流動(dòng)代謝雜志(J.Cereb.Blood Flow Metab.)，18，349-360，1998)，胚胎齡17的大鼠的腦皮質(zhì)神經(jīng)元在無血清培養(yǎng)介質(zhì)中保持3天，然后，用含或不含人參皂甙Rb1的新鮮介質(zhì)替代上述介質(zhì)，將神經(jīng)元再孵化48小時(shí)。然后，將介質(zhì)轉(zhuǎn)換成含有硫酸亞鐵和抗壞血酸，但是不含人參皂甙Rb1的新鮮介質(zhì)，將神經(jīng)元培養(yǎng)物保持2小時(shí)以產(chǎn)生羥基自由基，并對(duì)神經(jīng)元膜造成氧化作用傷害。通過光度法測(cè)定所生成的神經(jīng)元膜脂過氧化物，測(cè)定用十二烷基硫酸鈉溶解細(xì)胞后固定的硫代巴比妥酸(TBA)的量。
本發(fā)明試驗(yàn)的目的是測(cè)定在抑制硫酸亞鐵引起的神經(jīng)細(xì)胞壞死所需要的0.1-100fg/ml的濃度范圍內(nèi)，人參皂甙Rb1能不能預(yù)防細(xì)胞膜脂的過氧化作用。
圖5的試驗(yàn)結(jié)果表明，只有在濃度為100fg/ml時(shí)人參皂甙Rb1對(duì)細(xì)胞膜脂的過氧化略有預(yù)防作用，在0.1-10fg/ml沒有觀察到它們對(duì)細(xì)胞膜脂的過氧化有預(yù)防作用，所述的預(yù)防作用是其中由硫酸亞鐵所引起的自由基損傷減少。因此，正如前述報(bào)告(Lim J.-H.，等人，神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)研究(Neurosci.Res.)，28，191-200，1997；Zhang B.，等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)所述的，濃度為0.1-100fg/ml時(shí)人參皂甙Rb1確實(shí)減少了自由基的神經(jīng)毒性。但是，后來發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rb1也可以抑制脂過氧化物形成的假設(shè)是不正確的。因此，本試驗(yàn)說明了有必要對(duì)人參皂甙Rb1作用的新機(jī)理進(jìn)行分析。
為此目的，我們測(cè)定人參皂甙Rb1對(duì)神經(jīng)細(xì)胞死亡的抑制作用(編程性細(xì)胞死亡)。
根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞的死亡可粗略地分成壞死和編程性細(xì)胞死亡。關(guān)于神經(jīng)細(xì)胞死亡，壞死的概念已經(jīng)確定。但是，作為神經(jīng)元編程性細(xì)胞死亡的概念，如在淋巴細(xì)胞中所觀察到的典型特征很少被注意到，雖然在病態(tài)條件下成熟的腦細(xì)胞中也有類似的現(xiàn)象。因此，在本說明書中，在神經(jīng)細(xì)胞死亡的漸變過程中它們不同于壞死，被定義為“神經(jīng)細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡”或“神經(jīng)細(xì)胞的類編程性細(xì)胞死亡”。
最近發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞(或神經(jīng)元)短時(shí)間暴露于氧化氮(NO)供體和硝普納鹽(SNP)時(shí)，可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡(Toku K.，等人，神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)研究學(xué)報(bào)(J.Neurosci.Res.)，53，415-425，1998)。在此培養(yǎng)試驗(yàn)中可觀察到編程性細(xì)胞死亡的典型特征，通過此系統(tǒng)可判斷出人參皂甙Rb1對(duì)編程性細(xì)胞死亡的抑制作用。
在取自胚胎齡17的大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元)于無血清培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)4或5天后，然后，用含或不含人參皂甙Rb1的新鮮介質(zhì)替代上述介質(zhì)，將神經(jīng)元孵化24小時(shí)。然后，用10分鐘將濃度為100μM的SNP加入介質(zhì)，使神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元)保持在含人參皂甙Rb1的介質(zhì)中16小時(shí)。用氧化還原作用指示劑alamar藍(lán)測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞的生存率。
在前述加入硫酸亞鐵的試驗(yàn)中，預(yù)先在培養(yǎng)介質(zhì)中加入人參皂甙Rb1，測(cè)定其結(jié)果。在此試驗(yàn)中可在SNP加入之前和之后加入人參皂甙Rb1，或者只在加入SNP之后加入人參皂甙Rb1，然后測(cè)定其效果。
圖6給出了試驗(yàn)結(jié)果。圖6的右圖中是用SNP處理的結(jié)果。實(shí)心柱說明了在SNP處理前和后均加入人參皂甙Rb1的結(jié)果；斜線柱說明了只在SNP處理后加入人參皂甙Rb1的結(jié)果。
如圖6的左圖所指出的，在未用氧化氮(NO)供體、硝普納鹽(SNP)處理的情況下，人參皂甙Rb1對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的代謝活性沒有顯著作用。SNP處理的結(jié)果是沒有加入人參皂甙Rb1的發(fā)生了神經(jīng)細(xì)胞死亡(編程性細(xì)胞死亡)(圖6的右圖中左起第一柱)，但是濃度為1-100fg/ml的人參皂甙Rb1大大抑制了神經(jīng)細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡，在SNP處理前和后用藥的情況或是僅僅在SNP處理后用藥的情況下都是如此。
本試驗(yàn)的結(jié)果是證明了低濃度，如1-100fg/ml的人參皂甙Rb1可抑制劑細(xì)胞外液中神經(jīng)細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡，甚至是在以前知道的很低的濃度下。這就從實(shí)際上說明了人參皂甙Rb1有可能被用于處理或治療病理性的類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)細(xì)胞死亡，這在世界上尚屬首次。
下面說明可分析人參皂甙Rb1對(duì)Bc1-xL表達(dá)的作用的試驗(yàn)。
Bc1-xL基因存在于很多組織如成熟的腦、免疫系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)中，并且被證明它們對(duì)細(xì)胞的生存起著重要的作用(Adams J.M.和Cory S.，科學(xué)(Science)，281，1322-1326，1998；Boise，L.H.，等人，細(xì)胞(Cell)，74，597-608，1993；Gottschalk A.R.，等人，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，91，7350-7354，1994；Gonzalez-Garcia M.，等人，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，92，4304-4308，1995)。
本發(fā)明研究了人參皂甙Rb1是不是可以提高Bc1-xL的表達(dá)。試驗(yàn)技術(shù)是按照Wen等人所述進(jìn)行的(Wen T.-C.，等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)，188，635-649，1998)。總RNA由培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中萃取得到，該細(xì)胞被濃度為0fg/ml，1fg/ml和100fg/ml的人參皂甙Rb1處理24小時(shí)。用低聚脫氧核苷酸引物和反轉(zhuǎn)錄酶(Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶)由脫氧核糖核酸酶處理的總RNA(3μg)制備cDNA。使用Taq聚合酶，在下述條件下進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)(聚合酶鏈反應(yīng)，PCR)(1)94℃，2分鐘；(2)94℃，1.5分鐘；55℃，1.5分鐘；72℃，2分鐘構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，對(duì)Bc1-xL進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，對(duì)B-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行20個(gè)循環(huán)；和(3)72℃，2分鐘。
在3％瓊脂糖凝膠上用電泳測(cè)定PCR產(chǎn)物，用溴化乙錠染色使之可見。用B-肌動(dòng)蛋白mRNA的表達(dá)作為內(nèi)標(biāo)。結(jié)果見圖7。
為了研究人參皂甙Rb1是不是可以提高神經(jīng)細(xì)胞中Bc1-xL蛋白的表達(dá)，用抗Bc1-xL蛋白抗體免疫印跡法進(jìn)行試驗(yàn)。將大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元在有或沒有人參皂甙Rb1的情況下培養(yǎng)48小時(shí)后，將神經(jīng)元(神經(jīng)細(xì)胞)溶解于用于電泳分析的樣品緩沖液中進(jìn)行電泳分析。將電泳的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜上進(jìn)行免疫印跡法分析，結(jié)果如圖8所示。
進(jìn)一步的，用圖象分析儀對(duì)和抗Bc1-xL蛋白抗體反應(yīng)的帶進(jìn)行定量，結(jié)果如圖9所示。
如圖7所示，在用1fg/ml或100fg/ml人參皂甙Rb1處理的培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞中，和對(duì)照組(0fg/ml)相比，Bc1-xLmRNA的表達(dá)提高了。濃度為1-100fg/ml范圍內(nèi)的人參皂甙Rb1對(duì)類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)細(xì)胞死亡具有抑制作用，大大提高了神經(jīng)元的Bc1-xL蛋白表達(dá)的數(shù)量，差不多可達(dá)到50％(圖8和圖9)。
在神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)元有助于Bc1-xL蛋白表達(dá)的活性物質(zhì)中，濃度為0.6-15.0ng/ml的白細(xì)胞介素3已有報(bào)道(Wen T.-C.，等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)，188，635-649，1998)。與白細(xì)胞介素3相比，很低的濃度下的人參皂甙Rb1可上調(diào)Bcl-xL蛋白的表達(dá)，Bc1-xL蛋白的表達(dá)的提高比白細(xì)胞介素3提高大約10％。只有在直接用于腦室之內(nèi)時(shí)，白細(xì)胞介素3才表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用，但是前述試驗(yàn)已經(jīng)證明靜脈施用人參皂甙Rb1也可保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞或腦神經(jīng)元(實(shí)施例1)。因此，在非肽類親神經(jīng)性的物質(zhì)中，目前在世界上人參皂甙Rb1是僅有的一種可由外圍給藥的Bc1-xL蛋白表達(dá)增長劑。迄今為至，沒有人能夠預(yù)測(cè)出能夠有助于Bc1-xL蛋白的表達(dá)的，顯示出比肽因子(白細(xì)胞介素3)具有更有效的活性的非肽類藥物。在神經(jīng)細(xì)胞中能使Bc1-xL蛋白的表達(dá)略有提高的肽因子，我們僅知道白細(xì)胞介素3。
據(jù)說，作為與Apaf 1結(jié)合的結(jié)果，與Bc1-xL蛋白有關(guān)的線粒體能夠抑制Apaf 1與procaspase 9的結(jié)合(Adams J.M.和Cory S.，科學(xué)(Science)，281，1322-1326，1998)。如果Bc1-xL蛋白減少或功能衰退，可由Bc1-xL蛋白釋放出Apaf 1以活化procaspase 9，并伴隨著來自線粒體的細(xì)胞色素C的損耗(Adams J.M.和Cory S.，科學(xué)(Science)，281，1322-1326，1998)。一旦細(xì)胞質(zhì)的procaspase 9被活化，接著caspase 9和caspase 3也被活化，通過這些蛋白酶的作用加速了細(xì)胞的自體溶解，從而進(jìn)入編程性細(xì)胞死亡的過程。在活化procaspase 9的階段，細(xì)胞可能出現(xiàn)死亡，因此，通過提高Bc1-xL蛋白的表達(dá)(人參皂甙Rb1)，防止或抑制procaspase 9的活化是預(yù)先排除細(xì)胞死亡的一種聰明的方法。
為了分析人參皂甙Rb1對(duì)腦內(nèi)類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)元死亡的抑制作用，本發(fā)明人測(cè)試了在成熟的腦中實(shí)際出現(xiàn)的類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)元死亡是否可以因?yàn)槭┯昧巳藚⒃磉癛b1而減少。使用沙鼠的3分鐘前腦缺血模型作為動(dòng)物模型。有報(bào)道說，在3分鐘缺血后的第一周，大約產(chǎn)生一半的海馬CA1錐體神經(jīng)元(Sakanaka M.，等人，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95，4635-4640，1998)。但是，應(yīng)用TUNEL染色法，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在此瞬間，在保留的神經(jīng)細(xì)胞中，作為類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)元死亡標(biāo)志的神經(jīng)細(xì)胞核的碎片仍然在繼續(xù)變化(Wen T.-C.，等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)，188，635-649，1998；Peng H.，等人，腦血液流動(dòng)代射雜志(J.Cereb.BloodFlow Metab.)，18，349-360，1998)。用此動(dòng)物模型，采用TUNEL染色的方法測(cè)試了3分鐘缺血模型在第7天的類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)元死亡是否可被靜脈內(nèi)施用人參皂甙Rb1所抑制。
在用吸入法麻醉使沙鼠前腦3分鐘缺血后立即以2.5ng或25ng的劑量由靜脈內(nèi)一次施用人參皂甙Rb1，隨后用微型滲透真空泵將人參皂甙Rb1(60ng/天或600ng/天)連續(xù)注入腦室，共一周。在沙鼠前腦3分鐘缺血一周后，在戊巴比妥麻醉下，沙鼠用含有4％多聚甲醛的磷酸鹽緩沖溶液穿心灌注和固定，將腦切下。將腦置于石蠟中，切成5μm厚的石蠟切片。按照常規(guī)方法進(jìn)行TUNEL染色。對(duì)照動(dòng)物灌注相等量的生理鹽水。
結(jié)果見圖10。圖10(A)說明了對(duì)照組動(dòng)物的試驗(yàn)結(jié)果；(B)為以劑量60ng/天施用人參皂甙Rb1的動(dòng)物的試驗(yàn)結(jié)果；和(C)為以劑量600ng/天施用人參皂甙Rb1的動(dòng)物的試驗(yàn)結(jié)果。
如圖10(A)所示，在造成前腦3分鐘缺血的沙鼠的海馬CA1區(qū)域，在缺血一周后出現(xiàn)大量的TUNEL-陽性神經(jīng)元，這說明神經(jīng)元在以類編程性細(xì)胞死亡的方式死亡。在3分鐘前腦缺血后立即在腦室內(nèi)施用人參皂甙Rb1的結(jié)果是以劑量依賴關(guān)系的方式大大地減少了TUNEL-陽性神經(jīng)細(xì)胞[Fig.10(B)，10(C)，10(D)]。這說明實(shí)施例3和4的培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果可應(yīng)用于體內(nèi)。已有報(bào)告說，人參皂甙Rb1不能影響腦血流或腦溫(Lim J.-H.，等人，神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)研究(Neurosci.Res.)，28，191-200，1997；Zhang B.，等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)。
上述試驗(yàn)結(jié)果說明用于靜脈內(nèi)施用的，含有人參皂甙Rb1或其鹽的制劑在很低的濃度下使用時(shí)是有效的，可用于治療、預(yù)防或處理腦和神經(jīng)疾病，如腦血管癡呆、腦梗塞、腦中風(fēng)和暫時(shí)性腦缺血發(fā)作(TIA)。
已經(jīng)證明在1ng/ml或更低，更具體地是1pg/ml或更低，更具體地是在1-100fg/ml的濃度下，人參皂甙Rb1或其鹽能夠抑制編程性細(xì)胞死亡或類編程性細(xì)胞死亡。進(jìn)一步地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rb1或其鹽可促進(jìn)抑制細(xì)胞死亡的基因產(chǎn)物Bc1-xL的表達(dá)。
已知人參皂甙Rb1或其鹽是藥用人參的一種組分，其毒性很低。
本發(fā)明提供了可臨床使用的腦和神經(jīng)疾病的治療劑或預(yù)防劑。本發(fā)明的腦和神經(jīng)疾病的治療或預(yù)防劑優(yōu)選是靜脈內(nèi)使用的制劑。更具體地，本發(fā)明靜脈內(nèi)使用的制劑以及腦細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑含有人參皂甙Rb1或其鹽，并可調(diào)節(jié)其在受損組織中的細(xì)胞外濃度，使人參皂甙Rb1或其鹽在受損組織中的細(xì)胞外濃度保持在1ng/ml或更低，優(yōu)選1pfg/ml或更低，更優(yōu)選在1-100fg/ml。
在MCA永久阻塞后，立即在左股靜脈一次性注射含有濃度為1μg/μl或0.1μg/μl人參皂甙Rb1的60μl生理鹽水；然后用導(dǎo)管連接到Alza微型滲透真空泵，該泵植入每只動(dòng)物背部皮下，由一次性注射人參皂甙Rb1的部位插入相同的靜脈。在所述的微型滲透真空泵中預(yù)先充滿含有人參皂甙Rb1的生理鹽水，將人參皂甙Rb1以60μg/天或6μg/天的劑量通過置于左股靜脈的導(dǎo)管連續(xù)輸入血液，共28天。含有人參皂甙Rb1的溶液的流速是每小時(shí)0.25μl。
MCA永久阻塞的對(duì)照動(dòng)物(缺血對(duì)照動(dòng)物)和假性操作動(dòng)物施用相同劑量的生理鹽水。
在MCA永久阻塞之后，按照常規(guī)的方法(Zhang B.等人，J.StrokeCerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)，各自在第二周和第四周的第4天進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，測(cè)定SH-SP大鼠的位置導(dǎo)向能力。
結(jié)果如圖1所示。圖1的左圖說明了MCA阻塞第二周的水迷宮試驗(yàn)的結(jié)果；圖1的右圖說明了MCA阻塞第四周的水迷宮試驗(yàn)的結(jié)果。圖1中，實(shí)心圈(●)表示大鼠假性操作的結(jié)果；空心圈(○)表示MCA阻塞的大鼠僅用生理鹽水灌輸?shù)慕Y(jié)果；實(shí)心方塊(■)表示每天以6μg劑量的人參皂甙Rb1灌輸?shù)腗CA阻塞大鼠的試驗(yàn)結(jié)果；空心方塊(□)表示每天以60μg劑量的人參皂甙Rb1灌輸?shù)腗CA阻塞大鼠的試驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)以平均值±SE表示。統(tǒng)計(jì)分析用ANOVA＋Fisher的PLSD方法進(jìn)行。
在四個(gè)試驗(yàn)組中游泳速度沒有觀察到顯著差別。
在第四周終止水迷宮試驗(yàn)以后，將SH-SP大鼠用水合氯醛麻醉，用含有4％多聚甲醛的0.1mol磷酸鹽緩沖溶液穿心灌輸和固定，切下腦，并將發(fā)生梗塞的腦皮質(zhì)部分照相。用圖象分析儀測(cè)量照片上的左大腦半球的面積和左腦皮質(zhì)梗塞的損傷面積。左腦皮質(zhì)梗塞面積除以左大腦半球面積，可計(jì)算出腦皮質(zhì)梗塞的比率(％)。結(jié)果如圖2所示。
圖3A和圖3B分別說明了用生理鹽水灌輸和每天以6μg人參皂甙Rbl灌輸組大腦皮質(zhì)梗塞損傷的實(shí)際情況。
圖4是歸納了本試驗(yàn)結(jié)果的圖示。在施用生理鹽水的大鼠中留下的腦梗塞較大，在水迷宮試驗(yàn)中，大鼠逃逸到目標(biāo)平臺(tái)的時(shí)間較長。相反，施用本發(fā)明人參皂甙Rb1的大鼠，其梗塞面復(fù)原和減少，其結(jié)果是，大鼠逃逸到目標(biāo)平臺(tái)所用的時(shí)間短。實(shí)施例2(人參皂甙Rb1對(duì)神經(jīng)元膜脂過氧化的預(yù)防作用)胚胎齡17的大鼠的腦皮質(zhì)神經(jīng)元在無血清培養(yǎng)介質(zhì)中保持3天，然后，用含有人參皂甙Rb1的新鮮介質(zhì)替代上述介質(zhì)，濃度為0.1fg/ml，lfg/ml，10fg/ml，100fg/ml和1000fg/ml，或者不含人參皂甙Rb1(0fg/ml)，將神經(jīng)元再孵化48小時(shí)。然后，將介質(zhì)轉(zhuǎn)換成含有硫酸亞鐵和抗壞血酸，但是不含人參皂甙Rb1的新鮮介質(zhì)，將神經(jīng)元培養(yǎng)物保持2小時(shí)以產(chǎn)生羥基自由基，并對(duì)神經(jīng)元膜造成氧化作用傷害。通過光度法測(cè)定所生成的神經(jīng)元膜脂過氧化物，測(cè)定用十二烷基硫酸鈉溶解細(xì)胞后固定的硫代巴比妥酸(TBA)的量。
結(jié)果見圖5。由試驗(yàn)結(jié)果可知，只有在濃度為100fg/ml時(shí)人參皂甙Rb1對(duì)細(xì)胞膜脂的過氧化略有預(yù)防作用，在0.1-10fg/ml沒有觀察到它們對(duì)細(xì)胞膜脂的過氧化有預(yù)防作用，所述的預(yù)防作用是其中由硫酸亞鐵所引起的自由基損傷減少。實(shí)施例3 [確定人參皂甙Rb1對(duì)神經(jīng)細(xì)胞死亡(編程性細(xì)胞死亡)的抑制作用的試驗(yàn)]將取自胚胎齡17的大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元)于無血清培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)4或5天，然后，用含有人參皂甙Rb1的新鮮介質(zhì)替代上述介質(zhì)，濃度為1fg/ml，100fg/ml和100pg/ml，或者不含人參皂甙Rb1(0fg/ml)的新鮮介質(zhì)替代上述介質(zhì)，將神經(jīng)元孵化24小時(shí)。然后，用10分鐘將氧化氮(NO)供體、濃度為100μM的硝普納鹽(SNP)加入介質(zhì)，使神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元)保持在含人參皂甙Rb1的介質(zhì)中16小時(shí)。用氧化還原作用指示劑alamar藍(lán)測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞的生存率。
圖6給出了試驗(yàn)結(jié)果。圖6的左圖給出了未用SNP處理的結(jié)果；人參皂甙Rb1對(duì)沒有SNP處理的神經(jīng)元的代謝活性沒有影響。圖6的右圖中是用SNP處理的結(jié)果。實(shí)心柱說明了在SNP處理前和后均加入人參皂甙Rb1的結(jié)果；斜線柱說明了只在SNP處理后加入人參皂甙Rb1的結(jié)果。數(shù)據(jù)以平均值±SE表示。統(tǒng)計(jì)分析用ANOVA＋Fisher的PLSD進(jìn)行。星號(hào)表示相對(duì)于沒有加入人參皂甙Rb1的情況具有顯著的差異(*p＜0.05，**p＜0.01)。
圖6的左圖給出了用氧化氮(NO)供體、硝普納鹽(SNP)處理的結(jié)果，人參皂甙Rb1對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的代謝活性沒有顯著影響。作為SNP處理的結(jié)果，沒有加入人參皂甙Rb1的發(fā)生了神經(jīng)細(xì)胞死亡(編程性細(xì)胞死亡)(圖6的右圖中左起第一柱)，但是濃度為1-100fg/ml的人參皂甙Rb1大大抑制了神經(jīng)細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡，在SNP處理前和后用藥的情況或是僅在SNP處理后用藥的情況下都是如此。實(shí)施例4(分析人參皂甙Rb1對(duì)Bc1-xL表達(dá)的作用的試驗(yàn))為了研究本發(fā)明的人參皂甙Rb1是不是可以提高Bc1-xL基因的表達(dá)，按照Wen等人的試驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行(Wen T.-C.，等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)，188，635-649，1998)，總RNA由培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中萃取得到，該細(xì)胞被濃度為0fg/ml，1fg/ml和100fg/ml的人參皂甙Rb1處理24小時(shí)。用低聚脫氧核苷酸引物和反轉(zhuǎn)錄酶(Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶)由脫氧核糖核酸酶處理的總RNA(3μg)制備cDNA。用PCR進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增。PCR是用Taq聚合酶，在下述條件下進(jìn)行的(1)94℃，2分鐘；(2)94℃，1.5分鐘；55℃，1.5分鐘；72℃，2分鐘構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，對(duì)Bc1-xL進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，對(duì)β-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行20個(gè)循環(huán)；和(3)72℃，2分鐘。
在3％瓊脂糖凝膠上用電泳測(cè)定PCR產(chǎn)物，用溴化乙錠染色使之可見。用β-肌動(dòng)蛋白mRNA的表達(dá)作為內(nèi)標(biāo)。結(jié)果見圖7。
此外，為了研究人參皂甙Rb1是不是可以提高神經(jīng)細(xì)胞中Bc1-xL蛋白的表達(dá)，用抗Bc1-xL蛋白抗體免疫印跡法進(jìn)行試驗(yàn)。將大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元在有或沒有人參皂甙Rb1的情況下培養(yǎng)48小時(shí)后，將神經(jīng)元(神經(jīng)細(xì)胞)溶解于用于電泳分析的樣品緩沖液中進(jìn)行電泳分析。將電泳的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜上進(jìn)行免疫印跡法分析，結(jié)果如圖8所示。
進(jìn)一步的，用圖象分析儀對(duì)和抗Bc1-xL蛋白抗體反應(yīng)的帶進(jìn)行定量，結(jié)果如圖9所示。統(tǒng)計(jì)分析按照ANOVA＋Fisher的PLSD方法進(jìn)行。圖中的星號(hào)表示相對(duì)于沒有加入人參皂甙Rb1的情況具有顯著的差異(**p＜0.01)。
如圖7所示，在用1fg/ml或100fg/ml人參皂甙Rb1處理的培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞中，和對(duì)照組(0fg/ml)相比，Bc1-xLmRNA的表達(dá)提高了。濃度為1-100fg/ml范圍內(nèi)的人參皂甙Rb1對(duì)類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)細(xì)胞死亡具有抑制作用，大大提高了類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)細(xì)胞中Bc1-xL蛋白表達(dá)的數(shù)量，差不多可達(dá)到50％(參見圖9)。實(shí)施例5(分析人參皂甙Rb1對(duì)腦內(nèi)類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)元死亡的抑制作用)在用吸入法麻醉下使沙鼠前腦3分鐘缺血后立即以2.5ng或25ng的劑量在靜脈內(nèi)一次施用人參皂甙Rb1，隨后用微型滲透真空泵將人參皂甙Rb1(60ng/天或600ng/天)連續(xù)注入腦室，共一周。在沙鼠前腦3分鐘缺血一周后，在戊巴比妥麻醉下，沙鼠用含有4％多聚甲醛的磷酸鹽緩沖溶液穿心灌注和固定，將腦切下。將腦置于石蠟中，切成5μm厚的石蠟切片。按照常規(guī)方法進(jìn)行TUNEL染色。對(duì)照動(dòng)物灌注相等量的生理鹽水。
結(jié)果見圖10。在圖10(D)用Mann-Whitney的U-試驗(yàn)方法進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。圖10(A)說明了對(duì)照組動(dòng)物的試驗(yàn)結(jié)果；(B)為以劑量60ng/天施用人參皂甙Rb1的動(dòng)物的試驗(yàn)結(jié)果；和(C)為以劑量600ng/天施用人參皂甙Rb1的動(dòng)物的試驗(yàn)結(jié)果。
如圖10(A)所示，在造成3分鐘前腦缺血的沙鼠的海馬CA1區(qū)域，在缺血一周后出現(xiàn)大量的TUNEL-陽性神經(jīng)元，這說明神經(jīng)元在以類編程性細(xì)胞死亡的方式死亡。在3分鐘前腦缺血后立即在腦室內(nèi)施用人參皂甙Rb1的結(jié)果是以劑量依賴關(guān)系的方式大大地減少了TUNEL-陽性神經(jīng)細(xì)胞[Fig.10(B)，10(C)，10(D)]。這說明實(shí)施例3和4的培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果可應(yīng)用于體內(nèi)。已有報(bào)告說，人參皂甙Rb1不能影響腦血流或腦溫(Lim J.-H.，等人，神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)研究(Neurosci.Res.)，28，191-200，1997；Zhang B.，等人，J.Stroke Cerebrovasc.Dis.，7，1-9，1998)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了用于治療、處理或預(yù)防腦和神經(jīng)疾病特別有效的，含有人參皂甙Rb1的制劑，該制劑在損傷部位為低細(xì)胞外濃度，所述的腦和神經(jīng)疾病例如急性或慢性腦梗塞、腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦栓塞或短暫大腦缺血發(fā)作的癥狀；本發(fā)明還提供了神經(jīng)保護(hù)劑或靜脈內(nèi)用藥的制劑，其中含有在損傷部位為低細(xì)胞外濃度的人參皂甙Rb1。也就是說，關(guān)于人參皂甙Rb1，本發(fā)明提供了可用于給疑有腦中風(fēng)的患者在靜脈內(nèi)滴注輸液的藥物，甚至在救護(hù)車中也可使用。在急性腦中風(fēng)的情況下，發(fā)作后的二周內(nèi)其損傷往往會(huì)惡化，如果在此期間(例如1天或14天)施用本發(fā)明的人參皂甙Rb1，預(yù)期可達(dá)到足夠的效果。進(jìn)一步的，在臨床醫(yī)學(xué)、外科血管成形術(shù)和/或給腦中風(fēng)患者再灌注方面實(shí)際應(yīng)用的結(jié)果可能還會(huì)擴(kuò)大。
含有本發(fā)明人參皂甙Rb1或其鹽的藥物組合物可提高Bc1-xL蛋白的表達(dá)，因此對(duì)伴隨有類編程性細(xì)胞死亡的神經(jīng)細(xì)胞死亡的其它原發(fā)或繼發(fā)的神經(jīng)變性疾病(阿爾茨海默氏癥、Pick病、脊髓小腦退化、帕金森癥、舞蹈癥、青光眼、肌萎縮側(cè)索硬化、老年性黃斑變性、AIDS性腦病、肝性腦病、糖尿病性視網(wǎng)膜炎、腦炎、大腦性癱瘓、視網(wǎng)膜脫離、頭或腦損傷、脊髓損傷、脫髓鞘病、新生兒窒息、周圍神經(jīng)疾病、視網(wǎng)膜色素退化等)是有效的。
本發(fā)明的藥物組合物提供了高安全性的藥物，因?yàn)樗鼛缀鯖]有副作用。
本發(fā)明公開了通過在損傷部位的低細(xì)胞外濃度的人參皂甙Rb1促進(jìn)Bc1-xL蛋白的表達(dá)，人參皂甙Rb1可抑制編程性細(xì)胞死亡或類編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞死亡，這在過去是未知的。這個(gè)事實(shí)說明人參皂甙Rb1不僅對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)是有效的，而且對(duì)伴隨有編程性細(xì)胞死亡或類編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞死亡的外圍組織疾病(例如，器官移植后的排斥、心力不足或心臟衰竭、心肌病、心臟缺血的再灌注損傷、肝和腎病、舌痛、心肌梗死、放射性損傷、外周動(dòng)脈阻塞、周圍循環(huán)衰竭、褥瘡、角膜損傷、自身免疫病和免疫缺陷)或在器官移植之后保護(hù)器官和組織也是有效的。在治療或處理外周組織疾病時(shí)，人參皂甙Rb1的用量小于給CNS疾病所使用的量就可達(dá)到足夠的效果和效力。此外，本發(fā)明含有人參皂甙Rb1或其鹽的藥物組合物不僅可用作靜脈內(nèi)使用的制劑，而且還可用作鼻的滴劑、吸入劑、舌下片劑、栓劑、局部應(yīng)用的制劑、皮膚外用的制劑、口服制劑、眼睛用滴劑、局部應(yīng)用的擴(kuò)散劑、肌內(nèi)注射劑、皮下注射劑和皮內(nèi)注射劑。另外，本發(fā)明的藥物組合物還可用作口服給藥的制劑，通過將人參皂甙Rb1與載體混合、裝入膠囊或相結(jié)合制成口服制劑，所述的載體在消化道中可抑制分解或促進(jìn)吸收。
權(quán)利要求
1.適于靜脈內(nèi)用藥的藥物組合物，該組合物含有人參皂甙Rb1或其鹽以及載體。
2.按照權(quán)利要求1的藥物組合物，其中人參皂甙Rb1或其鹽在損傷組織細(xì)胞外液中的濃度為1ng/ml或更低。
3.按照權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述的細(xì)胞是腦細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞。
4.按照權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的藥物組合物，該組合物包括一次性靜脈內(nèi)施用的或靜脈內(nèi)連續(xù)施用的制劑。
5.按照權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的藥物組合物，包括促進(jìn)細(xì)胞死亡抑制性基因產(chǎn)物Bc1-xL表達(dá)的藥物組合物。
6.按照權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的藥物組合物，包括抑制編程性細(xì)胞死亡或類編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞死亡的藥物組合物。
7.按照權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的藥物組合物，包括用于治療、預(yù)防或處理腦和神經(jīng)疾病的藥物組合物。
8.按照權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述的腦和神經(jīng)疾病是大腦血管癡呆、腦梗塞、腦中風(fēng)或短暫腦缺血發(fā)作。
9.用于治療、預(yù)防或處理腦和神經(jīng)疾病的制劑，其中含有人參皂甙Rb1或其鹽。
10.按照權(quán)利要求9的用于治療、預(yù)防或處理腦和神經(jīng)疾病的制劑，其中所述的腦和神經(jīng)疾病是大腦血管癡呆、腦梗塞、腦中風(fēng)或短暫腦缺血發(fā)作。
11.腦細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)性藥劑或制劑，其中含有人參皂甙Rb1或其鹽。
12.用于促進(jìn)細(xì)胞死亡抑制性基因產(chǎn)物Bc1-xL的藥劑或制劑，其中含有人參皂甙Rb1或其鹽。
13.用于抑制編程性細(xì)胞死亡或類編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞死亡的藥劑或制劑，其中含有人參皂甙Rb1或其鹽。
14.按照權(quán)利要求9-13中任意一項(xiàng)的用于治療、預(yù)防或處理的制劑或藥劑，其中人參皂甙Rb1或其鹽在損傷組織細(xì)胞外液中的濃度為1ng/ml或更少。
15.按照權(quán)利要求14的用于治療、預(yù)防或處理的制劑或藥劑，其中人參皂甙Rb1或其鹽在損傷組織細(xì)胞外液中的濃度為1-100fg/ml。
16.治療、預(yù)防或處理腦和神經(jīng)疾病的方法，該方法包括施用有效量的人參皂甙Rb1或其鹽。
17.按照權(quán)利要求16的治療、預(yù)防或處理疾病的方法，其中所述的腦和神經(jīng)疾病是大腦血管癡呆、腦梗塞、腦中風(fēng)或短暫腦缺血發(fā)作。
18.按照權(quán)利要求16或17的治療、預(yù)防或處理疾病的方法，其中所述的施用是靜脈內(nèi)給藥。
19.人參皂甙Rb1或其鹽在制備用于治療、預(yù)防或處理腦和神經(jīng)疾病的制劑中的應(yīng)用。
20.按照權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中用于治療、預(yù)防或處理腦和神經(jīng)疾病的制劑是靜脈內(nèi)施用的制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了有效地施用人參皂甙Rb
文檔編號(hào)A61P37/00GK1331698SQ99814933
公開日2002年1月16日 申請(qǐng)日期1999年5月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者阪中雅廣, 田中潤也, 佐藤康二 申請(qǐng)人:科學(xué)技術(shù)振興事業(yè)團(tuán)