本發(fā)明涉及桑葉、石榴皮降血糖藥用活性物質(zhì)水解工藝及降血糖藥。

背景技術(shù)：

糖尿病是一種常見的以慢性高血糖和糖脂代謝、蛋白質(zhì)代謝紊亂為主要特點的內(nèi)分泌疾病，其發(fā)病原因主要為胰島素分泌絕對不足和胰島抵抗。胰島素不足時，血清葡萄糖含量持續(xù)增高，超過腎臟的重吸收能力，致使大量葡萄糖隨尿排泄，引起滲透性利尿，導(dǎo)致機體脫水，腦細胞失水可引起腦功能紊亂直至昏迷，且由于糖尿病病人存在糖的利用障礙，轉(zhuǎn)而通過分解脂肪產(chǎn)生能量，伴隨著脂肪分解，酮體生成增加，導(dǎo)致糖尿病酮癥酸中毒(楊軒璇.中藥降糖藥理作用研究進展[j]，河北中醫(yī)，2004；26(4)：305-308)。研究顯示，氧化應(yīng)激與糖尿病的形成有密切聯(lián)系，氧化應(yīng)激產(chǎn)生過量的自由基會導(dǎo)致胰島β細胞功能損傷，胰島素分泌量不足及外周胰島素抵抗，誘發(fā)糖尿病的形成，并引起糖尿病神經(jīng)病、糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病心腦血管疾病等多種并發(fā)癥(selvarajuv,joshim,sureshs,sanchezja,maulikn,maulikg.diabetes,oxidativestress,molecularmechanism,andcardiovasculardisease--anoverview.toxicolmechmethods2012；22(5):330–335.)。因此治療糖尿病，除了要控制血糖之外，抑制自由基過量產(chǎn)生而導(dǎo)致的組織細胞氧化損傷也十分必要。

桑葉作為一味傳統(tǒng)中藥在古代就被用來治療消渴癥，《本草綱目》明確記載桑葉“煎之代茗，能止消渴”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桑葉中的多糖、黃酮、生物堿等成分具有降血糖的作用，其中生物堿的降血糖作用最顯著，它可顯著抑制α-糖苷酶活性，降低碳水化合物的轉(zhuǎn)化吸收(原愛紅，馬駿，蔣曉峰，等.桑葉中糖苷酶抑制活性組分的篩選及體外活性研究[j].同濟大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2005,26(4):8-11.)。桑葉生物堿中多種已知化合物的降血糖效果已經(jīng)被諸多報道證實(you-guili,dong-fengji,shizhong,tian-baolin,zhi-qianglv,gui-yanhu&xinwang.1-deoxynojirimycininhibitsglucoseabsorptionandacceleratesglucosemetabolisminstreptozotocin-induceddiabeticmice.scientificreports,2013；3:1377；liy-g,jid-f,zhongs,lvz-q,lint-b。you-guili,dong-fengji,shizhong,zhi-qianglv,tian-baolin.cooperativeanti-diabeticeffectsofdeoxynojirimycin-polysaccharidebyinhibitingglucoseabsorptionandmodulatingglucosemetabolisminstreptozotocin-induceddiabeticmice[j].plosone,2013,8(6):e65892.)。

石榴皮中多酚化合物鞣花酸已被證實具有很強的抗氧化能力，能夠體外清除·oh、超氧陰離子、dpph·，抑制脂質(zhì)過氧化，在體內(nèi)能夠降低氧化應(yīng)激小鼠的肝臟和血液中脂質(zhì)過氧化標志物丙二醛(mda)的含量，提高肝臟和血液中總抗氧化能力(t-aoc)，同時提高肝臟中抗氧化酶超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)的活力(sunyq,taox,menxm,liym,xuzw,wt.invitroandinvivoantioxidantactivitiesofthreemajorpolyphenoliccompoundsinpomegranatepeel:ellagicacid，punicalin，andpunicalagin.journalofintegrativeagriculture,2017)。但是石榴皮多酚中游離鞣花酸的含量較低，要獲得高含量鞣花酸的石榴皮多酚需使石榴皮多酚中鞣花單寧水解釋放鞣花酸，提高鞣花酸的含量。

因此本發(fā)明建立了石榴皮多酚鞣花酸的水解工藝，并利用桑葉生物堿的α-糖苷酶抑制劑作用及石榴皮多酚中鞣花酸的清除自由基的能力，將兩種藥用成合理配比組成配方，一方面降低餐后血糖，另一方面減少自由基導(dǎo)致的胰島β細胞及其他組織器官氧化損傷，達到治療糖尿病綜合癥的目的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供桑葉、石榴皮降血糖藥用活性物質(zhì)水解工藝及降血糖藥，通過兩類藥用活性物質(zhì)的相互協(xié)同作用，在降低糖尿病患者餐后血糖，改善糖耐量的同時，修復(fù)受損的胰島β細胞功能，達到治療糖尿病綜合癥的作用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：桑葉、石榴皮降血糖藥用活性物質(zhì)提取工藝，包括桑葉降血糖藥用活性物質(zhì)提取方法和石榴皮降血糖藥用活性物質(zhì)提取方法，所述桑葉降血糖藥用活性物質(zhì)提取方法，依次包括以下步驟：

a.采摘：采摘桑葉，每年5月至10月；

b.干燥：將采摘的桑葉干燥，干燥溫度不大于50℃；

c.粉碎：粉碎粒度30目至80目；

d.加入酒精，然后超聲波提?。壕凭珴舛?0-70％，料液的重量比為1：30-50，提取時間4-6小時，提取溫度30-50℃，超聲功率：1000-1300w，提取完成后細篩過濾去除濾渣，得到提取液進行8000-10000rpm離心，得到上清液；

e.將d步驟產(chǎn)生的上清液旋蒸去除酒精，離心收集上清液，上清液用酸型陽離子交換樹脂吸附12-24小時，自來水沖洗去雜后，樹脂用0.25-0.5mol/l的氨水洗脫，收集洗脫液旋蒸去除氨水，濃縮至小體積后離心得上清夜；

f.重復(fù)步驟e，將上清液用強酸型陽離子交換樹脂吸附2-4小時，自來水沖洗去雜后，樹脂用0.25-0.5mol/l的氨水洗脫，收集洗脫液旋蒸去除氨水，濃縮至小體積后冷凍或噴霧干燥，得到桑葉生物堿的原料粉1；

所述石榴皮降血糖要用活性物質(zhì)提取方法，依次包括以下步驟：

g.采摘：采摘桑葉，每年5月至10月；

h.干燥：將采摘的桑葉干燥，干燥溫度不大于50℃；

i.粉碎：粉碎粒度30目至80目；

j.加入酒精，然后超聲波提?。壕凭珴舛?0-70％，料液的重量比為1：30-50，提取時間4-6小時，提取溫度30-50℃，超聲功率：1000-1300w，提取完成后細篩過濾去除濾渣，得到提取液進行8000-10000rpm離心，得到上清液；

k.將d步驟產(chǎn)生的上清液旋蒸去除酒精，離心收集上清液，上清液用酸型陽離子交換樹脂吸附12-24小時，自來水沖洗去雜后，樹脂用0.25-0.5mol/l的氨水洗脫，收集洗脫液旋蒸去除氨水，濃縮至小體積后離心得上清夜；

l.重復(fù)步驟e，將上清液用強酸型陽離子交換樹脂吸附2-4小時，自來水沖洗去雜后，樹脂用0.25-0.5mol/l的氨水洗脫，收集洗脫液旋蒸去除氨水，濃縮至小體積后冷凍或噴霧干燥，得到桑葉生物堿的原料粉1；

所述石榴皮降血糖藥用活性物質(zhì)提取方法，依次包括以下步驟：

a)采摘成熟石榴果實，剝下果皮于不大于50℃條件下干燥；

b)將干燥石榴皮粉碎，過30目至80目篩；

c)提取：石榴皮粉按1:30-1:50(w/v)加入蒸餾水，超聲功率：1000-1300w，60℃-80℃提取4-6小時；提取完成后真空抽濾除去濾渣，收集富含多酚的上清液；

d)將c步驟中的多酚上清液中按50:1-100:1(v/v)的比例加入10-40u/l單寧酶液，并用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)酸堿度至ph5-ph5.5，37℃-45℃反應(yīng)過夜；

e)將d步驟中反應(yīng)液8000-1000r/min離心，傾出上清液，沉淀用水洗滌后烘干保存，傾出的上清液85-100℃水浴中5-15分鐘滅活單寧酶，8000-1000r/min離心，棄去蛋白沉淀，上清液用弱極性大孔樹脂吸附過夜，蒸餾水沖洗去除緩沖鹽、糖類等雜質(zhì)，樹脂用80-95％乙醇洗脫，收集洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去掉酒精，濃縮至小體積后烘箱烘干或冷凍干燥得到干燥固體，該固體與前述烘干的沉淀合并，共同于研磨儀中磨成細粉，該細粉即為石榴皮多酚的原料粉2。

采用桑葉、石榴皮降血糖藥用活性物質(zhì)提取工藝得到的活性物質(zhì)制作降血糖藥，將原料粉1、原料粉2按1:0.5-1:2的比例進行配比，充分混合均勻。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是：以石榴皮為原料，獲得具有清除自由基能力強的多酚鞣花酸，與以桑葉為原料提取得到的高含量α-葡糖苷酶抑制劑合理配比后，使其協(xié)同發(fā)揮作用，開發(fā)出新的降糖藥物。該產(chǎn)品能夠降低糖尿病患者空腹血糖、餐后血糖，并減小自由基對胰島β細胞的氧化損傷，改善糖尿病的并發(fā)癥狀。本發(fā)明所用植物材料資源豐富、價格低廉，提取制作工藝簡單，提取溶劑為水，純化洗脫液為乙醇，安全環(huán)保，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明：

圖1為采用本工藝生產(chǎn)的藥劑對小鼠糖耐量的影響對比圖；

圖2為采用本工藝生產(chǎn)的藥劑對stz誘導(dǎo)損傷的胰島β細胞保護作用對比圖；

圖3本工藝生產(chǎn)的藥劑對stz誘導(dǎo)損傷的胰島β細胞保護作用顯微鏡圖；

圖4為本工藝生產(chǎn)的藥劑對dpph自由基的清除作用。

具體實施方式

桑葉、石榴皮降血糖藥用活性物質(zhì)提取工藝，包括桑葉降血糖要用活性物質(zhì)提取方法和石榴皮降血糖要用活性物質(zhì)提取方法，所述桑葉降血糖要用活性物質(zhì)提取方法，依次包括以下步驟：

a.采摘：采摘桑葉，每年5月至10月；

b.干燥：將采摘的桑葉干燥，干燥溫度不大于50℃；

c.粉碎：粉碎粒度30目至80目；

d.加入酒精，然后超聲波提取：酒精濃度50-70％，料液的重量比為1：30-50，提取時間4-6小時，提取溫度30-50℃，超聲功率：1000-1300w，提取完成后細篩過濾去除濾渣，得到提取液進行8000-10000rpm離心，得到上清液；

e.將d步驟產(chǎn)生的上清液旋蒸去除酒精，離心收集上清液，上清液用酸型陽離子交換樹脂吸附12-24小時，自來水沖洗去雜后，樹脂用0.25-0.5mol/l的氨水洗脫，收集洗脫液旋蒸去除氨水，濃縮至小體積后離心得上清夜；

f.重復(fù)步驟e，將上清液用強酸型陽離子交換樹脂吸附2-4小時，自來水沖洗去雜后，樹脂用0.25-0.5mol/l的氨水洗脫，收集洗脫液旋蒸去除氨水，濃縮至小體積后冷凍或噴霧干燥，得到桑葉生物堿的原料粉1；所述石榴皮降血糖要用活性物質(zhì)提取方法，依次包括以下步驟：

a)采摘成熟石榴果實，剝下果皮于不大于50℃條件下干燥；

b)將干燥石榴皮粉碎，過30目至80目篩；

c)提取：石榴皮粉按1:30-1:50(w/v)加入蒸餾水，超聲功率：1000-1300w，60℃-80℃提取4-6小時；提取完成后真空抽濾除去濾渣，收集富含多酚的上清液；

d)將c步驟中的多酚上清液中按50:1-100:1(v/v)的比例加入10-40u/l單寧酶液，并用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)酸堿度至ph5-ph5.5，37-45℃反應(yīng)12-24h；

e)將d步驟中反應(yīng)液8000-1000r/min離心，傾出上清液，沉淀用水洗滌后烘干保存，傾出的上清液85-100℃水浴中5-15分鐘滅活單寧酶，8000-1000r/min離心，棄去蛋白沉淀，上清液用弱極性大孔樹脂吸附過夜，蒸餾水沖洗去除緩沖鹽、糖類等雜質(zhì)，樹脂用80-95％乙醇洗脫，收集洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去掉酒精，濃縮至小體積后烘箱烘干或冷凍干燥得到干燥固體，該固體與前述干燥沉淀合并，共同于研磨儀中磨成細粉，該細粉即為石榴皮多酚的原料粉2。

采用桑葉、石榴皮降血糖藥用活性物質(zhì)提取工藝得到的活性物質(zhì)制作降血糖藥，將原料粉1、原料粉2按1:0.5-1:2的比例進行配比，充分混合均勻。

采用上述工藝生產(chǎn)的原料粉可以選自以下劑型：片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、丸劑、散劑、口服液、混懸劑、溶液劑。有效成分含量：桑葉生物堿≥20％，鞣花酸含量≥20.0％。以下是對采用本工藝生產(chǎn)的原料進行藥理藥效實驗。

1.試驗?zāi)康?/p>

觀察本工藝生產(chǎn)的藥劑對小鼠糖耐量的影響、對stz誘導(dǎo)損傷的胰島β細胞保護作用及對自由基的清除作用，為本工藝生產(chǎn)的藥劑降糖作用提供初步的實驗依據(jù)。

2.受試藥物

本工藝生產(chǎn)的藥劑片原料，形狀：棕色粉末，批號：170321，貯存方法：避光、干燥、常溫(25℃以下)保存，配制方法：臨用前在用0.9％生理鹽水溶解至所需濃度。

3.試驗動物

品種品系：c57/b6小鼠，級別：spf級，性別：雌性，體重：18-20g，數(shù)量：50只，來源：中國科學(xué)院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可證：scxk(滬)2012-0005]。

4.實驗條件

溫度：22±1℃，濕度：50-70％，光照：150-200lx，12小時明暗交替，噪音<50db。飲水：自來水置于飲水瓶中自由飲用。飼料：全價營養(yǎng)顆粒飼料。飼養(yǎng)方式：自由飲食，小鼠飼養(yǎng)籠中給予充足的飼料和水，每籠飼養(yǎng)8只小鼠。

5.試劑與儀器

5.1試劑

蔗糖(中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)；鏈脲佐菌素(stz)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)購自美國sigma公司；血糖試劑條(美國強生公司)；胰島β細胞株ins-1(中國科學(xué)院上海細胞庫)。胎牛血清(杭州民康生物技術(shù)有限公司)；rpmi1640培養(yǎng)基(杭州昊天生物技術(shù)有限公司)；dmso(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所)；臺盼藍染色液(北京索萊寶科技有限公司)；水溶性維生素e(日本東京化工有限公司)。

5.2儀器設(shè)備

spectramaxm5多功能酶標儀，美國分子儀器公司；onetouchrultra血糖儀，強生(上海)醫(yī)療器材有限公司；countstar細胞計數(shù)儀，上海睿鈺生物科技有限公司；co2培養(yǎng)箱，美國therom公司；超凈工作臺，新加坡esco公司。

6.試驗方法

6.1小鼠篩選

取體重為18-20g的雌性c57/b6小鼠，禁食不禁水12小時，篩選空腹血糖在4-6mmol/l的糖尿病小鼠20只。

6.2糖耐量實驗

試驗小鼠禁食不禁水12小時后尾靜脈取血，用onetouch^rultra血糖儀測定小鼠的空腹血糖值。本工藝生產(chǎn)的藥劑組口服給予藥劑50mg/kg，對照組口服給予相等劑量的生理鹽水溶液，30分鐘過后各組即時口服給予0.3g/ml的蔗糖溶液(用生理鹽水配制)0.1ml/10g，測定給糖后30min、60min、120min的血糖。

6.3胰島β細胞保護作用

將胰島β細胞ins-1以1*10⁵個/ml的密度接種于24孔板中，每孔250μl。實驗組加入不同劑量本工藝生產(chǎn)的藥劑溶液，每孔250μl使本工藝生產(chǎn)的藥劑終濃度分別為0.125、1.25μg/ml，空白對照組加入同體積rpmi1640完全培養(yǎng)液，每組設(shè)6復(fù)孔。

另外，實驗孔加入16mmstz溶液125μl，同時加入0.125、1.25μg/ml本工藝生產(chǎn)的藥劑溶液125μl，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，并設(shè)正常對照組(細胞，未加stz)、stz損傷模型組(細胞，加stz，不加藥物)。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，每孔棄去培養(yǎng)液，加入pbs洗滌細胞，0.25％胰酶消化，收集細胞，離心棄去上清液，加入500μlpbs，吹打均勻，即為細胞懸液。20μl臺盼藍染料與20μl細胞懸液混勻，用countstar細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)。

6.4dpph自由基清除試驗

依據(jù)用無水乙醇配制0.25mg/ml的dpph自由基溶液，4℃避光保存。將待測試劑用dmso稀釋成60、40、20、10和5mg/l共5個梯度濃度，向96孔酶標板的微孔中分別加入100μl被測液和100μl自由基溶液，37℃孵育30min后，測定516nm處od值。以無水乙醇代替自由基溶液作為本底對照，以dmso代替被測液作為空白對照。根據(jù)下面公式計算自由基清除率：dpph自由基清除率＝[1－(od樣品－od本底)/od空白]×100％

7.數(shù)據(jù)處理

用spss12軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，計量資料應(yīng)用t檢驗評價試驗結(jié)果。

8試驗結(jié)果

8.1本工藝生產(chǎn)的藥劑對糖尿病小鼠糖耐量的影響

從圖1結(jié)果可見，與對照組相比，本工藝生產(chǎn)的藥劑量組小鼠在口服給予蔗糖后血糖和血糖曲下面積均明顯降低(p<0.01)。

8.2本工藝生產(chǎn)的藥劑對胰島β細胞的影響

由圖2、圖3可知，stz可顯著損傷胰島β細胞ins-1，本工藝生產(chǎn)的藥劑對stz損傷的胰島β細胞ins-1具有明顯的保護作用，活細胞數(shù)量顯著高于stz損傷組(p<0.01)，且有隨著劑量增加而提高的趨勢，發(fā)揮這一作用可能是因為本工藝生產(chǎn)的藥劑具有顯著的清除自由基的功能。顯微觀察與細胞計數(shù)測定結(jié)果基本一致，如圖3所示，正常對照組ins-1細胞扁平，貼壁牢固，呈不規(guī)則多邊形；stz致ins-1細胞數(shù)量減少，形狀變圓，貼壁不牢，萎縮脫落；本工藝生產(chǎn)的藥劑可減輕stz對ins-1細胞的損傷，細胞數(shù)量增加，貼壁生長，細胞形態(tài)明顯改善趨向正常。

注：與stz模型組比較，**p<0.01。

8.3本工藝生產(chǎn)的藥劑對自由基的清除作用

由圖4可以看出，本工藝生產(chǎn)藥劑對dpph自由基有很強的清除作用，與常用的抗氧化劑水溶性維生素e相當。優(yōu)越的清除自由基能力可能是本試劑能夠保護胰島β細胞的重要原因之一。

以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明的技術(shù)特征并不局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的領(lǐng)域內(nèi)，所作的變化或修飾皆涵蓋在本發(fā)明的專利范圍之中。