治療性hbv微環(huán)dna疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和DNA疫苗制備領(lǐng)域，具體地說，涉及一種治療性HBV微環(huán) DNA疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)在全球范圍廣泛流行。HBV感染可引起急、慢性和重型肝炎， 并與肝硬化、肝癌的發(fā)病密切相關(guān)，是嚴(yán)重危害人類健康的感染性疾病。目前全球約有3. 5 億慢性乙型肝炎病毒感染者，其中75%分布在亞太地區(qū)，我國的慢性無癥狀感染者超過 1. 2億，且慢性乙型肝炎預(yù)后不良。目前的抗病毒藥物主要是核苷類似物和重組干擾素類藥 物，但效果不十分理想。因此，急需一種更有效的治療藥物，清除肝細(xì)胞的cccDNA病毒，使 患者痊愈。
[0003] DNA疫苗，是將外源目的基因構(gòu)建于真核表達(dá)載體的質(zhì)粒，可直接注射到動物體內(nèi) 的第三代疫苗。由于可在體內(nèi)表達(dá)目的抗原，通過外源性、內(nèi)源性以及交叉抗原遞呈途徑被 DC細(xì)胞提呈，有效激活⑶4+Thl和⑶8+T細(xì)胞，因此特別有利于誘導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答，打破 慢性乙肝患者的免疫耐受狀態(tài)，清除病毒，使患者痊愈。
[0004] 基因載體的選擇對DNA疫苗的構(gòu)建至關(guān)重要，一方面，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的骨架DNA成分均 包括DNA復(fù)制起始位點(diǎn)、抗菌素抵抗基因等，這些成分會抑制目的基因表達(dá)，并且載體基因 DNA可能插入宿主基因組，誘發(fā)插入突變和基因沉默的危險；另一方面，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率 低，目的基因只能實現(xiàn)瞬間表達(dá)，其分子量較大，容易引發(fā)免疫反應(yīng)和被機(jī)體所清除。因此， 安全高效的表達(dá)是研宄核酸DNA疫苗基因治療的關(guān)鍵。
[0005] Chen 等（Mar A.Kay,Cheng-Yi He,Zhi-Ying Chen.A robust systemfor production of minicircle DNA vectors. Nature Biotechnology, (2010). doi:10. 1038/ nbt. 1708)開發(fā)的微環(huán)DNA載體（MC)技術(shù)和微環(huán)生成菌株大腸桿菌ZYCY10P3S2T有助于解 決以上問題。MC是一種環(huán)狀表達(dá)盒子，不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中細(xì)菌骨架DNA，能在體內(nèi)長期表達(dá)高 水平的目的基因產(chǎn)物。MC在結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)的持久性和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性等方面與共價鍵密閉 環(huán)狀DNA (cccDNA)相同，使MC成為安全、高效的理想載體之一。微環(huán)DNA的制備方法是將含 目的基因的親本質(zhì)粒（PP)轉(zhuǎn)化入宿主菌ZYCY10P3S2T后，以阿拉伯糖誘導(dǎo)重組酶的表達(dá)， 重組酶介導(dǎo)其識別位點(diǎn)發(fā)生重組，使PP重組形成含細(xì)菌骨架的微質(zhì)粒（miniplasmid，MP) 和含目的基因表達(dá)盒的微環(huán)（minicircl e，MC)DNA。通過宿主菌體內(nèi)聯(lián)合表達(dá)I-SceI內(nèi)切 酶，將MP和PP質(zhì)粒酶切，使之成為線性DNA，繼而在宿主菌內(nèi)降解，通過常規(guī)質(zhì)粒分離方法 即可獲得高純度的微環(huán)DNA。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種新型的治療性HBV微環(huán)DNA疫苗。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供上述微環(huán)DNA疫苗的制備方法。
[0008] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種治療性HBV微環(huán)DNA疫苗，所述疫苗包括雙質(zhì) 粒，即含有編碼HBV外包膜蛋白preS2. S基因的微環(huán)DNA質(zhì)粒以及含有編碼hIL2-IFNy融 合蛋白基因的微環(huán)DNA質(zhì)粒。所述雙質(zhì)粒中均不含有原核質(zhì)粒的復(fù)制元件和抗菌素元件。
[0009] 上述疫苗的制備方法包括以下步驟：
[0010] 1)分別以質(zhì)粒 preS2. S/pcDNA3. 1 和 hIL2-IFNy/pcDNA3. 1 為模板，設(shè)計引物，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，得到目的片段；
[0011] 2)用BglII和Sail同時雙酶切目的片段和ZY781載體，回收，連接，將目的片段 分別克隆至載體ZY781的多克隆位點(diǎn)上，即得親本質(zhì)粒preS2. S/ZY781和hIL2-IFNy/ ZY781 ；
[0012] 3)分別用上述親本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ZYCY10P3S2T，過夜培養(yǎng)，質(zhì)粒酶切及測序 驗證插入正確的片段；
[0013] 4)按0· 25%。的接種量分別將上述菌液接入含kana的TB培養(yǎng)液中，37°C，250rpm 過夜培養(yǎng)，取過夜培養(yǎng)的菌液與Minicle Induction Mix按等體積混合，于32°C，250rpm反 應(yīng)5-8h，反應(yīng)結(jié)束后，離心提質(zhì)粒，即得含有編碼HBV外包膜蛋白preS2. S基因的微環(huán)DNA 質(zhì)粒pMCS2. S，以及含有編碼hIL2-IFNy融合蛋白基因的微環(huán)DNA質(zhì)粒pMCIIF ;
[0014] 5)分別對含有上述質(zhì)粒pMCS2. S和質(zhì)粒pMCI IF的陽性克隆進(jìn)行菌株發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā) 酵結(jié)束后，離心提質(zhì)粒，純化。
[0015] 其中，步驟1)中所述引物包括：
[0016] 上游引物 5' -GAAGATCTGGCGGGTTGACATTGATTATTGACTAG-3' 和
[0017] 下游引物 5 ' -ACGCGTCGACCCATAGAGCCCACCGCAT-3 ' ；
[0018] 步驟4)中所述Minicle Induction Mix的制備方法為：向100ml L B中加入IM NaOH 4ml和20 %阿拉伯糖200 μ 1，混合后經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾。
[0019] 本發(fā)明還提供含有所述疫苗的用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎的藥物。
[0020] 本發(fā)明還提供所述疫苗在制備用于預(yù)防和/或治療乙型肝炎的藥物中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明提供的治療性HBV微環(huán)DNA疫苗，包括含有編碼HBV外包膜蛋白preS2. S基因的微環(huán)DNA質(zhì)粒pMCS2. S以及含有編碼hIL2-IFNy融合蛋白基因的微環(huán)DNA質(zhì)粒 pMCIIF。質(zhì)粒pMCS2. S和pMCIIF中均不含原核質(zhì)粒的復(fù)制元件和抗菌素元件，可游離于宿 主細(xì)胞基因組DNA之外穩(wěn)定持久地表達(dá)外源目的基因，成功實現(xiàn)了在C0S-7細(xì)胞中表達(dá)外 源基因，誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生針對乙型肝炎病毒的高水平IFN γ的Thl型免疫應(yīng)答和特異 性殺傷應(yīng)答。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明微環(huán)DNA質(zhì)粒生成示意圖。
[0023] 圖2為本發(fā)明微環(huán)DNA質(zhì)粒pMCS2. S和pMCIIF構(gòu)建流程圖。
[0024] 圖3為本發(fā)明質(zhì)粒及質(zhì)粒酶切后的電泳結(jié)果；其中，l.DL2000marker ;2. ZY781 空載體；3. pMCS2. S 質(zhì)粒；4. preS2. S/ZY781 質(zhì)粒；5. pMCS2. S 質(zhì)粒雙酶切后；6. preS2. S/ ZY781質(zhì)粒雙酶切后；7. pMCIIF質(zhì)粒；8. hIL2-IFN γ/ZY781質(zhì)粒；9. pMCIIF質(zhì)粒雙酶切后； 10.hIL2-IFNy//ZY781 質(zhì)粒雙酶切后。
[0025] 圖4為本發(fā)明pMCIIF和hIL2-IFNy /pcDNA3. 1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞后IL2的表 達(dá)量。
[0026] 圖5為本發(fā)明pMCIIF和hIL2-IFNy /pcDNA3. 1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后IFNy的 表達(dá)量。
[0027] 圖6為本發(fā)明實施例3中各實驗組ELISPOT斑點(diǎn)直觀示意圖；其中，a.生理 鹽水對照組；b. PHA陽性對照組；c. pcDNA3. l/preS2. S質(zhì)粒實驗組；d pcDNA3. l/preS2. S+pcDNA3. l/hIL2-IFNy 雙質(zhì)粒實驗組；e. pMCS2. S微環(huán)質(zhì)粒實驗組；f. pMCS2. S+pMCIIF雙 微環(huán)質(zhì)粒實驗組。
[0028] 圖7為本發(fā)明實施例3中各實驗組ELISPOT斑點(diǎn)統(tǒng)計結(jié)果。
【具體實施方式】
[0029] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0030] 實施例1治療性HBV微環(huán)DNA疫苗的制備
[0031] 包括以下步驟：
[0032] 1.弓丨物設(shè)計和PCR擴(kuò)增目的片段
[0033] 基于重組質(zhì)粒 preS2. S/pcDNA3. 1 和 hIL2-IFN γ /pcDNA3. 1 (構(gòu)建方法見：何 曉嬙，陳光明，黃英，等.治療性雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗的構(gòu)建和鑒定.解放軍醫(yī)學(xué)雜 志，2003, 28(6) :493-498)的序列，在目的基因的增強(qiáng)子上游和polyA下游設(shè)計引物，用于 擴(kuò)增含有目的基因及其上下游的增強(qiáng)子、啟動子和polyA調(diào)控序列的DNA片段。設(shè)計的引 物序列如下：
[0034] F: 5，-GAAGATCTGGCGGGTTGACATTGATTATTGACTAG-3 '
[0035] R: 5 ' -ACGCGTCGACCCATAGAGCCCACCGCAT-3 '
[0036] 分別以質(zhì)粒 preS2. S/pcDNA