一種無創(chuàng)制作肺纖維化動物模型的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于動物實驗模型構建技術領域，具體地說，涉及一種無創(chuàng)制作肺纖維化動物模型的方法。
【背景技術】
[0002]現(xiàn)有的構建肺纖維化動物模型的方法有很多，主要包括:氣管切開術、氣管插管、額鏡引導灌注、腹腔注射或靜脈滴注化學藥物法、輻射法、口咽部給藥法。
[0003]造模方法有很多，但是各自都美中不足，存在或多或少的缺點。氣管切開對標本鼠的外源性創(chuàng)傷大操作繁雜，對相關實驗室數(shù)據(jù)的影響較大，且實施操作耗費時間；氣管插管或額鏡引導方法存在操作盲目性大、準確性差、成功率低、用時長等缺陷。
[0004]腹腔注射或靜脈滴注化學藥物等方法主要是腹腔或者靜脈給予博來霉素法，腹腔注射博來霉素法，可以減輕因手術操作熟練程度的不同造成的纖維化程度不同，但由于造模需要的博來霉素總劑量較大，費用高，且藥物注射次數(shù)較多，因此國內(nèi)應用受到一定限制。靜脈給藥的最大優(yōu)點是它更接近人類給藥的基本途徑，但是模型形成晚。
[0005]輻射法:選用對輻射敏感的動物為構建肺纖維化模型帶來了便利，且特定近交品系動物具有輻射敏感性這一特點有利于肺纖維化與該動物遺傳特性之間的相關性的研宄，該動物模型的缺點是形成肺纖維化的時間較長，且用于動物實驗的費用增高。
[0006]口咽部給藥主要通過氣霧給藥，一般情況下，除滿足藥物霧化后粒徑要求外，選擇合適的霧化發(fā)生裝置和動物霧化吸入裝置同樣重要，藥液用量小常用壓縮式霧化器，若用量大則用超聲霧化器；而吸入裝置應根據(jù)不同動物選擇不同型號的面罩或噴霧吸嘴。目前常用的是動式吸入裝置，應選擇對供試品吸附較少，氣溶膠發(fā)生能力強、密封性好、易于清洗的裝置，并確保能快速達到試驗所需濃度并在試驗過程中保持藥物濃度穩(wěn)定性。藥物仍須保持分散均勻，不形成結塊。所以從霧化粒徑之外，裝置要求較多，并難以計算以及掌握吸入量的多少，容易造成給藥量不均。
[0007]針對上述現(xiàn)有的操作技術，目前，需要一種操作方便，成功率高，損傷小且成本低廉的大鼠用氣管內(nèi)給藥方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了克服現(xiàn)有技術中存在的缺陷，本發(fā)明提出了一種無創(chuàng)制作肺纖維化動物模型的方法。其技術方案如下:
[0009]一種無創(chuàng)制作肺纖維化動物模型的方法，包括以下步驟:
[0010]采用內(nèi)窺鏡引導下氣管內(nèi)灌注的滴注菌液方式，設備采用鼻O度4#硬式內(nèi)窺鏡、氙燈冷光源及松下KS-822攝錄監(jiān)視系統(tǒng)；
[0011]將大鼠置于直徑為26cm的干燥器內(nèi)乙醚麻醉，麻醉滿意后迅速將鼠從麻醉器中取出，呈仰臥位狀以彈力固定夾將其四肢分別固定于鼠板上；
[0012]兩名操作者并排位于鼠頭頂方向，首先助手以左手持鼠麻醉喉鏡，自鼠上唇齒伸入口腔、提壓鼠舌，伸至鼠會厭緣處時提拉鼠舌根，以右手持牽拉套圈，套住鼠上列長尖牙門齒，左右手同時相反方向上下牽拉舌根與長尖牙門齒，使鼠自唇齒至喉部間上呼吸暢通暴露聲門區(qū)域，此時主操作者以左手持O度硬式內(nèi)窺鏡，右手持7號長針注射器，內(nèi)裝定量造模所用肺炎鏈球菌菌懸液，在監(jiān)視器顯示引導下將7號長注射針插入氣管內(nèi)，并深入聲門下15?20mm，此時觀察鼠的聲帶活動情況，當雙側聲帶由內(nèi)收狀向外展狀變化時，迅速推注藥物博來霉素200 μ I入氣管內(nèi)，使藥物隨吸氣時的氣流充分進入支氣管內(nèi)，推注完畢后，將鼠板迅速立起鼠頭在上左右翻轉15?20秒，此目的是利用體位及重力作用，使藥物充分能夠達到細支氣管以提高造模藥物肺部覆蓋面從暴露氣道至推注藥物完成時間用20?30秒；空白組不做處理，鹽水對照組注入同等量的無菌生理鹽水；每7天滴入一次，共2次；
[0013]解除鼠四肢彈力固定夾將鼠放回鼠籠內(nèi)待復蘇，鼠復蘇時間30?60秒，然后置于恒溫動物房飼養(yǎng)；接種后每日觀察其活動、取食、精神的一般情況，記錄相應數(shù)據(jù)。
[0014]進一步優(yōu)選，所述博來霉素的濃度為2.5mg/ml。
[0015]本發(fā)明的有益效果為:
[0016]本發(fā)明造模方法采用無創(chuàng)氣管內(nèi)滴入博來霉素法構建肺纖維化動物模型，改方法你能夠模擬臨床肺纖維化的形成過程，其操作簡便、快捷，減少氣管切開等對動物造車的外源性損傷，且能夠保證藥物完全進入氣管內(nèi)，也縮短了造模時間。該方法既能保證藥物的不浪費，也能縮短造模時間，從經(jīng)濟學角度考慮也減少了造模成本。
[0017]【附圖說明】請
[0018]圖1為空白組HE染色(400倍)；
[0019]圖2為空白組Masson染色(400倍)；
[0020]圖3為模型組第21天HE染色(400倍)；
[0021]圖4為模型組第21天Masson染色(400倍)。
【具體實施方式】
[0022]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細地說明。
[0023]實驗動物:清潔級Wistar雄性大鼠60只，月齡3-6個月，體重180 士 20g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格(許可)證號:SCXK(京)2009-0004 ;實驗大鼠喂養(yǎng)在天津實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境室內(nèi)相對濕度為50% -60%，溫度控制在18-22°C ;常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲用水，按時通風沖刷糞便，保持環(huán)境安靜，適應性喂養(yǎng)I周后開始實驗。
[0024]實驗藥品:博萊霉素(造模型組芪術合劑組，潑尼松組)由日本化藥株式會社生產(chǎn)，進口許可證號X20000349
[0025]造模方法
[0026]采用內(nèi)窺鏡引導下氣管內(nèi)灌注的滴注菌液方式，設備采用鼻O度4#硬式內(nèi)窺鏡、氙燈冷光源及松下KS-822攝錄監(jiān)視系統(tǒng)；
[0027]將大鼠置于直徑為26cm的干燥器內(nèi)乙醚麻醉，麻醉滿意后迅速將鼠從麻醉器中取出，呈仰臥位狀以彈力固定夾將其四肢分別固定于鼠板上；
[0028]兩名操作者并排位于鼠頭頂方向，首先助手以左手持鼠麻醉喉鏡，自鼠上唇齒伸入口腔、提壓鼠舌，伸至鼠會厭緣處時提拉鼠舌根，以右手持牽拉套圈，套住鼠上列長尖牙門齒，左右手同時相反方向上下牽拉舌根與長尖牙門齒，使鼠自唇齒至喉部間上呼吸暢通暴露聲門區(qū)域，此時主操作者以左手持O度硬式內(nèi)窺鏡，右手持7號長針注射器，內(nèi)裝定量造模所用肺炎鏈球菌菌懸液，在監(jiān)視器顯示引導下將7號長注射針插入氣管內(nèi)，并深入聲門下15?20mm，此時觀察鼠的聲帶活動情況，當雙側聲帶由內(nèi)收狀向外展狀變化時，迅速推注藥物博來霉素(濃度2.5mg/ml) 200 μ I入氣管內(nèi)，因為此時鼠呈吸氣階段，可以使藥物隨吸氣時的氣流充分進入支氣管內(nèi)，取得最佳的造模效果推注完畢后，將鼠板迅速立起鼠頭在上左右翻轉15?20秒，此目的是利用體位及重力作用，使藥物充分能夠達到細支氣管以提高造模藥物肺部覆蓋面從暴露氣道至推注藥物完成時間約用20?30秒?？瞻捉M不做處理，鹽水對照組注入同等量的無菌生理鹽水；每7天滴入一次，共2次。
[0029]解除鼠四肢彈力固定夾將鼠放回鼠籠內(nèi)待復蘇，鼠復蘇時間約30?60秒，然后置于恒溫動物房飼養(yǎng)；接種后每日觀察其活動、取食、精神的一般情況，記錄相應數(shù)據(jù)
[0030]實驗結果:
[0031]動物一般情況
[0032]造模后的I?7天內(nèi)，模型組組大鼠有不同程度的聳毛、精神萎靡、活動減少，并見有明顯的體重下降，正常組無明顯異常。
[0033]動物組織病理
[0034]光鏡下觀察其病理形態(tài)學改變:肺泡擴張，間隔變窄，肺泡孔擴大，肺泡間隔斷裂，擴張的肺泡融合成較大的囊腔，并伴隨小氣道，周圍肺間質及肺泡間隔有大量炎細胞的浸潤，以單核、巨噬細胞為主，大部分形成炎癥灶，成纖維細胞增多，病灶內(nèi)出現(xiàn)肺泡萎縮，Masson染色可見少量膠原纖維被染成藍色，顯示造模成功，具體如圖1_圖4所示。
[0035]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，本發(fā)明的保護范圍不限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【主權項】
1.一種無創(chuàng)制作肺纖維化動物模型的方法，其特征在于，包括以下步驟: 采用內(nèi)窺鏡引導下氣管內(nèi)灌注的滴注菌液方式，設備采用鼻O度4#硬式內(nèi)窺鏡、氙燈冷光源及松下KS-822攝錄監(jiān)視系統(tǒng)； 將大鼠置于直徑為26cm的干燥器內(nèi)乙醚麻醉，麻醉滿意后迅速將鼠從麻醉器中取出，呈仰臥位狀以彈力固定夾將其四肢分別固定于鼠板上； 兩名操作者并排位于鼠頭頂方向，首先助手以左手持鼠麻醉喉鏡，自鼠上唇齒伸入口腔、提壓鼠舌，伸至鼠會厭緣處時提拉鼠舌根，以右手持牽拉套圈，套住鼠上列長尖牙門齒，左右手同時相反方向上下牽拉舌根與長尖牙門齒，使鼠自唇齒至喉部間上呼吸暢通暴露聲門區(qū)域，此時主操作者以左手持O度硬式內(nèi)窺鏡，右手持7號長針注射器，內(nèi)裝定量造模所用肺炎鏈球菌菌懸液，在監(jiān)視器顯示引導下將7號長注射針插入氣管內(nèi)，并深入聲門下15?20mm，此時觀察鼠的聲帶活動情況，當雙側聲帶由內(nèi)收狀向外展狀變化時，迅速推注藥物博來霉素200 μ I入氣管內(nèi)，使藥物隨吸氣時的氣流充分進入支氣管內(nèi)，推注完畢后，將鼠板迅速立起鼠頭在上左右翻轉15?20秒，利用體位及重力作用，使藥物充分能夠達到細支氣管以提高造模藥物肺部覆蓋面從暴露氣道至推注藥物完成時間用20?30秒；空白組不做處理，鹽水對照組注入同等量的無菌生理鹽水；每7天滴入一次，共2次； 解除鼠四肢彈力固定夾將鼠放回鼠籠內(nèi)待復蘇，鼠復蘇時間30?60秒，然后置于恒溫動物房飼養(yǎng)；接種后每日觀察其活動、取食、精神的一般情況，記錄相應數(shù)據(jù)。
2.根據(jù)權利要求1所述的無創(chuàng)制作肺纖維化動物模型的方法，其特征在于，所述博來霉素的濃度為2.5mg/mlo
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種無創(chuàng)制作肺纖維化動物模型的方法，采用內(nèi)窺鏡引導下氣管內(nèi)灌注的滴注菌液方式，設備采用鼻0度4#硬式內(nèi)窺鏡、氙燈冷光源及松下KS-822攝錄監(jiān)視系統(tǒng)；將大鼠置于直徑為26cm的干燥器內(nèi)乙醚麻醉，推注藥物博來霉素200μl入氣管內(nèi)，使藥物隨吸氣時的氣流充分進入支氣管內(nèi)，解除鼠四肢彈力固定夾將鼠放回鼠籠內(nèi)待復蘇，鼠復蘇時間30～60秒，然后置于恒溫動物房飼養(yǎng)；接種后每日觀察其活動、取食、精神的一般情況，記錄相應數(shù)據(jù)。
【IPC分類】A61D7-00
【公開號】CN104605958
【申請?zhí)枴緾N201510038225
【發(fā)明人】孫增濤, 鄭兆曄, 廉富, 楊曉敏, 閆博, 劉恩順, 祁海燕, 李美鳳, 封繼宏
【申請人】天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年1月26日