包含輕鏈和重鏈的選擇性配對的免疫球蛋白構(gòu)建體的制作方法
【專利說明】包含輕鏈和重鏈的選擇性配對的免疫球蛋白構(gòu)建體
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年7月23日提交的美國申請序列號61/674,820 ;和2013年7 月23日提交的美國申請序列號61/857, 652的權(quán)益，所述申請各自特此以引用的方式整體 并入。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明的領(lǐng)域是合理設(shè)計(jì)用于生物治療劑的定制研發(fā)的免疫球蛋白構(gòu)建體。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 治療性單克隆抗體（Mab)被廣泛用于治療人疾病。然而，僅靶向ー種抗原通常 在適應(yīng)癥如腫瘤學(xué)中是不足的，并且腫瘤在潛伏期之后進(jìn)展。用于將現(xiàn)有抗體轉(zhuǎn)化成 IgG樣雙特異形式的一般方法論將大大促進(jìn)雙特異性抗體的臨床開發(fā)。自抗體工程化 的早期以來，在產(chǎn)生能夠同時結(jié)合兩種不同靶標(biāo)的這類抗體方面一直存在廣泛興趣。本 領(lǐng)域中已描述了雙特異性抗體如四價IgG-單鏈可變片段（scFv)融合體、卡妥索單抗 (catumaxomab)(-種三官能大鼠/小鼠雜合雙特異性上皮細(xì)胞粘附分子-CD3抗體）、雙特 異性⑶19-〇)3scFv抗體蘭妥莫單抗（blinatumomab)、"雙作用Fab"（DAF)抗體、四價雙特 異性形式如IgG樣雙重可變結(jié)構(gòu)域抗體（DVD-Ig)。這些方法各自具有局限性，如免疫原性、 較差的藥物代謝動力學(xué)特性或由片段可結(jié)晶（Fe)區(qū)的缺乏引起的效應(yīng)子功能的損失；此 外，它們可能傾向于聚集或可能包含潛在免疫原性非人結(jié)構(gòu)域。大多數(shù)形式從天然IgG蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu)顯著地偏離，或者它們不能應(yīng)用于基于可供使用的抗體以一般方式制備穩(wěn)定的雙 特異性IgG抗體。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本文提供包含單鏈Fab區(qū)（scFab)的免疫球蛋白構(gòu)建體，所述單鏈Fab區(qū)包含 來自免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)多肽（VH)、來自免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)多肽（VL)、來自 免疫球蛋白輕鏈的恒定區(qū)多肽（CL)以及來自免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)多肽（CHl);其中 VH多肽和VL多肽通過第一接頭連接以形成單鏈Fv構(gòu)建體（scFv)。在一些實(shí)施方案中， 所述CL和CHl通過第二接頭連接。在某些實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白構(gòu)建體具有包含 VH-L1-VL-CL-L2-CH1的序列，其中Ll和L2是第一接頭和第二接頭。在某些實(shí)施方案中， 所述免疫球蛋白構(gòu)建體具有包含VH-L1-VL-L3-CL-L2-CH1的序列，其中L1、L2以及L3是接 頭。在一個實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白構(gòu)建體具有包含VL-L4-VH-CH1-L5-CL的序列，其 中L4和L5是接頭。這類構(gòu)建體的某些實(shí)施方案在本文或者被稱為輕鏈插入物（LCI)。
[0008] 在某些實(shí)施方案中，每個接頭是包含約1至約100個氨基酸的多肽。在一些實(shí)施 方案中，所述接頭包含含有選自Gly(G)、Ser(S)和Glu(E)的氨基酸的氨基酸序列。在ー個 實(shí)施方案中，所述接頭由通式（Gly-Gly-Gly-Ser)n的多肽組成,其中n是4至10的整數(shù)。
[0009] 提供ー種包含單鏈Fab區(qū)（scFab)的分離的免疫球蛋白構(gòu)建體，所述單鏈Fab區(qū) 包含來自免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)多肽（VH)、來自免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)多肽（VL)、來 自免疫球蛋白輕鏈的恒定區(qū)多肽（CL)以及來自免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)多肽（CHl);其中 所述VH和CL通過接頭多肽連接，其中所述接頭多肽表現(xiàn)出形成螺旋結(jié)構(gòu)的傾向。在ー些 實(shí)施方案中，單鏈Fab多肽具有包含VL-CL-L8-VH-CH1的序列；其中L8是所述具有形成螺 旋結(jié)構(gòu)的傾向的接頭。在一些實(shí)施方案中，所述接頭的至少約25%以螺旋形式存在。在一 些實(shí)施方案中，所述接頭的至少約50%以螺旋形式存在。在某些其它實(shí)施方案中，所述接 頭的至少約60%以螺旋形式存在。在另ー個實(shí)施方案中，所述接頭的至少約75%以螺旋形 式存在。在另ー個實(shí)施方案中，所述接頭的至少約80%以螺旋形式存在。在其它實(shí)施方案 中，所述接頭的至少約90%以螺旋形式存在。在其它實(shí)施方案中，所述接頭的至少約95% 以螺旋形式存在。在某些實(shí)施方案中，所述接頭包含多個螺旋區(qū)段。
[0010] 提供本文所描述的免疫球蛋白構(gòu)建體，其中所述接頭多肽形成a螺旋、聚脯氨酸 I型螺旋、聚脯氨酸II型螺旋以及31(|螺旋中的至少ー個。在一些實(shí)施方案中，所述接頭形 成約1圈至約20圈之間的螺旋。在一個實(shí)施方案中，所述接頭形成約3圈至約5圈之間的 螺旋。在一個實(shí)施方案中，所述接頭形成約2圈至約4圈之間的螺旋。在一個實(shí)施方案中， 所述接頭形成約2圈至約10圈之間的螺旋。在一些實(shí)施方案中，所述接頭包含至少ー對形 成螺旋穩(wěn)定相互作用的氨基酸。在一個實(shí)施方案中，所述螺旋穩(wěn)定相互作用是電荷-電荷 相互作用、陽離子相互作用、疏水相互作用以及大小互補(bǔ)相互作用中的至少ー個。
[0011] 提供本文所描述的分離的免疫球蛋白構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體包含至少ー個具有 形成螺旋的傾向的接頭多肽，并且其中所述接頭多肽包含選自Gly(G)、Ser(S)、Glu(E)、 Gln(Q)、Asp⑶、Asn(N)、Arg(R)、Lys(K)、His(H)、Val(V)以及l(fā)ie(I)的氨基酸。在某些 實(shí)施方案中，所述接頭多肽包含選自Met(M)、Ala(A)、Leu(L)、Glu(E)以及Lys(K)的氨基 酸。在一個實(shí)施方案中，所述接頭多肽包含至少ー個Pro(P)殘基。在某些實(shí)施方案中，所 述接頭具有包含至少ー個（Asp-Asp-Ala-Lys-Lys)n基序的氨基酸序列，其中n是1至10 的整數(shù)。
[0012] 本文提供包含以下各項(xiàng)的免疫球蛋白構(gòu)建體：第一多肽構(gòu)建體，其包含本文所描 述的第一scFab和含有第一CH3區(qū)的第一重鏈多肽；以及第二多肽構(gòu)建體，其包含含有第 二CH3區(qū)的第二重鏈多肽，其中所述第一重鏈多肽和第二重鏈多肽中的至少ー個任選地包 含變體CH3區(qū)，所述變體CH3區(qū)促進(jìn)異二聚體的形成。在一些實(shí)施方案中，所述第一多肽構(gòu) 建體和第二多肽構(gòu)建體還包含抗原結(jié)合多肽構(gòu)建體。在一個實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合多 肽構(gòu)建體是scFv或scFab中的至少ー個。在一些實(shí)施方案中，所述scFab是本文所描述的 scFab〇
[0013] 在一些實(shí)施方案中，所述第一重鏈多肽和第二重鏈多肽形成異二聚體Fc。在某些 實(shí)施方案中，所述異二聚體Fc包含含有至少ー個氨基酸突變的變體免疫球蛋白CH3結(jié)構(gòu) 域。在某些實(shí)施方案中，所述至少一個氨基酸突變促進(jìn)具有可比得上天然同二聚體Fc的穩(wěn) 定性的所述異二聚體Fc的形成。在一個實(shí)施方案中，所述變體CH3結(jié)構(gòu)域具有約73°C或更 大的熔解溫度（Tm)。在一個實(shí)施方案中，所述異二聚體Fc被形成為具有至少約70%的純 度。在一些實(shí)施方案中，所述異二聚體Fc被形成為具有至少約70%的純度并且Tm是至少 約73°C。在另ー個實(shí)施方案中，所述異二聚體Fc被形成為具有至少約75%的純度并且Tm 是約75で。
[0014] 提供ー種本文所描述的免疫球蛋白構(gòu)建體，其中所述第一重鏈多肽和第二重鏈多 肽中的至少ー個還包含變體CH2結(jié)構(gòu)域，所述變體CH2結(jié)構(gòu)域包含氨基酸修飾以便促進(jìn)與 至少ー種FeY受體的選擇性結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，所述第一重鏈多肽和第二重鏈多肽 中的至少ー個包含變體CH2結(jié)構(gòu)域或鉸鏈，所述變體CH2結(jié)構(gòu)域或鉸鏈包含阻止與至少ー 種FeY受體的功能有效結(jié)合的氨基酸修飾。在一些實(shí)施方案中，所述Fe區(qū)是糖基化的。在 一些實(shí)施方案中，所述Fe區(qū)是無糖基化的。在一個實(shí)施方案中，所述Fe區(qū)是巖藻糖化的。 在另ー個實(shí)施方案中，所述Fe區(qū)是無巖藻糖化的。
[0015] 在一些實(shí)施方案中提供ー種本文所描述的免疫球蛋白構(gòu)建體，其中所述免疫球蛋 白構(gòu)建體是多特異性免疫球蛋白構(gòu)建體。在一個實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白構(gòu)建體是雙 特異性的。
[0016] 提供ー種包含以下各項(xiàng)的分離的免疫球蛋白構(gòu)建體：第一単體多肽，其包含通過 接頭連接至第一恒定結(jié)構(gòu)域多肽的第一單鏈Fv多肽；以及第二単體多肽，其包含通過接頭 連接至第二恒定結(jié)構(gòu)域多肽的與所述第一Fv多肽不同的第二單鏈Fv多肽；每個所述恒定 結(jié)構(gòu)域多肽包含CL區(qū)、CHl區(qū)以及CH3區(qū)或其片段、變體或衍生物中的每個中的至少一個； 并且其中所述CL區(qū)和CHl區(qū)通過接頭連接，并且其中所述第一和第二恒定結(jié)構(gòu)域多肽形成 Fe區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體不包含任何CH2結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，來自所 述第一恒定結(jié)構(gòu)域多肽的CH3結(jié)構(gòu)域不同于來自所述第二恒定結(jié)構(gòu)域多肽的CH3結(jié)構(gòu)域， 并且所述第一和第二恒定結(jié)構(gòu)域多肽CH3結(jié)構(gòu)域配對以形成穩(wěn)定的異二聚體Fc。
[0017] 在一個實(shí)施方案