一種避免加速血液清除現(xiàn)象的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體、制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，具體涉及一種避免加速血液清除現(xiàn)象的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，更具體地涉及一種含有聚羧基甜菜堿脂質(zhì)的脂質(zhì)體，包含其的藥物制劑及它們的制備方法和應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0002]脂質(zhì)體作為藥物載體具有生物相容性好、降低藥物毒性、增加藥物穩(wěn)定性和增強(qiáng)藥物靶向性等優(yōu)點(diǎn)，脂質(zhì)體作為藥物載體一直備受廣大研宄工作者的關(guān)注，脂質(zhì)體作為藥物載體已得到很多方面的應(yīng)用。但以脂質(zhì)體為載體的藥物制劑易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)識(shí)另IJ，這雖然能提高某些治療藥物的安全性，但卻不能有效發(fā)揮藥物活性。通過(guò)高分子物質(zhì)來(lái)改變脂質(zhì)體表面親水性亞結(jié)構(gòu)，形成表面有高分子材料包裹的脂質(zhì)體，尤其是表面用聚乙二醇(PEG)修飾的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，PEG通過(guò)氫鍵和溶劑中的水分子作用，在被修飾的脂質(zhì)體表面形成一層水合層，掩蓋脂質(zhì)體表面正電荷，從而達(dá)到抑制蛋白質(zhì)吸附并減少吞噬系統(tǒng)識(shí)別的作用，有效解決了上述問(wèn)題。
[0003]基于PEG修飾的脂質(zhì)體盡管細(xì)胞毒性低、血清穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)單，但是，研宄發(fā)現(xiàn)PEG修飾影響脂質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)吞和內(nèi)涵體逃逸過(guò)程，導(dǎo)致藥物分子無(wú)法有效釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，發(fā)揮藥效。更重要的是，自2000年來(lái)，PEG化制劑給藥的安全性和治療的有效性受到了挑戰(zhàn)。鑒于大多數(shù)PEG化制劑在臨床應(yīng)用上需要多次給藥，Dams等(Dams ETM, LavermanP，Oyen WJGjet al.Accelerated blood clearance and altered b1distribut1n ofrepeated inject1ns of sterically stabilized liposomes[J].J Pharmacol expTher，2000，292:1071 - 1079)以"mT。標(biāo)記脂質(zhì)體，研宄大鼠重復(fù)注射PEG化脂質(zhì)體后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)和組織分布變化情況，意外的發(fā)現(xiàn)第二次注射的脂質(zhì)體血漿水平出現(xiàn)極大降低(20分鐘時(shí)的濃度約為首次注射的10% )，且肝攝取量從8.1±0.8%驟升至46.2±9.8%,即為加速血液清除(Accelerated Blood Clearance，ABC)現(xiàn)象。這一現(xiàn)象導(dǎo)致藥物在革巴部位的富集下降，治療效果差，甚至引起臨床的毒副作用。一些研宄者通過(guò)改變脂質(zhì)體表面PEG的化學(xué)結(jié)構(gòu)或者改變給藥途徑來(lái)避免PEG化脂質(zhì)體的這一現(xiàn)象，但是這樣卻使脂質(zhì)體的長(zhǎng)循環(huán)功能大大降低，并不能滿足治療的要求。
[0004]因此，目前的PEG化的脂質(zhì)體，因存在影響脂質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)吞和內(nèi)涵體逃逸的過(guò)程，且會(huì)產(chǎn)生多次給藥的ABC現(xiàn)象，難以滿足臨床應(yīng)用的需要。如何來(lái)尋找一種本領(lǐng)域中需要的毒性小、內(nèi)吞效果明顯，并且適用于多次給藥可以避免ABC現(xiàn)象的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體是解決冋題的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種具有優(yōu)異抗非特異性蛋白吸附性能的，可避免加速血液清除(accelerated blood clearance, ABC)現(xiàn)象的聚羧基甜菜堿(PCB)脂質(zhì)分子修飾的脂質(zhì)體，及其制備方法和應(yīng)用。
[0006]為達(dá)此目的，解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了大量、細(xì)致的研宄工作，研宄發(fā)現(xiàn):
[0007]1、新型脂質(zhì)體的機(jī)制:1)脂質(zhì)體利用細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，形成內(nèi)涵體；2)脂質(zhì)體中聚羧基甜菜堿在內(nèi)涵體的酸性條件下發(fā)生質(zhì)子化帶有正電荷，與內(nèi)涵體中帶負(fù)電荷的脂質(zhì)發(fā)生靜電相互作用；3)帶負(fù)電荷的脂質(zhì)由內(nèi)涵體的腔外翻轉(zhuǎn)到腔內(nèi)，與正電荷脂質(zhì)形成中性離子對(duì)，藥物脫離脂質(zhì)體后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；4)藥物在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮疾病治療作用。
[0008]2、用聚羧基甜菜堿脂質(zhì)分子修飾的脂質(zhì)體制備長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的機(jī)制??聚羧基甜菜堿脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征是，每個(gè)單體單元側(cè)鏈都有一個(gè)陰離子基團(tuán)(羧酸根基團(tuán))和一個(gè)陽(yáng)離子基團(tuán)(季胺基團(tuán))，總體表現(xiàn)電中性。兩性離子聚合物利用陽(yáng)離子和陰離子基團(tuán)與水分子的靜電相互作用吸附大量水分子，在被修飾脂質(zhì)體表面形成水合層，有效抵抗非特異性蛋白質(zhì)與脂質(zhì)體的吸附作用，增強(qiáng)脂質(zhì)體的血液穩(wěn)定性，延長(zhǎng)脂質(zhì)體的血液循環(huán)時(shí)間，提高脂質(zhì)體的內(nèi)吞效率和內(nèi)涵體逃逸能力，避免加快血液清除現(xiàn)象。
[0009]結(jié)合上述發(fā)現(xiàn)的結(jié)果，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0010]第一方面，本發(fā)明提供了一種新型可避免加速血液清除(accelerated bloodclearance, ABC)現(xiàn)象的長(zhǎng)循環(huán)空白脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體包括磷脂、輔助脂質(zhì)和聚羧基甜菜堿脂質(zhì)。
[0011]所述磷脂為1-棕櫚酰基-2-油?；蚜字?POPC)U-棕櫚酰基-2-硬脂?；蚜字?HSPC)、二硬脂?；字Ｄ憠A(DSPC)、二棕櫚?；蚜字?DPPC)、二肉豆蔻?；蚜字?DMPC)、二油?；蚜字?DOPC)或二芥?；蚜字?DEPC)中的任意一種或者至少兩種的混合物，優(yōu)選為POPC和DSPC。
[0012]所述輔助脂質(zhì)為1，2_油?；字Ｒ掖及?DOPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或膽固醇中的任意一種或者至少兩種的混合物，優(yōu)選為DOPE。
[0013]所述聚羧基甜菜堿脂質(zhì)為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚羧基甜菜堿(DSPE-PCBn)、I, 2-油酰基磷脂酰乙醇胺_聚羧基甜菜喊(DOPE-PCBn)、1，2-十八酰基_sn_甘油-聚羧基甜菜堿(DG-PCBn)、膽固醇-聚羧基甜菜堿(膽固醇-PCBn)或α -十六烷基丙三醇醚-聚羧基甜菜堿(HG-PCBn)中的任意一種或者至少兩種的混合物，優(yōu)選為DSPE-PCBn、DOPE-PCBn或膽固醇-PCBn*的任意一種或者至少兩種的混合物，其中，所述聚羧基甜菜堿(PCBn)中聚合度η為1-500間任意整數(shù)，優(yōu)選為1-100間任意整數(shù)，進(jìn)一步優(yōu)選為5_50間任意整數(shù)，最優(yōu)選為10-30間任意整數(shù)。
[0014]所述磷脂:輔助脂質(zhì):聚羧基甜菜堿脂質(zhì)摩爾比為η:1:m，其中η為0.1_100，優(yōu)選為0.2-50，進(jìn)一步優(yōu)選為0.5-10 ；m為0.1-100，優(yōu)選為0.2-10，進(jìn)一步優(yōu)選為0.4-1，例如可以是:0.1:1:0.1、0.2:1:0.2,0.5:1:0.4、1:1:0.5、2:1:0.6、5:1:0.8、8:1:0.9、10:1:1、20:1:5、30:1:8、40:1:10、50:1:12、60:1:20、70:1:50、80:1:60、90:1:80 或 100:1:100。
[0015]第二方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)第一方面所述的新型避免ABC現(xiàn)象的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的方法，采用被動(dòng)載藥法或主動(dòng)載藥法制備所述新型長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體。
[0016]所述被動(dòng)載藥法包括薄膜分散法、超聲分散法、反相蒸發(fā)法、冷凍干燥法、凍融法、復(fù)乳法或注入法。
[0017]所述主動(dòng)載藥法包括pH梯度法、硫酸銨梯度法或醋酸銨梯度法，優(yōu)選為薄膜分散法和硫酸錢梯度法，進(jìn)一步優(yōu)選為硫酸錢梯度法。
[0018]所述硫酸銨梯度法包括以下步驟:
[0019](I)按比例稱取磷脂、輔助脂質(zhì)和聚羧基甜菜堿脂質(zhì)，使其在有機(jī)溶劑中充分溶解，搖勻，減壓旋蒸除去有機(jī)溶劑，形成油膜，用真空泵抽干，徹底除去有機(jī)溶劑；
[0020](2)加入硫酸銨溶液，水浴超聲，形成半透明狀乳液；
[0021](3)將上述乳液加入到高壓均質(zhì)機(jī)中過(guò)壓，再將過(guò)壓后的乳液加入脂質(zhì)體擠出器中過(guò)膜，形成空白脂質(zhì)體；
[0022](4)將空白脂質(zhì)體置于pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中透析；
[0023](5)將透析過(guò)的空白脂質(zhì)體與待包載的藥物分子置于水浴中孵育；
[0024](6)將包載藥物分子的脂質(zhì)體置于pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中透析除去未包載的游離藥物，制得新型長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體。
[0025]步驟(I)所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷或甲醇中的任意一種或者至少兩種的混合物，優(yōu)選為三氯甲烷和甲醇。
[0026]優(yōu)選地，步驟(I)所述減壓旋蒸的轉(zhuǎn)速為30-300rpm，進(jìn)一步優(yōu)選為50-200rpm，最優(yōu)選為 100_170rpm，例如可以是 30rpm、50rpm、80rpm、lOOrpm、120rpm、150rpm、180rpm、200rpm、220rpm、250rpm、280rpm 或 300rpm ；
[0027]優(yōu)選地，步驟(I)所述減壓旋蒸的溫度為10_200°C，進(jìn)一步優(yōu)選為20_100°C，最優(yōu)選為 40-80°C，例如可以是 10°C、20°C、30°C、40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C、100°C、Ii(rc、i2(rc、i3(rc、i4(rc、i5(rc、i6(rc、i7(rc、i8(rc、i9(rc 或 2oo°c。
[0028]優(yōu)選地，步驟(I)所述真空泵抽干時(shí)間為l-72h，進(jìn)一步優(yōu)選為5-48h，最優(yōu)選為15-36h，例如可以是 lh、5h、8h、10h、12h、15h、18h、20h、25h、28h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h、65h 或 72h。
[0029]優(yōu)選地，步驟(2)所述硫酸銨溶液的質(zhì)量濃度為0.1-80%,進(jìn)一步優(yōu)選為1-50%，最優(yōu)選為 5-20%，例如可以是 0.1%、0.5%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75% 或 80%。
[0030]優(yōu)選地，步驟(2)所述水浴超聲的頻率為10-300HZ，進(jìn)一步優(yōu)選為30_200Hz，最優(yōu)選為 60-150Hz，例如可以是 1Hz、20Hz、30Hz、40Hz、50Hz、60Hz、65Hz、7