一種多肽復(fù)合物作為多肽或蛋白質(zhì)藥物載體的應(yīng)用、方法及其融合蛋白復(fù)合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明創(chuàng)造屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于Titin - Telethonin β -折疊片結(jié) 構(gòu)的多肽復(fù)合物作為多肽及蛋白質(zhì)藥物的載體，延長多肽或者蛋白質(zhì)類藥物半衰期的應(yīng)用 及方法，同時(shí)經(jīng)過這種多肽復(fù)合物對多肽或者蛋白質(zhì)類藥物的設(shè)計(jì)和改造，獲得了具有藥 用作用的融合蛋白復(fù)合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，絕大多數(shù)肽類和其類似物藥物為激素或具有激素作用的肽衍生物，具有生 物活性和特異性較高，可溶性強(qiáng)，低毒性等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為藥物研發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域。肽類或蛋 白質(zhì)類藥物雖然具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，但在體內(nèi)發(fā)揮藥理學(xué)作用時(shí)，也具有以下限制因 素：1) 口服利用度低，給藥方式通常選用注射；2)親水性強(qiáng)，不易通過生理屏障；3)較高的 構(gòu)象靈活性，有時(shí)與受體和靶標(biāo)進(jìn)行結(jié)合時(shí)缺乏特異選擇性，易導(dǎo)致副作用。除以上的因 素，還有一個(gè)最為主要的限制因素為其在體內(nèi)半衰期較短。一些肽或蛋白質(zhì)類藥物的體內(nèi) 半衰期僅有幾分鐘，從而導(dǎo)致到達(dá)靶組織的藥物濃度過低，不能發(fā)揮足夠的藥效，嚴(yán)重限制 了臨床應(yīng)用。
[0003] 半衰期較短一般有兩方面原因造成，一是在血漿、肝臟和腎臟中存在著大量的肽 酶（Peptidase)和蛋白酶（Protease)，肽或蛋白質(zhì)在酶的作用下迅速降解；二是在血衆(zhòng)中 分子量較小的肽類或蛋白質(zhì)類藥物（低于50kDa)，由于腎臟的過濾作用而被快速排出。延 長肽類或蛋白質(zhì)類藥物的半衰期，不但可以改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特征，而且可 以減少用藥量和用藥次數(shù)，而這也是現(xiàn)在肽類或蛋白質(zhì)類藥物臨床應(yīng)用上的難題。
[0004] 目前，已經(jīng)開發(fā)出一系列的延長肽類或蛋白質(zhì)類藥物半衰期的方法，如提高肽類 或蛋白質(zhì)類藥物對酶的穩(wěn)定性來減少酶的降解；或者通過增加肽類或蛋白質(zhì)類藥物的流體 力學(xué)體積（Hydrodynamic Volume)和FcRn介導(dǎo)的再生作用來減少腎臟過濾排出。另外， 將較小的多肽或者蛋白質(zhì)類藥物與大分子物質(zhì)通過基因融合或者化學(xué)偶聯(lián)的方式連接在 一起，不僅可以增大其分子量，使其超過腎臟過濾的臨界值（40_50kDa)，減少腎臟的過濾排 出；而且可以依靠大分子量物質(zhì)的空間位阻效應(yīng)，減少蛋白質(zhì)酶等對多肽或者蛋白質(zhì)藥物 的降解，從而極大的延長多肽或者蛋白質(zhì)類藥物的半衰期，增加了臨床應(yīng)用的潛力。
[0005] 目前，應(yīng)用的比較成熟的大分子量載體有PEG，Albumin和IgG-Fc等。現(xiàn)在最普遍 用的一種方法，就是通過化學(xué)交聯(lián)的方式將不同分子量的PEG與多肽或蛋白質(zhì)類藥物的特 異位點(diǎn)相連，能顯著延長多肽或蛋白質(zhì)藥物的半衰期。PEG修飾增加蛋白質(zhì)和多肽藥物的可 溶性，提高了穩(wěn)定性，降低免疫原性，減少蛋白酶的降解，延長在血液中的滯留時(shí)間，延長了 藥物的作用時(shí)間。但是，PEG修飾也存在一些問題，如生產(chǎn)成本較高；有些PEG修飾的藥物 其活性降低；近年來又發(fā)現(xiàn)PEG修飾的蛋白和其降解物容易在腎臟中累積，干擾了正常腎 臟的過濾作用；人和動(dòng)物能夠?qū)EG產(chǎn)生一定的抗體，表明其具有一定的免疫原性。
[0006] 因此，有必要開發(fā)一種免疫原性更低或無免疫原性，在體內(nèi)更穩(wěn)定的肽或者蛋白 質(zhì)類藥物的載體，使多肽或者蛋白質(zhì)類藥物既能保持原來的活性，其半衰期又得到延長，從 而更好的應(yīng)用在臨床上。
[0007] 肌原纖維是由肌節(jié)（sarcomere)構(gòu)成的，Z-盤（Z-disk)是肌節(jié)的分界線。在 Z-盤中錨定著許許多多的蛋白質(zhì)，構(gòu)成了細(xì)胞的骨架成分，起著維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和肌肉伸縮 的重要作用。在Z-盤中，titin分子起著維持肌節(jié)完整性的重要作用。Titin分子是自 然界中已知的最大的蛋白質(zhì)，其分子量約為4MDa，長度約為1 μ m，其N端銷定在Z-盤中， 其C端則跨越了肌節(jié)一半的長度到達(dá)M線。電鏡圖像和基因序列分析表明，titin分子 是由300多個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（Immunoglobulin-like，簡寫為Ig)和纖維連接蛋白 III (fibronectin-like，簡寫為FN-III)樣的結(jié)構(gòu)域，以及其他一些結(jié)構(gòu)域（如PEVK結(jié)構(gòu) 域）等構(gòu)成。
[0008] 在Z-盤中，titin的N端與許多蛋白質(zhì)分子能發(fā)生相互作用，這些相互作用能在 結(jié)構(gòu)上支持肌原纖維的功能。在這些蛋白質(zhì)分子中有一種特殊的分子，Telethonin，其能將 兩個(gè)titin分子的N端通過非共價(jià)鍵連接在一起。
[0009] 晶體結(jié)構(gòu)分析表明，Telethonin N端（TeN)的偽對稱結(jié)構(gòu)（pseudosymmetric structure)通過氫鍵等非共價(jià)鍵將titin分子的N端的兩個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域（Z1Z2)以反向平行 的方式連接起來，構(gòu)成了獨(dú)特的β-折疊片結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)類型在先前的研宄中僅在蛋白 質(zhì)-DNA 復(fù)合物中被發(fā)現(xiàn)（Zou PJ et al, Nature, 12Jan. 2006, 439:229-233)。這種交聯(lián)代 表著一種新型的配體和受體相互作用的方式。傳統(tǒng)的配體和受體的相互作用是配體分子插 入到受體分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，而Telethonin與Z1Z2的相互作用是配體分子Telethonin 的N端通過β-折疊片的交聯(lián)作用將兩個(gè)titin分子的N端（Z1Z2)結(jié)合在一起。這種相 互作用對于穩(wěn)定titin的N端具有非常重要的作用。
[0010] 研宄中，常將包含這種titin - Telethonin β -折疊片結(jié)構(gòu)的復(fù)合物稱為 ZlZ2/Telethonin 復(fù)合物。Steered molecular dynamics (SMD)模擬顯不，這種 Ζ1Ζ2/ Telethonin復(fù)合物所能承受的機(jī)械力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單獨(dú)的Z1Z2分子（Lee EH, et al, S tructure, Mar. 2006, 14 (3) : 497-509)。而單分子機(jī)械力實(shí)驗(yàn)表明，ZlZ2/Telethonin 復(fù)合物能夠承受 700pN 的拉力（Bertz Μ, et al, Proc Natl Acad Sci USA, IlA ug. 2009, 106(32) :13307-133310)，超過目前已知的蛋白質(zhì)分子或者復(fù)合物所能承受的拉 力，因此ZlZ2/Telethonin復(fù)合物是非常穩(wěn)定的一種結(jié)構(gòu)。
[0011] 雖然對ZlZ2/Telethonin復(fù)合物這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)已經(jīng)取得了一定的研宄進(jìn)展，但 對于這種結(jié)構(gòu)在各方面的應(yīng)用卻尚未見報(bào)道，而擁有這種結(jié)構(gòu)的復(fù)合物在作為藥物載體方 面的適用性的研宄至今也更未涉及。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明創(chuàng)造提供一種基于Titin - Telethonin β -折疊片結(jié)構(gòu)的多肽復(fù)合物作為 多肽或蛋白質(zhì)藥物載體的應(yīng)用，所述多肽復(fù)合物含有：（i)多肽A :包含titin分子N端的兩 個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域（Z1Z2)的多肽、其同源物、類似物或衍生物；（ii)多肽B :包含Telethonin分 子N端的β -折疊片區(qū)域的多肽、其同源物、類似物或衍生物；所述多肽B將兩個(gè)所述多肽 A結(jié)合在一起構(gòu)成β-折疊片結(jié)構(gòu)。
[0013] 進(jìn)一步，所述多肽復(fù)合物中，所述多肽A為包含SEQ ID NO:6中31-221位所示的 氨基酸序列的片段、其保守性變體、生物活性片段或衍生物，所述多肽B為包含SEQ ID N0:2 中30-116位所示的氨基酸序列的片段、其保守性變體、生物活性片段或衍生物，且所述多 肽B將兩個(gè)所述多肽A結(jié)合在一起構(gòu)成β-折疊片結(jié)構(gòu)。
[0014] 在一些方案中，所述多肽復(fù)合物中所述多肽A為包含與SEQ ID NO:6中31-221位 所示的氨基酸序列至少具有60%相同性的序列的多肽片段，優(yōu)選為至少具有70%相同性， 還優(yōu)選為至少具有80%相同性，再優(yōu)選為至少具有90%相同性，更優(yōu)選為至少具有95%、 96%、97%、98%、99%的相同性 ；所述多肽B為包含與SEQIDN0:2中30-116位所示的氨基 酸序列至少具有60%相同性的序列的多肽片段，優(yōu)選為至少具有70%相同性，還優(yōu)選為至 少具有80%相同性，再優(yōu)選為至少具有90%相同性，更優(yōu)選為至少具有95%、96%、97%、 98%、99%的相同性。
[0015] 在一些方案中，所述多肽復(fù)合物中所述多肽A包含從SEQ ID NO: 6中31-221位所 示的氨基酸序列中連續(xù)或間斷地缺失、替換或插入0-36中任意數(shù)值個(gè)氨基酸殘基得到的 多肽之一，優(yōu)選為0-20中任意數(shù)值個(gè)，更優(yōu)選為0-10中任意數(shù)值個(gè)，最優(yōu)選為0、1、2、3、4、 5、6個(gè)；所述多肽B包含從SEQ ID NO: 2中30-116位所示的氨基酸序列中連續(xù)或間斷地缺 失、替換或插入0-36中任意數(shù)值個(gè)氨基酸殘基得到的多肽之一，優(yōu)選為0-20中任意數(shù)值 個(gè)，更優(yōu)選為0-10中任意數(shù)值個(gè)，最優(yōu)選為〇、1、2、3、4、5、6、7、8個(gè)。
[0016] 進(jìn)一步，所述多肽A和/或多肽B還可以包含或連接蛋白質(zhì)純化標(biāo)識(shí)序列，所述蛋 白質(zhì)純化標(biāo)識(shí)序列可選自撤、651\把86、]\^?、？1 &8、他1〇、080、51'印中的一種或多種。
[0017] 進(jìn)一步，所述多肽A和/或多肽B還可以包含或連接一段或多段蛋白質(zhì)間隔或連 接序列（linker)，所述蛋白質(zhì)間隔或連接序列用于將外源的氨基酸序列插入多肽A和/或 多肽B的氨基酸序列中，而不破壞所述多肽復(fù)合物的β-折疊片結(jié)構(gòu)。
[0018] 優(yōu)選的，所述多肽復(fù)合物中，所述多肽A為具有SEQ ID NO:6中31-221位所示的 氨基酸序列，多肽B為具有SEQ ID NO: 2中30-116位所示的氨基酸序列或?qū)⑵銫ys突變?yōu)?Ser的變體序列（SEQ ID NO:4中30-116位所示的氨基酸序列）。
[0019] 還優(yōu)選的，所述多肽復(fù)合物中，所述多肽A為具有SEQ ID NO:6中27-221位所示 的氨基酸序列，多肽B為具有SEQ ID NO: 2中27-116位所示的氨基酸序列或具有SEQ ID NO:4中27-116位所示的氨基酸序列。
[0020] 更優(yōu)選的，所述多肽復(fù)合物中，所述多肽A為具有SEQ ID NO:6中25-221位所示 的氨基酸序列，多肽B為具有SEQ ID NO: 2中25-116位所示的氨基酸序列或具有SEQ ID NO:4中25-116位所示的氨基酸序列。
[0021] 最優(yōu)選的，所述多肽復(fù)合物中，所述多肽A為具有SE