五龍鵝的融合催乳素主動免疫提高產(chǎn)蛋率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及產(chǎn)蛋技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及五龍鵝的融合催乳素主動免疫提高產(chǎn)蛋率的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 五龍鵝是我國優(yōu)良地方家禽品種，它的突出優(yōu)點是體型小，產(chǎn)蛋多，屠宰率高，同 時五龍鵝還具有耐粗飼、覓食能力強(qiáng)、以草食為主、抗病能力強(qiáng)、放牧圈養(yǎng)都可以為季節(jié)性 產(chǎn)蛋，且就巢性極強(qiáng)，導(dǎo)致其產(chǎn)蛋量低下。因此，消除就巢性可能成為提高五龍鵝繁殖性能 的有效手段。
[0003] 禽類的就巢性與血漿PRL水平變化有關(guān)。血漿PRL濃度上升到一定的程度可引發(fā) 就巢，就巢開始后，就巢行為本身又促進(jìn)PRL的分泌，高PRL水平進(jìn)而繼續(xù)維持就巢行為，產(chǎn) 蛋期火雞注射PRL能使就巢行為立刻產(chǎn)生，強(qiáng)制終止火雞就巢將導(dǎo)致血漿中PRL水平迅速 下降。在五龍鵝繁殖周期中PRL含量水平測定結(jié)果表明，就巢期的PRL，水平顯著高于休產(chǎn) 期和產(chǎn)蛋期。對矮腳雞PRL的主動免疫和對促PRL釋放因子一VIP的被動免疫均可以降低 就巢發(fā)生率。這證明了 PRL在血漿中的濃度變化是禽類就巢發(fā)生和維持的重要因素。
[0004] 以五龍鵝為實驗動物，通過實驗室技術(shù)克隆PRL基因，可經(jīng)原核誘導(dǎo)表達(dá)制備重 組催乳素，在產(chǎn)蛋后期采取主動免疫手段，并測定鵝血清中與就巢相關(guān)激素的濃度，同時觀 察記錄休產(chǎn)間隔、產(chǎn)蛋量。探討降低鵝就巢率和提高產(chǎn)蛋率途徑，為進(jìn)一步提高鵝的繁殖性 能和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)，同時對其它禽類遺傳學(xué)、行為學(xué)和內(nèi)分泌學(xué)等方面的研宄具有 重要的指導(dǎo)意義。
[0005] 現(xiàn)在已有重組催乳素表面抗原多五龍鵝就巢和產(chǎn)蛋的影響，鵝催乳素受體基因 PRLRSNPs檢測及其與產(chǎn)蛋量的關(guān)系，調(diào)控四季鵝繁殖周期提高產(chǎn)蛋性能的影響等文章，五 龍鵝的融合催乳素蛋白主動免疫提高繁殖性能尚屬空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，為提高五龍鵝的就巢性和產(chǎn)蛋 率，提供五龍鵝的融合催乳素主動免疫提高產(chǎn)蛋率的方法。
[0007] 五龍鵝的融合催乳素主動免疫提高產(chǎn)蛋率的方法，包括以下步驟： (1) cRNA第一鏈合成及擴(kuò)增： 對采集的五龍鵝垂體使用TRIzol試劑提取總RNA，以總RNA為模板，用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix 合成 cDNA，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物檢測及電泳用 1% 瓊脂 糖凝膠，電泳檢測目的基因，切膠回收； (2) PRL原核表達(dá)載體的建立、篩選和鑒定： 向上清中添加硫酸銨至20 %飽和度，冰上攪拌至硫酸銨完全溶解靜置過夜后， 8000rpm，冷凍15min離心15min，收集上清； (3) 向步驟2的上清中加入硫酸銨至50%飽和度，冰上攪拌至硫酸銨完全溶解靜置過 夜后，8000rpm，冷凍15min離心15min，收集沉淀； (4) 重組PRL蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及破碎： 過夜復(fù)蘇保種菌，振蕩培養(yǎng)至OD值約為0. 45-0. 55時1:1000比例加 I mmol · T1IPTG 誘導(dǎo)，取樣處理并設(shè)置空白對照、以含空載體的BL21菌為陰性對照，以未轉(zhuǎn)化BL21菌、未誘 導(dǎo)的BL21菌為空白對照，處理方式上同，加入1/4誘導(dǎo)菌液體積的超聲裂解緩沖液，振蕩混 勻，超聲破碎； (5) 重組PRL蛋白純化、回收： 用Ni-NTA柱純化，透析袋透析，純化得到的重組蛋白，超聲破碎后棄去沉淀，用Lowry 法測重組PRL蛋白濃度，過Ni-NTA后，Lowry法測定蛋白濃度，計算Ni柱回收率； (6) 重組PRL蛋白注射針劑制備： 測定濃縮蛋白含量，稀釋至I mg/ml、2 mg/ml、4mg/ml，與弗式不完全佐劑按體積 1:1混合，采用針管反復(fù)推注的方法，使蛋白與佐劑充分混合至白色無液滴狀液體，制成 l_2ml\支的注射劑，采取即用即制原則，防止針劑長時間放置出現(xiàn)水油分離的現(xiàn)象； (7) 主動免疫及觀察記錄： 所有鵝在免疫前采前翅靜脈采血，送測血清中催乳素水平。
[0008] 本發(fā)明的有益效果是可提高五龍鵝的就巢性和產(chǎn)蛋率，進(jìn)而可提高五龍鵝的生產(chǎn) 性能和市場價值。
【具體實施方式】
[0009] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明： 一、實驗方法： (I) CRNA第一鏈合成及擴(kuò)增： 就地隨機(jī)取兩只五龍鵝，頸部放血處理后取垂體，存于液氮中-80°C保存?zhèn)溆?。對采?的五龍鶴垂體使用TRIzol試劑提取總RNA。以總RNA為模板，用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix合成cDNA。PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測及電泳用1%瓊脂糖凝膠，電泳檢 測目的基因，切膠回收。
[0010] (2) PRL原核表達(dá)載體的建立、篩選和鑒定： 將得到的PCR產(chǎn)物雙酶切得到pET32a ( + )片段，4°C保存?zhèn)溆?。純化的PCR產(chǎn)物用T4 連接酶得到連接產(chǎn)物pET32a-PRL，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并連接pET32a質(zhì)粒，雙酶切鑒定正確后 測序。
[0011] (3)重組PRL蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及破碎： 過夜復(fù)蘇保種菌，振蕩培養(yǎng)至OD值約為0. 45-0. 55時1:1000比例加 I mmol · T1IPTG 誘導(dǎo)，取樣處理并設(shè)置空白對照、以含空載體的BL21菌為陰性對照，以未轉(zhuǎn)化BL21菌、未誘 導(dǎo)的BL21菌為空白對照，處理方式上同。加入1/4誘導(dǎo)菌液體積的超聲裂解緩沖液，振蕩 混勻，超聲破碎。
[0012] (4)重組PRL蛋白的SDS-PAGE檢測及濃度測定： 制作蛋白膠，加入樣品10 μ 1至上樣孔中，上樣順序：誘導(dǎo)4h，誘導(dǎo)3h，誘導(dǎo)2h，誘導(dǎo) lh，M，未誘導(dǎo)菌，未轉(zhuǎn)化菌，空載體菌。濃縮膠電壓80V，分離膠電壓160V。用染色液染色 30min，脫色液過夜脫色，凝膠照相。Lowry法測定蛋白濃度。
[0013] (5)重組PRL蛋白純化、回收： 用Ni-NTA柱純化，透析袋透析，純化得到的重組蛋白。超聲破碎后棄去沉淀，用Lowry 法測重組PRL蛋白濃度，過Ni-NTA后，Lowry法測定蛋白濃度，計算Ni柱回收率；。
[0014] (6)重組PRL蛋白注射針劑制備： 測定濃縮蛋白含量，稀釋至I mg/ml、2 mg/ml、4mg/ml，與弗式不完全佐劑按體積 1:1混合，采用針管反復(fù)推注的方法，使蛋白與佐劑充分混合至白色無液滴狀液體，制成 l_2ml\支的注射劑，采取即用即制原則，防止針劑長時間放置出現(xiàn)水油分離的現(xiàn)象。
[0015] (7)主動免疫及觀察記錄： 所有鵝在免疫前采前翅靜脈采血，送測血清中催乳素水平。
[0016] 二、試驗免疫方法： 陰性對照組：頸部皮下注射生理鹽水； 陽性對照組：每只鵝口服溴隱亭藥片1片； 試驗組I :頸部皮下多點注射重組催乳素 PRL Img; 試驗組II :頸部皮下多點注射中劑量重組催乳素 PRL 2mg; 試驗組III :頸部皮下多點注射高劑量重組催乳素 PRL 4mg ; 重組PRL蛋白首次免疫后10天，五龍鵝采翅靜脈血送測，然后加強(qiáng)免疫一次，免疫劑量 同首次，二次免疫后10天，對五龍鵝采翅靜脈血送測。
[0017] 觀察記錄每只鵝，記錄每天的就巢行為和產(chǎn)蛋情況，統(tǒng)計各組鵝的就巢數(shù)、醒抱數(shù) 和產(chǎn)蛋量。A表示就巢鵝，B表示醒抱但未產(chǎn)蛋的鵝，C表示產(chǎn)蛋鵝，每天定點觀察鵝群產(chǎn)蛋 及就巢情況。實驗采用T檢驗方法對試驗鵝群就巢相關(guān)性狀和產(chǎn)蛋量進(jìn)行分析。
[0018] 三、結(jié)果： 1、垂體中提取RNA，經(jīng)引物擴(kuò)增獲得特異性條帶，條帶大小約600bp，與目的片段大小 一致，測序鑒定后證實為PRL基因片段。
[0019] 2、擴(kuò)增獲得的PRL基因片段兩端分別設(shè)計有Ecor I、Hind III內(nèi)切酶位點，經(jīng)雙酶 切后與載體pET32a連接。連接結(jié)果進(jìn)行雙酶切鑒定，初步表明載體構(gòu)建成功。構(gòu)建成功的 載體經(jīng)測序鑒定，證明插入序列正確，獲得pET32a ( + ) -PRL原核表達(dá)質(zhì)粒。
[0020] 3、表達(dá)產(chǎn)物以可溶性蛋白為主，重組菌體蛋白在約44KD處出現(xiàn)目的蛋白 帶。分別取lh、2h、3h、4h，不同時間重組蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的含量分別為： 13. 6%(±0. 946%)、24. 0%(±2. 50%)、35. 2%(± L 88%)、35. 6%(±3. 33%)，重組 PRL 蛋白表達(dá) 量隨時間的延長呈平穩(wěn)增長，誘導(dǎo)表達(dá)3小時，其表達(dá)量與時間比最為理想，重組PRL融合 蛋白獲得了較為高效可溶性表達(dá)。
【主權(quán)項】
1.五龍鵝的融合催乳素主動免疫提高產(chǎn)蛋率的方法，包括以下步驟： (1) CRNA第一鏈合成及擴(kuò)增： 對采集的五龍鵝垂體使用TRIzol試劑提取總RNA，以總RNA為模板，用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix 合成 cDNA，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物檢測及電泳用 1% 瓊脂 糖凝膠，電泳檢測目的基因，切膠回收； (2) PRL原核表達(dá)載體的建立、篩選和鑒定： 向上清中添加硫酸銨至20 %飽和度，冰上攪拌至硫酸銨完全溶解靜置過夜后， 8000rpm，冷凍15min離心15min，收集上清； (3) 向步驟2的上清中加入硫酸銨至50%飽和度，冰上攪拌至硫酸銨完全溶解靜置過 夜后，8000rpm，冷凍15min離心15min，收集沉淀； (4) 重組PRL蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及破碎： 過夜復(fù)蘇保種菌，振蕩培養(yǎng)至OD值約為0. 45-0. 55時1:1000比例加 I mmol · T1IPTG 誘導(dǎo)，取樣處理并設(shè)置空白對照、以含空載體的BL21菌為陰性對照，以未轉(zhuǎn)化BL21菌、未誘 導(dǎo)的BL21菌為空白對照，處理方式上同，加入1/4誘導(dǎo)菌液體積的超聲裂解緩沖液，振蕩混 勻，超聲破碎； (5) 重組PRL蛋白純化、回收： 用Ni-NTA柱純化，透析袋透析，純化得到的重組蛋白，超聲破碎后棄去沉淀，用Lowry 法測重組PRL蛋白濃度，過Ni-NTA后，Lowry法測定蛋白濃度，計算Ni柱回收率； (6) 重組PRL蛋白注射針劑制備： 測定濃縮蛋白含量，稀釋至I mg/ml、2 mg/ml、4mg/ml，與弗式不完全佐劑按體積 1:1混合，采用針管反復(fù)推注的方法，使蛋白與佐劑充分混合至白色無液滴狀液體，制成 l_2ml\支的注射劑，采取即用即制原則，防止針劑長時間放置出現(xiàn)水油分離的現(xiàn)象； (7) 主動免疫及觀察記錄： 所有鵝在免疫前采前翅靜脈采血，送測血清中催乳素水平。
【專利摘要】本發(fā)明公開了五龍鵝的融合催乳素主動免疫提高產(chǎn)蛋率的方法，包括以下步驟：（1）cRNA第一鏈合成及擴(kuò)增；（2）PRL原核表達(dá)載體的建立、篩選和鑒定；(3)重組PRL蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及破碎；（4）重組PRL蛋白的SDS-PAGE檢測及濃度測定；(5)重組PRL蛋白純化、回收；(6)重組PRL蛋白注射針劑制備；(7)主動免疫及觀察記錄。本發(fā)明可提高五龍鵝的就巢性和產(chǎn)蛋率，進(jìn)而可提高五龍鵝的生產(chǎn)性能和市場價值。
【IPC分類】C07K1-34, C07K1-36, C07K1-22, C12N15-16, C07K14-575, A61K39-00, C12N15-70
【公開號】CN104645323
【申請?zhí)枴緾N201510106534
【發(fā)明人】李明義, 劉陽, 李曉林, 李彥鳳, 趙航
【申請人】山東信得科技股份有限公司
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年3月12日