一種豬支原體肺炎疫苗株的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品領(lǐng)域，涉及一種新的豬支原體肺炎疫苗株的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬支原體肺炎又稱豬地方性流行肺炎（Swine enzootic hyopneumoniae)，我國俗 稱豬喘氣病，是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一種慢性、接觸性、呼 吸道傳染病。主要臨診癥狀是咳嗽和氣喘，常有其他病菌（如多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿 菌、豬胸膜肺炎放線桿菌等）繼發(fā)感染。本病廣泛分布于世界各地，在我國許多地區(qū)的豬場 都有發(fā)生。由于帶菌病豬的存在和分布較廣，通常會引起豬群生產(chǎn)性能顯著下降，受感染豬 群日增重下降，飼料報酬降低，上市時間延遲，豬群生長均勻度較差，藥物治療成本增加，因 而給豬場造成較為嚴重的經(jīng)濟損失。由國內(nèi)外臨床經(jīng)驗可知，接種疫苗，能夠顯著的降低豬 肺炎病變程度，降低飼養(yǎng)成本，是一種比較可行的預(yù)防方法。
[0003] 為了減少豬支原體肺炎對養(yǎng)豬業(yè)造成的損失，國內(nèi)外許多學者進行了廣泛研宄， 并取得了一定的成果。目前，國內(nèi)自主研發(fā)的豬支原體肺炎疫苗只有弱毒疫苗，該疫苗由于 需要胸腔接種，所以不易于推廣普及，而國外已有多家獸藥公司研發(fā)生產(chǎn)了豬支原體肺炎 滅活疫苗，并在國內(nèi)市場上銷售，滅活疫苗可以通過肌肉注射進行接種，易于操作。由于國 內(nèi)無自主研發(fā)的豬支原體肺炎滅活疫苗，市場上均依賴進口，可進口疫苗價格較為昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于，提供一種豬支原體肺炎疫苗株的應(yīng)用，該疫苗株用于豬肺炎 支原體感染引發(fā)疾病的預(yù)防用獸用生物制品或獸藥。本發(fā)明的滅活疫苗所用的菌株是從國 內(nèi)商品豬上分離得到的，對商品豬具有良好的免疫原性；本發(fā)明的滅活疫苗制備工藝簡單， 安全有效，能夠有效預(yù)防豬支原體肺炎疾病的發(fā)生。
[0005] 本發(fā)明所述的一種豬肺炎支原體疫苗株的應(yīng)用，該豬支原體肺炎疫苗株在制備治 療豬支原體肺炎的獸藥中的應(yīng)用，將疫苗株接種培養(yǎng)基培養(yǎng)，收獲培養(yǎng)物，經(jīng)甲醛溶液滅活 與佐劑混合制成，具體操作按下列步驟進行：
[0006] a、生產(chǎn)用種子制備：從菌種庫中取出生產(chǎn)種子，用改良Friis液體培養(yǎng)基溶解，并 按1 : 10繼代于改良Friis液體培養(yǎng)基中，放入溫度36-38°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72小 時，待菌液顏色發(fā)生改變，pH值降低至6. 70-6. 80時收取菌液，純粹檢驗合格，作為一級種 子液，再重復制備二級種子液和三級種子液；
[0007] b、制苗用菌液制備：將步驟a得到的三級種子液按1 : 10加入改良Friis液體培 養(yǎng)基中，密閉發(fā)酵罐罐口，通入無菌空氣，罐內(nèi)壓力達到〇. 〇8MPa時，關(guān)閉發(fā)酵罐上所有進 出口，保壓，溫度36-38 °C培養(yǎng)2-3天，pH值降低至6. 70-6. 80時取樣，進行純粹檢驗和含菌 量測定；
[0008] C、滅活：按步驟b中制備菌液總量的0. 2%加入甲醛溶液，在溫度36-38°C滅活2 小時，再將滅活的菌液置溫度2-8°C保存；
[0009] d、配苗：將步驟c中滅活的菌液與免疫佐劑混合，即得到豬支原體肺炎滅活疫苗， 再將疫苗無菌定量分裝后，加蓋密封，粘貼標簽，置溫度2-8 °C保存。
[0010] 步驟a和步驟b中的改良Friis液體培養(yǎng)基是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基為PPLO肉湯粉 3. 0-5. 0g、腦心浸液粉2. 0-4. 0g、去離子水660-740. 0ml，輔助培養(yǎng)基為IOX漢克氏平衡鹽 溶液 20-40. 0ml、酵母浸出液 20-40. 0ml、青霉素 100-300U/ml、桿菌肽粉 5-20U/ml、0. 25% 酚紅5-10.0 ml和滅活的豬血清100-250.0 ml混合制成。
[0011] 步驟d中所述的免疫佐劑為氫氧化鋁膠、MONTANIDE ISA 206、ISA 11R、ISA 760、 ISA 563 或 Gel Ol0
[0012] 本發(fā)明所述的豬支原體肺炎疫苗株的應(yīng)用，所述的豬支原體肺炎疫苗株，于2010 年在新疆昌吉某豬場分離鑒定獲得的一株豬支原體肺炎疫苗株。其分類命名為豬肺炎支原 體，菌株號為CJ株，已于2014年11月06日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC No. 9909。
[0013] 本發(fā)明所述的改良Friis固體培養(yǎng)基是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基為PPLO肉湯粉3. 0-5. OgJ^ 心浸液粉2. 0-4. 0g、去離子水660-740.0 ml和瓊脂粉10-15. 0g，輔助培養(yǎng)基為IOX漢克氏 平衡鹽溶液20-40. 0ml、酵母浸出液20-40. 0ml、青霉素100-300U/ml、桿菌肽粉5-20U/ml、 0. 25 %酚紅5-10.0 ml和滅活的豬血清100-250.0 ml混合制成。
[0014] 本發(fā)明所述的豬支原體肺炎疫苗株的應(yīng)用，其有益效果為：
[0015] (1)菌株免疫原性好：本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗株是從國內(nèi)商品豬上分離得到 的新菌株，培養(yǎng)滴度高且具有良好的免疫原性，保證了疫苗的免疫效力。
[0016] (2)疫苗生產(chǎn)簡便：該菌株在改良液體培養(yǎng)基上能夠快速生長，菌液滴度高，適合 于大生產(chǎn)；用甲醛滅活，滅活完全且時間短，且甲醛本身是一種防腐劑，用其來滅活兼顧了 滅活和防腐，減少了用量以及對動物的不良反應(yīng)；本發(fā)明的滅活疫苗中使用的免疫佐劑成 分簡單，制苗方法簡便，簡化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)污染的風險。
[0017] (3)疫苗安全有效：本發(fā)明的豬支原體肺炎滅活疫苗（CJ株）經(jīng)過安全檢驗和與 同類進口疫苗進行效力比對試驗，證明疫苗是安全的，免疫保護效力與進口疫苗沒有差異。
[0018] 總之，本發(fā)明的滅活疫苗免疫原性良好、生產(chǎn)簡便、成本低廉，易于大范圍推廣應(yīng) 用，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟、社會效益。
【具體實施方式】
[0019] 通過下列實施例進一步說明本發(fā)明，而不限制本發(fā)明的范圍；
[0020] 實施例1 :豬支原體肺炎滅活疫苗（CJ株）的制備：
[0021] 1 菌種：
[0022] I. 1制造本品用菌種為豬肺炎支原體CJ株（所述的豬支原體肺炎疫苗株，其分類 命名為豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae)，菌株號為CJ，已保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO :9909,保藏日期為2014年11月 06日），檢驗用菌種為豬支原體肺炎肺組織毒，均由新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司 分離、鑒定、保管和供應(yīng)；
[0023] 1.2生產(chǎn)用菌種：
[0024] 1.2. 1形態(tài)和生化特性：用液體培養(yǎng)物涂片，經(jīng)姬母薩氏染色，在高倍鏡下可見環(huán) 狀、短鏈狀和兩極狀等典型的多形態(tài)，并具有代謝葡萄糖的生化特性；
[0025] 1.2. 2培養(yǎng)特性：在改良Friis液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3日，呈輕度渾濁，在改良 Friis固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-10日，肉眼可見針尖大小的菌落，顯微鏡下觀察為外周質(zhì)地疏 松、中央致密的圓形菌落，表面粗糙帶有顆粒狀；
[0026] 1. 2. 3生長抑制試驗：吸取菌液涂布于改良Friis固體培養(yǎng)基上，置溫度36-38°C 使瓊脂表面稍干燥，夾取浸豬肺炎支原體抗血清紙片貼于瓊脂表面，培養(yǎng)14日后，分離菌 株出現(xiàn)大于2. Omm的抑菌圈，其中所述的改良Friis固體培養(yǎng)基是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基為PPLO肉 湯粉3. 0-5. 0g、腦心浸液粉2. 0-4. 0g、去離子水660-740.0 ml和瓊脂粉10-15. 0g，輔助培養(yǎng) 基為IOX漢克氏平衡鹽溶液20-40. 0ml、酵母浸出液20-40. 0ml、青霉素100-300U/ml、桿菌 肽粉5-20U/ml、0. 25 %酚紅5-10.0 ml和滅活的豬血清100-250.0 ml混合制成；
[0027] 1. 2. 4免疫原性：用3-4周齡健康易感仔豬10頭，5頭各耳后頸部深層肌肉注射 豬支原體肺炎滅活疫苗（CJ株）2ml，另5頭不注射作為對照，在同等條件下隔離飼養(yǎng)，一免 后14日，以相同途徑與相同劑量進行二免，二免后14日，連同對照豬5頭，各氣管注射豬肺 炎支原體肺組織毒，連續(xù)觀察28日進行剖檢，按28分評分法對每頭豬肺炎病變進行評分肺 炎病變減少率=(對照豬肺炎算術(shù)平均分-免疫豬肺炎算術(shù)平均分）/對照豬肺炎算術(shù)平 均分X 100%，按上述公式計算免疫組豬的肺炎病變減少率，免疫組豬肺炎病變減少率不低 于 60% ;
[0028] 1. 2. 5檢驗用菌種毒力：將豬支原體肺炎肺組織毒用無菌生理鹽水稀釋，氣管注 射健康易感仔豬5頭，連續(xù)觀察28日，部分仔豬出現(xiàn)咳嗽或腹式呼吸；攻毒28日進行剖檢， 患病豬出現(xiàn)典型的豬支原體肺炎肺部病變，在肺臟心葉、尖葉、膈葉前1/3部位以及中間 葉，出現(xiàn)"肉樣"或"胰樣"實質(zhì)樣病變，界限明顯；
[0029] 2疫苗制造及半成品檢驗：
[0030] 2. 1生產(chǎn)用種子制備：
[0031] 2. I. 1 -級種子繁殖及鑒定：從菌種庫中取出生產(chǎn)種子，用改良Friis液體培養(yǎng) 基溶解，并按1 : 10繼代于改良Friis液體培養(yǎng)基中，放入溫度36-38°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48-72小時，待菌液顏色發(fā)生改變，pH值降低至6. 70-6. 80時收取菌液，作為一級種子液，按 《中國獸藥典》附錄進行純粹檢驗，應(yīng)純粹，在溫度2-8°C保存，使用期應(yīng)不超過7日，繼代應(yīng) 不超過5代，其中改良Friis液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基為PPLO肉湯粉3. 0-5. 0g、腦心浸液 粉2. 0-4. 0g、去離子水660-740. 0ml，輔助培養(yǎng)基為IOX漢克氏平衡鹽溶液20-40. 0ml、酵 母浸出液20-40. 0ml、青霉素100-300U/ml、桿菌肽粉5-20U/ml、0.