一種胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑及其制備方法和應用
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑及其制 備方法和應用。
【背景技術】：
[0002] 胰腺癌起病隱匿，進展快速，治療難度和死亡率都很高，被醫(yī)學界列為"21世紀的 頑固堡皇"，近年來國內外胰腺癌的發(fā)病率明顯上升。胰腺癌治療手段中最有效的是早期根 治性手術切除，胰腺癌長徑小于Icm時，病變限于胰腺導管內皮，根治術后5年生存率接近 100% ;而長徑超過Icm時，多伴有淋巴結、血管和胰腺包膜等周圍組織的侵犯，術后5年生 存率為17%左右，且有85%的患者會出現復發(fā)和肝轉移，平均生存期15-19個月。受診斷 條件所限，目前胰腺癌的手術切除率僅為10%-20%，5年生存率僅為0.4%-3. 4%。因此， 早期診斷和早期治療是改善胰腺癌預后的關鍵。
[0003] 超聲造影增強（contrast-enhanced endoscopic ultrasound，CE-EUS)技術是近 年來發(fā)展起來的一種能夠對病灶進行"血池成像"的新技術，相比較其他影像學方法（如 CT、MRI等），具有價格低廉、安全、易操作、觀察實時、無輻射等優(yōu)勢。CE-EUS主要通過靜脈 注射微泡態(tài)造影劑，掃查對象界面回聲聲阻抗差，將腫瘤病灶從周圍組織中凸顯出來，在胰 腺癌診斷中，可以作為胰腺癌篩查的常規(guī)手段，已成為胰腺疾病診斷研宄的熱點之一。由于 普通的造影劑在胰腺組織中濃度整體偏低，半衰期短，較小的病灶會出現漏診等，使得這項 技術具有一定的局限性。
[0004] 近年來，分子影像學高度發(fā)展，靶向分子技術越來越受到研宄者的重視。Hedgehog 蛋白幾乎在所有胰腺癌中高度表達，且高度表達狀態(tài)在腫瘤病變早期已出現，而Hedgehog 蛋白在正常組織中分布有限，目前尚無革巴向Hedgehog蛋白的超聲造影劑，故制備一種能夠 靶向Hedgehog蛋白的超聲造影劑對胰腺癌早期診斷具有非常重要的意義。
[0005] PLGA(聚乳酸聚乙醇酸嵌段共聚物）是經過美國FDA認證可用于人體的可生物降 解材料，具有良好的親水性和生物相容性，可制備成多種藥物的納米級微粒載體。其中，使 用PEG(聚乙二醇）的技術修飾PLGA納米載體較為成熟和穩(wěn)定。研宄證實，利用PLGA與 NH2-PEg-COOH制備新的PLGA衍生物后，靶向性抗體可以與納米微粒表面的-PEG-COOH末端 反應并銷定在納米微粒上，形成具有祀向性的納米微粒。此外，納米微粒表面經PEG修飾后 會進一步減少納米粒受到RES(網狀內皮系統）的非特異性吞噬，從而達到"隱形"的效果， 在體循環(huán)中可以達到更長的半衰期。
[0006] 目前主要用于超聲造影增強（CE-EUS)的造影劑主要為微泡造影劑。微泡造影 劑可以清晰顯示由于血管問題或組織病變而造成的異常灌注區(qū)域，從而為臨床提供精確、 動態(tài)的組織灌注信息，但是，這種微泡造影劑仍存在很多問題，如：①對病變組織沒有親和 力，只能對病變組織進行非特異性顯影，無法判斷病變性質；②微泡直徑相對較大（多為 2-6 μ m級），雖然可以自由通過肺循環(huán)，但無法穿透血管壁到達靶細胞；③微泡內包含的氣 體本身具有先天性反射和背向散射的特征，常常使得觀測目標與背景的對比度不強；④半 衰期短，有效增強時間僅數十秒或數分鐘，對需要較長時間檢查的病變，只能通過反復推注 造影劑才能滿足要求。液態(tài)氟碳有別于先天性反射和背向散射特征的超聲微泡造影劑，其 產生超聲增強顯影的性能是以靶向聚集為基礎的：當液態(tài)氟碳造影劑微球處于分散狀態(tài) 時，對超聲敏感性非常弱，只有當微粒聚集到靶組織或細胞膜時，才在超聲下顯影。這種聚 集顯影沒有微泡超聲造影劑的聲影現象與背景噪聲，從而可以大大提高分辨準確性，全氟 溴辛烷（PFOB)是液態(tài)氟碳造影劑中的代表性化合物。
[0007] 目前尚無革巴向Hedgehog蛋白的納米級超聲造影劑的相關文獻報道。

【發(fā)明內容】
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[0008] 本發(fā)明的目的在于解決目前胰腺癌超聲造影增強（CE-EUS)技術中特異性顯像能 力差等局限性，提供一種胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供該胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑的制備方法。
[0010] 本發(fā)明的第三目的，是提供該胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑在制備胰腺癌早期 診斷制劑中的應用。
[0011] 本發(fā)明是通過以下技術方案實現：
[0012] 本發(fā)明利用PEG修飾的PLGA作為液態(tài)全氟溴辛烷的納米級微粒載體，并連接能夠 革巴向早期胰腺癌細胞膜表面Hedgehog蛋白的單抗，最終制備成胰腺癌祀向的納米級超聲 造影劑，并評價了其體外細胞靶向能力。
[0013] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑。
[0014] 本發(fā)明的一種胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑，如圖1所示，從里到外依次為：
[0015] 全氟溴辛烷（PFOB);
[0016] 聚乙二醇（PEG)修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA);
[0017] Hedgehog單克隆抗體；
[0018] 具體是以聚乙二醇（PEG)修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA)作為高分子載 體材料，包裹全氟溴辛烷（PFOB)，并在其表面通過聚乙二醇（PEG)連接Hedgehog單克隆抗 體。
[0019] 本發(fā)明所述的納米級超聲造影劑，其粒徑為100~500nm，該粒徑范圍以外的納米 不適宜，粒徑過小會減弱成像效果，粒徑過大會降低造影劑在血管中的通透性，并影響其靶 向效果。
[0020] 本發(fā)明所述的Hedgehog單克隆抗體，可市售，例如英國Abcam公司等。
[0021] 本發(fā)明以聚乙二醇（PEG)修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA)包裹全氟溴辛 烷（PFOB)，所用的方法為乳化揮發(fā)法，可參見文獻：Cheng J J，T印Iy B A，Sherifi，Sung J，Luther G，Gu F X，et al. Formulation of functionalized PLGA-PEG nanoparticles for in vivo targeted drug delivery[J]· Biomaterials，2007,28:869-876.
[0022] 本發(fā)明的第二方面，是提供上述的胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑的制備方法。
[0023] 本發(fā)明的一種胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑的制備方法，該方法包括以下步 驟：
[0024] A、PLGA-PEG-NHS 的合成
[0025] PLGA-C00H和1-3(-3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC . HC1)及 N-羥基硫化琥珀酰亞胺（NHS)反應預活化成琥珀酰亞胺，然后與NH2-PEg-COOH反應生成 PLGA - PEG-COOH ;所得的 PLGA - PEG-COOH 再與 NHS 和 EDC . HCl 反應生成 PLGA-PEG-NHS ;
[0026] B、納米級超聲造影劑的制備
[0027] 將10~IOOmg PLGA - PEG-NHS溶于ImL二氯甲烷溶液中，加入全氟溴辛烷 (PFOB) 5~50 μ L和Img焚光染料香豆素 -6 (加入焚光物質香豆素 -6可用于評價超聲造影 劑的靶向性能，因此可不加入），充分混勻后倒入1 %的膽酸鈉溶液中，冰水浴400W超聲乳 化30- 100秒，揮干二氯甲燒；
[0028] C、抗體和納米級超聲造影劑表面的連接
[0029] 將步驟B制得的納米級超聲造影劑分散于PBS溶液（ρΗ7. 4)中，加入Hedgehog單 克隆抗體，混合反應，分離得到經標記的抗體修飾的祀向納米級超聲造影劑；避光攪拌反應 4小時以上（較佳為6小時），高速離心（1000 Orpm最佳）收集納米級超聲造影劑，凍干。
[0030] 所述的納米級超聲造影劑和Hedgehog單克隆抗體的重量比以50-100 :1為佳。
[0031] 本發(fā)明步驟A中，較佳地，PLGA-C00H和1-3(-3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞 胺鹽酸鹽（EDC . HC1)的重量比為1 :8。
[0032] 使用8倍量EDC活化PLGA-C00H的羧基，增強與NHS反應的活性。同時，使用PEG 的技術修飾可使PLGA納米載體較為成熟和穩(wěn)定，并可進一步減少納米級超聲造影劑受到 網狀內皮系統（RES)的非特異性吞噬。
[0033] 本發(fā)明步驟B中，將全氟溴辛烷（PFOB)包裹于PEG修飾的PLGA載體中，PFOB與 PLGA-PEG-NHS在冰水浴超聲混合，以保證高分子載體包裹PFOB的均一性。較佳地，冰水浴 400W超聲乳化30秒，間隔10秒，重復3次。
[0034] 本發(fā)明步驟B中，較佳地，PLGA - PEG-NHS 20mg、二氯甲烷ImL全氟溴辛烷 (PFOB)10 μL。
[0035] 本發(fā)明步驟C中，較佳地，納米級超聲造影劑10mg，Hedgehog單克隆抗體200 μ g。
[0036] 本發(fā)明的第三方面，是提供上述的胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑在制備胰腺癌 早期診斷制劑中的應用。
[0037] 本發(fā)明進一步提供了所述的納米級超聲造影劑在胰腺癌靶向性診斷中的應用，所 述應用包括以下內容：
[0038] 將納米級超聲造影劑分別加入到Hedgehog高表達的人胰腺癌SW1990細胞株和 Hedgehog低表達的人胰腺癌CFPAC-I細胞株中，觀察和檢測