細(xì)胞的攝取情況。上述所述的 納米級超聲造影劑與細(xì)胞株在37°C孵育1小時，合理的孵育時間確保了造影劑與細(xì)胞結(jié)合 并入胞。本發(fā)明提供的納米超聲造影劑加入到用Hedgehog單抗預(yù)孵育的SW1990細(xì)胞株中， 以進(jìn)一步證明靶向納米級超聲造影劑體外靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞的能力。
[0039] 實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hedgehog抗原高表達(dá)的SW1990細(xì)胞對革E向納米級超聲造影劑的攝 取量比較多，綠色熒光在細(xì)胞內(nèi)分布比較均勻，熒光強度明顯高于非靶向納米級超聲造影 劑的對照組。靶向納米級超聲造影劑作用1小時后，SW1990細(xì)胞的平均熒光強度為1463. 9， 而非靶向納米級超聲造影劑作用的SW1990細(xì)胞平均熒光強度只有352. 6,僅為前者的四分 之一。
[0040] 可見納米超聲造影劑能革El向性地進(jìn)入Hedgehog高表達(dá)的胰腺癌SW100細(xì)胞內(nèi)，說 明包裹PFOB的PLGA納米級超聲造影劑適合作為胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑。
[0041] 本發(fā)明的有益效果：
[0042] 本發(fā)明的納米級超聲造影劑采用PEG修飾的PLGA生物可降解材料為納米載體， 所形成的納米級超聲造影劑穩(wěn)定性好，粒徑大小均勻，能夠滿足穿透腫瘤血管壁的要求，達(dá) 到在腫瘤部位滯留和蓄積的目的。液態(tài)氟碳有別于先天性反射和背向散射特征的超聲微 泡造影劑，其產(chǎn)生超聲增強顯影的性能是以靶向聚集為基礎(chǔ)的，從而大大提高分辨準(zhǔn)確性。 全氟溴辛烷（PFOB)是液態(tài)氟碳造影劑中的代表性化合物。Hedgehog蛋白在胰腺癌中高表 達(dá)，且高表達(dá)狀態(tài)在腫瘤病變早期已存在，而正常人中Hedgehog蛋白分布有限，因此靶向 Hedgehog對于胰腺癌早期病變非常有意義。
[0043] 本發(fā)明的制備方法操作簡單，反應(yīng)試劑和得到的產(chǎn)物毒性非常小，不會對環(huán)境產(chǎn) 生污染，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)后得到的納米級超聲造影劑純化簡便，成本低廉，利于大規(guī)模 推廣于研宄和應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明的第一方面，是提供一種胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑。
【附圖說明】：
[0044] 圖1為本發(fā)明納米級超聲造影劑的模型。
[0045] 圖2為本發(fā)明合成的PEG-PLGA-NHS的1HNMR圖譜。
[0046] 圖3為本發(fā)明不同處方下制備的納米級超聲造影劑透射電鏡圖；其中A、B、C、D、 E、F表示相應(yīng)的各組處方。
[0047] 圖4為本發(fā)明制備的靶向納米級超聲造影劑的粒徑分布直方圖。
[0048] 圖5為本發(fā)明制備的靶向納米級超聲造影劑的電位分布直方圖。
[0049] 圖6為本發(fā)明制備的單抗連接的納米級超聲造影劑子的氟定性表征（D2O做內(nèi) 標(biāo)）。
[0050] 圖7為本發(fā)明制備的靶向納米級超聲造影劑的體外度釋放曲線。
[0051] 圖8為本發(fā)明制備的靶向納米級超聲造影劑熒光顯微鏡下細(xì)胞的攝取情況。
[0052] 圖9為本發(fā)明制備的靶向納米級超聲造影劑流式細(xì)胞儀檢測下細(xì)胞的攝取情況； 其中上排為SW1990細(xì)胞，下排為CFPAC-I細(xì)胞，柱狀圖顯示的是各組細(xì)胞的平均熒光強度。
【具體實施方式】：
[0053] 以下結(jié)合附圖和具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于 說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0054] 實施例 I :PLGA-PEG-NHS 的合成
[0055] 將2000mg PLGA-C00H (購自美國LAKESHORE公司）溶解在5mL二氯甲烷中，向溶液 中加入50mg N-羥基琥泊酰亞胺（NHS)(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、100mg 1-(3-二 甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC ·Η(：1)(購自Sigma公司），避光攪拌反應(yīng)12小 時，氮氣吹干二氯甲烷，加入乙醚沉淀并洗滌，真空干燥得到PLGA-NHS。
[0056] 稱取合成的PLGA-NHS 1000 mg溶解在2mL三氯甲烷中，加入 300mgNH2-PEG-C00H(購自嘉興博美生物技術(shù)有限公司），反應(yīng)12小時后在甲醇中沉淀并氮 氣吹干得到PLGA-PEG-C00H。
[0057] 將500mg PLGA-PEG-C00H溶解在2mL二氯甲烷中，向溶液中加入15mg NHS和 25mg EDC · HC1，充分反應(yīng)后乙醚沉淀洗絳，真空干燥得到制備納米級超聲造影劑的材料 PLGA-PEG-NHSo
[0058] 合成產(chǎn)物溶解于氘代氯仿（⑶C13)中，利用300MHz核磁鑒定（圖2)。
[0059] 其中峰 a ( δ 4. 5 ~δ 4. 8)，b ( δ 5. 2)，c ( δ 1. 5)為 PLGA 的特征峰，峰 d 為 PEG ( δ 3. 6)的特征峰，峰e ( δ 4. 1~δ 4. 3)為NHS的特征峰。
[0060] 核磁共振圖譜表明所合成的材料為制備納米粒所需的目標(biāo)產(chǎn)物PLGA-PEG-NHS。
[0061] 實施例2 :包裹PFOB的PLGA納米級超聲造影劑制備處方篩選
[0062] 把一定量的PLGA與IOyL PFOB(購自Sigma公司）溶于ImL二氯甲烷中，然后與 5mL 1 %的膽酸鈉溶液混合。冰浴下超聲30s停10s，功率為400W，反復(fù)三次后，在室溫下開 口攪拌4小時揮發(fā)掉二氯甲烷，表1為不同原料的組成。
[0063] 利用電位粒度儀測定粒徑和電位（表2)，透射電鏡觀察形態(tài)（圖3)，其中從粒徑 和電位測定結(jié)果來看，A組處方為最優(yōu)處方。 Γππα/ι? ^ 1 ~7C P^l /Bi
【主權(quán)項】
1. 一種胰腺癌祀向的納米級超聲造影劑，其特征在于，所述的納米級超聲造影劑組成 從里到外依次為： 全氟溴辛烷； 聚乙二醇修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物； Hedgehog單克隆抗體； 所述的聚乙二醇修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物作為高分子載體材料，包裹全氟溴辛 燒，并在其表面通過聚乙二醇連接Hedgehog單克隆抗體； 所述的納米級超聲造影劑的粒徑為100~500nm。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑，其特征在于，所述的 聚乙二醇修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物作為高分子載體材料，用乳化揮發(fā)法包裹全氟溴 辛烷。
3. -種如權(quán)利要求1所述的胰腺癌祀向的納米級超聲造影劑的制備方法，其特征在 于，該方法包括以下步驟： A、 PLGA-PEG-NHS 的合成 PLGA-C00H和1-3 (-3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及N-羥基硫化琥珀酰 亞胺反應(yīng)預(yù)活化成琥珀酰亞胺，然后與NH2-PEg-COOH反應(yīng)生成PLGA - PEG-COOH ;所得的 PLGA - PEG-COOH 再與 NHS 和 EDC . HCl 反應(yīng)生成 PLGA-PEG-NHS ; B、 納米級超聲造影劑的制備 將10~IOOmg PLGA - PEG-NHS溶于ImL二氯甲烷溶液中，加入全氟溴辛烷5~50 μ L， 充分混勻后倒入1 %的膽酸鈉溶液中，冰水浴400W超聲乳化30 - 100秒，揮干二氯甲烷； C、 抗體和納米級超聲造影劑表面的連接 將步驟B制得的納米級超聲造影劑分散于ρΗ7. 4的PBS溶液中，加入Hedgehog單克隆 抗體，混合反應(yīng)，分離得到經(jīng)標(biāo)記的抗體修飾的祀向納米級超聲造影劑；避光攪拌反應(yīng)4小 時以上，高速離心收集納米級超聲造影劑，凍干。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑的制備方法，其特征在于， 步驟A中，PLGA-C00H和1-3 (-3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的重量比為1 :8。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑的制備方法，其特征在于， 步驟B中，冰水浴400W超聲乳化30秒，間隔10秒，重復(fù)3次。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑的制備方法，其特征在于， 步驟B中，PLGA - PEG-NHS 20mg、二氯甲烷ImU全氟溴辛烷10 μ L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑的制備方法，其特征在于， 步驟C中，所述的納米級超聲造影劑和Hedgehog單克隆抗體的重量比為50-100 :1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑的制備方法，其特征在于， 步驟C中，納米級超聲造影劑10mg，Hedgehog單克隆抗體200 μ g。
9. 一種如權(quán)利要求1所述的胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑在制備胰腺癌早期診斷 制劑中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種胰腺癌靶向的納米級超聲造影劑，是由聚乙二醇修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物經(jīng)過包裹全氟溴辛烷并連接胰腺癌細(xì)胞靶向的Hedgehog單克隆抗體而成的。本發(fā)明還提供了該納米級超聲造影劑的制備方法，以及該納米級超聲造影劑在制備胰腺癌診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的納米級超聲造影劑設(shè)計為在胰腺癌早期診斷中能特異性靶向Hedgehog高表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞，從而成為胰腺癌早期診斷的一種超聲造影增強、特異性顯像能力強的超聲造影劑。
【IPC分類】A61K49-22
【公開號】CN104645358
【申請?zhí)枴緾N201510067550
【發(fā)明人】張敏敏, 胡楚玲, 高申, 臺宗光, 朱全剛, 楊驊, 王曉宇, 田涇, 姚翀, 武鑫, 顧芬芬
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年2月9日